大鼠心肌细胞培养上清的用途和应用 一、技术领域
本发明涉及大鼠心肌细胞培养上清液的用途和保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基及其制备方法,尤其是大鼠心肌细胞培养上清液用于制备保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基及制备方法。
二、背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是具有全能分化潜能的细胞,体外培养极易发生分化,需加入细胞因子以抑制其分化。体外培养ES细胞的方法归纳起来有两类:有饲养层培养法和无饲养层培养法。有饲养层培养法是早期的方法,主要应用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或STO细胞系作为饲养层细胞,经处理终止其分裂后制备成饲养单层,将ES细胞种植在这样的单层上。MEF和STO都能分泌促进ES细胞增生和抑制其自主分化的因子—白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),含量在500~1000IU/ml(分泌型);同时在MEF和STO基质上还存在LIF(基质型)。无饲养层培养法是在基础培养基中加入重组的LIF制备成条件培养基。使用饲养层来培养ES细胞,具有很多缺点:1、MEF生命有限,不能在体外长期传代。在体外传代时间太长,其产生促增生因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失;2、在ES细胞培养过程中,死亡的MEF或STO细胞染色体释放出可能会引起ES细胞的突变及影响正常核型的保持。因此目前多使用无饲养层的含LIF的条件培养基,使ES细胞以未分化的、贴壁的、细胞集落的方式生长。
白血病抑制因子(LIF),美国专利US5166065对此有具体的描述,LIF是美国CHEMICON公司专利产品,是重组的细胞因子,不仅价格昂贵,市场售价为2600~3000人民币/10μg,且按照产品推荐浓度,不能维持ES细胞在体外的增殖,需2倍、3倍或更高浓度才能达到要求。
三、发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种价格低廉、效果好,能保持鼠胚胎干细胞在体外培养不产生分化而增殖的培养基,以解决现有技术利用LIF加入鼠ES细胞培养基对体外培养鼠ES细胞成本高且效果不佳地缺点。为此,本发明采取以下技术方案:
一种大鼠心肌细胞培养上清的用途,所述大鼠心肌细胞培养上清可用作保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基。大鼠心肌细胞培养上清不仅可单独作为保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基,还可在大鼠心肌细胞培养上清中加入适当的培养基辅料成为鼠胚胎干细胞的专用培养基。
一种保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基,所述的培养基含有大鼠心肌细胞培养上清及培养基辅料。这里所讲的鼠心肌细胞培养上清就是取大鼠心脏按一定的方法制备出的心肌细胞培养上清液。
为了使鼠胚胎干细胞在体外的生长达到更好的效果,在将大鼠心肌细胞培养上清液和谷胺酰胺配制组合成为能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基,谷胺酰胺在培养基中的终浓度为1~4mmol/L。
同样的大鼠心肌细胞培养上清液和非必需氨基酸也可配制成组合物作为能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基,非必需氨基酸的终浓度为0.1mmol/L。
大鼠心肌细胞培养上清液与终浓度为1~4mmol/L谷胺酰胺及终浓度为0.1mmol/L非必需氨基酸也可共同组合,成为能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基。
上述这三种方式组合成的鼠胚胎干细胞的培养基,还可分别加入含量为0.05mmol/L的2-巯基乙醇各自构成组配更完善的鼠ES细胞培养基。
为了使培养基保持有充分的营养物质,还可在培养基中加入胎牛血清,胎牛血清的含量为10%~20%,如可在大鼠心肌细胞培养上清液中加入含量为终浓度为1~4mmol/L的谷胺酰胺和含量为10%~20%胎牛血清组成能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基。
