一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法技术领域
本发明涉及利用PCR筛选方法从129sv小鼠基因组文库中克隆
得到的神经胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)
基因的大小为1.8kb的5’端调控区并利用该调控序列制备中枢神经
系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的一种制备方法。
背景技术
中枢神经系统包括脑和脊髓，是人类各种机能活动的高级中枢，
也是人类思想和意识活动的物质基础。1989年美国率先推出了全国
性的以保护脑和防治脑疾病为重点的脑科学计划，并把本世纪的最后
十年命名为“脑的十年”。这一举动立刻得到了国际脑研究组织和许多
国际学术组织的响应。该计划也因此成为继人类基因组计划之后的另
一国际性科研计划。随着功能基因组时代的到来，对基因功能特别是
在中枢神经系统中发挥作用的基因的功能和作用机理的研究显得尤
为迫切。传统的基因剔除和以后利用Cre/LoxP或Red重组系统介导
的组织特异性剔除作为一种有效的研究手段已经在这个方面发挥了
重要的作用，但是删除与胚胎发育相关的重要基因常常导致小鼠胚胎
畸形或在胚胎早期即死亡而无法获得成体动物。采用Cre/LoxP或Red
重组系统和昆虫激素诱导表达系统制备时空特异性表达的动物模型，
分别从时间和空间上来控制某些重要基因的表达来研究其在不同发
育阶段的作用无疑是一种更加切实有效的研究手段。
转基因技术始创于20世纪60年代末。1980年Gordon等人首先
报道利用显微注射纯化DNA的方法获得了世界上第一只转基因鼠。
此后，该技术几经发展完善，终于在1981年和1982年Brinster、
Palmiter和RonEvans分别合作成功制备了具有里程碑性质的在肝脏
中表达TK基因的超级小白鼠和整合表达大鼠GH基因的“巨型鼠”。
[Brinster RL，Chen HY，Trumbauer M et al.Somatic expression of herps
thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into
eggs.Cell，1981，27：223～231；Palmiter RD，Brinster RL，Hammer RE et
al.Dramatic growth of mice that develop from eggs with
metallothionein-growth hormone fusion gene.Nature，1982，300：611～
615.]自此转基因动物模型以其能够最大限度地模拟体内某些基因发
挥作用的真实环境从而更加容易和准确地探讨该基因的生物学功能
及表达调控机制而倍受遗传学者们的青睐。
在建立转基因动物模型的过程中，存在许多影响转入基因表达效
率和组织特异性的因素，其中首推指导转入基因表达的调控序列。调
控序列的长短是影响外源基因表达的组织特异性和水平高低的关键
因素之一。在指导外源基因表达的调控序列的选择过程中，调控序列
的长度应该是越长越好，至少应该不少于1.8～2.0kb，这样才可能保
证外源基因的表达表现出较好的组织特异性和较高的表达效率[Li S.
Glucocorticoid regulation of rat whey acidic protein gene expression
involves hormone-induced alterations of chromatin structure in the distal
promoter region.Mol Endocrinol.1994，8：1328～1335；David IK.
Regulation of beta-globin gene expression：straightening out the locus.
Curr Opin in Genntic&Dev.1996，6：488～495；Loc Phi-Van.Dissection
of the ability of the chicken lysozyme gene 5′matrix attachment region to
stimulate transgene expression and to dampen position effects.
