单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒及检测方法.pdf

本发明涉及单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒，该试剂盒检测单核增生李斯特菌hlyA的引物对以及屎肠球菌种ddl基因的引物，如在174bp和557bp处能得到特异性扩增条带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阳性，可同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌，该方法的检测灵敏度的下限低于致病菌的最低感染剂量，这对后期的临床应用以及单核增生李斯特菌和屎肠球菌的监测具有重要意义。

1.  一种单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测引物组，包括检测单核增生李斯特菌hlyA的引物对以及屎肠球菌种ddl基因的引物对，序列分别如下：hlyA的引物对：上游引物组LM-F(SEQ ID NO:1)、下游引物组LM-R(SEQ ID NO:2)；ddl基因的引物对：上游引物组EFM-F(SEQ ID NO:3)、下游引物组EFM-R(SEQ ID NO:4)。

2.  一种单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于，其包含上述的双重PCR检测引物组。

3.  采用权利要求2所述试剂盒进行单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测方法，步骤如下：制备待测样品核酸模板，采用引物对核酸模板进行PCR扩增检测，在172bp和561bp处能得到特异性扩增条带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阳性；在这两位置处无可见扩增带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阴性。

4.  权利要求1所述的引物组在制备用于检测羔羊脑炎试剂盒中的应用。

5.  根据权利要求3的双重PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增采用47℃为退火温度。

单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及单核增生李斯特菌和屎肠球菌试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种用于同步进行单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒对单核增生李斯特菌和屎肠球菌进行双重PCR检测的生物学检测方法。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种能引起人兽共患李斯特菌病的兼性胞内寄生菌，其引起的动物李斯特菌病引起猪、绵羊、牛、家兔发生脑膜脑炎、流产和急性败血病。肠球菌(Enterococci)属于人畜体内的正常菌群，也是重要的条件致病性病原菌。在肠球菌引起的感染病例中，屎肠球菌(Enterococcus faecium)引起感染的比例逐年升高。由于屎肠球菌对多种常用抗生素耐药，由其引起的感染通常难以应对。绵羊羔羊脑炎是目前我国羊场发生频率高，危害较为严重的一类传染病，给养羊业造成严重的经济损失。近期，从内蒙古部分羊场羔羊脑炎死亡病例分离得到的病原菌中，主要以单核细胞增生性李斯特菌和屎肠球菌为主。致病菌的感染剂量都不同，据报道称，大多数致病菌的感染剂量都大于10⁵CFU/mL。因此，寻求这两种病原菌快速简便的检测方法，对该地区有效的预防和控制疾病的发生有着重要的意义。
目前，针对单核细胞增生性李斯特菌和屎肠球菌，尚无可以同时检测这两种病原的PCR方法的报道。本发明建立了一种可以同时检测这两种病原的双重PCR方法，从而为本地区在生产中快速特异性检测这两种病原及其感染的鉴别诊断和流行病学调查提供新的方法。
发明内容
本发明经过多次筛选及鉴定，利用针对这两种菌特定基因的两对特异性引物，建立了一种能够同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR方法。结果显示，所建立的方法具有良好的特异性和敏感性，可用于后期临床样本的检测。
本发明的目的是提供一种可用于同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR检测试剂盒及检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：单核增生李斯特菌和屎肠球菌在同一PCR反应体系中进行特异性扩增，采用单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测引物组，包括 检测单核增生李斯特菌hlyA的引物对以及屎肠球菌种ddl基因的引物对，序列分别如下：hlyA的引物对：上游引物组LM-F(SEQ ID NO:1)、下游引物组LM-R(SEQ ID NO:2)；ddl基因的引物对：上游引物组FM-F(SEQ ID NO:3)、下游引物组EFM-R(SEQ ID NO:4)。
作为一个具体的技术方案，本发明涉及单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于，其包含上述的双重PCR检测引物组。
优选的是，单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR试剂盒具体包括：2x Es Taq MasterMix12.5μL，DNA模板2μL，引物各0.25μL，使用前用灭菌去离子水补足至25μL。
作为一个优选的技术方案，上述引物组可用于制备用于检测羔羊脑炎的试剂盒。
作为一个具体的技术方案，本发明还涉及采用试剂盒进行单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测方法，步骤如下：制备待测样品核酸模板，采用引物对核酸模板进行PCR扩增检测，在172bp和561bp处能得到特异性扩增条带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阳性；在这两位置处无可见扩增带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阴性。
优选的是，双重PCR检测方法以优化后的47℃为退火温度。
本发明所建立的双重PCR检测方法具有特异性，仅对单核增生李斯特菌和屎肠球菌具有阳性扩增结果，而不与其他常见病原菌发生交叉反应，这有助于对临床病例进行正确诊断，从而对生产实践中指导正确用药及采取相应防治措施具有非常重要的意义。同时，本发明建立的双重PCR方法具有较高的灵敏性，对单核增生李斯特菌和屎肠球菌的最低检测限分别为0.432pg和4.30pg。人工污染样品的检测结果显示，本发明建立的方法对单核增生李斯特菌和屎肠球菌人工污染样品的最低检测限均为10³CFU-10⁵CFU/mL。较高的灵敏性有助于感染动物的初期诊断，也可实现对含有较低病原体样本的检测，进而避免漏检，对准确诊断及全面的流行病学调查均有重要意义。
本发明所建立的双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等特点，为临床上单核增生李斯特菌和屎肠球菌的快速检测、鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法，对准确诊断及全面的流行病学调查均有重要意义。
附图说明
图1：双重PCR扩增产物。M：Marker，1：屎肠球菌DNA；2：单核增生李斯特菌DNA；3：屎肠球菌、单核增生李斯特菌混合DNA；4：无模板对照。
图2：双重PCR的特异性。M：Marker，1：屎肠球菌和单核增生李斯特菌；2～10分别为：屎肠球菌临床分离株C1、屎肠球菌临床分离株C2、单增李斯特杆临床分离株L1、单增李斯特杆临床分离株L2、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型、马链球菌兽疫 亚种、禽巴氏杆菌、绵羊肺炎支原体。
图3：双重PCR的灵敏性。M：Marker，1～9分别为：屎肠球菌DNA浓度分别为4.32×10²ng～4.32×10^-6ng；单核增生李斯特菌DNA浓度分别为4.3×10²ng～4.3×10^-6ng。
图4：人工污染样品检测灵敏度。M：Marker，1～7各菌株含量分别为10⁸CFU/mL～×10²CFU/mL。
具体实施方式
实施例1.本发明引物的设计和筛选
根据已知的单核增生李斯特菌和屎肠球菌的基因组全长序列，筛选特定基因进行引物设计，最终选定单核增生李斯特菌hlyA以及屎肠球菌种ddl基因，设计并筛选其特异性引物(表1)，分别标记为LM-F(SEQ ID NO:1)、LM-R(SEQ ID NO:2)、EFM-F(SEQ ID NO:3)、EFM-R(SEQ ID NO:4)。
表1引物信息

