《用于检测假高粱的引物对、探针、核酸组合物及检测方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于检测假高粱的引物对、探针、核酸组合物及检测方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104178579A43申请公布日20141203CN104178579A21申请号201410462473322申请日20140912C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心地址200135上海市浦东新区民生路1208号72发明人印丽萍吴申懋傅怡宁薛华杰54发明名称用于检测假高粱的引物对、探针、核酸组合物及检测方法57摘要本发明提供一种用于检测假高粱的核酸引物对、探针、核酸组合物及检测方法。核酸引物对包括核酸引物F5TGGTGGGCGACACTTAGTTG3、核酸引物R5CAACGATGTGCTGC。
2、GGTG3；核酸分子探针P为5FAMACGTGGCCGGCGCTAMRA3；核酸组合物由核酸引物F、R和核酸分子探针P组成；本发明的检测假高粱的方法为利用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P的实时荧光PCR检测方法。本发明的方法能在半个工作日内完成假高粱的检测，不仅检测时间大大缩短，检测的灵敏度也显著提高。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页10申请公布号CN104178579ACN104178579A1/1页21一种用于检测假高粱的引物对，其特征在于，其序列为核酸引物F5TGGTGGGCGACACTT。
3、AGTTG3（SEQIDNO1）或其互补链；核酸引物R5CAACGATGTGCTGCGGTG3（SEQIDNO2）或其互补链。2一种用于检测假高粱的探针，其特征在于，其序列为核酸分子探针P5ACGTGGCCGGCGC3（SEQIDNO3）或其互补链，其5端标记荧光基团，3端标记淬灭基团。3根据权利要求2所述的用于检测假高粱的探针，其特征在于，所述荧光基团为羧基荧光素。4根据权利要求2所述的用于检测假高粱的探针，其特征在于，所述淬灭基团为羧基四甲基落罗丹明。5一种用于检测假高粱的核酸组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸引物F、核酸引物R和权利要求24所述的核酸分子探针P。6一种用于检测假。
4、高粱的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤（1）设计合成权利要求1所述的核酸引物F、核酸引物F及权利要求2所述的核酸分子探针P；（2）样品DNA提取；（3）采用步骤（1）的引物和探针对样品DNA进行实时荧光PCR扩增，通过荧光标识判断目标样品是否为假高粱。7根据权利要求6所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为25L2PREMIXEXTAQTM125L，引物F和引物R各1L，核酸分子探针P1L，DNA模板1L，50ROXREFERENCEDYEII05L，灭菌蒸馏水补至25L。8根据权利要求6所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序。
5、为预变性9510S；然后以9515S，671MIN进行40个循环。9权利要求5所述的核酸组合物在对假高粱进行实时荧光PCR检测中的用途。权利要求书CN104178579A1/4页3用于检测假高粱的引物对、探针、核酸组合物及检测方法技术领域0001本发明涉及农业和植物检验检疫技术领域，具体涉及一种利用分子生物学检测技术检测假高粱（SORGHUMHALEPENSE）的引物对和探针，本发明还涉及利用该引物对和探针构成的核酸组合物检测假高粱的实时荧光PCR检测方法。背景技术0002高粱属（SORGHUMS），为禾本科植物，目前在国内外文献中常出现的高粱属的植物有假高粱（SORGHUMHALEPENSE。
6、）、黑高粱SORGHUMALMUM、高粱（SORGHUMBICOLOR）、拟高粱（SORGHUMPROPINQUUM）、光高粱（SORGHUMNITIDUM）及苏丹草（SORGHUMSUDANENSE）等。高粱作为世界5大粮食作物之一，被广泛地用于食品、饲料和酿造，因此，该属许多种在世界各地（包括我国）均有大量栽培，使得该属在世界范围内分布较为广泛。0003高粱属的各种植物的籽实极为相似，但是其危害性及检疫地位各有不同。高粱属中的假高粱（SORGHUMHALEPENSE）为检疫性有害植物，不仅可使作物产量降低，同时也是高粱属作物许多害虫和病害的寄主。在进口高粱中，经常可截获有毒和有害杂草假高粱。
