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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410840112.8(22)申请日 2014.12.24C07H 19/213(2006.01)C07H 1/06(2006.01)A61K 31/7076(2006.01)A61P 9/00(2006.01)(71)申请人 上海第一生化药业有限公司地址 200240 上海市闵行区剑川路 1317 号申请人 上海紫源制药有限公司(72)发明人 黄臻辉 杨柳青 霍建丽 朱鑫磊丁金国 张志刚(74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283代理人 朱水平 王卫彬(54) 发明名称一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型及其制备方法和应用(5。
2、7) 摘要本发明公开了一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型及其制备方法和应用。该无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型在使用辐射源为Cu-K的粉末X-射线衍射图谱中，在衍射角212.3 0.2、17.6 0.2、21.4 0.2、24.7 0.2、25.3 0.2和 27.8 0.2处有特征峰。本发明的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型纯度高、稳定性好、制备方法简便，而且重现性好，便于工业化推广应用。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页 附图4页(10)申请公布号 CN 104478979 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 1044。
3、78979 A1/1 页21.一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型在使用辐射源为Cu-K的粉末X-射线衍射图谱中，在衍射角2 12.3 0.2 、17.6 0.2、21.4 0.2 、24.7 0.2、25.3 0.2 和27.8 0.2处有特征峰。2.如权利要求 1 所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的粉末X- 射线衍射图谱中，在衍射角 2 5.3 0.2、18.0 0.2、33.2 0.2、35.2 0.2、37.4 0.2、39.2 0.2、43.4 0.2和 50.8 0.2还有次要峰。3.如权利要求1或2所述的无结晶水二丁。
4、酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的粉末X- 射线衍射图谱如图 1 所示。4.如权利要求1或2所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的红外光谱图中，在波数为 2974、1751、1704、1619、1465、1256、1105 和 1022cm-1处有红外吸收特征峰。5.如权利要求 4 所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的红外光谱图如图 2 所示。6.如权利要求1或2所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的差示扫描量热法图谱中，在 120 170有最大吸收峰 。
5、；较佳地，在 149.4有最大吸收峰。7.如权利要求 6 所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，其特征在于，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的差示扫描量热法图谱如图 3 所示。8.如权利要求 1 7 中任一项所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的制备方法，其包括下述步骤 ：将无水二丁酰环磷腺苷钙固体与溶剂混合，加热溶解，活性炭脱色，过滤不溶物，在滤液中加入反溶剂，降温搅拌析晶，即得。9.如权利要求 8 所述的制备方法，其特征在于，所述的溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和氯仿中的一种或多种 ；和 / 或，所述的反溶剂为正己烷、正戊烷、乙醚、异丙醚。
6、、甲基叔丁基醚和甲苯中的一种或多种。10.如权利要求 8 所述的制备方法，其特征在于，所述的溶剂与所述的无水二丁酰环磷腺苷钙固体的体积质量比为 2 10mL/g ；和 / 或，所述的加热溶解的温度为 25 60 ；和 / 或，所述的活性炭与所述的无水二丁酰环磷腺苷钙固体的质量比为 (0.01-0.1) ：1；和 / 或，所述的无水二丁酰环磷腺苷钙固体为无水二丁酰环磷腺苷钙无定形物 ；和 / 或，所述的降温搅拌析晶的温度为 -25 25 ；和 / 或，所述的反溶剂的加入方式为滴加，所述的滴加的速率较佳地为 0.3 2.0mL/min ；和 / 或，所述的降温搅拌析晶的时间为 1 24h。权 利 。
