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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410771714.2(22)申请日 2014.12.16A01H 4/00(2006.01)(71)申请人 四川省自然资源科学研究院地址 610015 四川省成都市武侯区一环路南2段24号申请人 峨眉山生物资源实验站(72)发明人 鲁松 熊铁一(74)专利代理机构 北京国林贸知识产权代理有限公司 11001代理人 李桂玲 许文娟(54) 发明名称峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法(57) 摘要本发明公开了一种可利用峨眉金线莲种子快速繁育种苗的方法，全过程不使用激素，以分布于四川峨眉山地区的野生或人工种植开花后受粉 5个月成熟未。
2、开裂金线莲果实为材料，通过种子原球茎完整植株炼苗移栽的途径高效快速地繁育种苗。整个过程使用无激素的培养基，一颗成熟果实通过 10-12 个月左右的组织培养，可快繁培育出 5000 株以上的优质种苗，经炼苗移栽温室大棚培养成活率可达 95% 以上。本发明方法可以保持峨眉金线莲的优良性状，保持其优良的药性，且方法简单、成本低，可以实现工厂化育苗，而且不使用激素，保证了种苗的安全性，对极度濒危的珍稀药用植物资源的再生和可持续利用及种质资源的保护都具有重要的意义。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页(10)申请公布号 CN 10442。
3、9965 A(43)申请公布日 2015.03.25CN 104429965 A1/1 页21.峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a、选取开花后受粉成熟但未开裂的金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理 ；b、种胚萌发及原球茎分化 ：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到种胚萌发及原球茎分化培养基上，暗培养 10 20 天，而后按照光照 8h/d 10h/d 12h/d 14h/d梯度增加光照时间培养，各级培养 25 30 天，种子萌发形成原球茎并分化形成带 2 片叶长2-3cm 的完整芽苗植株 ；c、壮。
4、苗及生根培养 ；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗 ；d、炼苗及移栽温室大棚培养 ：经生根培养的完整大苗经逐步炼苗后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后移栽温室大棚培养，移栽后保持温室大棚温度22-32，湿度 65 75%，成活率可达 95% 以上。2.根据权利要求 1 所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述步骤 b 中种胚萌发及原球茎分化培养基为 ：MS 培养基香蕉汁 100g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 。
5、8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2。3.根据权利要求 1 所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述步骤 c 中壮苗及生根培养基为 ：改良 MS 培养基马铃薯汁 200g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2。4.根据权利要求 1 至 3 中任一项所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述步骤 a 所述消毒处理是指将外植体材料用自来水冲洗 2 3 小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75% 酒精浸泡 45s-60s，无菌水清洗干净，再用0.1。
6、% 的升汞溶液进行表面消毒 15min，无菌水清洗 4-5 次，每次 2 分钟，最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。5.根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述步骤 d 移栽温室大棚培养是指生根壮苗培养后，炼苗 2-3 周左右，组培苗长至 6 7cm 高时移栽至温室大棚，移栽用介质为腐殖土加少量珍珠岩的混合物，移栽前用800-1000 倍多菌灵或百菌清加生根粉 50mg/kg 浸根 15-20min。6.根据权利要求 5 所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述腐殖土与珍珠岩的重量份数比为 34:1。7.根据权利要求 1 至。
