调控抗体血液动力学的方法.pdf

本发明发现，在含有FcRn结合区的多肽——IgG抗体的可变区残基中，使暴露在表面的残基变异、控制表面电荷，则可以调控IgG抗体的血液半衰期。通过本发明的方法，确认了血液半衰期得到调控的抗体可实际保有活性。本发明的方法与目标抗原的种类无关，广泛适用于IgG抗体等的可通过FcRn的补救途径回收的含有FcRn结合区的多肽。

1.  一种血液药代动力学得到调控的抗体的制备方法，其中该方法包含以下步骤：
(a)对编码抗体的核酸进行变异以改变至少一个选自下列氨基酸的氨基酸残基的电荷：位于所述抗体重链可变区的H1, H13, H16, H71, H73, H81, H83, H85和H97；和/或位于所述抗体轻链可变区的L18, L45, L79, L80和L107；
(b)培养宿主细胞，以使该核酸表达；以及
(c)从宿主细胞培养物中回收所述抗体。

2.  权利要求1所述的方法，其中抗体是IgG抗体。

3.  权利要求1所述的方法，其中，上述血液药代动力学的调控是对血液半衰期、平均血液停留时间、血液清除中任一项参数的调控。

4.  权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中氨基酸残基电荷的改变通过氨基酸置换进行。

5.  权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中所述变异的氨基酸残基是位于所述重链可变区的H97的氨基酸。

6.  权利要求1－5中任一项所述的方法，其中所述变异的氨基酸残基选自以下(a)或(b)任一组中的氨基酸残基：
(a) 谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；以及
(b) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。

调控抗体血液动力学的方法
本申请是国际申请日为2007年3月30日、国际申请号为PCT/JP2007/057036、进入国家阶段的申请号为200780019984.6、发明名称为“调控抗体血液动力学的方法”的PCT申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于调控抗体的血液动力学(血中動態)的抗体变异方法、含有在血液中动力学得到调控的抗体作为有效成分的药物组合物，及其制备方法等。
背景技术
抗体在血液中的稳定性高，副作用也少，因此作为药物受到人们的关注。其中，IgG型的抗体药物有很多已经上市，目前也有很多抗体药物正在开发(非专利文献1、非专利文献2)。人们开发了使效应子功能等增强的技术作为第二代抗体药物。例如已知有通过IgG抗体Fc区的氨基酸置换使抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)增强的技术(非专利文献3)。还有人报道了不仅使上述效应子功能增强，还使抗体的血液半衰期提高的Fc的氨基酸置换(非专利文献4、非专利文献5)。通过提高血液半衰期，有望降低给药量和延长给药间隔，可以提供低成本且便利性高的抗体药物。具体来说，通过在Fc区实施氨基酸置换，可以延长血液半衰期，所述的氨基酸置换可提高对于已知作为IgG的补救受体(Salvage receptor)的新生儿Fc受体的亲和性。另外，通过将CH1、CH2、CH3的恒定区进行改组(shuffling)，可以提高血液半衰期(非专利文献6)。但是，IgG抗体恒定区的氨基酸序列在人中较为保守，从免疫原性的角度考虑，导入到恒定区的人工氨基酸置换较少为好。
对于IgG抗体的可变区实施氨基酸置换的技术，有以下报道：以人源化(非专利文献7)，以及通过用于增强结合活性的互补决定区(CDR)的氨基酸置换形成亲和力成熟(非专利文献8)；通过框架区(FR)的氨基酸置换来提高物理化学稳定性(非专利文献9)。因此，与恒定区的氨基酸 置换不同，可变区的氨基酸置换是用于增强抗体的功能或提高特性通常采用的方法。由于人源化抗体的CDR的氨基酸序列是人以外的动物种的氨基酸序列，因此无需关注免疫原性的风险问题。另外，在FR序列中，只要与Kabat数据库(http：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http：//imgt.cines.fr/)中公开的人抗体的FR序列相同，则可以认为免疫原性的风险小。但是，目前只有通过上述恒定区的Fc的氨基酸置换作为提高IgG抗体血液半衰期的方法，而对于通过免疫原性风险小的可变区氨基酸置换提高IgG抗体的血液半衰期的方法目前尚未有报道。其原因可能是：IgG的血液半衰期与IgG的补救受体——新生儿Fc受体的结合以及其抗原依赖性的消除有很大的相关性(非专利文献10)，而可变区对于血液半衰期没有很大的影响。另外，通过使IgG琥珀酰化可以进行阴离子化，可以使IgG的等电点(pI)降低(非专利文献11)，或者通过多元胺修饰实现阳离子化，使IgG的pI升高(非专利文献12)，但在上述两种情况下血液半衰期没有提高，相反地缩短了，由此通过变异来改变pI无法提高血液半衰期。
另一方面，相对于全长抗体IgG，低分子量的低分子化抗体Fab或scFv的半衰期短，因此通过聚乙二醇等高分子进行修饰可以降低肾脏排泄，可以使血液半衰期提高(非专利文献13)。有报道称：除高分子修饰之外，改变低分子化抗体的等电点(pI)也可使其血液动力学发生变化。例如非专利文献14中公开了，用有机酸修饰抗-Tac Fab可使pI降低，AUC(曲线下面积)提高。而非专利文献15和非专利文献16中公开了，用有机酸修饰抗-Tac dsFv可使pI降低，同时AUC也降低。非专利文献17中公开了，通过氨基酸置换对抗Tac-scFv毒素的可变区施加变异使pI降低，半衰期(t1/2)和AUC也降低。非专利文献18中公开了，在scFv的C末端附加了使pI降低的氨基酸，但是AUC几乎未发生变化。如上所述，在低分子化抗体中，通过修饰以及氨基酸置换使pI降低时，AUC可能提高也可能降低，因此无法通过改变pI使血液半衰期按照目标进行调控。
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发明内容
针对上述状况，本发明的目的在于提供通过下述变异来调控含有FcRn结合区的多肽的血液半衰期的方法，其中所述的变异是通过对暴露于IgG抗体等含有FcRn结合区的多肽表面的氨基酸残基进行置换；本发明还提供包含下述多肽的药物组合物，以及这些药物组合物的制备方法，所述的多肽是通过氨基酸置换使其血液半衰期得到调控的、含有FcRn结合区的多肽。
本发明人对于通过氨基酸置换来调控含有FcRn结合区的多肽的血液半衰期的方法进行了深入的研究。结果，本发明人开发了在含有FcRn结合区的多肽——IgG抗体的可变区残基中，对暴露在表面的残基进行变异、控制表面电荷，由此调控IgG抗体在血液中的半衰期的方法。具体来说，发现了不会对抗体的功能、结构产生影响、可控制表面电荷、调控IgG抗体的血液半衰期的、可变区的变异位置。并且根据本发明确认了血液半衰期得到调控的抗体实际上保持有活性。
与目标抗原的种类无关、本发明的方法可广泛应用于IgG等含有FcRn结合区的多肽，所述的多肽通过FcRn补救途径再循环、其主代谢途径非肾脏排泄。
本发明涉及通过下述变异来调控含有FcRn结合区的多肽的血液半衰期的方法，其中所述的变异是通过对暴露于含有FcRn结合区的多肽表面的氨基酸残基进行置换；本发明还涉及包含下述多肽的药物组合物以及该药物组合物的制备方法，所述的多肽是通过氨基酸置换使其血液 半衰期得到调控的、含有FcRn结合区的多肽，更具体地说，提供以下内容：
[1]血液动力学得到控制的、含有FcRn结合区的多肽的制备方法，该方法包含以下步骤：
(a)为了使可暴露于含有FcRn结合区的多肽表面的至少一个氨基酸残基的电荷发生改变，对编码含有该氨基酸残基的多肽的核酸进行变异；(b)培养宿主细胞，以使该核酸表达；(c)从宿主细胞培养物中回收含有FcRn结合区的多肽。
[2][1]所述的方法，其中，上述可暴露在含有FcRn结合区的多肽表面的氨基酸残基位于含有FcRn结合区的多肽中FcRn结合区以外的区域。
[3][2]所述的方法，其中，上述FcRn结合区包含Fc区或Fc样区。
[4][1]所述的方法，其中，含有FcRn结合区的多肽是IgG抗体。
[5][4]所述的方法，其中，步骤(a)中电荷得到改变的氨基酸残基是IgG抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸残基。
[6][1]所述的方法，其中，上述血液动力学的调控是对血液半衰期、平均血液停留时间、血液清除中任一项参数的调控。
[7][1]所述的方法，其中，步骤(a)中氨基酸残基电荷的改变通过氨基酸置换进行。
[8]含有FcRn结合区的多肽，该多肽由[1]所述的方法制备。
[9]调控含有FcRn结合区的多肽的血液动力学的方法，该方法包括使可暴露于含有FcRn结合区的多肽表面的至少一个氨基酸残基的电荷发生改变。
[10][9]所述的方法，其中，上述可暴露在含有FcRn结合区的多肽表面的氨基酸残基位于含有FcRn结合区的多肽中FcRn结合区以外的区域。
[11][10]所述的方法，其中，上述FcRn结合区含有Fc区或Fc样区。
[12][9]所述的方法，其中，含有FcRn结合区的多肽是IgG抗体。
[13][12]所述的方法，其中，电荷发生改变的氨基酸残基是IgG抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸残基。
[14][9]所述的方法，其中，上述血液动力学的调控是对血液半衰期、平均血液停留时间、血液清除中任一项参数的调控。
[15][9]所述的方法，其中，氨基酸残基电荷的改变通过氨基酸置换进行。
[16]通过[9]的方法使血液动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽。
[17]人源化抗体，该人源化抗体含有来自人以外的动物的互补决定区(CDR)、来自人的框架区(FR)和人恒定区，其中，在CDR或FR中，可暴露在抗体表面的至少一个氨基酸残基是与野生型CDR或FR的相应位置上的氨基酸残基相比具有不同电荷的氨基酸残基，与可变区来自所述人以外的动物的抗体、且具有相同恒定区的嵌合抗体相比，该人源化抗体的血液动力学得到调控。
[18][17]所述的人源化抗体，其中，上述人恒定区含有野生型人Fc区。
[19]组合物，其含有[17]或[18]中所述的人源化抗体和可药用载体。
[20]核酸，其编码构成[17]或[18]所述的人源化抗体的多肽。
[21]宿主细胞，该宿主细胞具有[20]所述的核酸。
[22][17]或[18]所述的人源化抗体的制备方法，该方法包含培养[21]所述的宿主细胞的步骤；由细胞培养物回收多肽的步骤。
[23]IgG抗体，该抗体的重链可变区中选自Kabat编号的10号、12号、23号、39号、43号和105号的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基电荷发生改变，与该氨基酸残基发生改变前相比，该抗体的血液动力学得到调控。
[24][23]所述的IgG抗体，其中，上述变异的氨基酸残基选自以下(a)或(b)任一组中的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
[25]组合物，其含有[23]或[24]所述的IgG抗体和可药用载体。
[26]核酸，其编码构成[23]或[24]所述的IgG抗体的多肽。
[27]宿主细胞，该宿主细胞具有[26]所述的核酸。
[28][23]或[24]所述的抗体的制备方法，该制备方法包含培养[27]所述的宿主细胞的步骤；由细胞培养物回收多肽的步骤。
附图说明
