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一种3-羟基丙酸高产菌重组质粒的构建方法属于生物化工生产领域。鉴于现有产3-羟基丙酸工程菌产量大都较低，发现了适用于肺炎克雷伯氏杆菌的高效tac启动子以及能转化3-羟基丙醛为3-羟基丙酸的puuc醛脱氢酶，并以此构建重组工程菌。将该酶编码基因的序列进行分析后，对该基因进行了化学合成。测序验证后将该启动子和酶在肺炎克雷伯氏杆菌中超表达，获得了重组肺炎克雷伯氏杆菌pET(ptac-puuc)，测定其体内及体外对3-羟基丙醛的催化能力。在体外，该酶对3-羟基丙醛的酶活达到26.31U/mg，是原代肺炎克雷伯氏杆菌(3.82U/mg)的6.9倍。在5L发酵罐中培养改造后的工程菌，经培养基成分、IPTG浓度条件优化后，其48h后3-羟基丙酸产量高达73g/L。

1.  一种生产3-羟基丙酸菌株的重组质粒，其特征在于：导入了tac启动子和puuC醛脱氢酶基因。

2.  根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒被导入于肺炎克雷伯氏菌。

3.  一种构建权利要求2所述重组质粒的方法，包括以下步骤：
1)将启动子tac和醛脱氢酶基因puuC插入载体质粒中，构建重组质粒pET(ptac-puuC)；
2)用所构建的重组质粒转化到肺炎克雷伯氏菌中。

4.  根据权利要求3所述方法，其特征在于所述构建重组质粒包括：
1)含有puuC基因的DNA片段的PCR扩增；
2)限制性内切酶切割载体质粒和基因puuC、ptac；
3)将puuC基因和启动子ptac插入所述载体质粒中。

5.  一种生产3-羟基丙酸的方法，是对导入了含有tac启动子和醛脱氢酶基因puuC的pET-28a重组质粒的肺炎克雷伯氏菌进行发酵培养，并自发酵液中获得3-HP。

6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵液为：K₂HPO₄·3H₂O 4-6g/L、KH₂PO₄ 1.5-2.4g/L、(NH₄)₂SO₄ 6.4-9.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g/L、酵母粉3.2-4.8g/L、IPTG浓度为0.015-0.025mM、以及甘油含量维持到30g/L以上。

