基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤评价体内氧化应激的方法.pdf

本发明提供了检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用，以及基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤评价体内氧化应激的方法。

1.  检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用。

2.  权利要求1所述的应用，其中所述检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂为PCR引物和人8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)。

3.  权利要求2所述的应用，其中PCR引物为选自下列引物对的引物对：
DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)；
COX2：正向引物ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO.7)，反向引物TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO.8)；
ND1：正向引物CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO.9)，反向引物GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID NO.10)。

4.  权利要求3所述的应用，其中PCR引物为：
DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)。

5.  基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤来评价体内氧化应激的非诊断方法，步骤包括：
(1)提取样本DNA；
(2)使用hOGG1处理部分DNA；
(3)使用hOGG1处理过和未处理过的DNA进行qPCR反应；
(4)比较hOGG1处理过和未处理过的DNA的Ct值差异；
(5)根据Ct值差异，判断8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的含量，并间接反映DNA氧化损伤和体内氧化应激的水平。

6.  权利要求5所述的非诊断方法，其中步骤(3)的qPCR反应中使用的引物为选自下列引物对的引物对：
DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)；
COX2：正向引物ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO.7)，反向引物TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO.8)；
ND1：正向引物CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO.9)，反向引物GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID NO.10)。

7.  权利要求6所述的非诊断方法，其中步骤(3)的qPCR反应中使用的引物为：DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)。