现有技术中,是在培养液中加入LIF,能使鼠胚胎干细胞(鼠ES细胞)保持一种未分化的自我更新状态,我们在实验中发现,大鼠心肌细胞培养上清液除了单独用作鼠ES细胞培养基时可保持不分化而增殖,而且其细胞生长状态比只用LIF要好得多,更利于ES细胞的贴壁、增殖和克隆形成;在和LIF联合用作培养时也能保持鼠ES细胞不分化而增殖,且效果比单独使用LIF好。在大鼠心肌细胞培养上清液与LIF联合用作培养基时,LIF的含量选用1000单位/ml(即unit/ml)较合适。为确保能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的效果,通常选用2~3周龄大鼠心肌细胞1~6代培养上清液,这种情形取得的大鼠心肌细胞培养上清液通常质量较好,能保证鼠ES细胞在体外能迅速增殖而不产生分化。
一种用于制备保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的方法,所述的大鼠心肌细胞培养上清的制备方法按如下顺序进行:
a.取清洁级SD大鼠,处死,取心脏,去除心包膜及血块、结缔组织,洗涤,剪碎;
b.将小组织块移入培养瓶中进行培养,培养基为:含10%~20%牛血清的DMEM培养基,内含终浓度为1~4mmol/L谷胺酰胺,PH7.2~7.4;此为第一代心肌细胞,记为G1,当细胞长至瓶底面积的70%~80%时,进行传代,记为G2,如此传代,收集各代心肌细胞培养上清,于-30℃,备用。
为培养出更理想的大鼠心肌细胞培养上清液。可在上述方法的步骤a后增加消化步骤:m.将处理好的心脏剪碎物用0.02%-0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min,期间不断轻轻振荡,洗涤,离心,弃上清,保留沉淀细胞及小组织块。再进行b步骤。
所述的培养基的制备方法中的牛血清为可用胎牛血清。
鼠心肌细胞培养上清液的制备过程中提及的洗涤通常用无钙镁的缓冲液洗涤,如可用磷酸盐缓冲液洗涤。
本发明与现有技术相比具有如下优点及效果:(1)大鼠心肌细胞培养上清液可直接用作鼠ES细胞培养基,不需加入其它组分。(2)用本发明培养鼠ES细胞,使鼠ES细胞在体外培养保持不分化而增殖,效果比LIF好。根据LIF提供的产品说明,鼠ES细胞培养时,LIF最适浓度是1000单位/ml(即1000unit/ml),实验中发现此浓度不能使鼠ES细胞维持未分化增殖方式,需增加LIF浓度,而本发明使ES细胞体外生长状况良好。(3)本发明取材于大鼠心肌细胞,成本低,而LIF价格较为昂贵。(4)本发明不仅制备简单,且在促进ES细胞贴壁、增值、克隆形成等方面优于LIF。
四、附图说明
图1为实施例1所配培养基培养的鼠胚胎干细胞:鼠ES细胞集落(4×10倍)
图2为实施例2所配培养基培养的鼠胚胎干细胞:鼠ES细胞集落(10×10倍)
图3为实施例2所配培养基培养的鼠胚胎干细胞:鼠ES细胞集落(4×10倍)
五、具体实施方式
实施例1
1.1 准备以下材料:
1.1.1 鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠赠。
1.1.2 大鼠心肌细胞培养上清自备
1.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine,上海生工,Amresco产品分装,LotNo.1490B40)。
1.1.4 胎牛血清
1.1.5 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培养基
1.1.6 EDTA-胰蛋白酶
1.1.7 0.1%明胶溶液:明胶(gelatin,华美生物工程公司,Lot No.0205)用三蒸水稍加热后配成0.1%,0.22μm滤膜过滤,4℃保存备用。
1.1.8 碱性磷酸酶染色所用试剂:萘酚AS-MX磷酸酯;二甲基甲酰胺购自上海生工;2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇,上海化学试剂公司进口分装;坚牢蓝RR,购自Fluka公司。
1.1.9 实验动物:SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
1.2 制备方法按如下步骤:
1.2.1 大鼠心肌细胞培养上清制备
将3周龄的大鼠断颈处死,用75%酒精浸泡10分钟,取出心脏,去除心包膜及血块、结缔组织,用磷酸盐缓冲液(即PBS,pH调至7.4)洗涤,除去血液,剪碎。用0.02%-0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min,期间不断轻轻振荡,加入10倍量PBS进行洗涤,1200转离心5分钟,弃上清,将沉淀细胞及小组织块移入培养瓶中进行培养心肌细胞培养液采用贴片法于37℃,5%CO2中培养。培养基为:含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM高糖培养基,内含终浓度为2mmol/L谷胺酰胺(glutamin),PH7.2~7.4。此为第一代心肌细胞,记为G1,当细胞长至瓶底面积的70%~80%时,进行传代,记为G2,收集1-6代细胞的培养液,1200rpm离心8min,上清用0.22μm过滤,分装,-20℃保存备用。