图1是表示对人源化双特异性抗体(人源化A69(hA69a)/人源化B26(hB26-F123e4)/人源化BBA(hAL-F123j4))的凝固活性进行评价的结果的图。评价结果显示了与嵌合双特异性抗体具有同等以上的凝固活性。
图2是表示使用人源化A69-H链可变区(hA69a)和人源化BBA(hAL-F123j4)、以及人源化hB26-H链可变区(hB26-F123e4)和人源化BBA(hAL-F123j4)实施抗体建模(モデリング)的结果的图。强调显示了可以使表面电荷变化的氨基酸的支链。编号采用Kabat数据库的序列编号(Kabat EA等人.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)。
图3是表示ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF、hA69-N97R、hA69-p18、hB26-F123e4、hB26-p15的等电聚焦电泳分析的结果的照片。
图4是表示ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF、hA69-N97R、hA69-p18、hB26-F123e4、hB26-p15的等电聚焦电泳中的pI标记的校正曲线、以及由校正曲线计算的各样品的pI的图。可观察到：可变区氨基酸的不同导致表面电荷变化，以及氨基酸变异导致表面电荷变化，由此pI变化。
图5是表示使用未变异的、或可变区变异的人源化A69抗体(hA69a、hA69-N97R和hA69-N97R、hA69-p18、hA69-PF)分析与作为抗原的因子IXa的结合活性的结果的图。分析结果显示，等电点变化了的变异体与未经变异的抗体具有等同的结合活性。
图6是表示使用未变异的、或可变区变异的人源化B26抗体(hB26-F123e4、hB26-p15)分析与作为抗原的因子X的结合活性的结果的图。分析结果显示，等电点变化了的经变异的抗体与未经变异的抗体具有等同的结合活性。
图7是表示ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF在小鼠血浆中的浓度变化的图。
图8是表示作为ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF、hA69-N97R、hA69-p18、hB26-F123e4、hB26-p15的药物动力学参数的、清除(CL)和半衰期(T1/2)的相关性。
具体实施方式
本发明提供调控含有FcRn结合区的多肽的血液动力学的方法。作为本发明的方法的优选方案，提供了包含将可暴露于含有FcRn结合区 的多肽表面的至少一个氨基酸残基的电荷进行改变的方法。即，通过改变氨基酸残基的电荷，使含有FcRn结合区的多肽的等电点(pI)变化，由此可以调控该蛋白质的血液动力学。
如上所述，scFv或Fab等低分子抗体不一定能通过pI的改变来调控其血液动力学。已知scFv或Fab等低分子抗体的主要代谢途径是肾脏排泄。但是，非专利文献19-22中所示的肾脏排泄中，蛋白质的电荷的阴性越强则肾脏过滤效果越受到抑制，另一方面，也有蛋白质的电荷没有影响的报道。实际上，如非专利文献14-18所示，有使低分子化抗体的pI降低则可以使血液半衰期延长的报告，也有使血液半衰期缩短的报告。蛋白质的电荷为阴性，则肾脏过滤后的蛋白质被近端肾小管重新吸收的情形受到抑制，通过pI无法自由地调控低分子化抗体的血液半衰期。
另一方面，IgG抗体的分子量非常大，因此主要代谢途径不是肾脏排泄。已知具有Fc的IgG抗体通过在血管等内皮细胞中表达的FcRn的补救途径再循环，由此具有较长的半衰期，这可能是由于IgG主要在内皮细胞中代谢(非专利文献23)。即，被内皮细胞非特异性摄入的IgG与FcRn结合，IgG再循环，无法结合的分子被代谢。与FcRn的结合性降低的IgG，其血液半衰期缩短，相反提高与FcRn的结合性则可以使血液半衰期延长(非专利文献23)。如上所述，目前的IgG的血液动力学的调控方法是通过使Fc变异改变其与FcRn的结合性来进行，但本发明的实施例8中，无关乎目标抗原的种类，具有相同Fc的IgG的血液半衰期与pI具有高相关系数的相关性，实际上，对于针对不同的抗原的两种抗体，通过改变其可变区的pI，无需使Fc变异也可以调控血液半衰期。被内皮细胞非特异性摄入的速度可能与带有负电荷的细胞表面与IgG之间物理化学性的库仑相互作用有关，因此，通过降低(提高)IgG的pI，库仑相互作用降低(增大)，被内皮细胞的非特异性摄入减少(增多)，结果，通过使内皮细胞中代谢减少(增大)，可以调控血液动力学。内皮细胞的细胞表面负电荷的库仑相互作用是物理化学性相互作用，因此可以认为该相互作用不依赖于目标抗原。因此，本发明中发现的血液动力学的调控方法可广泛应用于不依赖于目标抗原种类的、任意的IgG等含有FcRn结合区的多肽，此类多肽通过FcRn的补救途径再循环、主要代谢途径不是肾脏排泄。
因此，本发明的含有FcRn结合区的多肽不限定于IgG抗体，只要是可以与Fc受体(FcRn)结合(具有结合活性或亲和性)的蛋白质即可，本发明的含有FcRn结合区的多肽没有特别限定，优选可以是含有抗体的Fc区或Fc样区的蛋白质。本发明的含有FcRn结合区的多肽，例如IgG抗体。这些抗体(蛋白质)的变异体只要是可与FcRn结合的蛋白质即包含在本发明的含有FcRn结合区的多肽之中。本发明中，含有FcRn结合区的多肽的最优选例子为IgG抗体。
使用IgG抗体作为本发明的含有FcRn结合区的多肽时，只要是IgG型的抗体分子即可，可以是任何亚型，也可以是双特异性IgG抗体。双特异性抗体是针对两种不同的表位具有特异性的抗体，除识别不同抗原的抗体之外，也包含识别同一抗原上的不同表位的抗体。另外，如上所述，当抗体分子如scFv或Fab，是以肾脏排泄作为主要代谢途径的低分子化抗体时无法通过pI调控血液动力学，但本发明中，只要是不以肾脏排泄作为主要的代谢途径的Fc结合蛋白即可，可以采用任何抗体分子形式，例如，scFv-Fc、bAb-Fc、Fc融合蛋白等。这些分子不以肾脏排泄作为主要的代谢途径，因此，采用本发明的方法来改变pI，则可调控血液动力学。可适用于本发明的抗体分子可以是抗体样分子。抗体样分子是通过与靶分子结合而发挥功能的分子(非专利文献30)，例如有DARPins、Affibody、Avimer等。
本发明中，“血液动力学得到调控”是指含有FcRn结合区的多肽在变异前和变异后的血液动力学进行比较，血液动力学朝目标方向变化。即，当目标是为了延长血液半衰期时，血液动力学的调控是指延长血液半衰期；当目的为缩短血液半衰期时，血液动力学的调控意味着使血液半衰期缩短。
本发明中，含有FcRn结合区的多肽的血液动力学是否朝目标方向变化、即血液动力学是否按照目标调控，可通过例如使用小鼠、大鼠、兔、狗、猴等的动力实验来适当评价。本发明的“血液动力学的调控”更具体地说，包含对血液半衰期、平均血液停留时间、或血液清除等任何参数(フア一マュキネテイクス演習による理解(南山堂))的调控。例如，使用体内动力分析软件WinNonlin(Pharsight)，按照所附说明书，通过Noncompartmental分析可适当评价。
本发明中，“可暴露于表面的氨基酸”通常是指构成FcRn结合区的 多肽的、位于多肽的表面的氨基酸。位于多肽的表面的氨基酸是其支链可与溶剂分子(通常为水分子)相接触的氨基酸，不一定是整个支链都与溶剂分子接触，支链的一部分与溶剂分子接触时，该氨基酸也是位于表面的氨基酸。本领域技术人员通过使用市售的软件进行的同源性建模等，可以制备多肽或抗体的同源模型，由此可以选择使适当的残基位于表面的氨基酸。
本发明中，“可暴露于表面的氨基酸”没有特别限定，优选位于含有FcRn结合区的多肽中FcRn结合区以外。该FcRn结合区例如Fc区或Fc样区。
本发明的含有FcRn结合区的多肽为IgG时，本发明中的改变电荷的氨基酸残基优选为IgG抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸残基。该可变区具体有：互补决定区(CDR)、框架区(FR)等。
本领域技术人员可以通过由同源性建模等制备的同源性模型来适当选择抗体可变区中的表面氨基酸，例如在H链FR区，可例举H1，H3，H5，H8，H10，H12，H13，H15，H16，H19，H23，H25，H26，H39，H42，H43，H44，H46，H68，H71，H72，H73，H75，H76，H81，H82b，H83，H85，H86，H105，H108，H110，H112为表面氨基酸，但本发明并不限于此。
H链的CDR区同样可通过同源性模型选择表面氨基酸，例如H97几乎整个抗体暴露在表面。在L链的FR区例如L1，L3，L7，L8，L9，L11，L12，L16，L17，L18，L20，L22，L38，L39，L41，L42，L43，L45，L46，L49，L57，L60，L63，L65，L66，L68，L69，L70，L74，L76，L77，L79，L80，L81，L85，L100，L103，L105，L106，L107，L108作为表面氨基酸，但本发明并不限于此。L链的CDR区同样可通过同源模型选择表面氨基酸。
本发明的方法中，氨基酸残基的“变异”具体指将原有的氨基酸残基置换为其它的氨基酸残基、使原有的氨基酸残基缺失、附加新的氨基酸残基等，优选指将原有的氨基酸残基置换为其它的氨基酸残基。即，本发明的“氨基酸残基电荷的改变”优选包括氨基酸置换。
本发明中，含有FcRn结合区的多肽为IgG抗体时，为了实现上述“使氨基酸残基的电荷改变”的目的，例如使选自该IgG抗体的重链可变区中的Kabat编号中10号、12号、23号、39号、43号和105号氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的电荷发生改变的方案。上述编号中所示的氨基酸残基中，该电荷被改变的氨基酸残基以外的氨基酸残基只要可实现 目标血液动力学的调控即可，无需对其进行变异，也可以适当变异为具有与变异的氨基酸残基同种电荷，或者不具有电荷。
氨基酸中已知有带有电荷的氨基酸。通常带有正电荷的氨基酸(正电荷氨基酸)有赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。带有负电荷的氨基酸(负电荷氨基酸)已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。已知除此以外的氨基酸不带有电荷。
上述“变异的氨基酸残基”优选从以下的(a)或(b)的任意一组所含的氨基酸残基中适当选择，没有特别限定。
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)
原有的(变异前的)氨基酸残基已经具有电荷时，将其变异成不具有电荷的氨基酸残基，这也是本发明的优选方案之一。即，本发明的变异有：(1)由具有电荷的氨基酸置换为不具有电荷的氨基酸，(2)由具有电荷的氨基酸置换为具有与原有电荷相反的电荷的氨基酸，(3)由不具有电荷的氨基酸置换为具有电荷的氨基酸。
本发明的方法中，优选使氨基酸残基变异，使含有FcRn结合区的多肽的等电点(pI)变化。通过变异导入多个氨基酸残基时，这些氨基酸残基中，可以含有少量的不带电荷的氨基酸残基。
本发明的方法中，可进行变异的氨基酸残基的数目没有特别限定，例如，使抗体的可变区变异时，优选在不使所述抗体与抗原的结合活性降低、不提高其免疫原性、可实现调控血液动力学目标所需的、最低限度的氨基酸残基变异。