7、要 求 书CN 104478979 A1/8 页3一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型及其制备方法和应用技术领域0001 本发明涉及药物领域，具体涉及一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型及其制备方法和应用。背景技术0002 二丁酰环磷腺苷钙为环磷腺苷 (cAMP) 丁酰化衍生物成钙盐后制得的产品。二磷酸腺苷钙作为蛋白激酶激活剂，可同时激活蛋白激酶A和蛋白激酶C(cAMP仅激活蛋白激酶A)。蛋白激酶是一种别构酶，由两个催化亚基和两个调节亚基组成，催化亚基具有催化蛋白质 ( 或酶 ) 磷酸化作用。故二磷酸腺苷钙可催化人体内最基本的生物化学代谢氧化磷酸化反应和三羧酸循环，使大多数蛋白质和酶类产生活性，激活人。
8、体各种反应，同时产生大量 ATP，改善细胞和能量代谢，从而实现其促进神经再生、转化异常细胞、扩张血管、舒张平滑肌、改善心肌缺血等作用。0003 二丁酰环磷腺苷钙临床上主要用于心绞痛、急性心肌梗死的治疗，亦可用于治疗心肌炎、心源性休克、手术后网膜下出血和银屑病，也可作为辅助抗癌药物用于临床治疗，如白血病等。0004 但是，二丁酰环磷腺苷钙无定型物原料药或其注射制剂在效期内易发生药物降解而产生相关物质，从而增加药物不良反应，如过敏性休克致心衰死亡、胎盘致畸等。经研究发现，其根本原因在于二丁酰环磷腺苷钙的不稳定性缺陷。0005 一个化合物的不同晶型被称作“多晶型变体”或“多晶型物”。多晶型物虽有相同。
9、的化学结构，但它们在堆积排列和几何排列方面的不同会导致药物稳定性、生物利用度等方面的显著差异，从而直接影响药物质量稳定及其疗效。因此，较为稳定的药物晶型对提高效期内药物临床疗效具有极为重要的价值。发明内容0006 本发明所要解决的技术问题即在于克服现有技术中二丁酰环磷腺苷钙无定形物效期内药物质量不稳定的缺陷，提供一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型及其制备方法以及无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物的药物组合物及其制备方法，以及无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用。本发明的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型纯度高、稳定性好、制备方法简便，而且重现性好，便于工业化推广应用。0007 。
10、本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的 ：0008 本发明提供了一种无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型在使用辐射源为Cu-K的粉末X-射线衍射图谱中，在衍射角2 12.3 0.2 、17.6 0.2、21.4 0.2 、24.7 0.2、25.3 0.2 和27.8 0.2处有特征峰。0009 其中较佳地，所述的粉末 X- 射线衍射图谱中，在衍射角 2 5.3 0.2、18.0 0.2 、33.2 0.2 、35.2 0.2 、37.4 0.2 、39.2 0.2 、说 明 书CN 104478979 A2/8 页443.4 0.2和 50.8 0.2还有次要。
11、峰。0010 其中较佳地，衍射角为 2 时的特征峰的相对强度如下表所示 ：0011 0012 0013 本发明中，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的粉末 X- 射线衍射图谱如图 1所示。0014 本发明中，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的红外光谱图中，在波数为2974、1751、1704、1619、1465、1256、1105 和 1022cm-1处有红外吸收特征峰 ；较佳地，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的红外光谱图如图 2 所示。0015 本发明中，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的差示扫描量热法图谱 (DSC)中，在120170有最大吸收峰 ；较佳地，在149.4有最大吸收峰。
12、 ；更佳地，所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的差示扫描量热法图谱如图 3 所示。0016 本发明还提供了所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的制备方法，其包括下述步骤 ：将无水二丁酰环磷腺苷钙固体与溶剂混合，加热溶解，活性炭脱色，过滤不溶物，在滤液中加入反溶剂，降温搅拌析晶，即得。0017 其中，所述的溶剂较佳地为甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和氯仿中的一种或多种。0018 其中，所述的反溶剂较佳地为正己烷、正戊烷、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚和甲苯中的一种或多种。0019 其中，所述的溶剂与所述的无水二丁酰环磷腺苷钙固体的体积质量较佳的比为2 1。