7、，但由于高粱属各种植物的籽实极为相似，其种子鉴定易发生混淆。0004假高粱的传统鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等进行鉴定。外观形态鉴定因能便捷地根据不同植物的外部特征对不同种植物进行分类而成为口岸检疫杂草的重要手段之一。但在实际工作中，农产品中夹杂的杂草种子的外观特征往往会因运输受到磨损而变形，环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同也会引起个体差异，这为形态鉴定增加难度。细胞生物学方法需要的鉴定周期比较长，且难以准确鉴定。发明内容0005本发明的第一目的在于克服上述现有技术中在形态鉴定和细胞生物学鉴定方法中存在的困难，提供一种采用分子生物学的方法，对核糖体内转录间隔区（IN。
8、TERNALTRANSCRIBEDSPACERS，ITS）序列差异设计的用于检测假高粱的引物对。0006一种用于检测假高粱的引物对，其序列为核酸引物F，即上游引物5TGGTGGGCGACACTTAGTTG3（SEQIDNO1）或其互补链；核酸引物R，即下游引物5CAACGATGTGCTGCGGTG3（SEQIDNO2）或其互补链。0007本发明的第二目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用分子生物学的方法，对核糖体内转录间隔区（INTERNALTRANSCRIBEDSPACERS，ITS）序列差异设计的用于检测假高粱的探针。0008一种用于检测假高粱的探针，其序列为核酸分子探针P5ACGTGG。
9、CCGGCGC3（SEQIDNO3）或其互补链，该核酸分子探针P为TAQMAN荧光探针，5端标记荧光基团，3端标记淬灭基团。0009其中，所述荧光基团可以是羧基荧光素（FAM）。所述淬灭剂可以是羧基四甲基落罗丹明（TAMRA）。说明书CN104178579A2/4页40010根据核苷酸碱基配对规则可以推知，与本发明提供的核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P核酸序列完全互补的核酸链组成的一组核酸组合物也适用于本发明当中。0011本发明提供的检测假高粱的核酸引物对和探针是基于假高粱与其近似种在RDNA内转录间隔区序列上的差异设计的。18S26S核核糖体DNA（NRDNA）的内转录间隔区ITS分为。
10、ITS1和ITS2两部分，ITS区在植物核基因组中是高度重复的，全部NRDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复TANDEMREPEATS方式出现在一个或多个染色体基因位点上。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上（如属间和种间）解决植物系统发育问题。通过对不同生物类群的ITS序列（自生物学数据库）的比较得出被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为12102，属间差异值为96288，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。0012本发明的第三个目的在于提供一种用于检测假高粱的核酸组合物。
11、，包含上述核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P。0013本发明的第四目的在于提供一种用于检测假高粱的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤（1）设计合成引物和探针所述引物为上述的引物F和引物R，所述探针为上述的核酸分子探针P；（2）样品DNA提取；（3）采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR扩增，通过荧光标识判断目标样品是否为假高粱。0014所述PCR扩增反应体系为25L2PREMIXEXTAQTM125L，引物F和引物R各1L，核酸分子探针P1L，DNA模板1L，50ROXREFERENCEDYEII05L，灭菌蒸馏水补至25L。反应程序为预变性9510S；然后以9515S，671。