为了不提高免疫原性，优选变异后的氨基酸序列为人序列，但本发明并不限于此。还可以向为了使等电点变化所导入的变异以外的位置引入突变，使变异后的FR(FR1、FR2、FR3、FR4)均为人序列。如上所述，将各FR置换为人序列的方法在非专利文献(Ono K.等人.，Mol.Immunol.1999Apr；36(6)：387-395)中有报道。为了使各FR的等电点变化，也可以将其变异为等电点不同的其它人FR(例如将FR3与等电点低的其它的人FR交换)。上述人源化方法在非专利文献(Dall’Acqua WF.，Methods.2005May；36(1)：43-60)中有报道。
在对少量的表面电荷进行变异未实现调控血液动力学的目标时，通过反复进行表面电荷的改变和血液动力学评价，可以获得所需要的血液 动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽。
非专利文献24中，将抗E，P-Selectin抗体的嵌合抗体(IgG4)——嵌合EP5C7.g4和人源化抗体(IgG4)HuEP5C7.g4在猕猴中的血液动力学进行比较，结果显示两者血液动力学同等。另外，非专利文献25中，将抗CD154抗体的嵌合型抗体——ch5d8与人源化抗体Hu5c8在食蟹猴中血液动力学进行比较，结果显示两者血液动力学同等。非专利文献26中显示：嵌合抗体cCC49与人源化抗体HuCC49在小鼠中血液动力学同等。另外，在非专利文献27和非专利文献28中，对于在小鼠中的评价，小鼠抗体与人源化抗体的血液动力学、分布显示为同等，小鼠Fc和人Fc均可与小鼠FcRn交叉反应，因此可以认为该嵌合抗体与该人源化抗体的血液动力学、分布同等。如这些例子所示，嵌合抗体与人源化抗体之间的血液动力学同等。即，按照非专利文献7等中公开的公知方法进行人源化时，与嵌合抗体比较，血液动力学同等，按照公知的方法是无法制备血液动力学得到调控的人源化抗体的。
根据本发明的方法，在将嵌合抗体人源化时，通过使表面氨基酸变异，可以使抗体的pI变化，由此与嵌合抗体比较，可以制成血液动力学得到调控(即，血液半衰期延长，或血液动力学降低)的人源化抗体。用于调控血液动力学的表面氨基酸的变异可以与人源化同时进行，或者进一步使人源化抗体变异。
非专利文献29中记载，使用相同人抗体的FR序列进行人源化得到的三种人源化抗体曲妥单抗、贝伐单抗、帕妥单抗(pertuzumab)的血液动力学大致相等。即，使用相同FR序列进行人源化时，血液动力学大致同等。为了调控血药浓度，除上述人源化步骤之外，根据本发明中发明的方法，通过对表面氨基酸施加变异，使抗体的pI变化，由此使血药浓度调控首次成为可能。
对于由人抗体文库或生成人抗体的小鼠等制备的人抗体的表面氨基酸进行变异，使抗体的pI改变，则与最初制备的人抗体相比，可以制备血液动力学得到调控的(即血液半衰期延长或血液动力学将低)的人抗体。
如上所述，本发明中的“抗体”包含对上述使氨基酸残基的电荷改变的抗体进一步通过氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入等使氨基酸序列发生变异的抗体。还包含对于通过氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入， 或者嵌合化或人源化等使氨基酸序列发生变异的抗体进一步使氨基酸残基的电荷改变的抗体。
氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入，以及人源化、嵌合化等氨基酸序列的变异可按照本领域所公知的方法进行。同样，以重组抗体的形式制备本发明的抗体时所利用的抗体的可变区和恒定区也可通过氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入，或嵌合化或人源化等来使其氨基酸序列变异。
本发明的抗体可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来自任何动物的抗体。并且，可以是经变异的抗体，例如将嵌合抗体、氨基酸序列进行置换得到的人源化抗体等。还可以是结合有各种分子的抗体修饰物。
“嵌合抗体”是指将来自不同的动物的序列组合制备的抗体。例如，可以是含有小鼠抗体的重链、轻链的可变(V)区和人抗体的重链、轻链的恒定(C)区的抗体。嵌合抗体的制备是公知的，例如可以将编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中，导入宿主由此可获得嵌合抗体。
“人源化抗体”也称为重构人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)置换到人抗体的CDR所得。鉴定CDR的方法是公知的(Kabat等人.，Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987)，National Institute of Health，Bethesda，Md.；Chothia等人.，Nature(1989)342：877)。另外，其常规的基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开编号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。因此，通过公知的方法，例如可以确定小鼠抗体的CDR，获得编码该CDR与人抗体的框架区(FR)连接而得的抗体的DNA，通过使用通常的表达载体所得的系统生产人源化抗体。上述DNA可以使用在CDR和FR两者的末端区具有重叠部分的多个寡核苷酸作为引物，通过PCR法合成(参照WO98/13388号公报所述方法)。对经CDR连接的人抗体的FR进行选择，以使CDR形成良好的抗原结合部位。还可根据需要使抗体可变区中的FR的氨基酸变异，以使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位(Sato，K.等人.，Cancer Res.(1993)53：851-6)。FR中可变异的氨基酸残基包含与抗原直接结合、或通过非共价键结合的部分(Amit等人.，Science(1986)233：747-53)、对于CDR的结构有影响或与之作用的部分(Chothia 等人.，J.Mol.Biol.(1987)196：901-17)以及与VH-VL相互作用相关的部分(EP239400号专利公报)。
本发明的抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，这些抗体的C区优选使用来自人抗体的区。例如，H链可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、L链可以使用Cκ、Cλ。为了改善抗体或其生产的稳定性，可以根据需要修饰人抗体C区。本发明中的嵌合抗体优选含有来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的恒定区。人源化抗体优选含有来自人以外的哺乳动物的抗体的CDR、以及来自人抗体的FR和C区。来自人抗体的恒定区是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等的同种型具有固有氨基酸序列。本发明的人源化抗体中使用的恒定区可以是属于任意同种型的抗体的恒定区。优选使用人IgG的恒定区，但并不限于此。另外，在人源化抗体中所利用的来自人抗体的FR也没有特别限定，可以是属于任意同种型的抗体。
本发明的嵌合抗体和人源化抗体的可变区和恒定区在保证可显示原有抗体的结合特异性的条件下，可以通过缺失、置换、插入和/或附加等进行变异。
利用来自人的序列得到的嵌合抗体和人源化抗体中，在人体内的免疫原性降低，因此可根据治疗目的等给予人。
本发明的方法中，编码导入突变前的抗体(本说明书中可简称为“本发明的抗体”)的H链或L链的基因可使用已知的序列，还可以按照本领域公知的方法获得。例如可以从抗体文库中获得，还可以从生产单克隆抗体的杂交瘤中克隆编码抗体的基因来获得。
关于抗体文库，已公知很多抗体文库，抗体文库的制备方法也是公知的，因此，本领域人员可以获得适当的抗体文库。例如对于抗体噬菌体文库可以参照Clackson等人.，Nature 1991，352：624-8；Marks等人.，J.Mol.Biol.1991，222：581-97；Waterhouses等人.，Nucleic Acids Res.1993，21：2265-6；Griffiths等人.，EMBO J.1994，13：3245-60；Vaughan等人.，Nature Biotechnology 1996，14：309-14；以及日本特表平10-504970号公报等文献。其它还可以使用将真核细胞制成文库的方法(WO95/15393号说明书)或核糖体展示法等公知的方法。并且还已知由使用人抗体文库、通过淘选获得人抗体的技术。例如，可以将人抗体的可变区制成单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的 噬菌体。对所选择的噬菌体的基因进行分析，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果了解了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以以该序列为基础制备适当的表达载体，获得人抗体。这些方法是已知的，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
由杂交瘤获得编码抗体的基因的方法基本上可以使用公知技术，可如下获得：使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，将其按照常规的免疫方法进行免疫，将所得免疫细胞通过通常的细胞融合与公知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法筛选单克隆的抗体生成细胞(杂交瘤)，使用反转录酶，从所得杂交瘤的mRNA中合成抗体的可变区(V区)的cDNA，将其与编码抗体恒定区(C区)的DNA连接。
更具体地说，用于获得编码上述H链和L链的抗体基因的致敏抗原包含具有免疫原性的完全抗原和譬如含有不显示免疫原性的半抗原等的不完全抗原，但并不限于此。例如可以使用目标蛋白质的全长蛋白或部分肽等。除此之外还已知由多糖类、核酸、脂质等构成的物质可以作为抗原，本发明的抗体的抗原没有特别限定。抗原的制备可按照本领域公知的方法进行，例如可按照使用杆状病毒的方法(例如WO98/46777等)进行。杂交瘤的制备例如可按照Milstein等人.(G.Kohler和C.Milstein，Methods Enzymol.1981，73：3-46)的方法等进行。抗原的免疫原性低时，可以与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合，进行免疫。还可根据需要使抗原与其它分子结合，制成可溶性抗原。使用受体等的跨膜分子作为抗原时，可以使用受体胞外区部分作为片段，或使用在细胞表面上表达跨膜分子的细胞作为免疫原。
抗体生成细胞可使用上述的适当致敏抗原免疫动物获得。或者将可生成抗体的淋巴细胞进行体外免疫，制成抗体生成细胞。被免疫的动物可使用各种哺乳动物，通常使用啮齿目、兔目、灵长目动物。例如，小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿目动物。兔等兔目动物。食蟹猴、猕猴、狒狒、黑猩猩等的灵长目动物。除此之外，还包括具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物，使用上述动物也可以获得人抗体(参照WO96/34096；Mendez等人.，Nat.Genet.1997，15：146-56)。例如在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞，将致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，以此作为使用上述转基因动物的替代方式，也可以获 得与抗原具有结合活性的所需的人抗体(参照日本特公平1-59878号)。另外，具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物用所需抗原免疫，则可以获得所需的人抗体(参照WO93/1227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735)。