Biochemistry，1996，35：10735～10742.]。
神经胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)为
神经胶质细胞的主要骨架蛋白，该蛋白的表达主要局限于中枢神经
系统的星形胶质细胞中，传统上被认为是神经胶质细胞的特异性标志
物。它在神经系统发育早期神经胶质细胞分化成熟时即开始表达，在
中枢神经系统受到损伤或处于疾病状态时表达量上调[Michael
Brenner，Albee Messing.GFAP transgenic mice.METHODS：A
Companion to Methods in Enzymology，1996，10：351～364；J.George
Quintana，Isabel Lopez-Colberg，Lee Anna Cunningham.Use of
GFAP-lacZ transgenic mice to determine astrocyte fate in grafts of
embryonic ventral midbrain.Development Brain Research，
1998，105：147～151；]。因此我们在制备中枢神经系统特异性表达Cre
重组酶的转基因小鼠的过程中，克隆了129sv小鼠GFAP基因5’端
1.8kb调控序列用于指导Cre重组酶基因在中枢神经系统中的特异性
高效表达。
该转基因鼠的获得为借助Cre/loxP重组系统在中枢神经系统中
实现一系列基因重组操作、制备时空特异性表达动物模型来研究某些
细胞因子(例如：IGF-I)在中枢神经系统的不同发育阶段中的神经生物
学功能及其表达模式提供一个极为有利的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的
转基因小鼠的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先利用PCR筛选的方法从129sv小鼠的基因组文库中克
隆得到了GFAP基因5’端1.8kb调控序列，本序列已被GeneBank收
录(Accession Number：AY279974)。该部分序列详见序列表。
将该调控序列用于中枢神经系统特异性表达Cre重组酶转基因载
体的构建，该载体主要包括4个元件：2.4Kb的两个β球蛋白绝缘子、
1.8Kb的GFAP5’端调控序列、1.2Kb的Cre重组酶基因和2.1Kb含内
含子的人生长激素基因的polyA，加之载体序列共11.3kb。利用Not
I线性化pGFAP-Cre-hGH载体，去除3.7Kb的无关序列，低熔点琼
脂糖电泳回收包含两个β球蛋白绝缘子、GFAP5’端调控序列、Cre
重组酶基因和人生长激素基因polyA大小为7.6Kb的目的片段。该注
射片段纯化后稀释至3ng/μl，经显微注射导入小鼠受精卵的雄原核，
再将注射后的受精卵移植入受体假孕母鼠的输卵管伞部，最后发育为
个体。通过PCR方法和Southern杂交鉴定出生的子代鼠，将两项鉴
定结果均为阳性的Cre转基因小鼠进行传代建系。选用PCR检测和
Southern杂交检测均为阳性的Cre重组酶转基因的首建者小鼠与
ROSA26鼠交配检测Cre重组酶转基因阳性的首建者小鼠中Cre重组
酶的活性和组织特异性。在ROSA26鼠的基因组中整合有包括SA启
动子、两个Loxp序列锚定的neomycin基因、LacZ基因和牛生长激
素基因polyA在内的一个表达框(见图4)。在没有Cre重组酶同时存
在的情况下，其中SA启动子对LacZ基因的启动作用被两个Loxp序
列锚定的neomycin基因阻断，不能被转录和编码出有活性的β-半乳
糖苷酶；如果同时存在有活性的Cre重组酶，它就可以将Loxp序列
之间的neomycin基因特异性删除，从而使SA启动子启动后面LacZ
基因的表达。此时如果加入特异性的生色底物X-gal，即会呈现出特
异性的蓝色。该方法通常称为LacZ染色。利用PCR检测F1代鼠中
Cre基因和LacZ基因的携带情况：在Cre基因上设计特异性引物C1
和C2引物进行Cre基因的PCR检测；在LacZ基因上设计特异性引
物L1和L2用于LacZ基因的PCR检测。经过上述检测，首先选取
发育至13d的基因型为Cre+/-/LacZ+/-子代鼠的胚胎，经LacZ染色
后制备石蜡切片观察其中Cre重组酶的表达情况；然后选取出生后约
2周基因型为Cre+/-/LacZ+/-的子代鼠的不同组织制备冰冻切片后
进行LacZ染色，观察Cre重组酶的活性和组织特异性。上述实验均
选取基因型为Cre-/-/LacZ+/-的子代鼠作为阴性对照。
附图说明
图1为转基因载体pGFAP-Cre-hGH的构建图。
图2为PCR鉴定Cre转基因首建者小鼠的电泳结果。其中，1
代表作为阴性对照的非转基因小鼠，2代表作为阳性对照的转基因载
体，3、4、5、7和8分别代表GFAP-Cre转基因首建者小鼠，M
代表DNA分子量标记物。
图3为Southern杂交鉴定Cre转基因首建者小鼠的杂交结果。其
中，1代表作为阳性对照的注射片段，2代表作为阴性对照的非转基
因小鼠，3、4、5、6、7和8分别代表不同的GFAP-Cre转基因首建
者小鼠。
图4为GFAP-Cre转基因鼠与ROSA26的交配情况。
图5为PCR鉴定GFAP小鼠F1代Cre基因携带情况的电泳图。
