奎尼定缀合物及其在免疫测定中的应用 发明领域
本发明涉及奎尼定缀合物及其在对试验样品中定量的奎尼定的免疫测定中的应用，以及，更具体地，涉及用于产生抗奎尼定抗体及用于合成与报道试剂结合的缀合物的奎尼定衍生物。本发明也涉及用于合成含亲水接头的奎尼定缀合物的单保护的亲水性双胺试剂。
技术背最
特殊的结合反应，如抗体-抗原相互作用，已被广泛地用于免疫测定中，以检测和/或定量分析存在于生物体液中的药物或其它令人感兴趣的化合物。这样的免疫测定已被发展用于测定多价抗原，如蛋白质，以及半抗原。
作为分子定义的半抗原太小，以致于将其用于动物时不能刺激抗体的产生，也就是说，半抗原本身是非免疫原性的。但是，本领域公知，通过将半抗原与合适的载体分子共价结合(缀合)而产生免疫原性。将这样地免疫原性的缀合物用于动物时，通常会引起抗体谱的产生，一些抗体抗载体天然的抗原位点(表位)，而一些抗体抗结合的半抗原分子。合适的载体通常含有聚(氨基酸)片段，包括多肽，蛋白质和糖蛋白。可使用的载体的特例为钥孔血蓝素(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)，γ-球蛋白和植物球蛋白(例如，南瓜籽球蛋白)。
各种化学物质已被用来制备产生抗-半抗原抗体所必须的免疫原性的半抗原-载体缀合物。由于天然的载体通常含有一定数量的赖氨酸残基，而后者又含有活性氨基，因此，一种特别有用的方法利用了含胺-反应性官能团的半抗原或半抗原衍生物与载体的反应。这种方法的一个重要的方面是由羧基官能化的半抗原和半抗原衍生物迅速地转化为合适的氨-反应中间体。
奎尼定，本申请特别关注的半抗原，为有效的药用化合物。它作为抗心律不齐药物的价值是由于在使用这些药物治疗并发房纤颤的疟疾病人时，偶然“治愈”了他们的心律不齐而偶然发现的。
在肝和/或肾无疾病的情况下，奎尼定的生物半衰期是约6小时。部分药物无变化地由肾脏排泄，剩余部分由肝脏代谢产生无抗心律不齐活性的产物。奎尼定通过直接作用于心肌及间接作用于传导系统而影响心脏的速率和节律。奎尼定降低兴奋性，传导速度和心肌收缩力。
奎尼定经常产生不需要的胃肠道副作用，该副作用多少与剂量相关。血浆药物水平的检测所提供的信息有助于在最大程度地限制不需要的副作用的同时保持适当的治疗水平。
但是，天然奎尼定不含上述的胺-反应性官能团。因此必须将其合成为合适的奎尼定衍生物。奎尼定中的C-10-C-11双键特别地提供了开始反应的位置。
考氏等(Kobayashi et al.)(聚合物科学杂志(Journal ofPolymer Science)：Polymer Letters Edition，vol.20，85-90，Functional Polymers 9。新金鸡纳生物碱衍生物不对称催化(Asymmetric Catalysis by New Cinchona AlkaloidDerivatives)。不对称诱导中C(3)取代基的作用(Effect of C(3)Substituent On Asymmetric Induction)，John Wiley and Sons，Inc.，[1982])公开了在奎尼定C-11位具有有机硫基团的金鸡纳生物碱的合成。但是，并未制备出含有适于本发明目的的官能团的衍生物。
公开于1991年10月31日国际公开号为WO 91/16322的国际PCT申请和公开于1993年4月15日国际公开号为WO 93/07142的国际PCT申请公开了奎尼定和奎尼定衍生物作为不对称羟基化催化剂的用途。所公开的化合物包括作为临界控制剂的C-11位由磺酰基或磺酰基类衍生的奎尼定衍生物。同样，这些衍生物也不含有适于本发明目的的官能团。
特别地，尚没有参考文献提及或暗示用于奎尼定免疫测定的合成的免疫原性的缀合物或报道试剂(例如粒子试剂)的奎尼定衍生物的制备。
目前需要奎尼定缀合物并将其应用于试验样品中奎尼定的定量免疫测定以及，具体地，应用于能够及时地，精确地监测奎尼定水平的产生抗-奎尼定抗体的奎尼定衍生物。
发明概要