动物的免疫例如可如下进行：用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水等将致敏抗原稀释并悬浮，根据需要混合佐剂进行乳化，然后注射到动物的腹腔内或皮下。然后优选每隔4-21天给予数次与氟氏不完全佐剂混合的致敏抗原。抗体生成的确认可通过常用的方法测定动物血清中的目标抗体效价来进行。
杂交瘤可以用常用的融合剂(例如聚乙二醇)，将从用所需抗原免疫了的动物或由淋巴细胞中得到的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合制备(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986，59-103)。还可根据需要培养杂交瘤细胞，使其增殖，通过免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法测定由该杂交瘤生成的抗体的结合特异性。然后根据需要将生产测定了目标特异性、亲和性或活性的生成抗体的杂交瘤通过有限稀释法等方法进行亚克隆。
接着，使用可与抗体特异性结合的探针(例如与编码抗体恒定区的序列互补的寡核苷酸等)，从杂交瘤或抗体生成细胞(致敏淋巴细胞等)中克隆编码被选择的抗体的基因。还可以通过RT-PCR从mRNA中克隆。免疫球蛋白分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五个不同的类。并且这些类又分为几种亚类(同种型)(例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2等)。本发明中，在抗体的制备中使用的H链和L链可以来自属于上述任意的类和亚类的抗体，没有特别限定，特别优选IgG。
这里，可以通过基因工程的方法将使编码H链和L链的基因变异。例如对于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、绵羊抗体、骆驼抗体等抗体，为了降低其与人的异种免疫原性等，可以适当制备人工变异的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。嵌合抗体是含有人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的H链、L链的可变区和人抗体的H链、L链的恒定区的抗体，可如下获得：将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其整合到表达载体中，导入宿主并生产。人源化抗体也称为重构人抗体，如下合成：设计成其末端部与下 述DNA序列具有重叠部分的多个寡核苷酸，通过PCR法合成与小鼠之类的、人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区(CDR)相连的DNA序列。将所得DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入宿主并生成抗体(参照EP239400，WO96/02576)。选择经由CDR连接的人抗体的FR，以使得互补决定区形成良好的抗原结合部位。还可以根据需要，置换抗体的可变区的框架区的氨基酸，使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(K.Sato等人.，Cancer Res.1993，53：851-856)。
除上述人源化之外，还可以为了改善与抗原的结合性等抗体的生物学特性对抗体实施变异。本发明的变异可通过位点定向诱变(例如参照Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)、PCR突变、盒突变法等方法进行。通常，生物学特性得到改善的抗体突变体与原有的抗体的可变区的氨基酸序列具有70％或以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上(例如95％以上、97％、98％、99％等)的氨基酸序列同源性和/或相似性。本说明书中，序列的同源性和/或相似性是通过序列比对以及根据需要导入缺口使序列同源性值获得最大化后，与原有的抗体残基相同(相同残基)或相似(通常根据氨基酸支链的特性被分类为同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的比例定义的。通常，天然的氨基酸残基根据其支链的性质被分类为(1)疏水性：丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸；(2)中性亲水性：天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸；(3)酸性：天冬氨酸和谷氨酸；(4)碱性：精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(5)对链的取向有影响的残基：甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性：酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
通常，存在于H链和L链可变区中的全部中，6个互补决定区(超可变部；CDR)相互作用，形成抗体的抗原结合部位。已知与含有全部结合部位的情况相比，仅一个可变区的亲和性较低，但是其仍具有识别抗原并结合的能力。因此，对于本发明的编码H链和L链的抗体基因，只要该基因所编码的多肽可以保持与所需抗原的结合性即可，可以编码含有H链和L链各抗原结合部位的片段部分。
重链可变区如上所述，通常由3个CDR区和4个FR区构成。本发明的优选方案中，进行“变异”的氨基酸残基可以在位于CDR区或FR区的氨基酸残基中适当选择。通常CDR区的氨基酸残基的变异可以使其 与抗原的结合能力降低。因此，本发明中，进行“变异”的氨基酸残基虽然没有特别限定，但优选从位于FR区的氨基酸残基中适当选择。对于CDR，如果确认即使进行了变异，其结合能力也不降低，则可以选择该位置。
在人或小鼠等生物中，本领域技术人员可以利用公共数据库等适当获得可用作抗体的可变区的FR的序列。
本发明进一步涉及通过本发明的方法使血液动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽。
本发明的优选方案中，提供通过本发明的方法使血液动力学得到调控的人源化抗体。该人源化抗体例如是该人源化抗体含有来自人以外的动物的互补决定区(CDR)、来自人的框架区(FR)和人恒定区，其中，在CDR或FR中，可暴露在抗体表面的至少一个氨基酸残基是与野生型CDR或FR的相应位置上的氨基酸残基相比具有不同电荷的氨基酸残基，与可变区来自所述人以外的动物的抗体、且具有相同恒定区的嵌合抗体相比，该人源化抗体的血液动力学得到调控。
上述人恒定区优选指含有野生型人Fc区的区域，可以是变异的Fc。
本发明还涉及含有FcRn结合区的多肽的制备方法，其中，所述的多肽血液动力学已通过本发明的方法得到调控。即，本发明提供血液动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽的制备方法。并且，由本发明的方法制备的含有FcRn结合区的多肽也包含在本发明中。
本发明的制备方法的优选方案是血液动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽的制备方法，该方法包含以下步骤：(a)为了使可暴露于含有FcRn结合区的多肽表面的至少一个氨基酸残基的电荷发生改变，对编码含有该氨基酸残基的多肽的核酸进行变异；(b)培养宿主细胞，以使该核酸表达；(c)从宿主细胞培养物中回收含有FcRn结合区的多肽。
本发明的上述方法中，“使核酸变异”是指使核酸变异，以使其对应于通过本发明的“变异”而导入的氨基酸残基。更具体地说，对于编码原有的(变异前)氨基酸残基的核酸，变异为编码通过变异导入的氨基酸残基的核酸。通常是指对于原有的核酸进行至少一个碱基的插入、缺失或置换等基因操作或突变处理，形成编码目标氨基酸残基的密码子。即，编码原有氨基酸残基的密码子置换为编码通过变异导入的氨基酸残基的密码子。上述核酸的变异可使用本领域公知的技术、例如位点定向诱 变法、PCR突变导入法等适当实施。
本发明的核酸通常是担载(插入)于适当的载体上，导入到宿主细胞中。该载体只要可稳定保有插入的核酸即可，没有特别限定，例如，宿主如果使用大肠杆菌，则克隆用的载体优选pBluescript载体(Stratagene制备)等，还可利用市场销售的各种载体。为了生产本发明的多肽而使用载体时，优选使用表达载体。表达载体只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可，没有特别限定，例如，如果在试管内表达则优选pBEST载体(プロメガ制备)，如果在大肠杆菌中表达则优选pEP载体(Invitrogen制备)，如果在培养细胞中表达则优选pME18S-SL3载体(GenBank登录号No.AB009864)，如果在生物个体中表达则优选pME18S载体(Mol Cell Biol.8：466-472(1988))等。本发明的DNA向载体中的插入可通过常规方法，例如可通过使用限制酶切位点的连接酶反应进行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section 11.4-11.11)。
上述宿主细胞没有特别限定，可以根据目的使用各种宿主细胞。用于表达多肽的细胞，例如有细菌细胞(例如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌)、真菌细胞(例如酵母、曲霉)、昆虫细胞(例如黑腹果蝇S2、夜蛾SF9)、动物细胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤细胞)和植物细胞。将载体导入宿主细胞，例如可通过磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section9.1-9.9)、脂转染法、显微注射法等公知的方法进行。
为了使在宿主细胞中表达的多肽在内质网的内腔中、周质中、或者细胞外的环境中分泌，可以将适当的分泌信号整合到目标多肽中。这些信号对于目标多肽可以是内源性，也可以是外源的信号。
上述制备方法中，对于多肽的回收，当本发明的多肽分泌到培养基中时则回收培养基。本发明的多肽在细胞内产生时，首先溶解该细胞，然后回收多肽。
从重组细胞培养物中回收本发明的多肽并纯化时，可以采用包含磷酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析等公知的方法。
本发明还涉及含有通过本发明的方法使血液动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽(例如IgG抗体)以及可药用载体的组合物(药物)。
本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或者检查、诊断的药物。
