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1、10申请公布号CN104293943A43申请公布日20150121CN104293943A21申请号201410527595622申请日20141009C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人武汉艾迪康医学检验所有限公司地址430023湖北省武汉市江汉经济开发区江旺路8号“汉口创业中心爱帝楼”五楼72发明人林筱剑陈奕磊王淑一74专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有限公司33100代理人徐关寿54发明名称检测PPM1D基因多态突变位点的引物和方法57摘要本发明公开了检测癌症患者，特别是检测脑胶质瘤患者的PPM1D基因第6号外显子S421S541段突变的引物和方法，其。
2、包括I扩增PPM1D基因第478位和525位氨基酸序列的引物；采用SANGER测序技术和测序引物。本发明可一次性快速地将癌症患者体内PPM1D基因突变热点的第478位及第525位氨基酸所有的突变类型检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以为放疗和化疗提供参考意见，减少病人的负担。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表1页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表1页附图3页10申请公布号CN104293943ACN104293943A1/1页21检测PPM1D基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括扩增PPM1D基因的引物，其碱基序列为。
3、PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTGPPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG。2如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为检测PPM1D基因的测序引物碱基序列为PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTGPPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG。3如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列PPM1D61F和PPM1D61R是扩增PPM1D基因包含第478位及525位氨基酸序列的引物。4如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列PPM1D61F和PPM1D61R是测序PPM1D基因扩增产。
4、物包含第478位及525位氨基酸序列的引物。5检测PPM1D基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤1）抽提血液或石蜡切片中的组织DNA；2）用PCR扩增步骤1中提取的DNA；3）对步骤2中的扩增产物进行测序；4）对测序结果进行判断，确定PPM1D基因是否发生突变；其中PCR扩增引物为PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTGPPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG。6如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTGPPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG。权利要求书。
5、CN104293943A1/7页3检测PPM1D基因多态突变位点的引物和方法技术领域0001本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测PPM1D基因多态突变热点的引物，采用普通PCR技术和SANGER测序，可用于快速检测癌症患者体内PPM1D基因多态位点的突变情况。背景技术0002PPM1D基因位于人类第17号染色体上，总长66097BP，共有6个外显子。PPM1D基因编码的是一种称为蛋白磷酸酶1DPPM1D的酶类。PPM1D属于PP2C家族，具有丝氨酸/苏氨酸酶活性。PPM1D是DNA损伤应答中的调控因子，对几个重要的细胞周期检查点包括ATM，CHK等有去磷酸化作用。因此PPM1D功能的行。
6、使对环境压力诱导的凋亡起到重要的作用。0003人的PPM1D蛋白主要有两个主要区域N端为高度保守的磷酸酶区，C端为无催化区，但C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位，对蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。有研究报道，PPM1D的6号外显子发生的截断突变具有促进肿瘤细胞生长的功能。这可能是由于6号外显子的突变使PPM1D的C端部分缺失，从而使PPM1D蛋白的磷酸酶功能高活性化，增强对DNA损伤检验蛋白CHK2激活功能的抑制，阻碍癌细胞灭亡。中国每年新增300多万癌症患者，大多数采用放疗和化疗进行治疗，而部分患者对这种治疗方案具有抗性，这可能就与之前报道的PPM1D基因的截断突变相关。当基因发生。
7、这种突变的时候，放疗和化疗不仅没有好的治疗效果，还增加病人的负担。0004目前，发现的PPM1D突变中有功能性增强突变的多发生于PPM1D的C端，本发明中所检测的两个热点突变C478X1434CA和E525X1573GT均为6号外显子上的截断突变，其中478位的突变与乳腺浸润性癌相关，而525位突变更是与多种癌症相关，包括子宫内膜样癌和脑胶质瘤。0005分子检测的样本通常是血液样本或用石蜡包埋的病理组织样本。由于石蜡中的组织经过甲醛固定、酒精脱水等步骤后，组织中的DNA会出现不同程度的断裂、降解，并且断裂和降解又是随机的。因此针对石蜡包埋样本的检测时，引物的设计就比较重要，它会影响石蜡组织中D。
8、NA的扩增效果。0006目前检测PPM1D基因突变的方法是提取样本中的RNA，将其逆转录为CDNA后测序。采用该检测方法需进行逆转录，无法实现石蜡包埋样本中的基因扩增。发明内容0007本发明的目的是提供一种检测PPM1D基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测癌症患者体内PPM1D基因多态位点的突变情况。所述检测PPM1D基因多态热点突变情况的引物，包括0008扩增PPM1D基因的引物，其碱基序列为0009PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG说明书CN104293943A2/7页40010PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG001。