本发明的一个实施方案包括结构式I的化合物，该化合物也可由内盐II表示，或离析为外盐III：其中x为1-2，而A-为一个阴离子，如氯离子，4-甲苯磺酸根离子，3-巯基丙酸根离子，等。当x＝2时，结构式I或II化合物被称为“QAD-1”，Quinidine Acid Derivative，No.1的首字母缩写词。该化合物合适的化学名称为11-(2-羧乙硫基)二氢奎尼定。
另一个实施方案为要求保护化合物和载体的免疫原性缀合物，其中载体优选聚(氨基酸)蛋白质和糖蛋白。
另一个实施方案为要求保护的化合物和报道试剂的缀合物。报道试剂为具有可使该试剂在样品中的量被迅速地定量测定的化学或物理性质的试剂。常见的报道试剂有乳胶颗粒，萤光团，化学发光物质，发色团，放射性物质和酶。在适当定型的测定中，药物或其他令人感兴趣的化合物与报道试剂的缀合物可被用来显示样品中的药物的量和样品中报道试剂的量(快速测量)。
另一个实施方案为要求保护的化合物与一种报道试剂的缀合物，更特别地，其中要求保护的化合物经亲水连接与报道试剂缀合。
另一个实施方案为一类用于在药物和报道试剂的缀合物中导入亲水接头部分(Seqment)的单保护的亲水性二胺。
本发明的另一个实施方案为测定试验样品中奎尼定的存在和/或含量的免疫测定法，其中的步骤为：
(a)将含要求保护的化合物与报道试剂形成的缀合物的报道试剂，试验样品，和一种凝集试剂混合在一起，接着
(b)按已知方法进行凝集免疫测定。
附图的简要说明
根据相应的附图，本发明将在下列详细描述中变得更加清楚，该附图也是本申请的一个组成部分，其中：
图1表示用各种QAD-1蛋白免疫原性的缀合物免疫小鼠，使之产生抗奎尼定-抗体。该图将在实施例3中更详细地讨论。
图2为浊度-抑制试验(turbity-inhibition test)数据的标示图，它表示溶液中游离的奎尼定与结合颗粒的奎尼定竞争以限制抗体的量。该图也将在实施例3中更详细地讨论。
图3表示奎尼定浊度抑制免疫测定中的标准曲线。它将在实施例6，部分B中更详细地讨论。
发明的描述
本发明涉及奎尼定衍生物，由其制备的免疫原性的缀合物，由免疫原性的缀合物引发的抗体，针对报道试剂的奎尼定缀合物，以及它们在免疫测定中的应用。
本发明最终涉及两种最终试剂，抗-奎尼定抗体和奎尼定-乳胶颗粒的制备。两种最终试剂为测定体液中奎尼定的存在与量的测量系统的组成部分。
在本发明中，通过C-10-C-11之间具有双键的硫羟基-官能化的羧酸的反应合成羧基-官能化的奎尼定衍生物。已知使用游离基化学可将硫羟基加到双键上。例如，使用2，2’-偶氮双(异丁腈)(AIBN)作为起始游离基源通过3-巯基丙酸(3-MPA)对奎尼定双键的加成得到称为QAD-1的衍生物。可以设想，该反应是在几个步骤中发生的。下式中，圆点表示未成对的电子而QCH＝CH2表示奎尼定。1.游离基产生(起始阶段)。2.游离基由碳转移至硫，形成硫羟游离基。3.硫羟游离基加入奎尼定双键。4.游离基由碳转移至硫。5.步骤3和4的反应循环多次，以令人满意的产率将反应物转化成QAD-1。
本发明的羧基-官能化的奎尼定衍生物可用载体缀合而形成免疫原。首先必需将羟基转化为胺-反应性基团。羧基-官能化反应剂向胺-反应反应剂的转化方法是本领域技术人员熟知的。形式上，羧基中的羟基由负电性的或吸电子的原子或基团取代，以使部分正电荷被诱导在羰基碳原子附近。某些可满足上述需要的X的结构如下表所示：
-Cl，-Br，-F 酰菌 酸酐或混合酐 异脲酯 异脲鎓酯 Formadinium ester 二甲基咪唑鎓酯 琥珀酰亚胺基酯 磺基琥珀酰亚胺基酯 苯并三唑基酯 6-氯苯并三唑基酯 6-硝基苯并三唑基酯 7-氯杂苯并三唑基酯 氧代苯并三嗪基酯 酰基鏻混合酐酰基鏻混合酐 混合磷酸酐 酰基膦酸酐 混合酰基焦磷酸酐 酰基硼酸混合酐-N3 酰基叠氮化物 咪唑化物 咪唑鎓衍生物 酰基咪唑鎓衍生物 三唑化物 1-甲基吡啶鎓-2-基酯， 4-硝基苯酯 三氯苯基酯 五氯苯基酯 四氟苯基酯 五氟苯基酯 硝基磺基苯酯三硝基磺基苯酯 三嗪基酯苯并噁唑鎓酯噻吩并酯
