抗人促血液血管生长因子(HAPO)的单克隆抗体、多克隆抗体及其应用 【技术领域】
本发明涉及抗人促血液血管生长因子(hemangiopoietin，HAPO)，尤其是抗人HAPO单克隆抗体、多克隆抗体的制备和检测HAPO的ELISA试剂盒。
背景技术
干细胞是起源于受精卵的原始细胞，具有自我复制和多向分化的特征。胚胎发育过程中，干细胞逐级丧失其全能性，形成亚全能、多能干细胞和组织专能干细胞，后者按分化功能分别称造血干细胞、血管干细胞、皮肤干细胞等。干细胞移植在白血病、遗传性血液病、严重免疫缺陷性疾病、急性放射损伤等疾病的治疗中，发挥着越来越重要的作用。在这些过程中，各种细胞因子在干细胞的扩增、分化等过程中发挥着不可替代的作用。不同的干细胞，同系干细胞发育的不同阶段，都需要不同剂量和组合的细胞因子的参与。常见的造血因子有G-CSF，GM-CSF，EPO，TPO，SCF，IL-3，IL11等，能有效的刺激造血干/祖细胞的发育或分化。
人促血液血管生长因子(Hemangiopoietin，HAPO)见专利ZL01109083.9，是从再生障碍性贫血患者的尿中提取的一种新的蛋白因子。氨基酸及DNA测序结果表明，该因子是蛋白多糖4(Proteoglycan 4，PRG4)基因的一种新的剪接体的表达产物。HAPO的部分cDNA片段通过PCR扩增后已成功地重组于pET22b(+)的表达载体中并在大肠杆菌中得到高效表达。实验表明：重组人HAPO在体外能明显刺激人和小鼠的造血及内皮干、祖细胞地增殖，在体内能加速正常及放射小鼠的骨髓造血并能明显提高放射小鼠的存活率。
但是，有关HAPO的进一步研究：如体内实验中不同病理、生理条件下血、尿等体液中HAPO的有无及含量的改变；体外实验中不同表达体系、不同纯化阶段样品中HAPO的有无及含量的改变；不同细胞、组织中HAPO的表达及定位等，因为没有相应的抗体而无法进行。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：通过制备抗HAPO的单克隆抗体和多克隆抗体和组装检测HAPO的ELISA试剂盒来检测不同细胞、组织中HAPO的定位及表达；检测血、尿、培养上清、细胞、组织等不同样品中HAPO的有无及含量的改变。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗人促血液血管生长因子(HAPO)的单克隆抗体，用于制备单克隆抗体的免疫原为人HAPO的基因工程表达片段，其cDNA全长876bp，表达蛋白产物的分子量为31.8kDa，核苷酸序列和氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
单克隆抗体来源于HAPO免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。
所制备的抗HAPO单克隆抗体为IgG型或IgM型。
一种抗人HAPO的多克隆抗体，用人基因重组HAPO作免疫原，通过免疫正常家兔，收集血清，从中分离纯化出抗人HAPO多克隆抗体。
所述的抗人HAPO单克隆抗体和多克隆抗体，可以作各种标记，用以组建检测血液、尿样、培养上清，和各种细胞、组织中HAPO含量的试剂盒。
所述的抗人HAPO单克隆抗体和多克隆抗体，可以用来中和HAPO的生物学活性。
一种检测HAPO的ELISA试剂盒，采用抗人HAPO多克隆抗体或单克隆抗体为捕获抗体，识别并结合待检标本中的HAPO，采用
a、以生物素标记的抗人HAPO单克隆抗体或多克隆抗体为检测抗体，通过亲和素/链酶亲和素-辣根过氧化物酶或亲和素/链酶亲和素-碱性磷酸酶催化底物显色；或
b、以酶标记的抗人HAPO单克隆抗体或多克隆抗体为检测抗体，直接加底物显色；或
c、以抗人HAPO单克隆抗体或多克隆抗体为二级抗体，以酶标记的山羊或兔的抗鼠抗体为三级抗体，催化底物显色；
然后根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本中HAPO的含量，试剂盒包括包被抗体1支、检测抗体1支、HAPO标准品1支、底物液1支、96孔ELISA板1块。
所述的抗人HAPO的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
a、动物免疫：初次免疫：Ag10-100μg加福氏完全佐剂皮下多点注射；2-4周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下注射；2-4周后第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，ip；2-4周后加强免疫50-100μg iv；3天后取脾融合；
b、细胞融合：NS-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶(3-5)的比例混合，在50％PEG 1000-4000存在下融合；
c、选择杂交瘤：融合24小时后，加HAT选择培养液维持培养1-2周，改用HT培养液，再维持培养1-2周，改用一般培养液；
d、检测抗体：间接ELISA法；
e、杂交瘤细胞的采用有限稀释法克隆化及冻存：
f、单克隆抗体的大量生产：同种小鼠的腹水瘤模型。
所述制备的抗HAPO单克隆抗体的纯化，包括以下步骤：
a、蛋白A或蛋白G亲和层析柱的平衡；
b、腹水的处理：1000-10000rpm离心2-20分钟；
c、上样，洗脱，中和，冻干，脱盐及定量。
所述制备的抗HAPO单克隆抗体的标记，包括以下步骤：NHS-Biotin或NHS-LC-Biotin或NHS-LC-LC-Biotin溶解于新鲜的DMSO中，使成1-5mg/ml；1ml 0.5-10mg/ml单克隆抗体与100ul活化生物素混合，冰浴1小时以上；脱盐，去除未反应的活化生物素；蛋白定量，与30％-70％甘油充分混合，分装，-20℃保存。