7、 4 中任一项所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述步骤 d 所述温室大棚采用双层遮荫网遮光，外层是一层固定的 50% 遮荫网，内层为可活动的遮荫网，便于调节光照强度，移栽2周内需遮光80-90%，之后需遮光60%，温室大棚中温度控制在 20 26，相对湿度控制在 65 75%。8.根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于 ：所述步骤 a 中所述金线莲是指生长在峨眉山地区的野生或人工种植开花后受粉 5个月成熟峨眉金线莲未开裂蒴果。权 利 要 求 书CN 104429965 A1/5 页3峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法技。
8、术领域0001 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用峨眉金线莲成熟蒴果无激素快速繁育有机种苗的方法。背景技术0002 峨眉金线莲( Anoectochilus emeiensis K. Y. Lang.)是兰科(Orchidaceae)、开唇兰属 ( Anoectochilus) 多年生草本植物，同花叶开唇兰、台湾、福建、广东、广西金线莲等统称为金线莲。在民间常作药用，其氨基酸组成、成分、含量及维生素、多糖等含量均高于西洋参和野山参。其性平味甘，具有清热、凉血、祛风利湿、强心利尿、固肾平肝以及降血压等功效，在治疗肝病、高血压、糖尿病及肿瘤等方面有良好的效果。另外，金线莲也是观赏价值。
9、极高的观赏植物。但是，由于金线莲属植物的种子微小，不具胚乳，无发芽能力，只有与真菌共生的情况下才能萌发，因此，发芽率低，野外生长条件苛刻，自然繁殖和生长缓慢。另外由于峨眉金线莲的生境地破坏严重，野生峨眉金线莲资源非常稀少，现已濒临灭绝。0003 目前已有的研究主要集中在台湾、福建、广东及广西金线莲中，多以茎段为外植体材料进行繁殖，未见有利用峨眉金线莲蒴果快繁育苗的报道。而且所用培养基多含激素，会造成激素富集到金线莲种苗中，产品质量达不到有机产品的标准，为此开展峨眉金线莲种子无激素人工快速培养的研究，建立一套种苗的组织培养快繁体系，对合理保护开发峨眉金线莲种质资源并产业化、规模化生产有机种苗有着。
10、十分重要的意义。发明内容0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用峨眉金线莲成熟未开裂果实及无激素培养基快速繁育种苗的方法，本方法不仅可以进行规模化生产有机种苗，而且也能有效保护野生资源。0005 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ：一种峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，所述方法包括如下步骤 ：a、选取开花后受粉成熟但未开裂的金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理 ；b、种胚萌发及原球茎分化 ：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到种胚萌发及原球茎分化培养基上，暗培养 10 20 天，而后按照光照 8h/d 10h/d 12h。
11、/d 14h/d梯度增加光照时间培养，各级培养 25 30 天，种子萌发形成原球茎并分化形成带 2 片叶长2-3cm 的完整芽苗植株 ；c、壮苗及生根培养 ；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗 ；d、炼苗及移栽温室大棚培养 ：经生根培养的完整大苗经逐步炼苗后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后移栽温室大棚培养，移栽后保持温室大棚温度说 明 书CN 104429965 A2/5 页422-32，湿度 65 75%，成活率可达 95% 以上。0。
12、006 进一步的，所述步骤 b 中种胚萌发及原球茎分化培养基为 ：MS 培养基香蕉汁100g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2。0007 进一步的，所述步骤 c 中壮苗及生根培养基为 ：改良 MS 培养基马铃薯汁 200g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2。所述改良 MS 培养基是在 MS 培养基基础上，大量元素减半，微量元素及有机母液等不变。0008 进一步的，所述步骤 a 所述消毒处理是指将外植体材料用自来水冲洗 2 3 小时，然后用软毛刷清洗，用。
13、蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75% 酒精浸泡 45s-60s，无菌水清洗干净，再用0.1%的升汞溶液进行表面消毒15min，无菌水清洗4-5次，每次2分钟，最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。0009 进一步的，所述步骤 d 移栽温室大棚培养是指生根壮苗培养后，炼苗 2-3 周左右，组培苗长至67cm高时移栽至温室大棚，移栽用介质为腐殖土加少量珍珠岩的混合物，移栽前用 800-1000 倍多菌灵或百菌清加生根粉 50mg/kg 浸根 15-20min。所述炼苗是将组培瓶置于温室大棚 1-2 周，然后松盖 2-3 天，部分开盖 2-3 天，完全去盖。所述腐殖土与珍珠岩的重量份数比为 34:1。001。