其中，1代表作为阴性对照的非转基因小鼠，2代表作为阳性对照的
Cre转基因小鼠，4、5和8分别代表Cre基因携带小鼠，3、6和7
分别代表未携带Cre基因的小鼠，M代表DNA分子量标记物。
图6为PCR鉴定GFAP F1代小鼠LacZ基因携带情况的电泳图。
其中，1代表作为阴性对照的非转基因小鼠，2代表作为阳性对照的
携带LacZ基因的小鼠，3、5、6和8分别代表LacZ基因携带小鼠，
4和7分别代表未携带LacZ基因小鼠，M：DNA分子量标记物。
图7为GFAP-Cre转基因鼠胚胎期13天LacZ染色后的石蜡切片
图8为GFAP-Cre转基因鼠出生后两周不同组织LacZ染色后的
冰冻切片。其中，A代表基因型为Cre+/-/LacZ+/-的小鼠的脑组织，B
代表基因型为Cre-/-/LacZ+/-的小鼠的脑组织，另外，C、D、E、F、G、
H和I分别代表基因型为Cre+/-/LacZ+/-的小鼠的心脏、肝脏、肺脏、
胃、肠、肾脏和肌肉。
具体实施方式
材料和方法
1质粒与菌株
胰腺特异性表达Cre重组酶质粒pRCH由本所周江博士惠赠，
pBC1质粒、pGEM-5Z质粒、DH10β菌株由本实验室保存。
2工具酶与试剂
所用限制性内切酶、Klenow fragment酶、T4DNA聚合酶、dNTP
购自TaKaRa公司。T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自华美公司，
蛋白酶K购自Merck公司。M2、M16、石蜡油购自Sigma公司。X-gal、
Wizard DNA Clean-up System、Prime-A-Gene Labeling System购自
Promega公司。QIAprep Spin Miniprep Kit购自QIAGEN公司。
3 pGFAP-Cre转基因载体的构建
利用PCR方法筛选129sv小鼠的基因组文库，成功克隆到129sv
小鼠神经胶质细胞酸性蛋白(GFAP)5’端侧翼区1.8Kb的调控序列(该
部分资料待发表)。以129sv小鼠的胚胎干细胞基因组DNA为模板扩
增获得1.8Kb的GFAP5’端调控序列。引物为GFAP-1：5’-CGCCATGTC
GCTGGTATG GAGTATAGGCTG-3’，GFAP-2：5’-CGCGTCGACCCTG
CCCTGCCTCTG CTGG-3’。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃
变性30sec，68℃退火延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃
保温。将得到的1.8Kb的GFAP5’端调控序列克隆至pGEM-5Z质粒，
序列测定确认无误。
pRCH质粒含有胰岛素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激
素基因polyA。以Sal I和BamH I双酶切pBC1质粒，回收2.4Kb的
含有两个β球蛋白绝缘子的片段，将其克隆至含有GFAP5’端调控序
列的5Z质粒上的Spe I位点中，再利用上述两个片段两侧预留的Sal
I位点将连在一起的β球蛋白绝缘子与GFAP5’端调控序列切出，插
入到胰岛素基因启动子和Cre重组酶基因之间的Sal I位点得到最后
的pGFAP-Cre-hGH转基因载体，经鉴定完全正确。
PCR产物的回收、质粒DNA的提取、DNA片段的回收与连接、
DH10β大肠杆菌感受态的制备、转化等操作均按《分子克隆》第二
版进行。
4受精卵的显微注射
回收并纯化注射片段，按常规进行显微注射和受精卵移植。实验
用昆明白小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。
5转基因小鼠的基因型鉴定
5.1 PCR检测
取出生后10～14d的小鼠，剪下尾尖约0.5cm置于1.5cm离心管
中，加入400μl组织裂解液[0.5％SDS、0.1mol/L NaCl、0.05mmol
/L EDTA、0.01mmol/L Tris-Cl(pH8.0)、100μg/ml蛋白酶K]，
50℃保温过夜，按《分子克隆》第二版制备基因组DNA作为PCR模
板。
Cre重组酶特异性引物C 1(5’-TTGCCTGCATTACCGGTCGATGC
-3’)和C2(5’-TTGCAC GTTCACCGGCATCAACG-3’)由本所国家生
物医学分析中心DNA合成和序列分析实验室合成，可扩增Cre重组
酶基因354bp的片段，用于转基因小鼠的PCR检测。PCR扩增条件：
94℃预变性5min；94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸1min，
30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
5.2 Southern杂交检测
取保存的pRCH质粒，用Sal I和EcoR I进行酶切，回收1.2kb
片段，用TE(pH7.4)稀释到25ng/μl，备用。
选用PCR鉴定为阳性的Cre转基因小鼠的鼠尾DNA，经Sma I
酶切过夜，0.8％琼脂糖凝胶电泳36h后转移至硝酸纤维素膜上。
Southern杂交方法参见《分子克隆》第二版进行。
6 Cre重组酶活性与组织特异性检测