在本发明的特例中，使用二琥珀酰亚胺碳酸酯将QAD-1转化成胺-反应活性的琥珀酰亚胺基酯，然后使其与载体中的赖氨酸(胺)基团反应，得到免疫原性的缀合物(免疫原)。该免疫原可被用来使用的已知抗体生产和筛选方法诱导抗体。例如，可将免疫原注射到合适的动物宿主体内以刺激抗体的产生。既可将如此制得的抗体直接用于与半抗原或密切相关的类似物的特定的结合反应，也可首先通过任何已知的方式，如亲和层析，从动物血清中纯化。选择性地，可使用本发明的缀合物筛选从被注射的宿主中得到的免疫淋巴细胞以选择对免疫原性的缀合物有反应的细胞。然后可将其与合适的骨髓瘤细胞融合，产生可产生单克隆抗体的杂交瘤。细胞融合，选择及增殖的方法为已知方法，通常由考氏等的方法[Kohler et al.，Nature，Vol.256，495-497(1975)]修改而来。优选地，本发明的抗体为使用杂交瘤技术制备的单克隆抗体。
使用本发明免疫原性的缀合物制备的抗-奎尼定抗体可被用于任何已知的免疫测定形式，以利用抗体和其半抗原之间的特定的结合反应，测定试验样品中游离的半抗原的存在和/或量。这样的已知免疫测定形式的例子包括同源的，异源的，竞争性的和直接的(非竞争性的)形式。
本发明的方法限于所要求的化合物与报道试剂，特别是乳胶颗粒的偶合。优选的颗粒包括具有聚苯乙烯芯和已与乙二醇二异丁烯酸酯交联的聚(缩水甘油基异丁烯酸酯)壳的颗粒。这种颗粒的制备和用途已在克氏等(Craig et al.)的美国专利No.4,480,042中公开，该文献在此作为参考。这些颗粒表面的环氧基与胺，硫醇等迅速反应，这一性质可用来使各种令人感兴趣的化合物附着在乳胶颗粒上。特别地，本发明使用环氧基与存在于亲水性二胺接头中的氨基的反应。在这种连接中，应当提到的是由其他的胺-反应活性剂-如醛，琥珀酰亚胺基酯，和烯丙基或苄基卤化物官能化的乳胶颗粒也适用作本发明的报道反应剂。
通过高亲水性接头(有时也称为间隔基或桥)将缀合物对的两个组分偶合，随后缀合物预定的功能为本领域技术人员已知的技术。下面是这种技术的-些例子：(a)付氏等。作为颗粒反应剂连接剂用于免疫测定的聚醚聚胺(W.A.Frey and D.M.Simons.Polyetherpolyamines as linking agents for particle reagnts useful inimmunoassays)。US 4,581,337，April 8，1986；(b)希氏等。使用于可释放配体的特定结合的测定方法(D.M.Simons，S.Y.Tseng and D.M.Obzansky.Method for Specific bindingassays using a releasable ligand)。U.S.5,332,679，DuPont，July 26，1994；(c)阿氏等。使用一种新的亲水性交联剂的单克隆抗体和葡萄球菌属内毒素A的缀合物的制备和性质。生物缀合物化学4：455-466(1993)(E.Akerblom，M.Dohlsten，C.Bryno，M.Mastej，I.Steringer，G.Hedlund，P.Lando and T.Kalland.Preparation and characterization of conjugates ofmonoclonal antibodies and staphylococcal enterotoxin A usinga new hydrphilic cross-liker.Bioconjugate Chem.4：455-466(1993)；(d)胡氏等(E，Huber，D.Zdunek，C.Klein and R.Schenk)。Hapten-Biotin-Konjugate und Ihre Verwendung.EP0 451 810 Al，April 10，1991(Boehringer mannheim)。假定好的效果由两种因素的结合得到：减少空间位阻和降低存在于缀合物这种或那种组分或者其它可随后加入的反应剂中的疏水区与亲水性接头的非特异性，非共价相互作用。在本例子中，使用这样的亲水性间隔基提高奎尼定测定的精度和准确度。
含有氧亚乙基单元的二胺或多胺试剂特别适用于亲水性接头。一些特例为：
H2NCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
1，8-二氨基-3，6-二氧杂辛烷
杜邦编码名称：DA-10：
商品名：Jeffamine EDR-148
制造商或来源：Texaco Chemical Co.