本发明的药物组合物可以按照本领域所公知的方法制成制剂。例如，可以以与水或其它的药学可接受的液体形成的无菌性溶液或混悬剂的注射剂形式非口服使用。例如，可以与药理学可接受的载体或介质、具体来说灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘结剂等适当组合，以公认的制药中所要求的单位用量形式混合，制成制剂。这些制剂中的有效成分量设定为可获得所指示的范围的适当的容量。
用于注射的灭菌组合物可使用注射用蒸馏水之类的载体，按照通常的制剂实施进行配制。
注射用的水溶液例如有：含有生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助试剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)的等渗液。也可以结合使用适当的溶解助剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇80(TM)、HCO-50等)。
油性液体有芝麻油、大豆油，溶解助剂可以结合使用苯甲酸苄酯和/或苄醇。还可以配合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苄醇和苯酚)、抗氧化剂。制备的注射液通常填充在适当的安瓿瓶中。
本发明的药物组合物优选非口服给予。例如可以制成注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、透皮给予型的组合物。例如通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等可以全身或局部给予。
给予方法可根据患者的年龄、症状适当选择。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给予量例如可设定为每次按照1公斤体重为0.0001mg-1000mg的范围。或者例如每位患者可以是0.001-100000mg的给予量，本发明并不限于这些数值。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等变化，本领域技术人员可考虑这些条件适当设定给予量和给予方法。
本发明还提供编码下述多肽的核酸，其中，所述多肽为通过本发明的方法使血液动力学得到调控的、含有FcRn结合区的多肽(例如人源化 抗体等)。并且带有该核酸的载体也包含在本发明中。
本发明进一步提供具有上述核酸的宿主细胞。该宿主细胞没有特别限定，例如有大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞例如可以以用于本发明的抗体或多肽的制备或表达的生产体系的形式使用。用于制备多肽的生产体系中有体外和体内的生产体系。体外的生产体系有使用真核细胞的生产体系和使用原核细胞的生产体系。
可作为宿主细胞使用的真核细胞例如有动物细胞、植物细胞、真菌细胞。动物细胞例如有哺乳类细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾细胞)、HeLa、Vero等，两栖类细胞例如非洲爪蟾卵细胞(Valle，等人.，Nature(1981)291：338-340)、以及昆虫细胞例如Sf9、Sf21、Tn5。本发明的抗体的表达中，优选采用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7细胞、HEK293细胞、BHK细胞。动物细胞中，为了大量表达，特别优选CHO细胞。载体对宿主细胞的导入例如可通过磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子性脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim制备)的方法、电穿孔法、脂转染等方法进行。
植物细胞例如已知有来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞和浮萍(Lemna minor)作为蛋白质生产体系，通过将该细胞进行愈伤组织培养可以生产本发明的抗体。真菌细胞公知有使用酵母例如酵母属(Saccharomyces)的细胞(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)等)；和丝状菌例如曲霉属(Aspergillus)的细胞(黑曲霉(Aspergillus niger)等)的蛋白质表达体系，可用作本发明的抗体生成的宿主。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产体系。细菌细胞除上述大肠杆菌之外，还已知使用枯草杆菌的生产体系，也可用于本发明的抗体生成。
使用本发明的宿主细胞生产抗体时，可以对用含有编码本发明抗体的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞进行培养，使多核苷酸表达。培养可按照公知的方法进行。例如以动物细胞为宿主时，培养液例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，可以结合使用FBS、胎牛血清(FCS)等血清补液，通过无血清培养进行细胞培养。培养时的pH优选约6-8。培养通常在约30-40℃下进行约15-200小时，可以根据需 要进行培养基的更换、通气、搅拌。
体内生产多肽的体系，例如有使用动物的生产系统或使用植物的生产系统。向这些动物或植物中导入目标多核苷酸，在动物或植物的体内生成多肽并回收。本发明的“宿主”包含这些动物、植物。
使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产体系。哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。使用哺乳类动物时，可以使用转基因动物。
例如将编码本发明的抗体的多核苷酸和编码如山羊β酪蛋白等，生产乳汁中特有的多肽的基因以融合基因的形式制备。接着，将含有该融合基因的多核苷酸片段注入到山羊的胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。从接受了胚胎的山羊所生产的转基因山羊、或其子代所生产的乳汁中可以获得目标抗体。为了使含有由转基因山羊生产的抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊适当给予激素(Ebert等人.，Bio/Technology(1994)12：699-702)。
生产本发明的抗体的昆虫例如可以使用蚕。使用蚕时，使插入了编码目标抗体的多核苷酸的杆状病毒感染蚕，由此可从蚕的体液中获得目标抗体(Susumu等人.，Nature(1985)315：592-594)。
将植物用于本发明的抗体生产时，例如可以使用烟草。使用烟草时，将编码目标抗体的多核苷酸插入到植物表达用的载体例如pMON 530中，将该载体导入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等的细菌中。将该细菌感染烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)，可由该烟叶获得所需抗体(Ma等人.，Eur.J.Immunol.(1994)24：131-8)。将同样的细菌感染浮萍，进行克隆后可由浮萍的细胞中获得所需抗体(Cox K.M.等人.，Nat.Biotechnol.2006Dec；24(12)：1591-1597)。
上述得到的抗体可从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)中分离，纯化为基本上纯的、均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常在多肽的纯化中使用的分离、纯化方法，并没有特别的限定。例如可以将层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳法、透析、重结晶等适当选择、组合，分离并纯化抗体。
层析例如有：亲和层析、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤、 反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人.，(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。这些层析可以使用液相层析例如HPLC、FPLC等液相层析进行。亲和层析中使用的柱有蛋白A柱、蛋白G柱。例如使用蛋白A的柱有：Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。
还可以根据需要，在抗体的纯化前或纯化后使适当的蛋白质修饰酶作用，由此可以施加任意的修饰，或可部分地除去肽。蛋白质修饰酶例如可使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
如上所述，包含培养本发明的宿主细胞、由该培养物中回收下述多肽的步骤的多肽的制备方法也是本发明的优选方案之一，所述多肽的血液动力学得到调控、且含有FcRn结合区。
本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照援引到本说明书中。
实施例
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
[实施例1]双特异性抗体的人源化
在日本特愿2005-112514中，对于缩短凝血时间最为有效的、含有抗FactorIXa抗体A69-VH、抗FactorX抗体B26-VH、杂合L链(BBA)的组合的双特异性抗体如下进行人源化。
1-1人抗体的同源性检索
由一般公开的Kabat数据库(ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http：//imgt.cines.fr/)获得人抗体氨基酸序列数据，使用构建的数据库，对小鼠A69-H链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO.15)、小鼠B26-H链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO.16)、小鼠BBA-L链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO.17)分别进行同源性检索。结果可以确认与以下所示人抗体序列具有高同源性，可用作人源化抗体的框架区(以下称为FR)。
(1)A69-H链可变区：KABATID-000064(Kabat数据库)
(Kipps等人.，J.Clin.Invest.1991；87：2087-2096)
(2)B26-H链可变区：EMBL登录号AB063872(IMGT数据库)
(未公开数据)
(3)BBA-L链可变区：KABATID-024300(Kabat数据库)
(Welschof等人.，J.Immunol.Method.1995；179：203-214)
将各小鼠抗体的互补决定区(以下称为CDR)移植到(1)-(3)的人抗体的FR，制备人源化抗体。
使用NCBI中一般公开的同源性检索网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，检索与(4)-(6)的人抗体同源性高的人抗体分泌信号序列。使用检索得到的、以下所示的分泌信号序列。
(4)A69-H链可变区：Genbank登录号AF062257。
(5)B26-H链可变区：Genbank登录号AAC18248。
