野山人参的分子标记及鉴别方法 【技术领域】
本发明属医药技术领域，具体涉及野山人参的分子标记及鉴别方法。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Myer)系五加科植物，其根是我国最为名贵的中药材之一。人参一般被分为三种类型：野山参、移山参和栽培参。野山参与其它人参的品质、药效相差很大，市场价格可以相差几倍、几十倍甚至上百倍，因此，鉴别野山人参的真伪就变得十分重要。然而，不同类型的人参在外形上十分相似，一般人难以区分，容易混淆。市场的人参鱼龙混杂，以次充好的情况屡见不鲜。
传统的人参鉴别主要依靠人参的形态特征，强调看“五行”(须、皮、芦、纹、体)和识“六体”(灵、苯、老、嫩、棱、顺)(孙三省，张继，刘宝玲，贾贵琛，祖舜华，任国栋.野山参移山参育山参及各类山参趴货的鉴别.解放军药学学报，1999，15(1)：47-51)。曾流行不少师徒相承，口传心授的歌诀，例如把野山参的特征概括为：“芦碗紧密相互生，圆膀圆芦枣核艼。紧皮细纹疙瘩体，须似皮条长又清。珍珠点点缀须上，具此特点野山参。”“马牙雁脖芦，下伸枣核艼，身短体横灵，环纹深密生，肩膀圆下垂，皮紧细光润，腿短二三个，分裆八字形，须疏根疣密，山参特殊形。
尽管形态鉴别方法方便快捷，一方面只有那些有丰富经验的老药师能完成，另一方面该方法带有很强的主观性，不同的人可能有不同的看法，也难以掌握，如很难说出“体灵”和“体笨”之间的界线。而且随着各式各样的“移山参”的出现，有些形态上的界线也较模糊，不易划分。
化学鉴别方法不仅需要较多的材料，而且结果不稳定。这对于价格昂贵的野山参来说成本太高，可能会为了鉴别一只人参的真伪而破坏人参地形体，从而大大降低了人参的价格。
有研究者探索用DNA指纹图谱鉴别野山参，但都未获得成功。大多数研究者没有获得野山参特有的分子标记(马小军等，野生人参RAPD指纹的研究.药学学报，1999，34(4)：312～316)，少数研究者获得部分野山参特有的分子标记，但一方面样品量太少，另一方面也不稳定，因而缺乏实用性(丁建弥，万树文，梅其春.野山参与移山参、栽培参的鉴定技术研究。上海预防医学杂志，2001，13(8)：359-371)。
【发明内容】
本发明的目的之一在于提出一种区别野山参与栽培参和移山参的特异性的DNA片断；
本发明的目的之二在于提出一种基于上述特异性DNA片断的野山人类的鉴别方法。
本发明采用DALP(直接扩增长度多态性Direct Amplification Length Polymorphisms，见Desmarais E，Lanneluc I，Lagnel J.Direct amplification of length polymorphisms(DALP)orhow to get and characterize new genetic markers in many species.Nucleic Acids Res，1998，26(6)：1458-1465.)方法构建了若干个人参样品(包括10个野山参样品、1个移山参样品和4个栽培参样品等)的指纹图谱，从中获得栽培参和移山参共有而野山参没有的特异性DNA片断(见SEQ.No.1)。
本发明根据该片断的DNA序列，设计了一对特异性引物：Seq.No.2和Seq.No.3，用45个栽培参(包括6个栽培品种)、28个移山参和5个高丽参样品检测，表明此对引物对栽培参有高度的特异性(见图2-图5)，所以可以用此对引物检测出冒充野山参的栽培参。
另外，本发明还获得了人参一对特有的引物：Seq.No4和Seq..No.5。
PCR反应将产生300bp的一条带，一方面可以用来来检测DNA的质量，另一方面来排除赝品。引物Seq.No.2和Seq.No.3是栽培参和移山参特有的，PCR的目的片断是174bp，可以用来排除栽培参和移山参，从而确定野山参。
基于上述的特异性DNA序列(Seq.No.1)和特殊设计的两对引物Seq.No.2和Seq.No.3、Seq.No.4和Seq.No.5，鉴别野山人参的具体操作步骤如下：
1、取待测人参样品，微量；通常只需取须根0.005g，这样不影响人参的整体性；
2、用DNA提取法从微量人参中提取DNA，并进行检测，确认已提取获得；
3、采用RCR技术，对提取的DNA进行扩增，使用两对引物为：
Seq.No.2和Seq.No.3，
Seq.No.4和Seq.No.5；