1.2.2培养板预处理 在24孔培养板中加入0.1%明胶溶液,以盖满孔底为宜,室温中放置30min,吸弃明胶溶液,将培养板中残留的溶液吹干,整个过程注意无菌操作。将培养板密封,备用,4℃可放置2周。这样处理过的培养板会使细胞在培养时更贴壁。
1.2.3能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的配制:
培养基的配制,取大鼠心肌细胞培养上清加入终浓度为2mmol/L谷胺酰胺,终浓度为15%的胎牛血清混合,构成培养基,即鼠ES培养基。
1.3鼠ES细胞培养 复苏ES细胞,用明胶预处理的培养板培养细胞,37℃,5%CO2中培养24小时后换液,以后每24小时半量换液。接种ES时应注意将ES细胞吹打成单个细胞,因为ES细胞团的存在可刺激细胞分化。
1.4验证:采用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES细胞AKP阳性(细胞染成兰色);分化细胞AKP阴性(细胞染成黄色)。
上述培养好的鼠ES细胞放在显微镜下观察。
1.5 结果
显微镜下观察到上述ES细胞生长均非常迅速,24~48h可观察到有小的ES细胞集落形成,细胞体积小,核大,核浆比例大,细胞排列紧密。AKP染色阳性。传6代后仍能呈现集落生长,AKP测定仍为阳性。
鼠ES细胞集落生长状况如图1所示。
实施例2
2.1 准备以下材料:
2.1 准备以下材料:
2.1.1 鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠赠。
2.1.2 大鼠心肌细胞培养上清自备
2.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine,上海生工,Amresco产品分装,LotNo.1490B40)。
2.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培养基
2.1.5胎牛血清
2.1.6 EDTA-胰蛋白酶
2.1.7 0.1%明胶溶液:明胶(gelatin,华美生物工程公司,Lot No.0205)用三蒸水稍加热后配成0.1%,0.22μm滤膜过滤,4℃保存备用。
2.1.8 碱性磷酸酶染色所用试剂:萘酚AS-MX磷酸酯;二甲基甲酰胺购自上海生工;2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇,上海化学试剂公司进口分装;坚牢蓝RR,购自Fluka公司。
2.1.9 实验动物:SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
2.1.10 15%FCS-DMEM,含白血病抑制因子1000unit/ml(recombinantmurine leukemia inhibitory factor,rmLIF,购自Chemicon,LotNo.11161032;)
2.2 制备方法按如下步骤:
2.2.1 大鼠心肌细胞培养上清制备
将2周龄的大鼠断颈处死,,取出心脏,去除心包膜及血块、结缔组织,用磷酸盐缓冲液(即PBS,pH调至7.4)洗涤,除去血液,剪碎。用0.02%-0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min,期间不断轻轻振荡,加入10倍量PBS进行洗涤,1200转离心5分钟,弃上清,将沉淀细胞及小组织块移入培养瓶中进行培养心肌细胞培养液采用贴片法于37℃,5%CO2中培养。培养基为:含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM高糖培养基,终浓度为2mmol/L谷胺酰胺(glutamin),PH7.2~7.4。此为第一代心肌细胞,记为G1,当细胞长至瓶底面积的70%~80%时,进行传代,记为G2,收集1-6代细胞的培养液,1200rpm离心8min,上清用0.22μm过滤,分装,-30℃保存备用。
2.2.2 培养板预处理 在24孔培养板中加入0.1%明胶溶液,以盖满孔底为宜,室温中放置30min,吸弃明胶溶液,将培养板中残留的溶液吹干,整个过程注意无菌操作。将培养板密封,备用,4℃可放置2周。这样处理过的培养板会使细胞在培养时更贴壁。
2.2.3 能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的配制:
培养基的配制,取大鼠心肌细胞培养上清加入终浓度为3mmol/L谷胺酰胺,含量为10%的胎牛血清,含量为1000unit/ml的LIF混合,构成培养基,即鼠ES培养基。