(6)BBA-L链可变区：Genbank登录号AAA59100。
1-2人源化抗体基因表达载体的构建
相应于编码由分泌信号序列至抗体可变区的氨基酸序列的碱基序列中，相互交叠地制备12条50个碱基左右的合成寡DNA，使其3′末端一侧有约20个碱基左右可退火。合成寡DNA设计成在5′末端一侧编码人序列，在3′末端一侧编码小鼠序列，或者全部碱基编码人序列。并且，在抗体可变区基因的5′末端退火且具有XhoI切割序列的引物，和在抗体可变区基因的3′末端退火且具有SfiI切割序列、并编码内含子序列的5′末端序列的引物。
将各1μL制备成2.5μM的合成寡DNA混合，加入1×TaKaRa Ex Taq缓冲液、0.4mM dNTPs、0.5单位TaKaRa Ex Taq(均为宝酒造制备)，制备成48μL反应液。在94℃下保温5分钟后，将含有94℃2分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的反应进行2个循环，实施各合成寡DNA的装配和链延伸反应。接着，添加1μL在抗体基因的5′末端和3′末端退火的引物(各10μM)，将含有94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟的反应进行35个循环，在72℃反应5分钟，扩增抗体可变区基因。PCR后，将全部反应液用于1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIA quick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书的方法纯化目标大小(约400bp)的扩增片段，用30μL灭菌水洗脱。使用pGEM-T Easy载体系统(Promega)，按照所附说明书 的方法对该片段进行克隆。各DNA片段的碱基序列是使用BigDye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM3730xL DNA测序仪或ABI PRISM 3700DNA测序仪(Applied Biosystems)，按照所附说明书的方法确定。
将确认插入了正确的人源化抗体可变区基因序列的H链可变区片段的质粒用XhoI和SfiI消化、将确认插入了正确的人源化抗体可变区基因序列的L链可变区片段的质粒用EcoRI消化，然后将反应液用于1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书的方法纯化目标大小(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。然后如下制备动物细胞用表达载体。为了使H链为异源重组的IgG4优先表达，参考IgG1的knobs-into-hole技术(Merchant AM等人.，Nature Biotechnology，1998年，Vol.16，p.677-681)，使用其CH3部分的氨基酸置换的IgG4。并为了促进H链的二聚体形成，向铰链导入氨基酸置换(-ppcpScp-→-ppcpPcp-)。在具有鸡β肌动蛋白启动子的pCAGGS(Niwa等人.，Gene，1991年，Vol.108，193-199页)中整合了经Y39C、T366W置换的恒定区基因，再向由此所得表达载体中插入人源化A69H链可变区抗体基因片段，制备人源化A69H链表达载体。另外，在pCAGGS中整合经E356C、T366S、L368A、Y407V置换的恒定区基因，再向由此所得表达载体中插入人源化B26H链可变区抗体基因片段，制备人源化B26H链表达载体。另外，在pCAGGS中插入了野生型抗体L链恒定区得到的质粒(pCAG-gκDNA)用EcoRI消化，制备插入了人源化BBA L链可变区抗体基因片段的表达载体。连接反应使用Rapid DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)，转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺绩制备)。
1-3人源化双特异性抗体的表达
采用以下方法进行人源化双特异性抗体的表达。将来自人胎儿肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5-6×10⁵个/mL的细胞密度、以10mL接种于粘着细胞用培养皿(直径10cm，CORNING)的各皿中，在CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)内培养一昼夜，然后吸除培养基，添加6.9mL含有1％胎牛血清(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基。将在1-2中制备的质粒DNA混合液(合计13.8μg)与20.7μL 1μg/mL聚氮丙啶(Polysciences Inc.) 和690μL CHO-S-SFM-II培养基混合，在室温下静置10分钟，将其加入到各培养皿的细胞中，在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)内培养4-5小时。然后添加6.9mL含有1％胎牛血清(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基，在CO₂培养箱内培养3天。回收培养上清，然后离心(约2000g，5分钟，室温)除去细胞，进一步过0.22μm滤器MILLEX^(R)-GV(Millipore)进行灭菌，该样品在使用之前在4℃下保存。
1-4人源化双特异性抗体的纯化
向按照实施例1-2所述方法得到的培养上清中添加100μL的rProtein A Sepharose^TMFast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下颠倒混合4小时以上。将该溶液转移至0.22μm的滤器杯Ultrafree^(R)-MC(Millipore)，用500μL含有0.01％吐温^(R)20的TBS洗涤3次，将100μL含有0.01％吐温^(R)20的50mM乙酸钠溶液悬浮于rrProtein A Sepharose^TM树脂中，使pH为3.3，静置2分钟，然后使抗体溶出。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl pH 7.8进行中和。
1-5人源化双特异性抗体的浓度定量
如下所示按照两种方法进行测定。
用包被缓冲液将山羊抗人IgG(Biosource International)制备成1μg/mL，固定于Nunc-Immuno板上(Nunc)。用稀释缓冲液(D.B.)进行封闭，然后添加用D.B.适当稀释的培养上清样品。同样地添加由2000ng/mL以3倍系列、用D.B.稀释为11个梯度的人IgG4(人源化抗TF抗体，参照WO 99/51743)，作为计算抗体浓度的标准品。洗涤3次后，使其与山羊抗人IgG、碱性磷酸酶反应(Biosource International)。洗涤5次后，以Sigma 104^(R)磷酸酶底物(Sigma-Aldrich)作为底物进行显色，通过吸光度读数仪型号3550(Bio-Rad Laboratories))、以665nm作为参照波长测定405nm的吸光度。使用微量板ManagerIII(Bio-Rad Laboratories)软件，由标准品的校正曲线计算培养上清中人IgG的浓度。
还使用Biacore 1000或Biacorell(BIACORE)，使用固定有蛋白A的传感芯片CM5(BIACORE)进行定量。具体来说，按照生产商的说明书，将用10mM乙酸钠水溶液(pH 4.0，BIACORE)稀释为50μg/mL的蛋白A(SIGMA)溶液以5μL/分钟在活化的传感芯片反应30分钟，然后实施封 闭操作，制备固定有蛋白A的传感芯片。使用该传感芯片、用Biacore1000(BIACORE)，测定培养上清和纯化品的浓度。传感芯片的固定和浓度测定是使用HBS-EP缓冲液(BIACORE)。浓度测定时的标准品使用由4000ng/mL按照2倍系列用HBS-EP缓冲液稀释为6个梯度的人源化IgG4抗体(人源化抗组织因子抗体，参照WO99/51743)。
1-6人源化双特异性抗体的凝血活性评价
为了明确双特异性抗体对血友病A血液的凝固能力是否有改变，研究该抗体对于使用缺少因子VIII血浆的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的影响。将50μL各种浓度的抗体溶液、50μL缺少因子VIII血浆(Biomerieux)和50μLAPTT试剂(Dade Behring)的混合液在37℃下加温3分钟。凝固反应是通过将50μL 20mM的CaCl₂(Dade Behring)加入到该混合液中引发。通过连接有CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)测定至凝固所需时间。
以缺少因子VIII血浆的凝固时间为0％，以正常血浆的凝固时间为100％，制作校正曲线，使用该校正曲线，由添加了双特异性抗体时的凝固时间计算双特异性抗体的因子VIII样活性(％)。
1-7保持凝血活性的人源化双特异性抗体的获得
在上述凝血活性评价中，对于凝血能力低的人源化双特异性抗体，为了使其活性升高而使人源化抗体FR的氨基酸变异。具体来说，使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，按照所附说明书记载的方法向人源化抗体可变区导入突变。将确认插入了正确的人源化抗体可变区基因序列的H链可变区片段的质粒用XhoI和SfiI消化、将确认插入了正确的人源化抗体可变区基因序列的L链可变区片段的质粒用EcoRI消化，然后将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书记载的方法纯化目标大小(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。然后按照实施例1-2所示方法制备动物细胞用表达质粒。按照实施例1-3、1-4、1-5所示方法制备人源化双特异性抗体，按照实施例1-6所示方法评价凝血活性。
反复进行FR序列的氨基酸变异和凝血能力的评价，获得与嵌合双特异性抗体(A69/B26/BBA)具有同等活性的人源化双特异性抗体(人源 化A69(hA69a)/人源化B26(hB26-F123e4)/人源化BBA(hAL-F123j4))(图1)。将各抗体可变区序列表示为以下的序列号(SEQ ID NO)。
(1)人源化A69抗体VH(hA69a)SEQ ID NO.1(碱基序列)、SEQ ID NO.2(氨基酸序列)
(2)人源化B26抗体VH(hB26-F123e4)SEQ ID NO.3(碱基序列)、SEQ ID NO.4(氨基酸序列)
(3)人源化BBA抗体VL(hAL-F123j4)SEQ ID NO.5(碱基序列)、SEQ ID NO.6(氨基酸序列)
[实施例2]为了双特异性抗体的分离选择可变区氨基酸变异位置
首先，为了确认暴露在人源化A69抗体和人源化B26抗体的可变区表面的氨基酸残基，使用MOE软件(Chemical Computing Group Inc.)，通过同源性建模制备人源化A69抗体和人源化B26抗体的抗体Fv区模型。模型如图2所示，通过该模型的详细分析，在CDR以外的FR序列中，在暴露于表面的氨基酸中，H10、H12、H23、H39、H43、H105(Kabat编号，Kabat EA等人.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)是不会使活性降低、而可以使等电点变化的候选氨基酸。CDR中，暴露于表面的氨基酸选择H97.