14、0 进一步的，所述步骤 d 所述温室大棚采用双层遮荫网遮光，外层是一层固定的 50%遮荫网，内层为可活动的遮荫网，便于调节光照强度，移栽 2 周内需遮光 80-90%，之后需遮光 60%，温室大棚中温度控制在 20 26，相对湿度控制在 65 75%。0011 进一步的，所述步骤 a 中所述金线莲是指生长在峨眉山地区的野生或人工种植开花后受粉 5 个月成熟峨眉金线莲未开裂蒴果。0012 本发明相比现有技术的有益效果是 ：本发明是以峨眉金线莲成熟未开裂果实为外植体，通过种子原球茎完整植株炼苗移栽的途径高效快速地繁育种苗。整个过程使用无激素的培养基，一颗成熟果实通过10-12 个月左右的组织培养，。
15、仅通过原球茎转接一次无需再次继代培养直接分化成完整的植株，可快繁培育出 5000 株以上的优质种苗，经炼苗移栽温室大棚培养成活率可达 95% 以上。0013 本发明方法可以保持峨眉金线莲的优良性状，保持其优良的药性，且方法简单、成本低，可以实现工厂化育苗，而且不使用激素，保证生产出的种苗不会残留超标，能为生产金线莲有机产品提供优质种苗，另外对极度濒危的珍稀药用植物资源的再生和可持续利用及种质资源的保护都具有重要的意义。具体实施方式0014 实施例一本发明具体可以按照以下方式实施，峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，包括如下步骤 ：a、选取 9 10 月份野生或人工种植开花后受粉 5 个月成。
16、熟未开裂金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理 ：用自来水冲洗 2 3 小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75% 酒精浸泡45s-60s，无菌水清洗干净，再用 0.1% 的升汞溶液中表面消毒 15min，无菌水清洗 4-5 次，每说 明 书CN 104429965 A3/5 页5次 2 分钟最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。0015 b、种胚萌发及原球茎分化 ：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到萌发及分化培养基上，先暗培养 15 天，光照 8h/d 10h/d 12h/d 14h/d 梯度增加光照时间培养，光照强度为 2。
17、000lux，培养温度为 22 25，各级培养 30 天，种子萌发形成原球茎并分化形成带 2 片叶长 2-3cm 的完整芽苗植株 ；所述萌发及分化培养基为 ：MS 培养基香蕉汁 100g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2 ；c、壮苗及生根培养 ；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗 ；所述壮苗及生根培养基为 ：改良 MS 培养基 ( 大量元素减半，微量元素及有机母液等不变 ) 马铃薯汁 2。
18、00g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2 ；d、炼苗及移栽温室大棚培养 ：经生根培养的健壮大苗经逐步炼苗 ( 将组培瓶置于温室大棚1-2周，然后松盖2-3天，部分开盖2-3天，完全去盖)，然后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后种植，移栽用介质为腐殖土土加少量珍珠岩的混合物，移栽后保持温室大棚温度 22-26，湿度 75% 左右，成活率可达 95% 以上。所述腐殖土与珍珠岩的重量份数比为 3:1。0016 本发明所述的 MS 培养基即为常规的 MS 培养基或常规方法配制的 MS 培养基。改良 MS 培养基。
19、 ：大量无机盐为 MS 培养基的一半，微量元素及有机母液等不变。本领域技术人员可以理解的是，本发明步骤 b、c 和 d 采用的培养基都是通过基础培养基（MS 培养基或改良 MS 培养基）配加蔗糖、琼脂、活性炭等配制得到，上述各物质的含量都是配制完成后各物质质量所占总体积的含量。其中，琼脂是以藻类的石花菜属 (Gelidium) 及江蓠属(Gracilaria) 制成的胶产品，为培养基的固化剂。0017 下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例之中。0018 实施例二本实施例选用的材料是峨眉金线莲野生成熟未开裂果实，采自四川峨眉山。按以下步骤繁。
20、殖 ：1、选取9月下旬及10月中旬野生成熟未开裂金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部丝状种胚颜色为金黄色或深黄色的果实进行消毒处理 ：用自来水冲洗 2 3 小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75% 酒精浸泡 45s-60s，无菌水清洗干净，再用0.1% 的升汞溶液中表面消毒 15min，无菌水清洗 4-5 次，每次 2 分钟最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。0019 2、种胚萌发及原球茎分化 ：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到萌发及分化培养基上，先暗培养 15 天，光照 8h/d 10h/d 12h/d 14h/d 梯度增加光照时间培养，光照强度为 2000lux，。