pKa(两个氨基相同)：9.4
H2NCH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NH2
1，10-二氨基-4，7-二氧杂癸烷
杜邦编码名称：DA-12：
制造商或来源：Tokyo Kasel，Inc.，
911N.Harborgate St.，Portland，OR
pKa(两个氨基相同)：9.98
H2NCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
1，11-二氨基-3，6，9-三氧杂十一碳烷
杜邦编码名称：DA-13
商品名：Jeffamine EDR-192
制造商或来源：Texaco Chemical Co.
pKa(两个氨基相同)：9.4
H2NCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
1，13-二氨基-4，7，10-三氧杂十三碳烷
杜邦编码名称：DA-15：
制造商或来源：Fluka
pKa(两个氨基相同)：10.02
在上述材料的杜邦编码名称中，“DA”表示二胺，数字表示除末端氢原子外的链中原子的数目。含氧亚乙基链的分子中固有的较低的非特异性，非共价的分子内部相互作用与它们类似物有关，表明了物理性质。例如，DA-10在室温下为液体，但它的全烃类似物，1，8-二氨基辛烷为熔点为52℃的固体。
本发明的奎尼定-亲水性间隔基-报道试剂缀合物可以几种方式制备。例如，可使用下列3步法：(a)将羧基官能化的药物衍生物(如QAD-1)转化成胺-反应活性的衍生物；(b)使胺-反应活性的药物衍生物与亲水性二胺的一个氨基偶合；以及(c)将制得的缀合物与胺-反应活性的报道试剂接触，形成所需的药物-亲水性间隔基-报道试剂缀合物。或者，选择性地，(a)使胺-反应活性报道试剂和亲水性二胺的一个氨基偶合；(b)将羧基官能化的药物衍生物转化成胺-反应活性的衍生物；以及(c)将两种试剂结合形成需要的药物-亲水性间隔基-报道试剂缀合物。本发明的方法中，羧基-官能化的QAD-1通过与二琥珀亚胺基碳酸酯反应的方式被转化成胺-反应活性的琥珀酰亚胺基酯。
上述各个亲水性二胺的两个氨基具有相同的碱性，如pKa值反映出的，以及对各种胺-反应活性试剂具有相同的反应性。这些二胺与限量的胺-反应活性试剂的反应总是得到含两种反应物加未反应的二胺的混合物。最终反应混合物中的各组分的摩尔分数为最初的化学计量的函数。产物的理论公布如表1所示。
表1
作为化学计量函数的理论产物分布反应剂摩尔比*：1∶1 2∶1 3∶1产物组分单取代二胺： 1/2 3/8 5/18双取代二胺： 1/4 1/16 1/36未反应二胺： 1/4 9/16 25/36*二胺与胺-反应活性试剂的摩尔比
转化成二取代的二胺的胺-反应活性药物衍生物的量通常都丢失了。当该衍生物很昂贵或难于定量合成时，这可能是个主要问题。作为化学计量函数的药物衍生物的理论损失如表2所示：
表2
作为化学计量函数的药物衍生物理论损失 反应剂摩尔比* 药物衍生物损失，％ 1∶1 50 2∶1 12.5 3∶1 5.6*二胺与胺-反应活性试剂的摩尔比
通过胺-反应活性药物衍生物与半保护的亲水性二胺，即，其中一个氨基预先已由适当的保护基封闭的亲水性二胺的反应可避免产生混合产物以及由此带来的有价值的药物衍生物的损失。上述保护基必须在与胺-反应活性药物衍生物的反应中使用的所有条件下保持完整，而且随后必须容易除去。在本例中，已发现叔丁氧羰基(Boc)为令人满意的保护基。已经发现一种既可提供所需要的半保护的中间体，又可避免二保护的二胺和未反应的二胺的方法。该方法包括下列连续的步骤：
(a)在氢氧化钠存在下在水/有机介质中使二叔丁基二碳酸酯
(‘Boc’酐)与过量亲水性二胺反应。
(b)除去有机溶剂，使系统基本上转入水相。
(c)降低水相的pH值，以确保所有剩余的氨基基本上都处于被质
子化的形式。