7.  根据权利要求5或6所述方法，其特征在于：所述发酵培养为流加培养方式，使pH恒定于6.5-7.5之间，通气量保持在1.5vvm，搅拌转速为400rpm。

8.  根据权利要求1所述的重组质粒，具有如NO.1的ptac-puuC基因序列。

一种3-羟基丙酸高产菌重组质粒的构建方法
技术领域
本发明属于生物化工生产领域，涉及一种高产3-羟基丙酸基因工程菌重组质粒的构建方法。
背景技术
3-羟基丙酸(3-HP)在工业应用上有很高的商业价值，但其化学合成方法较为复杂。近年来，随着合成生物学成为生物化工的研究热点，微生物合成法产3-羟基丙酸亟待突破。肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)具有较强的甘油代谢能力，从生物量积累的角度来看很适合作表达宿主。肺炎克雷伯氏杆菌利用甘油生成中间产物3-羟基丙醛，然后3-羟基丙醛被醛脱氢酶催化生成3-羟基丙酸。
在以肺炎克雷伯氏杆菌为宿主菌生产3-羟基丙酸的方法中，工程菌所用的启动子多为来自于dhaB基因自身的pk启动子。该启动子具有启动能力弱，从而使蛋白表达量小等缺点，影响了3-羟基丙酸的产量。因此，寻找出一种适合于肺炎克雷伯氏杆菌的强效启动子和产3-羟基丙酸的醛脱氢酶来构建工程菌成为了高产3-羟基丙酸的突破口。
经过大量筛选，发现tac启动子启动能力强，且适用于肺炎克雷伯氏杆菌。于是，创立了一种构建3-羟基丙酸高产工程菌的方法，在tac启动子后面连接上醛脱氢酶基因puuC，测定了醛脱氢酶puuC的蛋白表达量和体内外酶活性。结果显示，醛脱氢酶在tac启动子的作用下得到了超表达。在此基础上，测定了3-羟基丙酸产量，得到了高产3-羟基丙酸工程菌。
发明内容
鉴于现有产3-羟基丙酸工程菌产量大都较低，本发明旨在创立一种3-羟基丙酸高产工程菌的方法，并确定了该工程菌发酵的最佳培养条件。本发明的技术方案概述如下：
一种生产3-羟基丙酸菌株的重组质粒，其特征在于：导入了tac启动子和 puuC醛脱氢酶基因。
进一步，所述重组质粒被导入于肺炎克雷伯氏菌。
一种构建所述重组质粒的方法，包括以下步骤：
1)将启动子tac和醛脱氢酶基因puuC插入载体质粒中，构建重组质粒pET(ptac-puuC)；
2)用所构建的重组质粒转化到肺炎克雷伯氏菌中。
进一步，其特征在于所述构建重组质粒包括：
1)含有puuC基因的DNA片段的PCR扩增；
2)限制性内切酶切割载体质粒和基因puuC、ptac；
3)将puuC基因和启动子ptac插入所述载体质粒中。
一种生产3-羟基丙酸的方法，是对导入了含有tac启动子和醛脱氢酶基因puuC的pET-28a重组质粒的肺炎克雷伯氏菌进行发酵培养，并自发酵液中获得3-HP。
进一步，所述发酵液为：K₂HPO₄·3H₂O 4-6g/L、KH₂PO₄1.5-2.4g/L、(NH₄)₂SO₄6.4-9.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g/L、酵母粉3.2-4.8g/L、IPTG浓度为0.015-0.025mM、以及甘油含量维持到30g/L以上。
进一步，所述发酵培养为流加培养方式，使pH恒定于6.5-7.5之间，通气量保持在1.5vvm，搅拌转速为400rpm。
ptac-puuC基因序列具有如NO.1的基因序列。
经过大量筛选，发现了适用于肺炎克雷伯氏杆菌的高效tac启动子以及能转化3-羟基丙醛为3-羟基丙酸的puuc醛脱氢酶，并以此构建重组工程菌。将该酶编码基因的序列进行分析后，对该基因进行了化学合成。测序验证后将该启动子和酶在肺炎克雷伯氏杆菌中超表达，获得了重组肺炎克雷伯氏杆菌pET(ptac-puuc)，测定其体内及体外对3-羟基丙醛的催化能力。在体外，该酶对3-羟基丙醛的酶活达到26.31U/mg，是原代肺炎克雷伯氏杆菌(3.82U/mg)的6.9倍。在5L发酵罐中培养改造后的工程菌，经培养基成分、IPTG浓度条件优化后，其48h后3-羟基丙酸产量高达73g/L。
附图说明
图1重组肺炎克雷伯氏杆菌pET(ptac-puuC)的SDS-PAGE分析图.
M-marker；1-K.pneumoniae(ptac)；2-K.pneumoniae(ptac-puuC)
图2不同浓度培养基成分对3-羟基丙酸和生物量的影响.
A:K₂HPO₄·3H₂O；B:KH₂PO₄；C:(NH₄)₂SO₄；D:MgSO₄·7H₂O；E:Yeast extract(酵母粉).Biomass:生物量；3-HP：3-羟基丙酸；Lactic acid：乳酸；Acetic acid:乙酸
图3不同浓度的IPTG对重组菌的影响
Biomass:生物量；3-HP：3-羟基丙酸；Lactic acid：乳酸；Acetic acid:乙酸