[实施例3]人源化A69抗体及其变异体和人源化B26抗体的可变区氨基酸的变异
为了使人源化A69抗体和人源化B26抗体的等电点变化，进行人源化A69H链可变区和人源化B26H链可变区的氨基酸变异。具体来说，使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，向按照所附说明书记载的方法制备的人源化A69抗体H链可变区(hA69a，SEQ ID NO.1)和人源化B26抗体H链可变区(hB26-F123e4，SEQ ID NO.3)中导入突变。将确认插入了正确的人源化抗体可变区基因序列的H链可变区片段的质粒用XhoI和SfiI消化，然后将反应液用于1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书记载的方法纯化目标大小(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。按照实施例1-2所示的方法，将DNA片段插入到具有野生型恒定区的表达质粒中，制备H链表达载体。各抗体的变异的氨基酸残基和序列号如表1所示。制 备了(hA69-N97R、hA69-p18)、人源化B26抗体(hB26-F123e4)及其变异体(hB26-p15)。人源化A69抗体(hA69a)及其变异体(hA69-N97R、hA69-p18)是将H链表达载体(可变区为hA69-N97R、hA69-p18)和L链表达载体(可变区为hAL-F123j4，SEQ ID NO.6)组合，根据实施例1-3进行表达。人源化B26抗体(hB26-F123e4)及其变异体(hB26-p15)是将H链表达载体(可变区为hB26-F123e4、hB26-p15)L链表达载体(可变区为B26-VL，氨基酸序列为WO2005/035756，SEQ ID NO.18)组合，根据实施例1-3进行表达。按照实施例1-4所示方法纯化培养上清中的抗体。
[表1]

[实施例4]含有人源化A69抗体和人源化B26抗体的双特异性抗体表达细胞株的构建
为了制备人源化双特异性抗体，如下构建抗体表达细胞株。
以人IgG4的野生型H链恒定区基因为模板，使用设计为编码H链恒定区的N末端一侧的两个氨基酸(Ala-Ser)的碱基序列成为NheI识别序列(GCTAGC)的5′末端侧引物，和设计成与3′末端一侧退火、且具有NotI识别位点的引物，PCR扩增H链恒定区，与将pBluescriptKS+载体(东洋纺)用NheI、NotI(均为宝酒造制备)消化所得的载体连接，制备pBCH4(包含IgG4恒定区基因)。使用与人源化A69-H链抗体(hA69-PFL，SEQ ID NO.11)和人源化B26-H链抗体(hB26-PF，SEQ ID NO.12)的H链可变区5′末端一侧碱基序列互补、具有Kozak序列(CCACC)和EcoRI识别序列的引物，以及具有NheI识别序列的3′末端一侧碱基序列的引物进行PCR，将所得PCR产物用EcoRI、NheI(均为宝酒造制备)消化，插 入到同样用EcoRI、NheI消化的pBCH4中，连接可变区和恒定区。将制备的人源化A69-H链抗体载体用EcoRI、NotI(均为宝酒造制备)消化，克隆到同样用EcoRI、NotI消化的动物细胞用表达载体pCXND3中。该载体pCXND3的构建流程如下所示。
为了将DHFR-ΔE-γVH-PM1-f(参照WO92/19759)的抗体H链基因与载体分割，用限制酶EcoRI、SmaI进行消化，只回收载体一侧，然后克隆EcoRI-NotI-BamHI适体(宝酒造制备)。将该载体命名为pCHOI。将pCHOI的DHFR基因表达位点克隆到pCXN(Niwa等人，Gene 1991，108：193-200)的限制酶HindIII位点上，将所得载体命名为pCXND3。将制备的人源化B26-H链抗体载体用EcoRI、NotI(均为宝酒造制备)消化，克隆到同样用EcoRI、NotI消化的动物细胞用表达载体pCXZD1中。pCXZD1载体是将pCXND3载体的新霉素抗性基因置换为零霉素抗性基因得到的表达载体。按照实施例1-2，将人源化BBA-L链抗体(hAL-s8，SEQ ID NO.8)的L链可变区克隆到插入有L链恒定区的质粒(pCAG-gκDNA)上，制备L链表达载体。将制备的三种表达载体通过限制酶制成直链连接，然后基因导入CHO-DG44细胞中，建立抗体表达细胞株。
稳定表达细胞株的制备如下进行。通过使用GenePulserXcellII(Bio-Rad)的电穿孔法导入基因。将各抗体表达载体与0.75mL悬浮于PBS中的CHO细胞(1×10⁷细胞/mL)混合，将混合物在冰上冷却10分钟，转移到样品杯中，然后以1.5kV、25μFD的容量给予脉冲。在室温下恢复10分钟后，将电穿孔处理过的细胞悬浮于40mL以1倍浓度含有添加了HT(Invitrogen)的CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen)中。用同样的培养基制备10倍稀释液，以100μL/孔分注到96孔培养板中。在CO₂培养箱(5％CO₂)中培养24小时，然后添加0.5mg/mL遗传霉素(Invitrogen)、0.6mg/mL零霉素(Invitrogen)，培养2周。将显示抗药性的转化细胞的集落依次放大培养，使用建立的高生产细胞株进行大量的培养，得到培养上清。
[实施例5]人源化抗体同源二聚体和人源化双特异性抗体的分离纯化
按照以下方法，从实施例4得到的培养上清中纯化双特异性抗体。将培养上清添加到用平衡缓冲液(20mmol/L磷酸钠缓冲液、150mol/L  NaCl，pH 7.0)平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱(Amersham Biosciences，50mmI.D.×9.9cmH.＝194.3mL-树脂)中，用洗涤缓冲液1(20mmol/L磷酸钠缓冲液，150mol/L NaCl，pH 7.0)、洗涤缓冲液2(50mmol/L乙酸钠缓冲液，pH 6.0)洗涤，然后用50mmol/L乙酸洗脱。洗脱后立即加入1.5mol/L的Tris-HCl、pH 7.8，调节至pH 6.3。
将所得纯化溶液添加到用Solvent A(10mmol/L磷酸钠缓冲液，pH6.3)平衡的SP TOYOPERL 650M柱(東丷一、26mmI.D.×22.3cmH.＝118.3mL-树脂)中。在以下所示的溶液和梯度中通过抗体表面电荷差进行分离。
溶剂A：20mmol/L乙酸钠缓冲液，pH6.0
溶剂B：20mmol/L乙酸钠缓冲液，1mol/L NaCl，pH6.0
流速：10mL/分钟(113cm/小时)只在洗脱时为5.3mL/分钟(60cm/小时)

洗脱的结果显示，获得了检测出的三个峰，回收了两种同源二聚体(hA69-PF、hB26-PF)和一种杂合二聚体——双特异性抗体BiAb。
[实施例6]制备抗体的等电聚焦电泳分析
ATF是作为组织因子的单克隆抗体获得、具有人IgG4恒定区的人源化抗体。对于ATF的由来，在WO99/051743中有详细记载，H链可变区和L链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。对于ATF、以及实施例5中制备的hA69-PF、BiAb、hB26-PF、实施例3中制备的hA69-N97R、hA69-p18、hB26-e、hB26-p15，为了对由于可变区氨基酸序列不同而导致的表面电荷变化、以及氨基酸变异导致的表面电荷的变化进行评价，实施等电聚焦电泳分析。
ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF、以及人源化A69抗体hA69-N97R及其变异体hA69-p18、以及人源化B26抗体hB26-F123e4及其变异体hB26-p15的等电聚焦电泳如下进行。使用Phastsystem Cassette (Amercham Bioscience制备)，用以下的溶胀液使Phast-Gel Dry IEF(Amercham Bioscience制备)凝胶溶胀约30分钟。
MilliQ水                                            1.5mL
Pharmalyte 5-8用于IEF(Amercham Bioscience制备)      50μL
Pharmalyte 8-10.5用于IEF(Amercham Bioscience制备)   50μL
使用溶胀的凝胶，通过Phastsystem(Amercham Bioscience制备)，按照以下程序进行电泳。样品是在步骤2添加到凝胶中。pI标记使用pl校正曲线试剂盒(Amersham Biosciences)。

电泳后的凝胶用20％TCA固定，然后用银染试剂盒、蛋白质(Amersham Biosciences)，按照试剂盒所附的说明书进行银染。染色后，由pI标记的已知等电点计算样品的等电点。等电聚焦电泳的分析结果如图3所示。由pI标记制备的pI和移动率的校正曲线以及由此计算的等电点如图4所示。由于存在来自抗体的电荷异质性，因此各样品基于主条带的移动率来计算等电点。
由此，根据可变区氨基酸序列不同导致的表面电荷的变化、以及氨基酸变异导致的表面电荷的变化，观察到pI的变化。hB26-PF约为9.2，BiAb约为8.7，hA69-PF约为8.0，ATF约为7.2，hA69-N97R约为8.9，hA69-p18约为8.5，hB26-F123e4约为8.7，hB26-p15约为9.0。hA69-N97R和hA69-p18、hA69-PF同样是人源化抗体可变区变异，与hA69-N97R比较，hA69-PF中获得了约0.9pI的变化，与hB26-F123e4比较，hB26-p15带来了约0.3pI的变化。本研究中，由于可变区氨基酸序列的不同而使等电点发生变化，进一步通过选择的可变区的H10、H12、H23、H39、H43、H97、H105的表面氨基酸的电荷性改变，可以使等电点变化。
[实施例7]人源化A69抗体及其变异体以及人源化B26抗体及其变异体的结合活性评价
