一种黄曲霉菌株及其应用.pdf

本发明提供了一种黄曲霉菌株及其应用，具体是在处理含重金属废水中的用途，并提供了培养上述黄曲霉菌株的菌丝球的方法以及使用该黄曲霉菌株处理含有Cu(II)和/或Zn(II)的水的方法，从而为重金属污染微生物修复提供一种很好的基因工程菌资源。这对该菌株在含Cu(II)、Zn(II)及其复合污染的工业废水处理中的作用十分重要，在微生物修复含Cu(II)和Zn(II)的废水和土壤中具有重要的应用潜力。

权利要求书
1.  一种黄曲霉菌株，其属于曲霉属(Aspergillus)黄曲霉(Aspergillus flavus)，其保藏名称为黄曲霉菌株TL-F3，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年9月10日，保藏编号为CGMCC No.8146；优选地，所述菌种的ITS rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  权利要求1所述的黄曲霉菌株，其特征在于：
其在25-37℃，pH值6.0-7.0培养条件下较好的生长，在PDA上生长较快，菌落疏松略带絮状，初带黄色，后变黄绿色，成熟后颜色变暗，反面略带褐色；
显微镜下观察：菌丝无色，有隔，分生孢子梗无横隔，分生孢子头呈疏松放射形，继变为疏松柱状。顶囊烧瓶形或近球形，小梗单层或双层；
分生孢子球形或近球形，粗糙。

3.  权利要求1或2所述的黄曲霉菌株在处理含重金属废水中的用途，其中待处理的水含有Cu(II)和/或Zn(II)。

4.  权利要求3所述的用途，其中所述的Cu(II)的浓度为以Cu(II)计不高于800mg/L，优选地为25～200mg/L，更优选地为50～100mg/L。

5.  权利要求3所述的用途，其中所述的Zn(II)的浓度为以Zn(II)计不高于6000mg/L，优选地为25～200mg/L，更优选地为50～100mg/L。

6.  权利要求3-5中任一项所述的用途，其中所述Cu(II)和Zn(II)的浓度以Cu(II)或Zn(II)计分别为25～200mg/L；
优选地，Cu(II)和Zn(II)的浓度分别为以Cu(II)计25mg/L和以Zn(II)计100mg/L。

7.  一种制备权利要求1或2所述的黄曲霉菌株的菌丝球培养液的方法，其包括步骤：
取孢子浓度为105～108CFU/L的活菌，按照1:99的体积比接入液体培养基中；并且于30℃、转速为130转/分钟条件下震荡培养7天，即可得到菌丝球培养液；
优选地，所述的活菌的孢子浓度为107CFU/L；或者
优选地，所述的液体培养基按照如下的方法来制备：取葡萄糖20g、蛋白胨10g、NaCl 0.2g、CaCl20.1g、KCl 0.1g、K2HPO40.5g、NaHCO30.05g、MgSO40.25g、Fe(SO4)27H2O 0.005g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至5.0；在121℃下灭菌30分钟。

8.  一种处理含有Cu(II)和/或Zn(II)的水的方法，其包括步骤：
1)将含有权利要求1或2所述的黄曲霉菌株的培养液或者按照权利要求7所述的菌丝球培养液添加于待处理的水中；
2)调节所述的水的pH值至2.0～6.0；
3)将所述的水在20～35℃温度下，70～160转/分钟的转速下培养6～9天；
优选地，在步骤2中，将pH调节到4.0-6.0；
优选地，在步骤3中，使用100-160转/分钟的转速；
优选地，在步骤3中，水的温度为30～35℃；
优选地，在步骤1中，培养液的浓度为105-108CFU/L，例如为106-108CFU/L，最优选地为107CFU/L或者108CFU/L；
优选地，在步骤3中，培养时间是7-9天。

9.  权利要求8所述的方法，其中：所述黄曲霉菌株培养液或者菌丝球培养液与水的体积比为1:99。

10.  权利要求8或9所述的方法，其中：
在步骤2)中调节所述的水的pH值至5.0；以及
在步骤3)中将所述的水在30℃下，130转/分钟的转速下培养6-9天；
优选地，在步骤3)中培养时间为7天。