图4重组菌K.pneumoniae(ptac-puuC)的上罐发酵图
3-HP：3-羟基丙酸；Lactic acid：乳酸；Acetic acid：乙酸；
1,3-PD:1,3-丙二醇；1,3-PD:2,3-丁二醇；Biomass:生物量
具体实施方式
下面的具体方法可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明方法的具体步骤包括：
1.肺炎克雷伯氏杆菌中tac启动子和醛脱氢酶puuc的克隆
菌株及质粒：大肠杆菌(E.coli)top10购自北京博迈德公司，肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)DSM2026从德国DSM购买，表达载体pET-28a从诺维信公司购买。
培养基：LB培养基(g/L)蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，固体培养基中加入1.5％(100ml液体培养基中加入1.5g琼脂)的琼脂。抗性培养基需加入50μL/mL硫酸卡那霉素。
肺炎克雷伯氏杆菌发酵培养基(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O，3.4；KH₂PO₄，1.3；(NH₄)₂SO₄，4；MgSO₄·7H₂O，0.5；CaCO₃，0.1；酵母粉，3；甘油，40；微量元素，1.25mL/L(1L培养基中加入1.25mL微量元素)。
微量元素溶液(g/L)FeSO₄·7H₂O，1；ZnCl₂，0.07；CuCl₂·2H₂O，0.02；MnCl₂·4H₂O，0.1；NiCl₂·6H₂O，0.025；H₃BO₃，0.06；Na₂MO₄·2H₂O，0.035；CoCl₂·2H₂O，0.2；饱和HCl,4mL。
分子克隆及表达：将筛选得到的基因序列进行化学合成，连接至载体pET-28a中，得到重组质粒pET(ptac-puuC)，转入大肠杆菌top10中进行测序验证。之后将提取的质粒电穿孔转化至肺炎克雷伯氏杆菌并进行验证。验证结果显示tac启动子和醛脱氢酶基因puuC连接正确。
2.醛脱氢酶的表达
在发酵培养基中培养重组菌，在第12h取出发酵液，12000rpm离心10min，去上清。将收集到的菌体用50mM的PBS缓冲液(KH₂PO₄，0.27g/L；Na₂HPO₄，1.42g/L；NaCl，8g/L；KCl，0.2g/L)重悬。随后将菌体置于冰上，超声破碎细胞，功率为100W，工作3s，停止2s，共50次。破碎后将适量破碎液加入到酶活反应体系(50mM PBS缓冲液，0.2mM 3-羟基丙醛，0.4mM氨基安替比林，7mM苯酚，7U过氧化氢酶)中，37℃进行反应5min后在500nm下测定吸光度。一个活力单位定义为在该条件下，1min催化生成1μmol过氧化氢所需要的酶量。
测定puuC醛脱氢酶的SDS-PAGE蛋白电泳。
实验结果表明，醛氧化酶在体外对3-羟基丙醛的活性达到了26.31U/mg，为对照组的5.9倍。
3.最佳培养条件的确定
根据摇瓶发酵确定重组菌产3-羟基丙酸的最佳培养条件。
在250ml摇瓶中装入100ml发酵培养基，置于摇床中，37℃且150rpm条件下进行摇瓶发酵。每隔3h取出一次发酵液进行3-羟基丙酸产量的测定。分 析方法如下：发酵液中的产物质量浓度采用岛津高效液相色谱SPD-20A测定，色谱柱为C18柱，柱温30℃，流动相为0.05％磷酸，工作流速为0.8mL/min，检测器采用紫外检测器。取1mL发酵液12000rpm离心10min，取上清液用于高效液相色谱检测，样品分析前经0.22μm微滤膜过滤。甘油的测定方法使用的是高碘酸钠氧化法。
培养基成分的确定：
根据摇瓶发酵条件图2示，得到最佳培养基成分配制范围：
表1最佳培养基成分

IPTG浓度的确定：
根据图3中IPTG浓度梯度发酵生物质产量得出结论，确定发酵是重组菌的最佳IPTG浓度为0.015-0.025mM。
4.重组菌K.pneumoniae(ptac-puuc)的上罐发酵
上罐发酵在5L发酵罐(上海保兴)中完成，装液量为3L，在37℃下进行，pH自动维持在6.5-7.5，通气量1.5vvm，搅拌转速为400rpm，每3h取样测定，使甘油的含量维持在30g/L以上。分析方法同摇瓶发酵。
实验结果表明，在上罐发酵实验中，48h时3-羟基丙酸产量达到73g/L(图4)。摇瓶发酵和上罐发酵的结果表明，tac启动子确保了醛脱氢酶puuC在肺炎克雷伯菌体内的高效表达，提高了3-羟基丙酸的产量，成功构建了一株3-羟基丙酸的高产菌K.pneumoniae(ptac-puuC)。