一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法.pdf

本发明公开了一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，包括选取5年生以上的野生八角莲根茎移栽到干净的河沙基质上进行预培养；再将生长健壮的茎段放置于N-长链硫代羧酸型甜菜碱中浸泡，再用蒸馏水冲洗，并洗刷所述外植体表面污垢；再将外植体利用负离子光触媒处理，然后用次氯酸钠灭菌，并用无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面的水分，并切割成方块，并采用重金属络合剂浸泡；然后将其接种于MS改良培养基暗培养2周；最后进行亮培养。本发明的方法可有效地抑制八角莲外植体的污染和防止八角莲外植体的褐变，为药用植物八角莲的组织培养研究提供充足的无菌外植体，从而保证了后续组织培养的成功率，且成本较低，适于工业化生产。

权利要求书1.  一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1)选取5年生以上的野生八角莲根茎作为母株，将母株移栽到干净的 河沙基质上进行预培养1个月至长出新的茎和叶； (2)采取步骤(1)生长健壮、无病虫害的茎段或幼嫩叶片，先放置于 N-长链硫代羧酸型甜菜碱中浸泡5min，再用蒸馏水冲洗1小时，冲洗过程中 用软毛刷洗刷所述外植体表面污垢； (3)将步骤(2)处理后的外植体利用负离子光触媒处理10-15min，再 用浓度为2.5％的次氯酸钠灭菌4.5min-7min，并用无菌水冲洗3次，每次冲 洗时间为2min，再用无菌滤纸吸干所述外植体表面的水分，将材料切割成1cm ×1cm的方块或1cm长的茎段； (4)采用浓度为0.1％-1％的重金属络合剂浸泡步骤(3)切好的茎段或 方块1小时； (5)将步骤(4)处理后的材料接种于MS改良培养基，pH值调节为5.8， 在25℃±1℃的温度下，1.5个大气压的条件下暗培养2周； (6)将步骤(5)处理后的外植体转到光照强度为1000-2000Lux，光照 时间为10h/d，温度为25℃±1℃的培养条件下培养。 2.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，步骤(1)中所述河沙的湿度为65％-85％。 3.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，步骤(3)中所述负离子光触媒是由TiO2和压电晶体电气石的纳米级粉 体制成的中性液体。 4.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，步骤(3)中利用负离子光触媒处理所述外植体的步骤为将外植体放置于 涂有负离子光触媒的罐体中10-15min，在罐体内通入氮气和臭氧质量比为 10∶1的混合气体，负离子光触媒受外界光线激发而产生大量具有杀菌作用的 氢氧基等离子，从而对外植体进行杀菌处理。 5.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，所述的重金属络合剂为植酸和二乙烯三胺五甲叉膦酸按质量比1∶3混合 的溶液。 6.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，步骤(4)中利用重金属络合剂处理外植体的步骤为将外植体放置于10-15℃ 的浓度为0.1％-1％的重金属络合剂中，每15分钟更换一次重金属络合剂， 遮光培养1小时。 7.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，步骤(5)中所述MS改良培养基的成分包括不含有铜离子的MS培养基、 2mg/L水解酪蛋白、2mg/L活性炭、0.02mg/L生物素和0.8mg/L菸酸。 8.  如权利要求1所述的抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，其特征在 于，步骤(6)中采用红色LED光与蓝色LED光比例为4∶1的混合光照明。

说明书一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法