说明书一种黄曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物治理环境污染领域，具体地涉及一种对铜和锌具有高抗性的黄曲霉菌株，该菌株在处理含铜和锌的水中的应用。
背景技术
由于重金属导致的大气、土壤及地表水、地下水的环境污染问题日益突出，使生态环境面临着严峻的考验。我国20个主要城市土壤受Cr、Cu、Pb、Zn、Ni和Cd的污染十分普遍。与传统的物理化学治理方法相比，微生物修复是重金属污染治理最有效且广泛应用的方法之一。由于重金属毒害性限制微生物修复技术广泛应用，而长期生活在重金属污染环境中的抗性微生物在重金属修复中具有很大的应用潜力。因此，选择具有重金属耐性的菌种尤其关键。
目前，由于真菌细胞壁含有丰富多糖，在重金属污染修复技术方面得到广泛关注。已有研究报道表明抗性真菌能有效提高重金属的去除能力，从制革污泥中筛选抗Cr(VI)的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，能有效还原Cr(VI)和富集Cr(III)；抗性黑曲霉(Aspergillus niger)对城市垃圾焚烧飞灰中Cd、Mn、Zn和Pb的溶出率分别为87.4％、64.8％、49.4％和45.9％。因此，筛选一株对重金属具有耐性的霉菌菌株在重金属污染治理中将具有突出的应用潜力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对铜和锌具有高抗性的黄曲霉菌株，从而利用该菌株进行重金属铜和锌污染环境的微生物修复。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下的技术方案。
在本发明的一个方面，提供了一种黄曲霉菌株，其属于曲霉属(Aspergillus)黄曲霉(Aspergillus flavus)，其保藏名称为黄曲霉菌株TL-F3，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(位于：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2013年9月10日，保藏编号为CGMCC No.8146。
在本发明一个优选的方面，上述黄曲霉菌株的ITS rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明一个优选的方面，所述的菌株在25-37℃，pH值6.0-7.0培养条件下较好的生长，在PDA上生长较快，菌落疏松略带絮状，初带黄色，后变黄绿色，成熟后颜色变暗，反面略带褐色；显微镜下观察：菌丝无色，有隔，分生孢子梗无横隔，分生孢子头呈疏松放射形，继变为疏松柱状。顶囊烧瓶形或近球形，小梗单层或双层；分生孢子球形或近球形，粗糙。
在本发明的一个方面，提供了上文所述的黄曲霉菌株在处理水中的用途，其中待处理的水含有Cu(II)和/或Zn(II)。
在本发明一个优选的方面，所述的Cu(II)的浓度为以Cu(II)计不高于800mg/L，优选地为25～200mg/L，更优选地为50～100mg/L。
在本发明一个优选的方面，所述的Zn(II)的浓度为以Zn(II)计不高于6000mg/L，优选地为25～200mg/L，更优选地为50～100mg/L。
在本发明一个优选的方面，所述Cu(II)和Zn(II)的浓度分别为以Cu(II)或Zn(II)计25～200mg/L；优选地Cu(II)和Zn(II)的浓度分别为以Cu(II)计25mg/L和以Zn(II)计100mg/L。
在本发明的另一个方面，提供了一种培养所述的黄曲霉菌株的菌丝球培养液(即菌株培养液)的方法，其包括步骤：取孢子浓度为105～108CFU/L(优选地为107CFU/L)的活菌，按照1:99的体积比接入液体培养基中；于30℃、转速为130转/分钟条件下震荡培养7天，即可得到菌丝球培养液。
在本发明一个优选的方面，所述的液体培养基按照如下的方法来制备：取葡萄糖20g、蛋白胨10g、NaCl 0.2g、CaCl2 0.1g、KCl 0.1g、K2HPO4 0.5g、NaHCO3 0.05g、MgSO4 0.25g、Fe(SO4)2 7H2O 0.005g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至5.0；在121℃下灭菌30分钟。
在本发明的另一个方面，提供了一种处理含有Cu(II)和/或Zn(II)的水的方法，其包括步骤：1)将黄曲霉菌株孢子液加入分别含有50mg/L Cu(II)或Zn(II)前文所述的培养液中；2)调节所述的水的pH值至2.0～6.0；3) 将所述的水在25℃～35℃温度下，70～160转/分钟的转速下培养6～9天(具体见图6-图10)。
在本发明一个优选的方面，在步骤2中，将pH调节到4.0-6.0；
在本发明一个优选的方面，在步骤3中，使用100-160转/分钟的转速；
在本发明一个优选的方面，在步骤3中，水的温度为30～35℃；
在本发明一个优选的方面，在步骤1中，培养液的浓度为105-108CFU/L，例如为106-108CFU/L，最优选地为107CFU/L或者108CFU/L；
在本发明一个优选的方面，在步骤3中，培养时间是7-9天。
在本发明一个优选的方面，所述黄曲霉菌株培养液或者菌丝球培养液与水的体积比为1:99。
在本发明一个优选的方面，在上述的方法中，将所述的水的pH值调节至5.0；将所述的水在30℃下，130转/分钟的转速下培养6-9天，优选为7天。
本发明的技术方案带来了以下的有益技术效果：
1、本发明从污染矿区土壤中筛选对重金属铜和锌具有耐性的真菌菌株，该菌株对Zn(II)和Cu(II)耐受性分别为6000mg/L，800mg/L，对两种金属具有较强的耐性。菌种来源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；为重金属污染微生物修复提供一种很好的基因工程菌资源。