13、0mL/g。说 明 书CN 104478979 A3/8 页50020 其中，所述的加热溶解的温度较佳的为 25 60。0021 其中，所述的活性炭与所述的无水二丁酰环磷腺苷钙固体的质量比较佳的为(0.01-0.1) ：1。0022 本发明中，所述的无水二丁酰环磷腺苷钙固体较佳地为无水二丁酰环磷腺苷钙无定形物。0023 其中，所述的降温搅拌析晶的温度较佳地为 -25 25。0024 其中，所述的反溶剂的加入方式较佳地为滴加，所述的滴加的速率较佳地为0.3 2.0mL/min。0025 其中，所述的降温搅拌析晶的时间较佳地为 1 24h。0026 本发明又提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包。
14、含有如上所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型和药学上可接受的载体。0027 本发明还又提供了一种如上所述的药物组合物的制备方法，其包括下述步骤 ：将如上所述的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型和药学上可接受的载体混合，即可。0028 本发明再提供了上述无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型在制备治疗人类心脑血管疾病药物中的应用。0029 本发明中 ：术语“XRPD”是指粉末 X- 射线衍射 ；0030 术语“IR”是指红外光谱法 ；0031 术语“DSC”是指差示扫描量热法 ；0032 术语“HPLC”是指高效液相色谱法 ；0033 术 语“1HNMR”是指核磁共振氢谱 ；0034 术语“MS”是指质谱法 ；0。
15、035 术语“反溶剂”是指能与溶剂混溶而不能溶解溶质的溶剂。0036 本发明提供的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物，通过 XRPD 图谱、IR 图谱和 DSC图谱来测定。0037 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。0038 本发明所用试剂和原料均市售可得。0039 本发明的积极进步效果在于 ：0040 (1) 本发明的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型纯度高、稳定性好、制备方法简便，而且重现性好，便于工业化推广应用。0041 (2) 本发明对无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的数据采集、分析实验研究，有助于开发对水、光、热稳定的药物晶型，这有利于解决本领域长期以来存。
16、在的该药物效期内 ( 原料药或注射制剂 ) 储存期间有关物质增加的技术难题，有利于二丁酰环磷腺苷钙产品质量、临床疗效的提升。附图说明0042 图 1 为本发明制备得到的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的粉末 X- 射线衍射图谱。0043 图 2 为本发明制备得到的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的红外光谱图 (IR)。说 明 书CN 104478979 A4/8 页60044 图 3 为本发明制备得到的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型的差示扫描量热法图(DSC)。0045 图 4 为无水二丁酰环磷腺苷钙固体的粉末 X- 射线衍射图 (XRPD)。具体实施方式0046 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，。
17、但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。0047 本发明提供的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型，通过 XRPD 图谱、IR 图谱和 DSC 图谱来测定。0048 (1) 粉末 X- 射线衍射法0049 粉末 X- 射线衍射使用德国 BRUKER-AXS 公司的 D8ADVANCE X- 射线粉末衍射仪，测试条件为 ：0050 Cu 靶，K 光源 工作电压 40KV，工作电流 40mA，步长 0.02，扫描速度 0.3 秒 / 步，扫描角度 1.5 60.0。0051 (2) 核磁共振氢谱检测方法0052 核磁共振。
18、氢谱检测方法使用 Bruker 公司 Avance 400MHz，测试方法 ：将 5mg 二丁酰环磷腺苷钙原料药或晶型物放入核磁管中用氘水溶解，扫描得到核磁共振氢谱。0053 (3) 质谱检测方法0054 质谱检测方法采用美国 Waters 公司 ACQUITYTM UPLC&Q-TOF MS Premier，测试方法：0055 色谱柱为 Waters Acquity BEH C18 色谱柱 (2.1100mm，1.7m)，串联质谱离子源为电喷雾离子源 (ESI)，正离子扫描模式检测，毛细管电压为 3.0kV，离子源温度为100，雾化气温度为 350，雾化气流量为 600.0Lhr-1，碰撞电。