一种抗人促血液血管生长因子(HAPO)的多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：
a、纯化的抗原10-500ug/只，与等体积完全佛氏佐剂充分混合、乳化，皮下多点注射正常家兔；
b、2-4周后，相同量抗原与不完全佛氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射；
c、2-4周后，重复步骤b；
d、末次免疫一周后采耳血，免疫双扩散法测效价，大于1∶4即可；
e、耳缘静脉采血，收集血清，-20℃保存。
所述制备的抗HAPO多克隆抗体的纯化，包括以下步骤：
a、抗原亲和柱的制备：纯化的抗原透析于偶联缓冲液中，预冷的0.5-50mM HCl洗涤CNBr-活化的sepharose 4 fast flow胶数次，负压超滤，并置换于偶联缓冲液中；将抗原与活化的胶粒混合，4℃搅拌过夜；用偶联缓冲液洗涤未完全结合的抗原；封闭缓冲液室温作用0.5小时以上，封闭未被抗原饱和的活化位点；pH8-9的洗涤缓冲液和pH3-4的洗涤缓冲液交替洗涤2次以上，偶联抗原的胶粒保存于20％酒精中；
b、抗原亲和柱纯化多克隆抗体，方法同单克隆抗体的纯化，蛋白定量，分装，-20℃保存。
所述的检测HAPO的ELISA试剂盒，包被抗体浓度范围为0.2-20ug/ml；检测抗体浓度范围为0.2-20ug/ml；HAPO标准品浓度范围为5pg/ml-5ug/ml。
本发明的有益效果：使不同生理、病理条件下血、尿等体液中HAPO的有无及含量改变的检测成为可能；使体外实验中不同培养体系、不同纯化阶段中HAPO的有无及含量改变的检测成为可能；使HAPO在不同细胞、组织中的表达、定位等检测成为可能；为HAPO的受体研究等提供帮助。
【具体实施方式】
下面，结合实施例对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。
一、单克隆抗体制备
单克隆抗体制备的技术原理：要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体制备的技术路线：制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等耗时几个月的一系列实验步骤。
(一)细胞融合前准备
1、免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果，可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂有：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。人促血液血管生长因子(HAPO)为可溶性抗原，因此在其免疫过程中需加入佐剂。具体免疫方案如下：
初次免疫 Ag 50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
| (一般0.8～1ml 0.2ml/点)
↓3周后
第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下注射
↓3周后
第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip
|(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
↓3周后
加强免疫，剂量100μg为宜，iv
↓3天后
取脾融合
2、饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。本单克隆抗体生产过程中采用的饲养细胞为小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠胸腺细胞。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
6～8周龄雌性BALB/c小鼠
↓
拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入6～8ml培养液
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
放入10ml离心管，1200转/分离心5～6分钟
↓
用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培养
饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得(5～8)×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml。
3、骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞系和免疫动物属于同一品系BALB/c，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。所用骨髓瘤细胞系为NS-1(还有SP2/0、X63 Ag8.653)等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在(10～20)％，细胞的最大密度不得超106/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。
4、免疫脾细胞 免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞。取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积2倍，细胞数为2×108左右。
(二)细胞融合，选择杂交瘤
1、细胞融合流程