2、筛选的黄曲霉TL-F3对Cu(II)和Zn(II)具有高抗性和去除能力，在25mg/L时，TL-F3菌株对Zn(II)和Cu(II)去除率分别为83.34％、75.57％，在50mg/L的去除率分别为72.13％，60.45％。在Cu(II)+Zn(II)为(25+100)mg/L时，复合污染去除率达到最大，分别为77.65％和86.13％。这对该菌株在含Cu(II)、Zn(II)及其复合污染的工业废水处理中的作用十分重要，在微生物修复含Cu(II)和Zn(II)的废水和土壤中具有重要的应用潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1 黄曲霉菌株TL-F3系统发育树； 
图2 0、50mg/L Zn(II)和Cu(II)浓度溶液培养7d的SEM和TEM图，其中图2a为：A.flavus TL-F3富集前的SEM图；图2b为：A.flavus TL-F3富集Cu(II)后的SEM图；图2c为：A.flavus TL-F3富集Cu(II)后的SEM图；图2d为：A.flavus TL-F3富集前的TEM图；图2e为：A.flavus TL-F3富集Cu(II)后的TEM图；图2f为：A.flavus TL-F3富集Cu(II)后的TEM图；
图3 描述了不同浓度的Zn(II)和Cu(II)对Aspergillus flavus TL-F3生长影响的柱状图；
图4 描述了黄曲霉菌株TL-F3对单一浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图；
图5 描述了黄曲霉菌株TL-F3对复合浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图；
图6 描述了不同pH下黄曲霉菌株TL-F3对单一浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图；
图7 描述了不同转速下黄曲霉菌株TL-F3对单一浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图；
图8 描述了不同温度下黄曲霉菌株TL-F3对单一浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图；
图9 描述了不同孢子液浓度下黄曲霉菌株TL-F3对单一浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图；
图10 描述了不同作用时间黄曲霉菌株TL-F3对单一浓度Zn(II)和Cu(II)的去除率的柱状图。
具体实施方式
以下的实施例仅为说明本发明的实施方案，而不限制本发明的范围。
实施例1：黄曲霉菌株TL-F3的分离
本发明所涉及的黄曲霉菌株TL-F3是按照如下的方法来制备的：
将安徽某矿区铜和锌污染土壤(铜矿冶炼尾砂污染土壤)悬液以10％ 的接种量接种于分别含Zn(II)和Cu(II)的液体培养基中进行梯度压力驯化，于30℃、转速为130转/分钟条件下培养7d后，稀释转接到PDA固体培养基中，30℃恒温培养5-7d，对形成单菌落的菌株，在PDA固体培养中多次纯化得到单菌落的目的菌株。
本实施例中，共分离纯化得到9株菌株，发现其中1株菌株对Zn(II)和Cu(II)抗性最强，生长最为旺盛，本发明中将该菌株命名为TL-F3，进行进一步鉴定。
黄曲霉菌丝球的培养条件：取1mL孢子浓度为107CFU/L的活菌，按照1:99的体积比例接入液体培养基中，于30℃、转速为130转/分钟条件下震荡培养7天，即可得到黄曲霉的菌丝球。
经显微镜检查发现，在以上的培养液中产生形态良好的菌丝球。如无特殊说明，在本发明的其他实施例中使用的黄曲霉菌丝球培养液是按照1:99的体积比将107CFU/L的活菌接种到培养基中得到的菌丝球培养液。
其中，上述液体培养基成分：葡萄糖20g、蛋白胨10g、NaCl 0.2g、CaCl2 0.1g、KCl 0.1g、K2HPO4 0.5g、NaHCO3 0.05g、MgSO4 0.25g、Fe(SO4)2 7H2O 0.005g、使用蒸馏水定容至1000mL；将pH调节至5.0；121℃灭菌30min。
梯度压力驯化法：本实施例中所使用的梯度压力驯化法是指，在液体培养基中分别加入不同浓度的Zn(II)和Cu(II)，并按照本实施例中的黄曲霉菌丝球的培养方法进行培养后，过滤菌体，用去离子蒸馏水清洗处理后，放入温度为60℃的烘箱中烘至恒重，按照重量法称量菌体生长量，从而筛选适用的黄曲霉菌株或者研究给定菌株在不同的金属离子浓度下的生长行为。
其具体步骤如下：
(1)将1mL孢子浓度为107CFU/L黄曲霉TL-F3接入99mL液体培养基中，分别加入不同初始浓度的Zn(II)和Cu(II)，Zn(II)的浓度梯度分别为：50、100、200、300、400、500、600、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000mg/L；Cu(II)的初始浓度梯度分别为：50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L；
(2)于30℃、转速为130转/分钟条件下培养7d，把培养好的菌体过滤，用去离子蒸馏水清洗处理后，放入温度为60℃的烘箱中烘至恒重，按照重量法称量菌体生长量(见图3)从而确定重金属Zn(I I)和Cu(I I)对TL-F3菌株生长的最低抑制浓度分别为6000mg/L(91.8mM/L)和800mg/L(12.6mM/L)。
实施例2：黄曲霉菌株TL-F3的的鉴定
I.微生物生理生化特征
本发明黄曲霉菌株TL-F3可在25-37℃，pH值6.0-7.0培养条件下较好的生长，在PDA上生长较快，菌落疏松略带絮状，初带黄色，后变黄绿色，成熟后颜色变暗，反面略带褐色。显微镜下观察：菌丝无色，有隔，分生孢子梗无横隔，分生孢子头呈疏松放射形，继变为疏松柱状。顶囊烧瓶形或近球形，小梗单层或双层。分生孢子球形或近球形，粗糙。
黄曲霉TL-F3的微生物学特征见表1。
表1黄曲霉TL-F3的形态和理化特征