这里我们利用了ROSA26工具鼠来检测Cre重组酶转基因阳性的
首建者小鼠中Cre重组酶的活性和组织特异性。在ROSA26鼠的基因
组中整合有包括SA启动子、两个Loxp序列锚定的neomycin基因、
LacZ基因和牛生长激素基因polyA在内的一个表达框(见图4)。在没
有Cre重组酶同时存在的情况下，其中SA启动子对LacZ基因的启
动作用被两个Loxp序列锚定的neomycin基因阻断，不能被转录和编
码出有活性的β-半乳糖苷酶；如果同时存在有活性的Cre重组酶，它
就可以将Loxp序列之间的neomycin基因特异性删除，从而使SA启
动子启动后面LacZ基因的表达。此时如果加入特异性的生色底物
X-gal，即会呈现出特异性的蓝色。该方法通常称为LacZ染色。
选用PCR检测和Southern杂交检测均为阳性的Cre重组酶转基
因的首建者小鼠与ROSA26鼠交配。利用PCR检测F1代鼠中Cre
基因和LacZ基因的携带情况：利用前述的C1和C2引物进行Cre基
因的PCR检测；在LacZ基因上设计特异性引物L1(5’-TTCCATGTT
GCCACTCGCTTTA-3’)和L2(5’-GTTTCGGGTTTTCGACGTTCAG
-3’)，可扩增226bp的片段，用于LacZ基因的PCR检测。经过上述
检测，首先选取发育至13d的基因型为Cre+/-/LacZ+/-子代鼠的胚
胎，经LacZ染色后制备石蜡切片观察其中Cre重组酶的表达情况；
然后选取出生后约2周基因型为Cre+/-/LacZ+/-的子代鼠的不同组
织制备冰冻切片后进行LacZ染色，观察Cre重组酶的活性和组织特
异性。上述实验均选取基因型为Cre-/-/LacZ+/-的子代鼠作为阴性对
照。图4显示Cre重组酶转基因鼠与ROSA26鼠交配情况。
结果
2.1中枢神经系统特异性表达Cre重组酶转基因载体
pGFAP-Cre-hGH的构建
我们所构建的中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因载体
主要包括4个元件：2.4Kb的两个β球蛋白绝缘子、1.8Kb的GFAP5’
端调控序列、1.2Kb的Cre重组酶基因和2.1Kb含内含子的人生长激
素基因的polyA，加之载体序列共11.3kb(图1)。
2.2 GFAP-Cre转基因小鼠的建立
利用Not I线性化pGFAP-Cre-hGH载体，去除3.7Kb的无关序列，
低熔点琼脂糖电泳回收包含两个β球蛋白绝缘子、GFAP5’端调控序
列、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA大小为7.6Kb的目的片
段。该注射片段纯化后稀释至3ng/μl，经显微注射导入小鼠受精卵的
雄原核，再将注射后的受精卵移植入受体假孕母鼠的输卵管伞部，最
后发育为个体。共注射受精卵191枚，移植卵176枚，分别移植到8
只受体鼠中，其中6只怀孕，获得子代鼠25只，假孕母鼠怀孕率为
75％，移植胚胎成功率为14.2％。
经PCR检测和Southern杂交检测，从25只仔鼠中共筛选出7只
携带Cre转基因的小鼠，转基因首建者阳性率为28％。图2显示PCR
鉴定Cre转基因首建者小鼠的部分结果，图3显示Southern杂交鉴定
Cre转基因首建者小鼠的部分结果。
2.3 GFAP-Cre转基因小鼠中枢神经系统特异性表达Cre重组酶
为了检测GFAP-Cre转基因小鼠中表达Cre重组酶的活性和组织
特异性，将其与ROSA26鼠交配。ROSA26鼠基因组中已经鉴定整合
有两个Loxp序列锚定的neomycin基因序列，因此可借此检测
GFAP-Cre转基因小鼠中表达Cre重组酶能否正确介导两个Loxp间的
重组以及组织表达情况。正确表达的Cre重组酶能够介导两个Loxp
间的重组而删除neomycin基因，从而是后面的LacZ基因表达β-半乳
糖苷酶，经LacZ染色后可见特异性蓝色。
首先，我们选取子代鼠13d的胚胎，经PCR检测鉴定基因型后，
选取基因型为Cre+/-/LacZ+/-的胚胎，另外选取基因型为Cre-/-/LacZ
+/-的胚胎作为阴性对照，进行LacZ染色制备石蜡切片。图5显示PCR
鉴定子代鼠中Cre重组酶基因的携带情况的部分结果，图6显示PCR
鉴定Cre转基因首建者小鼠的部分结果，染色后的结果见图7。在同
时携带有Cre基因和LacZ基因的阳性胚胎头部的第四脑室处可见到
LacZ染色产生的特异性蓝色印记(图中黑色箭头标记处)，而在阴性对
照胚胎的任何部位均未见蓝色印记。上述结果显示，在我们的发育至
5-13d GFAP-Cre转基因小鼠胚胎的头部的确表达出了具有活性的Cre
重组酶，并且成功介导了两个Loxp间的重组。
我们还选取了出生后两周的子代鼠检测Cre重组酶表达的组织
特异性。同样利用PCR检测鉴定基因型，选取同一只同时携带有Cre
基因和LacZ基因的子代鼠的脑、心脏、肝脏、肺脏、胃、肠、肾脏
和肌肉，另外选取只携带LacZ基因的子代鼠的脑作为阴性对照，将
上述组织制备冰冻切片后进行LacZ染色，染色后的结果见图8。在
在同时携带有Cre基因和LacZ基因的阳性子代鼠的脑部观察到了
LacZ染色产生的大量蓝色斑点，而在同一只阳性子代鼠心脏、肝脏、
肺脏、胃、肠、肾脏和肌肉切片中均未观察到LacZ染色产生的蓝色
斑点，同样，在在阴性对照鼠脑的切片中也未观察到蓝色斑点。上述