技术领域
本发明涉及一种抑制外植体污染和褐变的方法，尤其涉及一种抑制八角 莲外植体污染和褐变的组织培养方法。
背景技术
药用植物八角莲隶属于小檗科鬼臼属多年生草本，是依托泊苷和替尼泊 苷等抗癌药物合成前体-鬼臼毒素的传统主要植物来源之一。由于过度采挖、 生境破坏和植物自身生长缓慢等原因，八角莲野生资源几近枯竭，物种濒危， 目前已被列为国家珍稀濒危三级保护植物。因此，通过采用药用植物组织培 养繁殖技术来获得八角莲愈伤组织或无菌苗，既可缓解八角莲的资源压力， 也可以为工业生产提供可利用的无菌材料。
药用植物组织培养的最大优点在于短期内能用较少的材料繁殖大量优质 种苗，具有用材少、周期短、速度快和不受季节限制等特点。因此，利用组 织培养技术快速育苗已成为许多药用植物商品化育苗的重要途径。
有关八角莲的组培快繁技术的研究报道较少，其主要问题是八角莲的组 织培养过程中易产生严重的细菌污染，污染率达100％；同时，由于八角莲含 有大量的酚类物质，非常容易产生褐变现象；切割后的茎、叶组织从表面向 培养基释放褐色物质，此时培养基逐渐变成褐色，外植体也逐渐变褐而死亡， 不能存活。
褐变是植物组织培养过程中经常遇到的问题，如解决方法不当，往往会 导致细胞死亡。关于褐变机理的研究表明，植物细胞中含有较多的酚类化合 物，可在多酚氧化酶的作用下转变为醌类物质，在外植体受伤部位积累，并 向其它组织和培养基中扩散，破坏正常的代谢过程，使植体生长受到抑制甚 至死亡。近来年的研究表明，多酚氧化酶是一种含铜的蛋白质，其氧化活性 依赖于铜的氧化还原作用。金属螯合剂如EDTA作为抑制剂，可以把Cu2+从 酶中螯合出来，形成稳定的螯合物，使多酚氧化酶失去活性，从而达到抑制 褐变的作用。
因此，为了建立高效的八角莲组培快繁技术体系，首要解决八角莲外植 体的污染和褐变问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说 明的优点。
本发明提供的技术方案为：
一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，包括以下步骤：
(1)选取5年生以上的野生八角莲根茎作为母株，将母株移栽到干净的 河沙基质上进行预培养1个月至长出新的茎和叶；
(2)采取步骤(1)生长健壮、无病虫害的茎段或幼嫩叶片，先放置于 N-长链硫代羧酸型甜菜碱中浸泡5min，再用蒸馏水冲洗1小时，冲洗过程中 用软毛刷洗刷所述外植体表面污垢；
(3)将步骤(2)处理后的外植体利用负离子光触媒处理10-15min，再 用浓度为2.5％的次氯酸钠灭菌4.5min-7min，并用无菌水冲洗3次，每次冲 洗时间为2min，再用无菌滤纸吸干所述外植体表面的水分，将材料切割成1cm ×1cm的方块或1cm长的茎段；
(4)采用浓度为0.1％-1％的重金属络合剂浸泡步骤(3)切好的茎段或 方块1小时；
(5)将步骤(4)处理后的材料接种于MS改良培养基，pH值调节为5.8， 在25℃±1℃的温度下，1.5个大气压的条件下暗培养2周；
(6)将步骤(5)处理后的外植体转到光照强度为1000-2000Lux，光照 时间为10h/d，温度为25℃±1℃的培养条件下培养。
优选地，步骤(1)中所述河沙的湿度为65％-85％。
优选地，步骤(3)中所述负离子光触媒是由TiO2和压电晶体电气石的 纳米级粉体制成的中性液体。
优选地，步骤(3)中利用负离子光触媒处理所述外植体的步骤为将外植 体放置于涂有负离子光触媒的罐体中10-15min，在罐体内通入氮气和臭氧质 量比为10∶1的混合气体，负离子光触媒受外界光线激发而产生大量具有杀菌 作用的氢氧基等离子，从而对外植体进行杀菌处理。
优选地，所述的重金属络合剂为植酸和二乙烯三胺五甲叉膦酸按质量比 1∶3混合的溶液。
优选地，步骤(4)中利用重金属络合剂处理外植体的步骤为将外植体放 置于10-15℃的浓度为0.1％-1％的重金属络合剂中，每15分钟更换一次重 金属络合剂，遮光培养1小时。
优选地，步骤(5)中所述MS改良培养基的成分包括不含有铜离子的 MS培养基、2mg/L水解酪蛋白、2mg/L活性炭、0.02mg/L生物素和0.8mg/L 菸酸。
优选地，步骤(6)中采用红色LED光与蓝色LED光比例为4∶1的混合 光照明。