(d)使用与水不混溶的有机溶剂萃取水相，除去非碱性物质。
(e)升高水相的pH值，以确保一半或一半以上的剩余的氨基处于
未质子化的形式。
(f)将盐加入水相。
(g)用水不混溶的有机溶剂萃取水相。
(h)分离有机相。
(i)从有机相中除去溶剂，得到所需的产物。
利用半-Boc亲水性二胺中间体，由单保护的二胺合成药物-亲水性间隔基-报道试剂缀合物的方法图解如下：
(a)将羧基-官能化的药物衍生物转化成胺-反应活性衍生物。
(b)使胺-反应药物衍生物与单保护的亲水性二胺的氨基偶合。
(c)除去保护基。
(d)从胺盐释放游离胺。
(e)使如此制得的药物-亲水性接头缀合物与胺-反应活性报道试剂(这里是环氧基-官能化的乳胶颗粒)反应。步骤(d)和(e)通常在相同的反应罐中一起进行。
这里描述的药物-亲水性接头-报道试剂缀合物可用于任何已知的使用报道试剂测定试验样品中的药物，如奎尼定的存在和/或量的免疫测定形式。
优选的使用本发明的药物-亲水性接头-颗粒报道试剂(颗粒试剂)的免疫测定形式为颗粒增强的浊度抑制免疫测定(PETINIA)。这种免疫测定形式利用了已将药物或其他令人感兴趣的化合物附着在上面的微小乳胶颗粒(例如70nm)。例如，当用波长大于悬浮颗粒的直径(例如，340nm)的单色光观察时，该悬浮液基本上是透明的。在适宜条件下，加入对颗粒上的药物具有特异性的抗体将导致颗粒凝集。这些凝集物很大，足以散射光线，这导致悬浮液变得混浊。加入含有游离药物的样品时，游离药物与结合在颗粒上的药物竞争抗体，因而抑制凝集的速度和程度。这提供了定量样品中药物的量的基础。特别地，本发明的奎尼定-亲水性间隔基-颗粒试剂和抗-奎尼定抗体可提供一种快速，精确，准确的测定存在于生物体液中的奎尼定的量的PETINIA法。
其它可使用本发明的报道试剂的已知免疫测定形式包括直接的凝集颗粒为基础的免疫测定，酶联免疫吸附免疫测定，和萤光法免疫测定，
下列实施例是说明本发明的：
实施例1
奎尼定衍生物(QAD-1)的合成
将装有磁搅拌棒，加热罩，回流冷凝器，和干燥氮气入口管和出口管的250mL二颈烧瓶用干燥氮气彻底清洗并装入13.00g(0.040mol)奎尼定(Aldrich Chemical Co.，Inc.WI)，80mL氯仿(VWRScientific，Inc.，NJ)，和14mL(0.16mol)3-巯基丙酸(AldrichChemical Co.，Inc.WI)。加入偶氮双(异丁腈)(660mg；Polysciences，Inc.，PA)，并将该混合物回流12-15小时。之后加入另一部分偶氮双(异丁腈)(550mg)并继续回流12-15小时。
将该溶液冷却至室温，在搅拌下滴到700mL无水乙醚中。分出粘合的沉淀。将烧瓶在冰浴中冷却30分钟，然后滗析醚层。将残留物用沸腾的醚(每次500mL)萃取三次，这将使其转化成细粉状物(重量，18g)。对硫羟基含量的分析显示这时的产物含QAD-1的3-巯基丙酸(3-MPA)盐的实际的量：每mg样品0.594μmole硫羟基(＝0.0594mole/100g)，这相当于73mole％QAD-1内盐和23mole％QAD-1∶3-MPA外盐。
将未纯化的产物溶于80mL氯仿，并将该溶液倒入250mL水中。将一个pH电极插入水相，温和地搅拌混合物，小心地加入固体碳酸氢钠直到pH稳定在7.0-7.2。分出氯仿层，用硫酸镁干燥，并在搅拌下滴入650mL无水乙醚中。过滤收集分离出的精细的白色固体状产物，重，15.3g。硫羟基分析显示每mg该物质的样品中含0.042μmole硫羟基。
将该物质在100mL乙醇中回流30分钟。(注：它不完全溶解)。然后将该混合物在冰浴中冷却2-3小时，过滤收集产物。重量，11.7g(75％理论值)。硫羟基含量为每mg样品0.030μmole硫羟基(＝0.003mole/100g)，对应98.7mole％QAD-1内盐和1.3mole％QAD-1∶3-MPA外盐的组合物。