(1)取对数生长的骨髓瘤细胞NS-1，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。
(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6)在37℃下融合：
①60秒内加入预热的1ml 50％PEG 4000，边加边搅拌。
②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
③加10ml预热的不完全培养液，终止PEG作用，前30秒加入2ml，剩下的一分钟内加完。
(7)离心，800rpm，6分钟。
(8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％C02孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
2、HAT选择杂交瘤一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有50倍浓缩的商品化试剂，用时1ml加入50ml 20％小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果。一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
(三)抗体的检测
通过选择性培养所获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可用间接ELISA放法检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
(四)杂交瘤的克隆化和冻存
克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化，将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞及其它无关抗体分泌细胞彼此分开。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
1、克隆化方案：有限稀释法
(1)制备饲养细胞悬液(同融合前准备)。
(2)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在(1～5)×103/ml。
(3)取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
(4)培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。
(5)第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
2、杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
(五)单克隆抗体的大量生产
先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)于BALB/c鼠，1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml。
(六)单克隆抗体的鉴定
(1)抗体特异性的鉴定：用ELISA等方法鉴定McAb与表达菌株的蛋白，常用动物血清及其它细胞因子间是否有交叉反应。
(2)McAb的Ig类/亚类、型/亚型的鉴定：用市售单克隆抗体Isotypingkit进行鉴定。
(3)McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。
(4)McAb亲和力的鉴定：用非竞争ELISA试验来确定McAb的亲和力。
二、单克隆抗体的纯化
(1)用结合缓冲液(0.1M乙酸钠-冰乙酸缓冲液，pH 5.0)充分平衡已装填好的2ml蛋白G亲和层析柱；
(2)1ml收集的腹水2000rpm离心10分钟，上清用1ml结合缓冲液稀释后反复上样3次，流速0.5ml/min；
(3)结合缓冲液充分洗涤至基线；
(4)洗脱缓冲液(0.1M盐酸-甘氨酸缓冲液，pH 2.8)洗脱，收集至加有适量磷酸盐缓冲液(10×PBS pH 7.6)的烧杯中；
(5)透析至0.05×PBS，pH 7.2中；
(6)冻干，重溶于1/20原体积的去离子水中，蛋白定量，调节抗体浓度至所需水平。
三、单克隆抗体的标记
(1)NHS-LC-Biotin溶解于新鲜的DMSO中，使成2mg/ml；
(2)1ml 2mg/ml单克隆抗体(溶解于0.1M phosphate，0.15MNaCl，pH7.2)与100ul活化生物素混合，冰浴2小时；
(3)G-25脱盐柱脱盐，去除未反应的活化生物素；
(4)蛋白定量，分装，-20℃保存。
四、多克隆抗体的制备
(1)纯化的抗原150ug/只，与等体积完全佛氏佐剂充分混合、乳化，皮下多点注射正常家兔；
(2)一月后，相同量抗原与不完全佛氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射；
(3)一月后，重复步骤(2)；
(4)末次免疫后一周采耳血，免疫双扩散法测效价，大于1∶8即可；
(5)耳缘静脉采血，50ml/次，采两次；
采集的血液置37℃孵箱静置1小时，小心剥离凝块，置4℃冰箱过夜。离心4000rpm，20min，上清分装、-20℃保存。
五、抗原亲和柱的制备
(1)纯化的抗原透析于0.05×偶联缓冲液中(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)，冻干，重溶于1/20原体积的去离子水中；
(2)预冷的1mM HCl洗涤CNBr-活化的sepharose 4 fast flow胶数次，负压超滤，并置换于偶联缓冲液中；
(3)将抗原与活化的胶粒混合，4℃搅拌过夜；
(4)用偶联缓冲液洗涤未完全结合的抗原；