结果证明：出生后两周的GFAP-Cre转基因小鼠仅在脑部表达出了具
有活性的Cre重组酶，在其他脏器组织中均未见表达，表现出较好的
组织特异性。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>一种在中枢神经系统中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1778
<212>DNA
<213>
<400>1
catgtcgctg gtatggagta taggctgttg ctatgacagg aactcagggg tcttaactgg 60
cttgagcgct gggagggggc aagcagccag gccttgtctg taagctgaag acctggcagt 120
gctgagctgg tcacccccca ggacctcctt ttgtgcccaa cgagtgactc accttggcat 180
agacataatg gtcaggggtg ggcacgcagc ctgcttcccg ctgtgctcca ggcctccttc 240
gatgctttcc gagaagtcta ttgagctggg agcttgtact gcacccgggg ctgacatcct 300
ggcatcctgg gataaaagca gcccacgggg ctgcccttgc catatgcctc actggcggca 360
gaggacaagg ctctattcag caagtgccct ggagtagaca ccagaagccc aagcatgggc 420
agaggaaggc aggggttggg gggagcagag ctgtctgtgt tccagaagcc caaggacaca 480
gatggctaag gcgcctggga gggacctgag tggaagagat agatgggcct gaagtctcaa 540
gcagcaacag cctcctcccc gccattggtg agggtggggt ttggtttccc ggacctacat 600
atccctcaga ggcctggtgt gtaggaattt aaaggaggta aatctcctga gagaatgagg 660
ggtacccagg aagacggggt gttacagaaa gactccagca tgcacagcca actcactcaa 720
aactactctg tcaggggctg ccgggggcca ggctcggggt ggggggtggg ggggcaaaga 780
gaagctggac cagggagaaa tggcccacta ggctggatat gaggccacag aggggctcag 840
gaatgaagcc tgctgtctta ccctattagg atctgcgtgc ataccttctg ctgtgcactc 900
taaacacaca gccagaggct caagttgacc ctggagtcac agagagggct ccaaccttag 960
ccctccactc ctgaactcca ggaatgagaa gatagagttg gagcgattca ggggagagga 1020
ctctgttgag aatgggggcc acaggaaact gtaatatagg ttgatcccgg aggaagggaa 1080
taggttcttc aagttcctag catctcacag gcccccagag aaggacagag ttggggtggt 1140
cctggcttac aggctctaag aactggaagc tgattacccc accaagctgt gcactctctg 1200
tctctgtctc tgtctctgtg tgtgcgcgct cgtgcacact tatcacacaa atgttcatgt 1260
gtgtgcacat agatgagttg agaccagagg tcaacctcag gcactgttgc cttggttttc 1320
tgagagagca tttctctctg gacctggaac tcgccaatta gtgagagcca ggaagtctgc 1380
tgattttcac tgcccagcac tggagtttac aagtatgcac tgtcaaccca ggccttttgt 1440
attcattctg cagctagaac ttgggtgggt cttcatgctt gacaggcaag caatttatgg 1500
actaagctgt ttcctcggcc ctctcttgac ccatttacca gaaagggggt tccttgatca 1560
atggcgaagc caggctggtg ttcccaagaa agccttgact ctgggtacag tgacctcagt 1620
ggggtgagag gagttctccc cttagctggg ctggggccca gcttcacccc ctcaggctat 1680
tcagtggggg tgcttccagg aagtcagggg cagatttagt ccaacccgtt cctccataaa 1740
ggccctgaca tcccaggagc cagcagaggc agggcagg 1778