为了评价人源化A69抗体及其变异体的功能，按照以下方法评价与 作为抗原的因子IXa的结合活性。人源化A69抗体(hA69a)及其变异体(hA69-N97R)的评价如下进行。将用包被缓冲液(100mM碳酸氢钠，pH9.6，0.02％叠氮化钠)稀释为1μg/mL的因子Ixaβ(Enzyme Research Labratories)以100μL/孔分注到Nunc-Immuno板(Nunc-Immuno^TM96MicroWell^TM MaxiSorp^TM(Nalge Nunc Interantional))，在4℃下温育过夜。用含有吐温^(R)20的PBS(-)洗涤3次，然后用稀释缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 8.1，1％牛血清白蛋白，1mM MgCl₂，0.15M NaCl，0.05％吐温^(R)20，0.02％叠氮化钠)将板在室温下封闭2小时。除去缓冲液，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释的纯化抗体，在室温下温育1小时。将板洗涤3次，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释为1/4000的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(BIOSOURCE)，在室温下温育1小时。将板洗涤5次，添加100μL/孔显色底物(Sigma)，在室温下温育30分钟。用微量板读板仪型号3550(Bio-Rad Laboratories)测定405nm(对照655nm)的吸光度。
实施例8中使用的变异抗体(hA69-N97R、hA69-p18、hA69-PF)如下进行评价。将用包被缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)稀释为1μg/mL的因子Ixa(Enzyme Research Labratories)以100μL/孔分注到Nunc-Immuno板(Nunc-Immuno^TM 96MicroWell^TM MaxiSorp^TM(Nalge Nunc Interantional))，在4℃下温育过夜。用含有0.05％吐温^(R)20的PBS(-)洗涤3次，然后以200μL/孔将稀释缓冲液(Tris盐缓冲液、吐温20，pH8.0(SIGMA)，1％牛血清白蛋白、0.02％叠氮化钠)添加到板中，在室温下封闭2小时。除去缓冲液，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释的纯化抗体，在4℃下温育过夜。将板洗涤3次，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释为1/500的碱性磷酸酶标记小鼠抗人IgG4(Southern Biotechnology)，在室温下温育2小时。将板洗涤5次，添加100μL/孔BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard&Perry Laboratories)作为底物，在室温下温育约30分钟。用微量板读板仪型Vmax(Molecular Devices)于650nm测定。结果如图5所示，由于改变表面电荷而使可变区变异的抗体与变异前的抗体显示同等的结合活性。
为了评价人源化B26抗体(hB26-F123e4)及其变异体(hB26-p15)的功能，按照以下方法评价与作为抗原的因子X的结合活性。将用包被缓冲液(100mM碳酸氢钠，pH 9.6，0.02％叠氮化钠)稀释为1μg/mL的 因子X(Enzyme Research Labratories)以100μL/孔分注到Nunc-Immuno板(Nunc-Immuno^TM 96MicroWell^TM MaxiSorp^TM (Nalge Nunc Interantional))，在4℃下温育过夜。用含有吐温^(R)20的PBS(-)洗涤3次，然后用稀释缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 8.1，1％牛血清白蛋白，1mM MgCl₂，0.15M NaCl，0.05％吐温^(R)20，0.02％叠氮化钠)将板在室温下封闭2小时。除去缓冲液，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释的纯化抗体，在室温下温育1小时。将板洗涤3次，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释为1/4000的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(BIOSOURCE)，在室温下温育1小时。将板洗涤5次，添加100μL/孔显色底物(Sigma)，在室温下温育30分钟。用微量板读板仪型号3550(Bio-Rad Laboratories)测定405nm(对照655nm)的吸光度。结果如图6所示，由于改变表面电荷而使可变区变异的抗体与变异前的抗体显示同等的结合活性。
以上显示，本实施例的可变区的变异对于抗体与抗原的结合没有影响。
[实施例8]制备抗体的体内动力学评价
8-1使用小鼠的动力学实验
ATF是作为人组织因子的单克隆抗体而获得、具有人IgG4的恒定区的人源化抗体。关于ATF的由来在WO99/051743中有详细记述，分别以SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14表示H链可变区和L链可变区的氨基酸序列。对于ATF、以及实施例5中制备的hA69-PF、BiAb、hB26-PF、实施例3中制备的hA69-N97R、hA69-p18、hB26-e、hB26-p15，评价其在小鼠(C57BL/6J，Charles River，Japan)体内的动力学。将ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF以5mg/kg静脉内单次给予小鼠(C57BL/6J，Charles River，Japan)，在给予前和给予后15分钟、2小时、8小时、1天、2天、4天、7天、11天、14天、21天、28天进行采血。采集的血液立即以4℃、15,000rpm离心15分钟，获得血浆。分离的血浆在实施测定之前一直保存在设定为-20℃以下的冰箱中。同样，以1mg/kg将hA69-N97R、、hA69-p18、hB26-F123e4、hB26-p15静脉内单次给予小鼠(C57BL/6J，日本チヤ一ルズリバ一)，在给予前和给予后15分钟、2小时、8小时、1天、2天、5天、7天、9天、14天、21天、28天进行采血。采集的血液立即以4℃、15,000rpm离心15分钟，获得血浆。分离的血浆在实施 测定之前一直保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
8-2通过ELISA法测定血浆中浓度
小鼠血浆中浓度测定通过ELISA法测定。血浆中的浓度是制备6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/mL的校正曲线试样。校正曲线试样和小鼠血浆测定试样分注到用抗人IgG(γ链特异性)F(ab′)₂(Sigma制备)固定的免疫板(Nunc-Immuno板，MaxiSorp(Nalge nunc International制备))中，在室温下静置1小时，然后依次与山羊抗人IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates制备)和链霉抗生物素-碱性磷酸酶偶联剂(Roche Diagnostics制备)依次反应，使用BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard&Perry Laboratories制备)作为底物进行显色反应，通过微量板读板仪测定650nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular devices制备)，由校正曲线的吸光度计算。ATF、hA69-PF、BiAb、hB26-PF的血浆中浓度的变化如图7所示。
8-3药物动力数据的计算方法
通过药物动力分析软件WinNonlin(Pharsight制备)，对所得血浆中浓度变化数据进行非模型依赖性分析，计算药物动力学的参数(清除率(CL)、半衰期(T1/2))。T1/2是由最终三点或WinNonlin自动设定的最终相血浆中浓度计算。所得药物动力学参数如表2所示。
[表2]

对于pI，对各抗体的清除率(CL)、半衰期(T1/2)进行制图，如图8所示。发现：使用的各抗体中，不管是否具有相同恒定区序列，pI与清除率(CL)和半衰期(T1/2)显示高的相关关系，pI越低则清除率降低，具有较长的血液半衰期。如上所述，即使为同一恒定区序列，根据pI值的 不同也可以调控血液半衰期，即，使pI降低则可以使血液半衰期延长，使pI升高则可以使半衰期缩短。实际上，在本实施例中，可以使hA69-N97R可变区的表面氨基酸变异(变异的位置如表3所示)、使pI降低，由此可以延长血液半衰期；使hB26-F123e4可变区的表面氨基酸变异(变异位置如表4所示)、使pI升高，由此可以缩短血液半衰期。由此，通过使可变区的表面氨基酸(具体例子有H10、H12、H23、H39、H43、H97、H105)进行电荷改变，可以调控IgG的血液动力学。
[表3]

[表4]

上述表3和表4中，Pyr(Q)是被焦谷氨酰化的N末端的谷氨酰胺残基，N末端的氨基被保护，因此，在Pyr(Q)和E中电荷没有大的差异。另外，表3和表4中，通过氨基酸置换而使pI发生变化的位置用*表示。
本发明发现，通过置换可变区的表面氨基酸、使IgG的pI降低，可以延长IgG的血液半衰期，相反，通过置换可变区的表面氨基酸、使IgG的pI升高，可以缩短IgG的血液半衰期。
在使用小鼠的血液动力学研究中，非专利文献(Nat Biotechnol.1997；15：637-640)中公开：使存在于恒定区的Fc的氨基酸变异、提高与FcRn的亲和性，可以使血液半衰期(T1/2)延长约1.5倍；本发明中，hA69-PF与hA69-N97R比较时，在相同的恒定区序列中，通过使可变区的表面氨基酸变异、使pI降低，可以使血液半衰期(T1/2)延长约1.5倍。 并且，hA69-PF、ATF与hA69-N97R比较，pI最低的ATF的T1/2比hA69-N97R延长约2.1倍，由此，通过使存在于hA69-N97R的可变区的表面氨基酸进一步变异、使pI降低，可以进一步延长hA69-N97R的血液半衰期。将本实施例中使用的抗体进行比较，则pI最高的hB26-PF和最低的ATF的血液半衰期约有2.4倍的差异，通过可变区氨基酸变异来调控血液动力学，这与现有的调控技术比较，有望获得高的效果。另外，从免疫原性的角度考虑，向恒定区导入的人工氨基酸置换越少越好，通过使可变区的表面氨基酸变异来调控血液半衰期的本发明在药物的开发中有用。
产业实用性
本发明的方法的优选方案中，氨基酸的置换在可变区进行，因此与使恒定区变异的以往的方法相比，免疫原性的风险小。另外，在使血液半衰期延长的调控中，比以往的使恒定区变异的方法显示更大的效果。另外，在可变区，无需使结构、功能(活性)发生改变，通过控制表面电荷即可以调控IgG抗体等含有FcRn结合区的多肽的血液半衰期。通过采用本发明的方法，可以实际保有活性地获得血液半衰期得到控制的含有FcRn结合区的多肽。