9、1进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为0012检测PPM1D基因的测序引物碱基序列为0013PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG0014PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG0015进一步地，引物序列IPPM1D61F和PPM1D61R是扩增PPM1D基因包含第478位及525位氨基酸序列的引物。0016本发明还提供了检测PPM1D基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤00171抽提血液/石蜡切片中的组织DNA；00182用PCR扩增步骤1中提取的DNA；00193对步骤2中的扩增产物进行测序；00204对测序结果进行判断，确定PPM1D基因。
10、是否发生突变；0021其中PCR扩增引物为0022扩增PPM1D基因的引物，其碱基序列为0023PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG0024PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG0025进一步地，测序引物碱基序列为0026检测PPM1D基因的测序引物碱基序列为0027PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG0028PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG0029本发明还提供了一种检测PPM1D基因多态突变位点的试剂盒，包括0030I组织DNA抽提试剂；0031II检测体系PCR扩增反应液；0032III测。
11、序体系试剂；0033其中PCR扩增反应液引物为0034扩增PPM1D基因的引物，其碱基序列为0035PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG0036PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG0037进一步地，测序引物碱基序列为0038PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG0039PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG0040有益效果本发明设计了扩增PPM1D第478位和525位氨基酸序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术。
12、检测患者PPM1D突变热点的方法，可以一次将PPM1D第478位及第525位氨基酸所有的突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计2个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大；相比较测序CDNA的方法，本发明介绍的方法无需进行逆转录。本发明充分考虑了石蜡包埋组织中DNA的断裂问题，设计出的引物其所扩增的片段较短，提高了石蜡包埋样本DNA的扩展率和检出的准确性。因此本发明不仅适用于血液样本的PPM1D基说明书CN104293943A3/7页5因突变的检测，并且可以接受石蜡包埋样本的检测。附图说明0041图1为PPM1D基因在染。
13、色体上定位图0042图2为PPM1D61F/R的电泳图，M为MARKERDL2000，114为送检的石蜡包埋样本114号，如图2所示，引物PPM1D61F/R扩增有效，且条带单一。0043图3样本APPM1D第478位点野生型测序截图。0044图4样本BPPM1D第478位点突变型测序截图。0045图5样本CPPM1D第525位点野生型测序截图。0046图6样本DPPM1D第525位点突变型测序截图。0047图7样本EPPM1D第478位点突变型测序截图。0048图8样本EPPM1D第525位点突变型测序截图。0049图9为PPM1D61F/R的电泳图，M为MARKERDL2000，114为送。
14、检的血液样本114号，如图9所示，引物PPM1D61F/R扩增有效，且条带单一。具体实施方式0050下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的精编分子生物学实验指南第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。0051实施例10052一种检测PPM1D基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对PPM1D突变热点所设计的特异性扩增引物，包括0053扩增PPM1D基因包含第478及525位氨基酸序列的引物，其碱基序列为0054PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTG。
15、0055PPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG0056一种检测PPM1D基因多态突变位点的试剂盒，包括0057I组织DNA抽提试剂；0058II检测体系PCR反应液；0059III测序体系试剂；0060其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。0061检测体系PCR扩增反应液包括2PCRBUFFER；2MMDNTPS；KODFXDNAPOLYMERASE1U/L；PPM1D基因第478及525位氨基酸序列的上、下游引物PPM1D61F10M、PPM1D61R10M。0062测序体系试剂包括测序纯化液EXOI06U，CIP12U、EDTA125MMOL、无。
16、水乙醇、75乙醇、HIDI高度去离子甲酰胺、测序引物检测PPM1D基因第478位及525位氨基酸序列的上、下游引物分别为PPM1D61F32M、PPM1D61R32M,以及BIGDYETERMINATORV31购买自美国APPLIEDBIOSYSTEMS公司。0063送检样本不仅有血液样本，还有为石蜡样本的可能性。本发明设计的引物充分考虑了石蜡样本中DNA的特性，引物所扩增的片段长度为505BP，即能满足血液样本的检测又说明书CN104293943A4/7页6能满足石蜡样本的检测。引物设计时首先将上游引物设在6号外显子编码区前52BP处，是考虑了测序引物后的2030BP检测是不稳定的，这样测序。
17、就可以从6号外显子的编码区开始一直测到突变位点，同样下游引物离525位突变位点大概93BP也是基于这个考虑。0064实施例20065血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒天根生物的操作流程00661抽提血液中的组织DNA1抽取300L血液加入900L红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000RPM离心1MIN，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200L缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2加入20L蛋白酶K溶液，混匀。3加入200L缓冲液GB，充分颠倒混匀，70放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4加入200L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮。