通过将其溶于氯仿并加入含理论量的4-甲苯磺酸，可将QAD-1转化成4-甲苯磺酸外盐。
实施例2
奎尼定-蛋白质缀合物的制备
所使用的蛋白质为钥孔血蓝素(KLH)，兔γ-球蛋白(RaIgG)，南瓜籽球蛋白(PSG)，和卵白蛋白(都来自Sigma ChemicalCo.，Inc.，MO)。通过在25mL150mM碳酸氢钠溶液中将蛋白质(150mg)搅拌数小时并离心除去任何不溶物(如果需要的话)而制得KLH，RaIgG和卵白蛋白溶液。通过加PSG(105mg)溶于含4M氯化钠的25mL 150mM碳酸氢钠而制得PSG溶液。
QAD-1琥珀酰亚胺基酯贮存液的制备。将QAD-1(120.45mg)，二琥珀酰亚胺基碳酸酯(78.83mg)，3344μL无水二甲亚砜和45μL三乙胺在一个配衡管形瓶中合并。溶液的总重量为3.963g。将该溶液在室温放置1.5小时。溶液的密度通过对1000μL样品称重测定，为1.0893mg/μL。如果假定该反应是定量进行的，那么QAD-1琥珀酰亚胺基酯的浓度为(120.45×1.0893)/(430.56×3963)＝7.69×10-5mmol/μL。
缀合物合成。
按下面给出的量：KLH(878μL)；PSG(878μL)；卵白蛋白(878μL)；和PaIgG(750μL)，将QAD-1琥珀酰亚胺基酯贮备液加入各蛋白溶液中。将该溶液放置过夜，然后对150mM碳酸氢钠的3次变化和碳酸盐-缓冲的盐水的3次变化透析。透析结束时，各溶液的表现如下：KLH缀合物，略有混浊；γ-球蛋白缀合物，含一些沉淀；RaIgG缀合物，含很多沉淀(由于盐浓度低)；卵白蛋白，透明。
实施例3
免疫和抗体试验流程简述
分别用三种剂量的奎尼定-KLH缀合物和奎尼定-兔γ-球蛋白缀合物和奎尼定-PSG缀合物对三批各五只的雌性BALB/c鼠注射。将各存在于合适的缀合物中的药剂在零天用完全的弗氏佐剂，在28天和56天用不完全的弗氏佐剂乳化，在开始免疫作用后42和70天采血。
通过ELISA法测定对奎尼定的小鼠IgG效价。室温下将塑料微量滴定板(Immulon II，Dynatech，Inc.，VA)用奎尼定-卵白蛋白缀合物(6mg/mL在0.1M碳酸盐中，pH 9.6)，50μL/well，包被3小时并用10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。将抗血清用含1％BSA和0.05％Tween 20(PBT)(Sigma Chemical Co.，MO)的PBS稀释并在37℃用抗原包被的板温育1小时。将该板用PBS洗涤三次，在37℃用50μL/孔用辣根过氧化物酶(Zymed Co.，Catalog no.61-6020，1∶1 000含0.05％Tween 20的PBS中)标记的抗-小鼠IgG家兔免疫球蛋白(gamma链专一)温育1小时。将各孔用PBS洗涤三次，并通过加100μL/孔过氧化物酶底物ABTS(2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸二铵盐)(Kierkegaard & Perry Co.，MD，Catalog no.50-66-1)，在室温下放置20分钟，然后在405nm观察光吸收而测定小鼠IgG的存在。血清取出42天的结果(见图1)显示在两种剂量的免疫原后，所有三种缀合物都能诱导奎尼定-特异的IgG抗体的产生。(在图1中，缩写词‘NMS’表示未免疫血清，用作对照)