2.3 鼠ES细胞培养 复苏ES细胞,用明胶预处理的培养板培养细胞,37℃,5%CO2中培养24小时后换液,以后隔天换液。接种ES时应注意将ES细胞吹打成单个细胞,因为ES细胞团的存在可刺激细胞分化。
2.4 验证:采用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES细胞AKP阳性(细胞染成兰色);分化细胞AKP阴性(细胞染成黄色)。
上述培养好的鼠胚胎干细胞放在显微镜下观察。
2.5 结果
显微镜下观察到上述ES细胞生长均非常迅速,24~48h可观察到有小的ES细胞集落形成,细胞体积小,核大,核浆比例大,细胞排列紧密。AKP染色阳性。传6代后仍能呈现集落生长,AKP测定仍为阳性。
鼠ES细胞集落生长状况如图2、图3所示。
实施例3
3.1 准备以下材料:
3.1.1 鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠赠。
3.1.2 大鼠心肌细胞培养上清自备
3.1.3 非必需氨基酸(non-essential amino acids solution,Gibco公司,Lot No.1127865)
3.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培养基
3.1.5 胎牛血清
3.1.6 0.1%明胶溶液:明胶(gelatin,华美生物工程公司,Lot No.0205)用三蒸水稍加热后配成0.1%,0.22μm滤膜过滤,4℃保存备用。
3.1.7 碱性磷酸酶染色所用试剂:萘酚AS-MX磷酸酯;二甲基甲酰胺购自上海生工;2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇,上海化学试剂公司进口分装;坚牢蓝RR,购自Fluka公司。
3.1.8 实验动物:SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
3.2 制备方法按如下步骤:
3.2.1 大鼠心肌细胞培养上清制备
将3周龄的大鼠断颈处死,取出心脏,去除心包膜及血块、结缔组织,用磷酸盐缓冲液(即PBS,pH调至7.4)洗涤,除去血液,剪碎。将小组织块移入培养瓶中进行培养心肌细胞培养液采用贴片法于37℃,5%CO2中培养。培养基为:含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM高糖培养基,内含终浓度为3mmol/L谷胺酰胺(glutamin),PH7.2~7.4。此为第一代心肌细胞,记为G1,当细胞长至瓶底面积的70%~80%时,进行传代,记为G2,收集1-6代细胞的培养液,1200rpm离心8min,上清用0.22μm过滤,分装,-30℃保存备用。
3.2.2培养板预处理 在24孔培养板中加入0.1%明胶溶液,以盖满孔底为宜,室温中放置30min,吸弃明胶溶液,将培养板中残留的溶液吹干,整个过程注意无菌操作。将培养板密封,备用,4℃可放置2周。这样处理过的培养板会使细胞在培养时更贴壁。
3.2.3 能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的配制:
培养基的配制,取大鼠心肌细胞培养上清加入终浓度为0.1mmol/L非必需氨基酸,终浓度为20%的胎牛血清混合,构成培养基,即鼠ES培养基。
3.3 鼠ES细胞培养 复苏ES细胞,用明胶预处理的培养板培养细胞,37℃,5%CO2中培养24小时换液,以后隔天换液。接种ES时应注意将ES细胞吹打成单个细胞,因为ES细胞团的存在可刺激细胞分化。
3.4 验证:采用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES细胞AKP阳性(细胞染成兰色);分化细胞AKP阴性(细胞染成黄色)。
上述培养好的鼠胚胎干细胞放在显微镜下观察。
3.5 结果
显微镜下观察到上述ES细胞生长均非常迅速,24~48h可观察到有小的ES细胞集落形成,细胞体积小,核大,核浆比例大,细胞排列紧密。AKP染色阳性。传6代后仍能呈现集落生长,AKP测定仍为阳性。
实施例4
4.1 准备以下材料:
4.1.1 鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠赠。
4.1.2 大鼠心肌细胞培养上清自备
4.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine,上海生工,Amresco产品分装,LotNo.1490B40)。
4.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基
4.1.5 胎牛血清
4.1.6 2-巯基乙醇