基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤评价体内氧化应激的方法
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域。具体地说，本发明提供了检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用，以及基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤评价体内氧化应激的方法。
背景技术
氧化应激，指机体活性氧(reactive oxygen species，ROS)或活性氮(reactive nitrogen species，RNS)产生过多和/或机体抗氧化能力减弱，ROS或RNS清除不足，导致体内ROS或RNS增多，破坏了机体的氧化/还原的正常失衡，从而导致组织和细胞发生氧化损伤的病理过程。因此，评价体内氧化应激在疾病诊断和相关科学研究中(如氧化应激与衰老、神经退行性变、代谢性疾病等的相关研究)均有重要意义。
目前，对于氧化应激水平的评价体系主要包括检测以下生物分子：1)活性氧/活性氮修饰的生物分子：包括蛋白质氧化损伤标志物，如蛋白质羰基化、硝基化损伤、晚期氧化蛋白产物(AOPP)；脂质过氧化产物，如4-羟基壬烯醛(HNE)和丙二醛(MDA)，以及核酸氧化损伤时产生的8-OHdG；2)抗氧化酶活性，如超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽S转移酶酶(glutathione S-transferase，GST)和血红素氧化酶(heme oxygenase，HO)等。目前常用检测方法主要包括，1)用分光光度法检测MDA、SOD、CAT、还原型/氧化型GSH、GPx等，方法简单，且相对便宜，但稳定性差；2)利用ELISA检测MDA、HNE、8-OHdG等，该法比较可靠，费用相对较高。此外，利用高效液相色谱-电化学(HPLC-ECD)法、气质联用(GC-MS)等可用于8-OHdG水平的检测，但由于需要相关仪器，且操作繁琐、灵敏度低等缺点，难于推广和应用。
发明内容
在对外周血的分子诊断研究中，认为外周血循环的核酸成分可成为反映疾病状态较好的指标。外周血包括血浆和血细胞(红细胞、粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板等)。外周血中淋巴细胞的基因组DNA的氧化损伤，如8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxygumlosine，8-OHdG)/8-羟基鸟嘌呤(8-oxo-guanine，8-oxo-G)的产生或者DNA链的断裂，已被应用于评价氧化应激状态。与核基因组DNA相似，线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)也存在类似的损伤。
mtDNA位于细胞线粒体内，为环状双链、多拷贝的DNA。人类完整的mtDNA为闭合环状 双链DNA，长16569bp，编码37个基因。线粒体独立存在于细胞核外的细胞器，是细胞能量和ROS产生的主要场所。由于mtDNA暴露于高活性ROS环境中，且缺乏组蛋白保护和有效的修复机制，mtDNA更易遭受氧化攻击而产生氧化损伤，进一步导致DNA突变，其突变率为核DNA的20倍。本专利基于mtDNA易氧化损伤的特点，通过分析细胞内、外mtDNA损伤水平来更灵敏的反映氧化应激状态，并将该方法应用于代谢综合征患者和健康对照外周血单个核细胞、血浆mtDNA氧化损伤水平的检测。
首先利用8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶(human oxoguanine glycosylase 1，hOGG1)在体外酶解DNA，该酶在体内为参与DNA碱基切除修复的关键酶，能特异性识别并切除DNA双链中8-OHdG，产生脱嘌呤(AP)位点，进而经碱基切除修复机制恢复正常G:C碱基配对。在体外，hOGG1酶去除DNA分子上的8-OHdG后，通过设计引物，利用荧光定量PCR特异性扩增mtDNA。由于mtDNA分子经hOGG1酶切后产生缺碱基位点，与未酶切的mtDNA存在扩增的差异，结果上表现为Ct的差异，Ct差值(ΔCt值)即反映mtDNA氧化损伤水平。
在专利的效果评价中，利用不同浓度H₂O₂建立氧化应激细胞模型，用线粒体靶向性抗氧化剂Mitoquinone(MitoQ)构建抗氧化细胞模型。H₂O₂作用细胞引起氧化应激是较为常用的方法，本专利使用中低浓度(50-200μM)H₂O₂。MitoQ是一种亲脂性的带正电荷的醌醇类物质，可穿过细胞脂质双分子层直接进入带负电荷的线粒体，降低线粒体ROS的产生，抑制线粒体膜电位的下降以及细胞色素C的释放，具有线粒体保护作用
一方面，本发明提供了检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用。
进一步地，其中所述检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂为PCR引物和人8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)。
再进一步地，其中PCR引物为选自下列引物对的引物对：
DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)；
COX2：正向引物ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO.7)，反向引物TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO.8)；
ND1：正向引物CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO.9)，反向引物GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID NO.10)。
进一步地，选择PCR引物：
DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA (SEQ ID NO.2)。
另一方面，本发明提供了基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤来评价体内氧化应激的非诊断方法，步骤包括：
(1)提取样本DNA；
(2)使用hOGG1处理部分DNA；
(3)使用hOGG1处理过和未处理过的DNA进行qPCR反应；
(4)比较hOGG1处理过和未处理过的DNA的Ct值差异；
(5)根据Ct值差异，判断8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的含量，并间接反映DNA氧化损伤和体内氧化应激的水平。
进一步地，其中步骤(3)的qPCR反应中使用的引物选自下列引物对：
DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)；
COX2：正向引物ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO.7)，反向引物TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO.8)；
ND1：正向引物CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO.9)，反向引物GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID NO.10)。
再进一步地，其中步骤(3)的qPCR反应中使用的引物为：DLP1：正向引物ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO.1)，反向引物GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO.2)。
附图说明
图1：荧光显微镜观察氧化应激和抗氧化应激细胞模型DCFH-DA荧光强度。
图2：流式细胞仪监测ROS水平。
图3：不同H₂O₂浓度下的细胞MDA含量和SOD活力。
图4：氧化应激和抗氧化应激细胞模型CAT、GSH-S、SOD活力和MDA含量。
图5：ΔCt值计算图示。
图6：各对引物的扩增的琼脂糖凝胶电泳结果。
图7：qPCR扩增结果(DLP1引物为例，上为扩增曲线，下为溶解曲线)
图8：各对引物扩增后的ΔCt值。
图9：利用DLP1检测氧化应激和抗氧化细胞内和细胞上清mtDNA氧化损伤水平。
图10：代谢综合征患者和健康对照血清MDA含量比较。
图11：外周血PBMC mtDNA与血浆游离mtDNA氧化损伤水平比较
具体实施方式
实施例1 引物设计
根据NCBI基因库人类mtDNA(NC_012920)标准序列，首先针对mtDNA D-loop区(displacement loop)设计引物。D-loop区包含mtDNA重链合成的复制起始区，是mtDNA复制的控制区，也是mtDNA与线粒体膜的结合位点，易受脂质过氧化物的影响，是mtDNA突变的高发区，碱基突变率比其他区域高6-8倍。D-loop区包括三个高变区，高变区I(np16024-16383)、高变区II(np57-372)和高变区III(np438-574)。因此，为保证扩增的特异性，在设计引物时避开这三个高变区。
表1中显示的DLP1引物扩增的片段，未涵盖高变区，而DLP2引物扩增片段则部分包含了高变区。此外，设计了扩增COX1基因、COX2基因和ND1基因的引物，以进行比较，这些区域在mtDNA中相对保守且不易缺失。
表1 用于mtDNA氧化损伤检测的引物列表