18、状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中吸附柱放入收集管中，12，000RPM离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6向吸附柱CB3中加入500L缓冲液GD使用前请先检查是否已加入无水乙醇，12，000RPM离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7向吸附柱CB3中加入700L漂洗液PW使用前请先检查是否已加入无水乙醇，12，000RPM离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8向吸附柱CB3中加入500L漂洗液PW，12，000RPM离心30秒，倒掉废液。9将吸附柱CB3放回收集管中，12，000RPM离心2分。
19、钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100L洗脱缓冲液TE，室温放置25分钟，12，000RPM离心2分钟，将溶液收集到离心管中。00672抽提石蜡样本中的DNA1用刀片刮去样本表层用于封闭的蜡，切3片510M厚的样本，迅速将其放入15ML离心管中，加1ML二甲苯，盖好管盖，漩涡搅拌10S。室温全速离心2MIN，吸去上清液，弃掉。2加入1ML乙醇96100，漩涡混匀，室温全速离心2MIN。吸取上清液，弃去。打开管盖，在室温1525或37的条件下孵育10MIN或直至残留的乙醇蒸干。3。
20、用180L缓冲液ATL重悬沉淀。加入20L蛋白酶K，漩涡混匀。56孵育1H或至样本完全溶解。90孵育1H。短暂离心去除管壁上的液滴。4加入200L缓冲液AL，漩涡混匀。加入200L乙醇96100，漩涡混匀。5短暂离心去除盖上的液滴，将全部的消化液移入QIAAMPMINELUTE吸附柱中放入2ML收集管中，关上盖子，8000RPM离心1MIN。弃去收集管及管内液体，将QIAAMPMINELUTE吸附柱置于新的收集管中。6小心打开QIAAMPMINELUTE的盖子，加入500L缓冲液AW1，关上盖子，8000RPM离心1MIN。弃去收集管及管内液体，将QIAAMPMINELUTE吸附柱置于新的收集。
21、管中。7全速13200RPM离心3MIN使吸附膜完全干燥。弃去收集管及管内液体。8将QIAAMPMINELUTE放入新的15ML离心管中，小心加入50L缓冲液ATE至滤膜中间。盖上管盖，室温1525静置1MIN。全速13200RPM离心，收集溶液。00683试剂配置按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XL，每人份18L分装0069X18L反应液N份标本1份空白对照0070N为检测标本数。00714加样加入检测体系PCR反应液中2LDNA；空白对照加2L生理盐水或不说明书CN104293943A5/7页7加任何物质。00725扩增检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABIVERITI美国AP。
22、PLIEDBIOSYSTEMS公司等。反应条件如下00730074PCR扩增体系试剂配制方法如下00750076其中，引物序列为0077引物名称引物序列PPM1D61FGCCTAATATCACATGCATAGATTTGPPM1D61RGGCTGAGCACCACTACTTCG00786电泳15琼脂糖凝胶电泳，110V，25MIN，凝胶成像系统观察。0079如图2所示，即为14例石蜡例样本以PPM1D61引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度为505BP，通过电泳图的分析表明本发明所述引物PPM1D61F/R扩增有效，且条带单一。00807SANGER测序0081取9LPCR产物与2L。
23、纯化体系。按照以下程序进行纯化0082说明书CN104293943A6/7页80083将1L纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合00840085测序反应程序00860087沉淀环节0088向完成测序反应的产物中加入2L125MMOL的EDTA，静置5MIN；加入15L无水乙醇，漩涡混匀；3700RPM离心30MIN；倒置离心15SEC，加入50L70乙醇，漩涡混匀；3700RPM离心15MIN；倒置离心15SEC，置于95金属浴上；加入10LHIDI后进行变性试验。变性程序00890090变性程序结束后，上测序仪ABI3730测序。00918结果判断分别将测序结果与PPM1D野生型。
24、参考序列GENBANKACCNNC_00001711进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。0092实施例3说明书CN104293943A7/7页90093取5例石蜡包埋的脑胶质瘤病变临床样本样本编号为AE。按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中2L。其中有一例478位由半胱氨酸突变为终止密码子，另有一例525位谷氨酸突变为终止密码子，另一例是478位和525位均突变的样本。0094样本A的检测结果如图3所示，图3显示是PPM1D478野生型测序截图，说明样本A的478位未发生突变。0095样本B的检测结果如图4所示，图4显示是PPM1。
25、D478突变型测序截图。如图4所见，框内的碱基1434CA，即C478X。说明样本B为478位由半胱氨酸突变为终止密码子。0096样本C的检测结果如图5所示，图5是PPM1D525野生型测序截图。说明样本C的525位未发生突变。0097样本D的检测结果如图6所示，图6是PPM1D525突变型测序截图。如图6所见，框内的碱基1573GT，即E525X。说明样本D为525位谷氨酸突变为终止密码子。0098样本E的检测结果如图7，图8所示。图7是PPM1D478突变型测序截图，框内的碱基1434CA。图8是PPM1D525突变型测序截图，碱基1573GT。说明样本E在478位和525位均发生突变。0。
26、099实施例40100取14例血液样本样本编号为血液样本114，按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中2L。电泳结果如图9所示，表明本发明所述引物PPM1D61F/R对血液样本同样能有效扩增，且条带单一。对这14例样本的测序，分别将测序结果与PPM1D野生型参考序列进行比对测序结果准确，获得测定样本的PPM1D基因类型。说明书CN104293943A1/1页10SEQUENCELISTING武汉艾迪康医学检验所有限公司检测PPM1D基因多态突变位点的引物和方法2PATENTINVERSION33125DNA人工序列1GCCTAATATCACATGCATAGATTTG25220DNA人工序列2GGCTGAGCACCACTACTTCG20序列表CN104293943A101/3页11图1图2图3图4说明书附图CN104293943A112/3页12图5图6图7图8说明书附图CN104293943A123/3页13图9说明书附图CN104293943A13。