19、压分别为 4.0eV(MS) 和15.0 30.0eV(MS/MS)，扫描范围 m/z100 1000。0056 (4)HPLC 检测方法0057 HPLC 检测方法采用美国 Waters 2695 高效液相色谱仪，自动进样器，Waters 2489型 UV/Vis 检测器，Empower 2 数据处理系统。色谱条件 ：0058 色谱柱 ：Diamonsil C18色谱柱(4.6250mm，5m) ；流动相A为50mM甲酸胺(甲酸调节pH至3.0)-乙腈(9010)，流动相B为乙腈 ；梯度洗脱条件 ：05min时B从0到15，5 10min 时 B 从 15到 22，10 11min 时 B 。
20、从 22到 25，11 12min 时 B 从25到 30，12 13min 时 B 从 30到 90，13 16min 时 B 为 90 ；流速 ：1mlmin-1；柱温 ：30；检测波长 ：273nm ；进样量 ：20L。此条件下二丁酰环磷酰苷钙主峰的保留时间为 11.5min 左右。以下实施例均按此法检测 HPLC 纯度。0059 下述实施例中的无水二丁酰环磷腺苷钙固体、DBC-Ca2.3H2O 晶体 ( 二丁酰环磷腺苷钙合 2.3 水 ) 购于上海第一生化药业有限公司。0060 实施例 1 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物制备0061 称取无水二丁酰环磷腺苷钙固体10g，加入甲醇40ml。
21、，加热搅拌溶解，加入0.3g活性炭脱色，搅拌 15min，滤除不溶物，得到滤液。在滤液中缓慢滴加入 100mL 乙醚，滴加 2h，说 明 书CN 104478979 A5/8 页7保持室温，搅拌析晶 8h，析出白色固体，固体经过滤，干燥，得到无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物。HPLC 纯度 95.4。收率为 88。0062 实施例 2 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物制备0063 称取无水二丁酰环磷腺苷钙固体10g，加入甲醇40ml，加热搅拌溶解，加入0.5g活性炭脱色，搅拌 15min，滤除不溶物，得到滤液。在滤液中缓慢滴加入 120mL 甲苯，滴加 2h，保持 5-10，搅拌析晶 5h，析出白。
22、色固体，固体经过滤，干燥，得到无结晶水二丁酰环磷腺苷钙结晶。HPLC 纯度 95.2。收率为 900064 实施例 3 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物制备0065 称取无水二丁酰环磷腺苷钙固体 10g，加入甲醇 40ml、丙酮 10mL，加热搅拌溶解，加入 0.3g 活性炭脱色，搅拌 30min，滤除不溶物，得到滤液。在滤液中缓慢滴加入 130mL 甲基叔丁基醚，滴加 3h，保持 0-5，搅拌析晶 5h，析出白色固体，固体经过滤，干燥，得到无结晶水二丁酰环磷腺苷钙结晶。HPLC 纯度 96.2。收率为 89。0066 实施例 4 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物制备0067 称取无水二丁酰环磷腺。
23、苷钙固体10g，加入乙醇35ml，加热搅拌溶解，加入0.5g活性炭脱色，搅拌 15min，滤除不溶物，得到滤液。滤液中缓慢滴加入 130mL 甲基叔丁基醚，滴加 3h，保持 0-5，搅拌析晶 5h，析出白色固体，固体经过滤，干燥，得到无结晶水二丁酰环磷腺苷钙结晶。HPLC 纯度 95.8。收率为 93。0068 实施例 5 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物制备0069 称取无水二丁酰环磷腺苷钙固体 10g，加入乙醇 35ml 加热搅拌溶解，加入 0.5g 活性炭脱色，搅拌30min，滤除不溶物，得到滤液。在滤液中缓慢滴加入120mL正己烷，滴加3h，保持 0-5，搅拌析晶 8h，析出白色固体，固。
24、体经过滤，干燥，得到无结晶水二丁酰环磷腺苷钙结晶。HPLC 纯度 95.2。收率为 90。0070 实施例 6 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物制备0071 称取无水二丁酰环磷腺苷钙固体 10g，加入异丙醇 60ml 加热搅拌溶解，加入 0.5g活性炭脱色，搅拌 15min，滤除不溶物，得到滤液。在滤液中缓慢滴加入 120mL 正己烷，滴加2h，保持 5-10，搅拌析晶 8h，析出白色固体，固体经过滤，干燥，得到无结晶水二丁酰环磷腺苷钙结晶。HPLC 纯度 95.3。收率为 89。0072 实施例 7 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物 X- 射线粉末衍射检测0073 粉末 X- 射线衍射使用德国 。