实施例2 构建细胞模型
HUEVC细胞培养：用含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素溶液RPMI 1640培养基，37℃，5％CO₂培养；细胞生长满培养皿后进行传代，传代时先用PBS洗细胞两次，胰蛋白酶37℃消化1-2min后加入1640培养基吹打细胞使其脱落，收集细胞后PBS洗细胞两次，继续培养；
氧化应激细胞模型：在HUEVC细胞培养基(RPMI 1640，含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)中加入一定量H₂O₂，使其终浓度为50，100，150，200μM；抗氧化组：细胞培养基中同时加入200μM H₂O₂和抗氧化剂MtioQ，终浓度分别为100，200，300nM；除外H₂O₂，相同培养条件下的HUEVC细胞作为对照组。作用2h后收集细胞，BCA法测蛋白浓度后，通过测定MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、GST-SH(谷胱甘肽-S-转移酶)等传统氧化损伤指标验证细胞模型氧化水平。同时利用ROS特异性荧光探针DCFH-DA染细胞，通过流式细胞术和荧光显微镜观察ROS产生情况。
如图1、2所示，在所构建的细胞模型中，H₂O₂作用细胞引起ROS水平的升高，而MitoQ则能抑制ROS水平的升高，该结果与以往研究结果一致。
图3显示MDA含量和SOD活力在H₂O₂浓度增加时并未表现出明显的浓度依赖性，仅在高浓度时(200μM和300μM)SOD活力明显下降。
图4显示在H₂O₂作用细胞后MDA含量升高、SOD活性、CAT活性、GSH-ST活性均下降，提示细胞处于氧化应激状态。而在使用MitoQ后，可以干预细胞的氧化损伤。
实施例3 细胞内、外mtDNA氧化损伤水平检测
提取各种H₂O₂和MitoQ浓度处理的细胞DNA，磁珠法提取细胞上清游离DNA。将一定量DNA与hOGG137℃水浴2h。相同量DNA作为对照，不加hOGG1，其他条件一致。然后利用上述5对引物分别进行qPCR反应，计算相同来源的DNA样本，在加与不加hOGG1时Ct值的差异，以此来 反应8-OH-dG的含量，并间接反映DNA氧化损伤的水平。
配制hOGG1酶切反应体系

混匀，37℃水浴2h，65℃酶失活15mim
荧光定量PCR
1)配制PCR反应体系

2)PCR反应条件：

3)计算每个样本的ΔCt值＝酶切组Ct值-对照组Ct值(计算方法示例见图5，DLP2扩增结果示例见图7)
4)PCR产物电泳：配制1％琼脂糖凝胶，于120V电压下电泳20min(各对引物扩增产物电泳结果见图6)。
以上对于mtDNA氧化损伤水平检测的结果(图8)中，利用DLP1、COX2和ND1引物扩增片段的ΔCt值呈现明显的H₂O₂浓度依赖性，其中利用DLP1引物时，扩增片段ΔCt值在低浓度 (50μM)H₂O₂时即被检测出明显的升高，COX2和ND1引物扩增片段ΔCt值在较高浓度时才表现出明显的升高，且ΔCt值较DLP1扩增ΔCt值低。
此外，与用分光度法检测的MDA含量和SOD活性比较，本专利基于qPCR的mtDNA8-OHdG水平检测更为灵敏，在利用引物DLP1、COX2、ND1扩增后计算的ΔCt值与H₂O₂浓度均具有较好的浓度依赖性，而DLP1引物扩增后ΔCt值大于其他引物扩增，组间差异也较大且更灵敏。因此也证明本专利在检测mtDNA氧化损伤水平时，利用DLP1引物优于其他引物(图9)。
实施例4 利用本发明的方法检测代谢综合征患者和健康对照中的氧化应激水平
符合IDF(international diabetes federation)诊断标准的112例代谢综合征病例和111例年龄、性别匹配的健康对照。利用血清MDA含量和外周血单个核细胞(PBMC)基因芯片分析研究对象氧化应激水平。
表2 代谢综合征患者与健康对照PBMC基因表达水平比较结果

上述对研究对象氧化应激水平的分析中，血清MDA含量在代谢综合征患者中明显高于健康对照(图10)。在对基因表达水平的差异分析中，与氧化-还原相关的基因LOX1、MPO、ABCG1、GLRX2基因在表达水平上变现出明显差异，反应患者处于氧化应激状态。在此基础上，利用本专利，对外周血PBMC和血浆游离mtDNA氧化损伤水平进行检测，结果如图11所 示。
外周血中，细胞内、外mtDNA氧化损伤在代谢综合征患者均高于健康对照，细胞外即血浆游离mtDNA氧化损伤的差异更为明显。该结果与前期的氧化应激检测一致，且更为简单易行，也较好的证明本专利在检测患者的外周血样本中的可行性。