I I.菌种鉴定
采用真菌通用引物ITS1和ITS4PCR扩增该菌株的ITS rDNA，扩增产物纯化后直接测序，测序结果在国际基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索、比对、分析，并建系统发育树，鉴定TL-F3为黄曲霉，系统进化树见图1，与黄曲霉(Aspergillus flavus)同源性达到99％，命名为Aspergillus flavus TL-F3。
实施例3：Zn(II)和Cu(II)对TL-F3菌株生长的最低抑制浓度测定
随后，按照实施例1中的梯度压力驯化法对黄曲霉菌株TL-F3进行培养，并且称量菌体生长量，从而得到黄曲霉菌株TL-F3的最低抑制浓度。
菌体生长量测试结果如图3所示。
测定结果表明：最低抑菌浓度是Zn(II)和Cu(II)完全抑制TL-F3菌株生长的最低浓度。用重量法测定不同Zn(I I)和Cu(II)浓度中菌体的生长量，测定结果说明，Zn(II)和Cu(II)对TL-F3菌株生长的最低抑制浓度分别为6000mg/L和800mg/L。换言之，在此浓度以下的Zn(II)和Cu(II)离子均可以被本发明的TL-F3菌株所吸附和富集。
实施例4：TL-F3对Zn(II)和Cu(II)胞外表面吸附和胞内富集的作用试验
对比空白和含50mg/L Zn(II)和Cu(II)的液体培养基培养7d后TL-F3的SEM和TEM(扫描和透射电镜)分析(见图2)，结果验证了TL-F3对Zn(II)和Cu(II)胞外表面吸附和胞内富集的作用。
实施例5：使用黄曲霉菌株TL-F3处理含有单一和复合重金属Zn(I I)和Cu(II)的试验
控制投加1mL孢子浓度为107CFU/L黄曲霉TL-F3于99mL液体培养基中，分别加入单一金属和两种重金属，单一浓度范围为：25-200mg/L，复合重金属的处理中Zn(II)和Cu(II)的浓度具体见表2，250mL锥形瓶的装液量为100mL，于pH 5.0、30℃、转速为130转/分钟的条件下培养7d，观测对菌株生长的影响，测定溶液中Zn(II)和Cu(II)浓度的变化，计算菌株对Zn(II)和Cu(II)的去除率，具体结果见图5所示。
结果表明：在25mg/L时，TL-F3菌株对Zn(II)和Cu(II)去除率分别为83.34％、75.57％，在50mg/L的去除率分别为72.13％，60.45％。在Cu(II)+Zn(II)为(25+100)mg/L时，复合污染去除率达到最大，分别为77.65％和86.13％。
表2复合处理中Zn(II)和Cu(II)的浓度表(单位：mg/L)
名称 Zn(II) Cu(II) 名称 Zn(II) Cu(II) 处理1 0 25 处理9 50 100 处理2 0 50 处理10 100 25 处理3 0 100 处理11 100 50 处理4 25 25 处理12 100 100 处理5 25 50 处理13 25 0 处理6 25 100 处理14 50 0 处理7 50 25 处理15 100 0 处理8 50 50      
实施例6：不同条件下黄曲霉菌株TL-F3除去金属离子的性质
发明人试验了不同pH、转速、温度、孢子液浓度和作用时间下，本发明的黄曲霉菌株除去单一浓度的Zn(II)和Cu(II)效率，具体实验结果显示在图6-图10中显示。
其中，除非另外地说明，本实施例的试验按照实施例5中的方法来进行，Zn(II)和Cu(I I)的浓度均分别为50mg/L，并且在改变pH、转速、温度、孢子液浓度和作用时间的试验中，对实施例5的方法进行相应调整。试验的结果见图6-10。
以上结果表明：本表明的黄曲霉可有效应用于重金属铜和锌单一和复合污染废水的生物处理，特别是对锌具有显著的去除效果。