本发明提供了一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法。本发明的优点 是：
第一、本发明选用五年生以上的八角莲植株，是提供优质外植体、减少 培养过程中褐化现象的基础，相比3年生的八角莲，五年生以上的八角莲植 株的根茎更大，所形成的外植体也更强壮。
第二、本发明选用N-长链硫代羧酸型甜菜碱浸泡，N-长链硫代羧酸型甜 菜碱具有良好的抗菌性，可以抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及部 分真菌的生长繁殖，同时N-长链硫代羧酸型甜菜碱表面活性高，刺激性很低， 湿润性能十分出色，可以有效清除污垢，不会对外植体造成损害，且安全无 残留。
第三、本发明对外植体采用负离子光触媒处理外植体，负离子光触媒在 光的照射下，会产生类似光合作用的光催化反应，产生出氧化能力极强的自 由氢氧基和活性氧，具有很强的光氧化还原功能，可氧化分解各种有机化合 物和部分无机物，能破坏细菌的细胞膜和固化病毒的蛋白质，可杀灭细菌和 分解有机污染物，把有机污染物分解成无污染的水和二氧化碳，具有极强的 杀菌、防污自洁的功能，在常温、常压条件下实现快速、高效地杀菌，不会 损伤外植体，且安全环保。
第四、本发明采用由植酸和二乙烯三胺五甲叉膦酸按质量比1∶3混合的 溶液浸泡外植体，由于植酸中含多个磷酸基团，植酸的络合要比EDTA更广 范和稳定；二氨基乙烷四乙酸钠螯合力比EDTA类、磷酸盐类等都要强，络 合容量高，络合稳定常数大，金属离子等被络合后不容易解离，而且耐化学稳 定性好，无毒且易生物降解，无公害污染。因此通过添加植酸和二氨基乙烷 四乙酸钠，将Cu2+从多酚氧化酶中螯合出来，形成稳定的螯合物，使多酚氧 化酶失去活性，从而达到抑制褐变的作用。
第五、本发明在诱导培养基中添加水解酪蛋白、活性炭、生物素和菸酸， 水解络蛋白是一种有机附加物质，其对八角莲植物细胞的生长发育具有促进 作用，且有助于抑制外植体愈伤组织诱导过程中褐化的形成；活性碳作为一 种吸附剂使用，可吸附微量物质和微小颗粒，对于防止外植体褐化有积极的 作用；生物素是植物生长发育中相当重要的营养物质，它参与植物的多种新 陈代谢活动，有助于培育优质的八角莲幼苗。
第六、本发明中步骤(6)中采用红色LED光与蓝色LED光比例为4∶1 的混合光照明，LED具有体积小、重量轻、固态、寿命长、波长特殊、驱动 电压较低、光效率高、能耗小、安全、可靠耐用、不容易色衰的优点，当红 蓝光比例为4∶1时，八角莲外植体的诱导率最高。
第七、本发明得到的无菌外植体，经过诱导单芽增殖系数达3.5倍以上， 通过进一步扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率达85％以上，移栽基质后 成活率在90％以上。本发明提供的八角莲的组织培养方法能够快速繁殖出大 量适合移栽的优良八角莲种苗，满足生产上的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参 照说明书文字能够据以实施。
实施例1：
一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，包括以下步骤：
(1)选取5年生以上的野生八角莲根茎作为母株，将母株移栽到湿度为 65％的河沙基质上进行预培养1个月至长出新的茎和叶；
(2)采取步骤(1)生长健壮、无病虫害的茎段或幼嫩叶片，先放置于 N-长链硫代羧酸型甜菜碱中浸泡5min，再用蒸馏水冲洗1小时，冲洗过程中 用软毛刷洗刷所述外植体表面污垢；
(3)将步骤(2)处理后的外植体放置于涂有TiO2和压电晶体电气石的 纳米级粉体制成的中性涂层的罐体中10min，并在罐体内通入氮气和臭氧质 量比为10∶1的混合气体，再用浓度为2.5％的次氯酸钠灭菌4.5min，并用无菌 水冲洗3次，每次冲洗时间为2min，再用无菌滤纸吸干所述外植体表面的水 分，将材料切割成1cm×1cm的方块或1cm长的茎段；
(4)将外植体放置于10-15℃的浓度为0.1％的重金属络合剂中，每15 分钟更换一次重金属络合剂，遮光培养1小时，所述重金属络合剂为植酸和 二乙烯三胺五甲叉膦酸按质量比1∶3混合的溶液；