实施例2.筛选双重PCR反应体系的建立及优化
2.1基因组提取 
将屎肠球菌临床分离株、单核增生李斯特菌临床分离株(本实验室保存)接种营养琼脂培养基上进行纯培养，再挑单一菌落于相应增菌液中继续培养至对数生长中后期，取2mL菌液10,000rpm离心1min，收集菌体，用细菌DNA提取试剂盒分别提取2种菌株的基因组DNA，-20℃保存备用。
2.2多重PCR反应体系的建立及优化
采用25μL的PCR反应体系进行检测，包括：2x Es Taq MasterMix 12.5μL，DNA模板2μL，引物各0.25μL，灭菌去离子水补足至25μL。反应条件参照试剂说明进行，并设定不同退火温度来确定最佳反应条件。
实施例3.双重PCR反应体系的特异性及灵敏度
3.1双重PCR的特异性
为了评价所建立方法的特异性，利用标准菌株以及实验室保存的2株屎肠球菌临床分离株、2株单核增生李斯特菌临床分离株、大肠杆菌0157、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、巴氏杆菌以及绵羊肺炎支原体的基因组DNA为模板，同法进行PCR检测。
3.2双重PCR的灵敏性
分别提取两菌株基因组DNA，经核酸浓度测定后分别得到432ng/μL(屎肠球菌)和430ng/μL(单核增生李斯特菌)浓度的基因组DNA。将两种病原不同浓度的因组DNA按1∶1的体积进行混合作为模板，并进行10倍稀释，按优化的多重PCR反应条件分别进行PCR扩增。
3.3人工模拟样品检测
将培养至对数生长期的两种细菌进行计数，调整细菌浓度后各取1mL，与8mL新鲜采集的健康绵羊抗凝血混合(各菌终浓度为10⁸CFU/mL)并进行10倍梯度稀释。各取2mL人工模拟样品，加入溶血试剂后离心收集沉淀，采用试剂盒提取基因组DNA，进行双重PCR检测。
3.4结果
3.4.1双重PCR扩增
如图1所示，以单一菌株DNA为模板时，分别得到172bp或561bp的单一条带；而将两种病原DNA混合后作为模板，以优化后的47℃为退火温度进行双重PCR扩增，能得到预期大小的2个条带，与预期相符且对照则无任何扩增产物。
3.4.2特异性评价 
采用建立的双重PCR方法对屎肠球菌、单核增生李斯特菌的临床分离株以及其他多种病原菌的DNA进行检测，结果如图2显示，各屎肠球菌、单核增生李斯特菌以及混合菌株都能够扩增得到相应大小的条带，而其它非目的病原菌均无明显的特异性条带出现，表明该方法对屎肠球菌和单核增生李斯特菌的检测具有高度的特异性。
3.4.3灵敏性评价 
建立的双重PCR体系对屎肠球菌DNA的最低检测限为0.432pg，对单核增生李斯特菌的最低检测限为4.30pg(见图3)。
3.4.4人工感染样品的PCR检测
两种致病菌人工模拟感染血液后的PCR检测结果如图4所示，可以看到从人工感染的血液样品提取的基因组DNA中可以扩增得到相应的特异性条带，且人工感染样本中各菌株菌的检测限均为10³CFU-10⁵CFU/mL。
为建立能够同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌的方法，本发明根据单核增生李斯特菌的hlyA基因和屎肠球菌的ddl基因分别设计引物，建立了同时检测这两种病原的双重PCR检测方法。实验结果显示该方法能够特异性的扩增单核增生李斯特菌(172bp)和屎肠球菌(561bp)DNA片段，其最低检出量分别为0.432pg和4.30pg。该方法对常见的致病菌无交叉反应。对人工污染样品检测的检出限均为10³CFU-10⁵CFU/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  申请人名称
 
<120>  单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒及检测方法
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gcatctgcat tcaataaaga                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tgtcactgca tctccgtggt                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cgcagagcat gaagtgtcca                                                 20
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
cttctcggtt ttctgctttt gt                                              22