4、判断扩增结果
(1)具有两条带，且分别在200bp和300bp，则为栽培参或移山参；
(2)无带，则为非人参；
(3)只有一条带，且在300bp，则为野山参。
上述过程中，PCR反应条件可以控制如下：
(1)94℃ 90sec
(2)94℃ 45sec
(3)55℃ 30sec
(4)72℃ 60sec
(5)(2)-(4)步骤重复3040次
(6)72℃ 10min
DNA模板：50～100ng
退火温度：52～55℃
引物浓度：(Seq.No.2，Seq.No.3)0.70-0.80pmol/μl
(Seq.No.4，Seq.No.5)0.20-0.30pmol/μl
与其他人参鉴定的方法相比，本发明有下列优点：
1、鉴定用的材料很少，只需0.005g的须根就能完成，不破坏人参的外形；
2、稳定性高，鉴定用的引物较长(≥20bp)，因此，PCR反应的结果稳定性较高；
3、可靠性强，不受人参外部形态特征的影响。
【附图说明】
图1为栽培参和移山参特有片断的DNA序列的测序报告(a为正链，b为反链)。
图2为栽培参特异性引物(Seq.No.2+Seq.No.3)检测不同人参的结果栽培参和移山参有约200bp的带，但野山参没有。
图3为栽培参特异性引物(Seq.No.2+Seq.No.3)检测移山参的结果，移山参全部有约200bp的特异性条带。
图4为栽培参特异性引物(Seq.No.2+Seq.No.3)检测栽培参的结果，来自5个品种，共45个栽培参全部具有约200bp的特异性条带，此图仅显示其中的9个样品。
图5为栽培参特异性引物(Seq.No.2+Seq.No.3)检测高丽参和移山参的结果，5个高丽参和7个移山参都有约200bp的特异性条带。
图6为野山参DNA鉴别的操作流程图。
图7为引物(Seq.No.4+Seq.No.5)检测15个人参样品的结果，15个样品都有约250bp的带，说明上述样品是人参且DNA质量很好。
图8为引物(Seq.No.2+Seq.No.3)检测15个人参样品的结果，15个样品中，只有S、Y和Z未出现栽培参的特异性条带。
图9为引物(Seq.No.2+Seq.No.3)和引物(Seq.No.4+Seq.No.5)检测15个人参样品的结果，15个样品中，只有S、Y和Z未出现栽培参的特异性条带。
【具体实施方式】
有人参样品15个(L～Z)，其中样品Z采自吉林通化，是当地农民从森林中挖得，样品L～X从市场上购买(仅为人参须根)，都被冠以野山参的名称。检测的操作步骤如前所述。取每个样品的须根0.005g，进行DNA提取，并检测确定；用人参引物(Seq.No.4+Seq.No.5)鉴别(结果见图7)，全都有人参的特有片断，因此，所有样品都是人参。用引物(Seq.No.2+Seq.No.3)鉴别(结果见图8)，只有样品S、Y和Z与栽培参和移山参不同。将两对引物(Seq.No.2+Seq.No.3，Seq.No.4+Seq.No.5)混合起来检测同样的样品，结果与上述两次的检测的结果一致(见图9)。在检测过程中，PCR反应条件如下：
(1)94℃ 90sec
(2)94℃ 45sec
(3)55℃ 30sec
(4)72℃ 60sec
(5)(2)-(4)步骤重复30-40次
(6)72℃ 10min
DNA模板：50～100ng
退火温度：52～55℃
引物浓度：(Seq.No.2，Seq.No.3)0.70-0.80pmol/μl
(Seq.No.4，Seq.No.5)0.20-0.30pmol/μl。
序列表
Seq.No.1：
5’-TAACAGCTATGACATGACGAGCTTACAGCGTAGAGTTATCATGGACGAGATTACCT
CAGGGCATGTAGTGTCCTTGGATTTCTTGATTGACCGATTTGGGTCAATGGAAAACTA
TCTACGACATTCAGGGGACTTTACCATTACTGAGGGTGAGTGGCATGTTGCCCGCGTA
GATATTTTATTGATGTGCGTCGTGAACTGGGAAAACA-3′
Seq.No.2：5′-CTATGACATGACGAGCTTACA-3′
Seq.No.3：5′-CACGACGCACATCAATAAAA-3′
Seq.No.4：5′-CCGCACGACATGAGAAGAGG-3
Seq.No.5：5′-CGATGAAGAACGTAGCGAAAT-3′