(5)封闭缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 8.0)室温作用2小时，封闭未被抗原饱和的活化位点；
(6)3个柱床体积的洗涤缓冲液1(0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8-9)和3个柱床体积的洗涤缓冲液2(0.1M acetate buffer，0.5M NaCl，pH3-4)交替洗涤3次以上。
偶联抗原的胶粒保存于20％酒精中。
六、多克隆抗体的纯化
(1)结合缓冲液(PBS)充分平衡抗原偶联的亲和层析柱；
(2)兔多克隆免疫血清1ml与3ml PBS混合后，反复上样3次，流速0.5ml/min；
(3)PBS充分洗涤，去除未结合蛋白；
(4)洗脱缓冲液(0.1M盐酸-甘氨酸缓冲液，pH 2.8)洗脱特异结合的抗免疫抗原的多克隆抗体，收集至加有适量10×PBS pH7.6的烧杯中；
(5)透析至1×PBS中，蛋白定量，分装，-20℃保存。
七、ELISA试剂盒
采用兔抗HAPO多克隆抗体为捕获抗体，识别并结合待检标本中的HAPO，以生物素标记的高亲和力抗HAPO单克隆抗体为检测抗体，通过链酶亲和素-辣根过氧化物酶催化底物显色。根据标准品OD值在双对数坐标纸上绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本中HAPO的含量。
(一)试剂盒
试剂盒提供：
(1)包被抗体一支(120ul)：使用时用包被缓冲液作100倍稀释。
(2)检测抗体1支(120ul)：使用时用稀释缓冲液作100倍稀释。
(3)HAPO标准品1支(20ul)：0.5mg/ml，使用时用稀释液稀释。
(4)Turbo-TMB底物1支。
(5)96孔ELISA板1块。
自备试剂和材料：
(1)0.1M phosphate buffer，0.15M NaCl，pH7.4(PBS)。
(2)包被缓冲液：0.05M Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。
(3)封闭液：1％BSA/PBS，0.02％硫柳汞。
(4)洗涤液：0.1M PBS，pH7.4，0.05％Tween 20
(5)稀释液：PBS，0.5％BSA，0.02％硫柳汞。
(6)读数仪等。
操作步骤：
(1)包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100ul/孔，4℃放置18小时以上。
(2.)封闭：倒掉包被液，洗板3次，300ul/孔，30秒/次；加入封闭液100ul/孔，37C放置1小时。
(3)倒掉封闭液，不洗，加待检标本、阴性对照及倍比稀释的标准品，100ul/孔，室温于摇床上孵育2小时。标准品稀释方法：取标准品1ul，加入1ml稀释缓冲液中，充分混匀，作1.10，1∶102，(1∶102)/3，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106系列稀释，成为500ng/ml，50ng/ml，16.67ng/ml，5ng/ml，500pg/ml，50pg/ml和5pg/ml。
(4)倒掉待检标本，洗3次。加生物素标记单克隆抗体100ul/孔，于室温摇床上作用2小时。
(5)倒掉一抗，洗3次，加入1∶500稀释的链酶亲和素-辣根过氧化物酶结合物，100ul/孔，于室温摇床上作用30分钟。
(6)洗5次。加入底物Turbo-TMB，100ul/孔，避光作用15-30分钟，至标准曲线出现明显梯度。
(7)加入2M H2SO4 50ul/孔，终止反应。
(8)ELISA读数仪测450nm处OD值，绘制标准曲线。
上述试剂配制比例：
(1)0.1M phosphate，0.15M NaCl，pH7.4(PBS)
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
双蒸水加至 1000ml
(2)包被缓冲液
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
双蒸水加至 1000ml
(3)洗涤液
PBS 1000ml
Tween20 0.5ml
(4)稀释液
洗涤液 100ml
BSA(牛血清白蛋白) 0.1g
(5)封闭液：
洗涤液 100ml
BSA(牛血清白蛋白) 1g
硫柳汞 0.02g
(二)贮存
(1)短期内使用，贮存于2～8℃。
(2)长期放置，需储存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。
(三)标本
细胞培养上清、血清、枸橼酸盐或EDTA抗凝血浆及尿液均可检测。
(四)注意事项
(1)血清或血浆中残存凝块或红细胞需经离心去除，勿用溶血或脂肪过多的血清。
(2)标本在2～8℃可贮存3天，超过3天应放入-20℃或-80℃，避免反复冻融。
(3)分别用加样器头吸取各份标本，避免相互交叉。
(4)叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用，在本试验系统中应避免使用。
(5)底物液应避光保存。
(6)所有试剂使用前应恢复至室温。
质量控制：
(1)灵敏度：本测定盒灵敏度＜0.2ng/ml。
(2)精密度：用本方法检测低、中、高三组样品。批内变异系数(CV)分别为5.19％(74.53±3.87ng/ml)，2.80％(83.26±2.33ng/ml)，3.10％(97.00±3.01ng/ml)。批间变异系数为8.70％(73.25±6.37ng/ml)，6.40％(82.53±5.28ng/ml)和4.89％(95.44±4.67ng/ml)。见表1。
表1正常血清中HAPO含量检测：分析变异度
标本 重复 HAP0含量(ng/ml)
编号 次数 均值 标准差 变异度％