通过颗粒-增加的浊度抑制免疫测定法(PETINIA)测定小鼠血清对游离奎尼定的反应性。使用与下面实施例6所述基本相同的方法制备在其表面共价偶合着奎尼定的乳胶颗粒(奎尼定颗粒试剂；QPR)。将此奎尼定颗粒试剂(QPR)以1∶100的比例稀释在由10mM磷酸盐，pH6.9，0.4％GAFAC RE-610，4％聚乙二醇8000组成的缓冲溶液(PGP缓冲液中。将由奎尼定-KLH缀合物(70天)和奎尼定(SigmaChemical Co.，MO；0mg/mL DMSO中)免疫接种的小鼠混合抗血清稀释在PGP缓冲液中。通过在96-孔，平底微量滴定板的孔中将50μL稀释的小鼠血清(1∶200)与200μL稀释的奎尼定颗粒试剂(QPR)(1∶1000)混合而开始测定。通过将游离的奎尼定掺入稀释的预先混入抗血清的奎尼定颗粒试剂抑制奎尼定颗粒试剂的凝集。图2显示与样品中奎尼定摩尔浓度相对的透光度。该数据说明用本发明所述的奎尼定-蛋白质免疫原性的缀合物免疫化的小鼠产生了在溶液中结合游离奎尼定的抗体。
实施例4
单叔丁氧羰基化的亲水性二胺：Boc-DA-10的制备
在一个装有机械搅拌器，温度计和滴液漏斗并在冰浴中冷却的2-升烧瓶中装入68g(0.458mole)DA-10，230mL水，460mL二噁烷和229mL 1N NaOH。搅拌混合物，直至温度低于10℃。剧烈搅拌该溶液并滴加Boc酐(50g；0.227mole)，同时烧瓶内温度保持在10℃以下。加完后，使该混合物温热至室温并放置过夜。
用旋转蒸发器除去反应混合物中的大部分二噁烷，这导致了油层的分离。将该混合物用1M硫酸氢钠调至pH 7(约需730mL)并用每份100mL的乙醚萃取三次。弃去乙醚萃取液。
用50％氢氧化钠溶液将水相的pH值调至9.4，加入175g氯化钠(大约半饱和)，并将该盐水溶液用每份100mL的氯仿萃取三次。如果需要，各次萃取后将pH再调至9.4。将氯仿萃取液合并并用硫酸镁干燥。为了这个步骤接近完全，将水浴温度升至45℃，用旋转蒸发仪尽可能完全地除去氯仿。残留物重25.74g(理论值＝42.6g)；产率(粗)为60.4％。通过酸滴定测得的胺含量如表4所示。
表4
Boc-DA-in的酸滴定(重复) 最终萃取产物 a b样品Wt.，mg 217 2410.0992 HCl，mL 实际 7.689 8.515 理论* 8.81 9.78纯度**，％ 87.3 86.3产率，纯碱，％ 52.7 52.1* 理论值为对纯Boc-DA-10的计算值，FW＝248.3** 杂质由残留的氯仿，叔丁醇，等组成。
实施例5
奎尼定-亲水性接头缀合物的制备方法A.QAD-1与DA-10的直接偶合
化学计量：DSC/QAD-1摩尔比＝1.10；DA-10/QAD-1摩尔比＝3.00。
溶液1。将QAD-1(107.65mg，0.2500mmole)和二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC；70.46mg，0.2750mmole)放入4-mL管形瓶中，加入3.0mL无水DMSO，将混合物搅拌至全部溶解，然后加入三乙胺(38μL)并将该溶液在室温下放置一小时。(周期性地松开管形瓶的盖稀释压力)。
溶液2：将12-mL管形瓶+盖贴标签并配衡至最接近的毫克。将DA-10(111.2mg，0.7503mmole)，1.25mL DMSO和一个磁搅拌棒加入管形瓶中。
溶液3：剧烈搅拌溶液2，仔细滴加溶液1，在加入下一滴以前均匀混合每一滴。用四批250-μL无水DMSO的等分试样漂洗管形瓶以保证完全转移，并将最终的溶液搅拌1小时。将磁搅拌棒移至管形瓶的液体水平面之上(使用磁力)，用新鲜的无水DMSO(1.00mL总量)漂洗，从管形瓶中取出搅拌棒。将管形瓶和它的盖放在天平上，通过加入无水DMSO使内含物的总重量达到7.646克。假定所有的反应都是定量进行的并且单和双取代的胺的理论分布是合适的，选择反应剂的量使最终缀合物的浓度约为3×10-5mmol/μL。方法B.QAD-1与Boc-DA-10的偶合和脱保护