21、培养温度为 22 25，各级培养 30 天，种子萌发形成原球茎并分化形成带 2 片叶长 2-3cm 的完整芽苗植株 ；所述萌发及分化培养基为 ：MS 培养基香蕉汁 100g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2 ；说 明 书CN 104429965 A4/5 页63、壮苗及生根培养 ；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗 ；所述壮苗及生根培养基为 ：改良 MS 培养基 ( 大量元素减半，微量元。
22、素及有机母液等不变 ) 马铃薯汁 200g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2 ；4、炼苗及移栽温室大棚培养 ：经生根培养的健壮大苗经逐步炼苗 ( 将组培瓶置于温室大棚1-2周，然后松盖2-3天，部分开盖2-3天，完全去盖)，然后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后种植，移栽用介质为腐殖土土加少量珍珠岩的混合物，移栽后保持温室大棚温度 22-26，湿度 75% 左右，成活率可达 95% 以上。移栽后每天浇水 3次，浇至培养基质湿透为止 ( 使植株周围湿度 70% 左右 )，每半月施复合肥一次 ( 常见蔬菜专。
23、用肥 ：氮 15%、五氧化二磷 7% 和氧化钾 8%)，并注意防治病虫害。所述腐殖土与珍珠岩的重量份数比为 4:1。0020 实施例三本实施例选用的材料为峨眉金线莲，采自四川峨眉山。按以下步骤繁殖峨眉金线莲。0021 a、选取人工种植开花后受粉 5 个月成熟未开裂得峨眉金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部丝状种胚颜色为金黄色或深黄色的果实进行消毒处理 ：用自来水冲洗23小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75% 酒精浸泡 45s-60s，无菌水清洗干净，再用 0.1% 的升汞溶液中表面消毒 15min，无菌水清洗 4-5 次，每次 2 分钟最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。002。
24、2 b、种胚萌发及原球茎分化 ：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到萌发及分化培养基上，先暗培养 15 天，光照 8h/d 10h/d 12h/d 14h/d 梯度增加光照时间培养，光照强度为 2000lux，培养温度为 22 25，各级培养 30 天，种子萌发形成原球茎并分化形成带 2 片叶长 2-3cm 的完整芽苗植株 ；所述萌发及分化培养基为 ：MS 培养基香蕉汁 100g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2 ；c、壮苗及生根培养 ；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25，光照强度2。
25、000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗 ；所述壮苗及生根培养基为 ：改良 MS 培养基 ( 大量元素减半，微量元素及有机母液等不变 ) 马铃薯汁 200g/L 蔗糖 25 35g/L 琼脂 6 8g/L 活性炭 1.5 2.5g/L，pH 值为 5.8 6.2 ；d、炼苗及移栽温室大棚培养 ：经生根培养的健壮大苗经逐步炼苗 ( 将组培瓶置于温室大棚1-2周，然后松盖2-3天，部分开盖2-3天，完全去盖)，然后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后种植，移栽用介质为腐殖土土加少量珍珠岩的混合物，移栽后保持温室大棚温度 22-。
26、26，湿度 75% 左右，成活率可达 95% 以上。移栽后每天浇水 3次，浇至培养基质湿透为止 ( 使植株周围湿度 70% 左右 )，每半月施复合肥一次 ( 常见蔬菜专用肥 ：氮 15%、五氧化二磷 7% 和氧化钾 8%)，并注意防治病虫害。0023 下面表 1-3 显示实例中不同果实来源及培养基对种子萌发、分化和壮苗等培养的影响。0024 表 1 不同来源种子的萌发率说 明 书CN 104429965 A5/5 页7种子来源 种胚颜色 萌发时间 萌发率 (%)1 9 月下旬 金黄色 25-30 75.22 10 月中旬 深黄色 25-30 76.33 人工授粉 120 天 金黄色 25-30 774 人工授粉 150 天 深黄色 25-30 81.1表 2 不同萌发及分化培养基对种苗生长的影响表 3 不同壮苗及生根培养基对种苗生长的影响说 明 书CN 104429965 A。