组内变异 1 6 74.53 3.87 5.19
2 6 83.26 2.33 2.80
3 6 97.00 3.01 3.10
组间变异 1 5 73.25 6.37 8.70
2 5 82.53 5.28 6.40
3 5 95.44 4.67 4.89
(3)准确性：用回收率实验验证方法的准却性。向已知HAPO浓度的中分别加入低、中、高三种HAPO标准品，测定回收率分别为：90.674.16％，94.67±6.51％，94.67±1.53％。见表2。
表2正常血清中HAPO含量检测：回收率
样品 HAPO含量(ng/ml) 回收率
编号 加入量 测定值 ％
1 0 72.64 ---
0.5 73.11 94
2 74.66 101
5 77.39 95
2 0 81.93 ---
0.5 82.36 86
2 83.68 88
5 86.59 93
3 0 90.26 ---
0.5 90.72 92
2 92.15 95
5 95.08 96
将HAPO含量较高的血清用稀释液做1/2、1/5及1/10稀释，测定各点的HAPO含量。测定值分别相当未稀释样品的92.54±3.50％，98.67±5.15％和106.54±3.37％。表明测定值与稀释度之间有良好的线性关系。见表3。
表3正常血清中HAPO含量检测：稀释线性度
样品 稀释倍数 HAPO含量(ng/ml)
编号 观测值 期望值 ％期望值
1 --- 73.38 73.38 100
2× 67.74 92.31
5× 76.47 104.21
10× 80.42 109.59
2 --- 82.94 82.94 100
2× 79.75 96.15
5× 81.08 97.76
10× 85.37 102.93
3 --- 94.46 94.46 100
2× 84.23 89.17
5× 88.82 94.03
10× 101.17 107.10
SEQUENCE LISTING(序列表)
<110>中国医学科学院血液学研究所
<120>抗人促血液血管生长因子(HAPO)的单克隆抗体、多克隆抗体及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>876
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(1)..(876)
<400>1
gat gcc acc tgc aac tgt gat tat aac tgt caa cac tac atg gag tgc 48
Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys
1 5 10 15
tgc cct gat ttc aag aga gtc tgc act gcg gag ctt tcc tgt aaa ggc 96
Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly
20 25 30
cgc tgc ttt gag tcc ttc gag aga ggg agg gag tgt gac tgc gac gcc 144
Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala
35 40 45
caa tgt aag aag tat gac aag tgc tgt ccc gat tat gag agt ttc tgt 192
Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys
50 55 60
gca gaa gtg cat aat ccc aca tca cca cca tct tca aag aaa gca cct 240
Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro
65 70 75 80
cca cct tca gga gca tct caa acc atc aaa tca aca acc aaa cgt tca 288
Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser
85 90 95
ccc aaa cca cca aac aag aag aag act aag aaa gtt ata gaa tca gag 336
Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu
100 105 110
gaa ata aca gaa aaa gat aac aag aag aac aga act aaa aag aaa cct 384
Glu Ile Thr Glu Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr Lys Lys Lys Pro
115 120 125
acc ccc aaa cca cca gtt gta gat gaa gct gga agt gga ttg gac aat 432
Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu Asp Asn
130 135 140
ggt gac ttc aag gtc aca act cct gac acg tct acc acc caa cac aat 480
Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr Thr Gln His Asn
145 150 155 160
aaa gtc agc aca tct ccc aag atc aca aca gca aaa cca ata aat ccc 528
Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys Pro Ile Asn Pro
165 170 175
aga ccc agt ctt cca cct aat tct gat aca tct aaa gag acg tct ttg 576
Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys Glu Thr Ser Leu
180 185 190
aca gtg aat aaa gag aca aca gtt gaa act aaa gaa act act aca aca 624
Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu Thr Thr Thr Thr
195 200 205
aat aaa cag act tca act gat gga aaa gag aag act act tcc gct aaa 672
Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr Thr Ser Ala Lys
210 215 220
gag aca caa agt ata gag aaa aca tct gct aaa gat tta gca ccc aca 720
Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp Leu Ala Pro Thr
225 230 235 240
tct aaa gtg ctg gct aaa cct aca ccc aaa gct gaa act aca acc aaa 768
Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu Thr Thr Thr Lys
245 250 255
ggc cct gct ctc acc act ccc aag gag ccc acg ccc acc act ccc aag 816
Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro Lys
260 265 270
gag cct gca tct acc aca ccc aaa gag ccc aca cct acc acc atc aag 864
Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Ile Lys
275 280 285
tct gca ccc acc 876
Ser Ala Pro Thr
290
<210>2
<211>292
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(1)..(292)
<400>2
Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys
1 5 10 15
Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly
20 25 30
Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala
35 40 45
Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys
50 55 60
Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro
65 70 75 80
Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser
85 90 95
Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu
100 105 110
Glu Ile Thr Glu Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr Lys Lys Lys Pro
115 120 125
Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu Asp Asn
130 135 140
Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr Thr Gln His Asn
145 150 155 160
Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys Pro Ile Asn Pro
165 170 175
Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys Glu Thr Ser Leu
180 185 190
Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu Thr Thr Thr Thr
195 200 205
Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr Thr Ser Ala Lys
210 215 220
Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp Leu Ala Pro Thr
225 230 235 240
Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro Lys
260 265 270
Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Ile Lys
275 280 285
Ser Ala Pro Thr
290