12、MIN进行40个循环。0015本发明的检测方法中，在提取目标样品的总DNA后，运用实时荧光PCR检测技术就可完成对目标样品的扩增，随着PCR循环数的增加，所能检测的荧光信号亦随之增加，从而通过荧光标识判断目标样品是否为假高粱。0016最后，本发明提供上述包含核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P的核酸组合物在对假高粱进行实时荧光PCR检测中的用途。0017本发明是在提取种子的DNA后，利用核酸引物F/R和核酸分子探针P进行实时荧光PCR检测，PCR扩增后的阳性样品能检测到荧光信号，PCR扩增后的阴性样品及空白对照无法检测到有荧光信号的增加，由此可以区分假高粱和其它高粱属的样品。0018假高粱的。
13、传统鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等进行鉴定。然而，外观形态鉴定存在不确定性，细胞生物学方法不仅需要较长的周期，而且仅依据染色体的形态难以鉴定。本发明采用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P及其互补核酸链形成的核酸组合物，采用实时荧光PCR检测技术实现对假高粱的特异性区分，能在半个工作日内完成检测，大大缩短了检测时间，并且能特异敏感准确快速地鉴定假高粱及其近似种，有利于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域对目标样品的快速准确的检测鉴定。说明书CN104178579A3/4页5附图说明0019图1是利用本发明的引物和探针对假高粱及其近似品种进行实时荧光PCR检测的检测结果示意图。
14、。具体实施方式0020为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式进行详细的阐述。0021（1）设计合成引物和探针引物F，即上游引物5TGGTGGGCGACACTTAGTTG3；引物R，即下游引物5CAACGATGTGCTGCGGTG3；核酸分子探针P5FAMACGTGGCCGGCGCTAMRA3。0022上述引物对和探针分别委托上海生工生物科技公司和基康生物公司进行合成。0023（2）样品DNA提取3粒种子液氮研磨粉碎，用试剂盒法（天根公司的DP320植物DNA提取试剂盒）提取DNA。0024（3）实时荧光PCR检测实时荧光PCR扩增体系25LPREMIXEXT。
15、AQTM（2）125L，上、下游引物（5MOL/L）各1L，TAQMAN核酸分子探针P（5MOL/L）1L，DNA（1020NG/L）模板1L，ROXREFERENCEDYEII（50）05L，灭菌蒸馏水补至25L，在ABI7500型FASTREALTIMEPCRSYSTEM上进行实时荧光PCR扩增。反应程序为预变性9510S；然后以9515S，671MIN进行40个循环。0025采用上述检测步骤，对来自于不同地区的假高粱及其近似品种的样品（见表1）进行检测，检测结果见图1。0026表1PCR扩增所用材料及其来源序号中文名拉丁名来源1假高粱SORGHUMHALEPENSE中国2假高粱SORGH。
16、UMHALEPENSE美国3假高粱SORGHUMHALEPENSE阿根廷4假高粱SORGHUMHALEPENSE澳大利亚5光高粱SORGHUMNITIDUM澳大利亚6黑高粱SORGHUMALMUN埃塞俄比亚7拟芦苇高粱SORGHUMARUDINACEUM澳大利亚8拟高粱SORGHUMPROPINQUUM澳大利亚9高粱SORGHUMBICOLOR巴西10SORGHUMDRUMMONDII土耳其11SORGHUMHYBRID澳大利亚12变色高粱SORGHUMVERSICOLOR澳大利亚13甜高粱SORGHUMSACCHARATUM中国14丝克高粱SORGHUMSILK澳大利亚15苏丹草SORGHU。
17、MSUDANENSE美国图1中，曲线0为空白对照；曲线1、2、3、4分别为实施例样品表1中高粱属序号为1、2、3、4的假高粱样品的扩增曲线；曲线515分别对应实施例样品表1中高粱属序号515的高粱属样品。说明书CN104178579A4/4页60027上述图中，DALTARN是PCR扩增第N次循环时的荧光信号的增加值。0028检测结果表明，检测结果与实验材料完全相符，4个不同来源的假高粱样品有扩增，能检测到荧光信号，假高粱近似品种黑高粱，拟高粱，光高粱及苏丹草（阴性）样品及空白对照没有荧光信号的增加。0029最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。说明书CN104178579A1/1页7图1说明书附图CN104178579A。