25、BRUKER-AXS 公司 D8ADVANCE 粉末 X- 射线衍射仪，测试条件为 ：Cu 靶，KI 光源 工作电压 40KV，工作电流 40mA，步长 0.02，扫描速度 0.3 秒 / 步。扫描角度 1.5 60.0。实施例 1 6 制得的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物的粉末 X- 射线衍射图谱如图 1 所示，其中，各特征峰的衍射角 2 值、晶面间距以及特征峰的相对强度的参数如下表所示 ：0074 说 明 书CN 104478979 A6/8 页80075 0076 实施例 8 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物红外光谱检测0077 德国 Bruker 公司 EQUINOX 55 红外光谱仪，。
26、测试方法 ：0078 本发明提供的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙结晶用KBr压片并从400至4000cm-1扫描测得的IR图谱，如图2所示，该红外谱图的特征峰位置位于2974、1751、1704、1619、1465、1256、1105、1022cm-1。0079 实施例 9 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物差示扫描量热法检测0080 德国 Netzsch 公司 DSC 204F1 差示扫描量热仪，工作条件为 ：0081 参比物为 Al 锅 (pan Al)，氛围为 N2，温度基准物为金属铟，升温速率为 10K/min，升温范围 0-300。0082 结果显示，该无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物中不含有结。
27、晶水。0083 DSC谱图见图3，其在120-170有最大吸热吸收峰峰值，尤其在149.4有最大吸收峰，熔融焓约为 26.97J/g。0084 实施例 10 无水二丁酰环磷腺苷钙固体 X- 射线粉末衍射检测0085 测试条件同实施例7，其X-射线粉末衍射检测图谱如图4所示，结果显示基本为无定形物。0086 实施例 11 无水二丁酰环磷腺苷钙固体的核磁共振氢谱 (1HNMR)0087 核磁共振氢谱检测方法使用 Bruker 公司 Avance 400MHz，测试方法 ：为将5mg无水二丁酰环磷腺苷钙固体原料药放入核磁管中用氘水溶解，扫描得到核磁共振氢谱。其结果数据为1HNMR(400MHz,D2。
28、O): 8.58(s,1H) ；8.37(s,1H) ；6.29(s,1H) ；5.64-5.61(d,1H) ；5.12-5.06(m,1H) ；4.46-4.37(m,1H) ；4.28-4.20(m,2H) ；2.51-2.40(m,4H) ；1.69-1.53(m,4H) ；0.93-0.88(t,3H) ；0.87-0.83(t,3H)。说 明 书CN 104478979 A7/8 页90088 实施例 12 无水二丁酰环磷腺苷钙固体的质谱图 (MS)0089 质谱检测方法采用美国 Waters 公司 ACQUITYTM UPLC&Q-TOF MS Premier，测试方法：0090。
29、 色谱柱为 Waters Acquity BEH C18 色谱柱 (2.1100mm，1.7m)，串联质谱离子源为电喷雾离子源 (ESI)，正离子扫描模式检测，毛细管电压为 3.0kV，离子源温度为100，雾化气温度为 350，雾化气流量为 600.0Lhr-1，碰撞电压分别为 4.0eV(MS) 和15.0 30.0eV(MS/MS)，扫描范围 m/z100 1000。其检测得到分子离子峰 m/z 为 469.4。0091 实施例 13 加速试验及室温长期留样稳定性考察0092 1、加速试验 ：将按实施例 制得的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物以及无水二丁酰环磷腺苷钙固体、DBC-Ca2.3H。
30、2O 晶体 ( 二丁酰环磷腺苷钙合 2.3 水 ) 共 5 个批次样品按原料药包装 ( 用药用低密度聚乙烯袋包装 )，置于 30、相对湿度为 755的恒温恒湿培养箱中，放置 6 个月，在试验的第 1、2、3、6 个月分别取样检测有关物质 (HPLC 检测方法检测 )、含量，并与 0 月的结果进行比较，结果见表 1。0093 表 1 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物和无水固体粉末的湿热加速试验结果0094 0095 0096 2、长期留样稳定性试验 ：将按实施例 1 制得的无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物以及无水二丁酰环磷腺苷钙固体、DBC-Ca2.3H2O 晶体 ( 二丁酰环磷腺苷钙合 2.3 水 ) 共 5个批次样品按原料药包装 ( 用药用低密度聚乙烯袋包装 )，置于 16、相对湿度为 605说 明 书CN 104478979 A8/8 页10的恒温恒湿培养箱中，放置 12 个月，在试验的第 3、6912 个月分别取样检测有关物质(HPLC 检测方法检测 )、含量，并与 0 月的结果进行比较，结果见表 2。0097 表 2. 无结晶水二丁酰环磷腺苷钙晶型物和无水固体粉末的长期稳定性试验结果0098 0099 说 明 书CN 104478979 A。