将QAD-1(107.65mg，0.2500mmole)和三乙胺(38μL)溶于2mL氯仿中。将二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC；70.46mg，0.2750mmole)溶于2mL乙腈。[注： DSC不溶于氯仿。]将QAD-1溶液滴入剧烈搅拌的DSC溶液中。加完后继续搅拌3小时，然后一次加入Boc-DA-10(62.08mg；0.2500mmol)和三乙胺(38μL)在2mL乙腈中的溶液。将合并的混合物搅拌3小时，然后减压蒸发至干。在残留物中加入10mL 1∶1的二氯甲烷/三氟乙酸，将该混合物搅拌30分钟，然后减压蒸发至干。将残留物溶于8250μL二甲亚砜。假定所有的反应都是定量进行的，选择反应剂的量使缀合物的最终浓度为3×10-5mmol/μL。
实施例6A.奎尼定-亲水性接头-报道试剂缀合物(奎尼定颗粒试剂；QPR)；QAD-1-DA-10缀合物与环氧化物-官能化的乳胶颗粒的偶合
定义：PRM(原材料颗粒)为由用交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)包被的聚苯乙烯核心组成的聚合物乳胶颗粒，它可按Graig等提出的U.S.专利No.4,480,042中所述的制备，该文献作为参考收编在此。GAFAC为GAFAC RE-610，从前由GAF Corporation出售，但现在从Rhone Poulenc，Collegeville，PA得到，其名称为Rhodafac RE-610。偶合缓冲液为100mM碳酸钠/碳酸氢钠，pH 9.5。洗涤缓冲液为含1％GAFAC的15mM磷酸钠，pH 7.4。贮存缓冲液为含0.5％GAFAC的15mM磷酸盐，pH 7.4。
将下列试剂顺序加入50mL试管反应器中：8.04mL去离子水，10mL偶合缓冲液，3.6mLPRM(固体含量，20.3％；颗粒大小，70nm)，1.25mL 10％GAFAC，1.8mL(典型地)奎尼定-亲水接头缀合物(得自实施例5，A或B)，和0.32mL 10％DA-10水溶液。将溶液的pH调至pH 9.5，并将反应试管在70℃保温18小时。通过在5℃离心2小时分出所得到的奎尼定-亲水接头颗粒试剂(Sorvall RC285，27500rpm on F28/13 rotor)。滗析上层清液，并将颗粒试剂块悬浮在25mL洗涤缓冲液中。将离心/洗涤步骤再重复两次，并将最终得到的颗粒试剂块再悬浮在25mL贮存缓冲液中。被称为QPR的该试剂含有3％的固体。B.使用奎尼定颗粒试剂(QPR)测定
定义：测定缓冲液为mM磷酸盐缓冲液，0.4％GAFAC，pH 7.0，0.002％thimerosal(乙基汞硫代水杨酸钠盐)(Aldrich Chemical Co.，Inc.WI)。颗粒测定溶液通过以1∶80比例用测定缓冲液稀释奎尼定颗粒试剂(QPR；3％固体)而制备。抗体原料溶液为使用与Kohlerand Milstein，Nature，256：495-497(1975)公开的方法基本相同的已知标准的杂交瘤技术纯化的家庭生产的抗-奎尼定单克隆抗体。抗体稀释剂为50mM磷酸盐缓冲液，75mM氯化钠，0.1％叠氮化钠，和0.05％thimerosal，pH 7.0。抗体测定溶液通过以1∶80的比例用抗体稀释剂稀释抗体原料溶液而制备。
完成测定并使用CobasB10分光光度计临床仪(RocheDiagnostics，Inc.，NJ)对奎尼定浓度作标准曲线。将5μL量的试验/校准溶液(来自E.I.du Pont de Nemours and Company，Wilmington，DE的奎尼定标准溶液，所使用的aca个别临床分析系统，也来自DuPont)加入Cobas分光光度计榈样品孔(wheel)中。将240μL颗粒测定溶液试液加入Cobas分光光度计试剂管中。将20μL抗体测定溶液试液加入Cobas分光光度计起始试剂管中。Cobas在37℃进行测定。样品首先与颗粒测定溶液混合并培养30秒钟。测量340nm处的吸收度并用作空白。然后通过加入抗体测定溶液(起始试剂)开始凝集反应。在220秒时测量终点吸收。持续读出样品产生的信号的两种吸收的差值。图3显示与校准器中游离奎尼定浓度(μg/mL)相对的终点(EP)吸收(以千分之一吸收为单位，在220秒后)。