(5)将步骤(4)处理后的材料接种于MS改良培养基，pH值调节为5.8， 在25℃±1℃的温度下，1.5个大气压的条件下暗培养2周；所述MS改良培 养基的成分包括不含有铜离子的MS培养基、2mg/L水解酪蛋白、2mg/L活 性炭、0.02mg/L生物素和0.8mg/L菸酸。
(6)将步骤(5)处理后的外植体由红色LED光与蓝色LED光比例为 4∶1的混合光照明，光照强度为1000Lux，光照时间为10h/d，温度为25℃±1℃ 的培养条件下培养，褐变率0.8％。
实施例2：
一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，包括以下步骤：
(1)选取5年生以上的野生八角莲根茎作为母株，将母株移栽到湿度为 85％的河沙基质上进行预培养1个月至长出新的茎和叶；
(2)采取步骤(1)生长健壮、无病虫害的茎段或幼嫩叶片，先放置于 N-长链硫代羧酸型甜菜碱中浸泡5min，再用蒸馏水冲洗1小时，冲洗过程中 用软毛刷洗刷所述外植体表面污垢；
(3)将步骤(2)处理后的外植体放置于涂有TiO2和压电晶体电气石的 纳米级粉体制成的中性涂层的罐体中15min，并在罐体内通入氮气和臭氧质 量比为10∶1的混合气体，再用浓度为2.5％的次氯酸钠灭菌7min，并用无菌 水冲洗3次，每次冲洗时间为2min，再用无菌滤纸吸干所述外植体表面的水 分，将材料切割成1cm×1cm的方块或1cm长的茎段；
(4)将外植体放置于10-15℃的浓度为1％的重金属络合剂中，每15分 钟更换一次重金属络合剂，遮光培养1小时，所述重金属络合剂为植酸和二 乙烯三胺五甲叉膦酸按质量比1∶3混合的溶液；
(5)将步骤(4)处理后的材料接种于MS改良培养基，pH值调节为5.8， 在25℃±1℃的温度下，1.5个大气压的条件下暗培养2周；所述MS改良培 养基的成分包括不含有铜离子的MS培养基、2mg/L水解酪蛋白、2mg/L活 性炭、0.02mg/L生物素和0.8mg/L菸酸。
(6)将步骤(5)处理后的外植体由红色LED光与蓝色LED光比例为 4∶1的混合光照明，光照强度为2000Lux，光照时间为10h/d，温度为25℃±1℃ 的培养条件下培养，褐变率1.3％。
实施例3：
一种抑制八角莲外植体污染和褐变的方法，包括以下步骤：
(1)选取5年生以上的野生八角莲根茎作为母株，将母株移栽到湿度为 75％的河沙基质上进行预培养1个月至长出新的茎和叶；
(2)采取步骤(1)生长健壮、无病虫害的茎段或幼嫩叶片，先放置于 N-长链硫代羧酸型甜菜碱中浸泡5min，再用蒸馏水冲洗1小时，冲洗过程中 用软毛刷洗刷所述外植体表面污垢；
(3)将步骤(2)处理后的外植体放置于涂有TiO2和压电晶体电气石的 纳米级粉体制成的中性涂层的罐体中12min，并在罐体内通入氮气和臭氧质 量比为10∶1的混合气体，再用浓度为2.5％的次氯酸钠灭菌6min，并用无菌 水冲洗3次，每次冲洗时间为2min，再用无菌滤纸吸干所述外植体表面的水 分，将材料切割成1cm×1cm的方块或1cm长的茎段；
(4)将外植体放置于10-15℃的浓度为0.7％的重金属络合剂中，每15 分钟更换一次重金属络合剂，遮光培养1小时，所述重金属络合剂为植酸和 二乙烯三胺五甲叉膦酸按质量比1∶3混合的溶液；
(5)将步骤(4)处理后的材料接种于MS改良培养基，pH值调节为5.8， 在25℃±1℃的温度下，1.5个大气压的条件下暗培养2周；所述MS改良培 养基的成分包括不含有铜离子的MS培养基、2mg/L水解酪蛋白、2mg/L活 性炭、0.02mg/L生物素和0.8mg/L菸酸。
(6)将步骤(5)处理后的外植体由红色LED光与蓝色LED光比例为 4∶1的混合光照明，光照强度为1500Lux，光照时间为10h/d，温度为25℃±1℃ 的培养条件下培养，褐变率1％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方 式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领 域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范 围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实 施例。