4.1.7 碱性磷酸酶染色所用试剂:萘酚AS-MX磷酸酯;二甲基甲酰胺购自上海生工;2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇,上海化学试剂公司进口分装;坚牢蓝RR,购自Fluka公司。
4.1.8 实验动物:SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
4.2 制备方法按如下步骤:
4.2.1 大鼠心肌细胞培养上清制备
将3周龄的大鼠断颈处死,取出心脏,去除心包膜及血块、结缔组织,用磷酸盐缓冲液(即PBS,pH调至7.4)洗涤,除去血液,剪碎。将小组织块移入培养瓶中进行培养心肌细胞培养液采用贴片法于37℃,5%CO2中培养。培养基为:含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基,内含终浓度为4mmol/L谷胺酰胺(glutamin),PH7.2~7.4。此为第一代心肌细胞,记为G1,当细胞长至瓶底面积的70%~80%时,进行传代,记为G2,收集1-6代细胞的培养液,1200rpm离心8min,上清用0.22μm过滤,分装,-30℃保存备用。
4.2.2 能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的配制:
培养基的配制,取大鼠心肌细胞培养上清加入终浓度为0.1mmol/L非必需氨基酸,终浓度为20%的胎牛血清,终浓度为0.05mmol/L 2-巯基乙醇混合,构成培养基,即鼠ES培养基。
4.3 鼠ES细胞培养 复苏ES细胞,用明胶预处理的培养板培养细胞,37℃,5%CO2中培养24小时后换液,以后隔天换液。接种ES时应注意将ES细胞吹打成单个细胞,因为ES细胞团的存在可刺激细胞分化。
4.4 验证:采用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES细胞AKP阳性(细胞染成兰色);分化细胞AKP阴性(细胞染成黄色)。
上述培养好的鼠胚胎干细胞放在显微镜下观察。
4.5 结果
显微镜下观察到上述ES细胞生长均非常迅速48h可观察到有小的ES细胞集落形成,细胞体积小,核大,核浆比例大,细胞排列紧密。AKP染色阳性。传6代后仍能呈现集落生长,AKP测定仍为阳性。
实施例5
5.1 准备以下材料:
5.1.1 鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠赠。
5.1.2 大鼠心肌细胞培养上清自备
5.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine,上海生工,Amresco产品分装,LotNo.1490B40)。
5.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培养基
5.1.5 EDTA-胰蛋白酶
5.1.6 0.1%明胶溶液:明胶(gelatin,华美生物工程公司,Lot No.0205)用三蒸水稍加热后配成0.1%,0.22μm滤膜过滤,4℃保存备用。
5.1.7 碱性磷酸酶染色所用试剂:萘酚AS-MX磷酸酯;二甲基甲酰胺购自上海生工;2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇,上海化学试剂公司进口分装;坚牢蓝RR,购自Fluka公司。
5.1.8 实验动物:SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
5.2 制备方法按如下步骤:
5.2.1 大鼠心肌细胞培养上清制备
将2周龄的大鼠断颈处死,用75%酒精浸泡10分钟,取出心脏,去除心包膜及血块、结缔组织,用磷酸盐缓冲液(即PBS,pH调至7.4)洗涤,除去血液,剪碎。用0.02%-0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min,期间不断轻轻振荡,加入10倍量PBS进行洗涤,1200转离心5分钟,弃上清,将沉淀细胞及小组织块移入培养瓶中进行培养心肌细胞培养液采用贴片法于37℃,5%CO2中培养。培养基为:含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM高糖培养基,内含终浓度为2mmol/L谷胺酰胺(glutamin),PH7.2~7.4。此为第一代心肌细胞,记为G1,当细胞长至瓶底面积的70%~80%时,进行传代,记为G2,收集1-6代细胞的培养液,1200rpm离心8min,上清用0.22μm过滤,分装,-20℃保存备用。
5.2.2 培养板预处理 在24孔培养板中加入0.1%明胶溶液,以盖满孔底为宜,室温中放置30min,吸弃明胶溶液,将培养板中残留的溶液吹干,整个过程注意无菌操作。将培养板密封,备用,4℃可放置2周。这样处理过的培养板会使细胞在培养时更贴壁。
5.2.3 能保持鼠胚胎干细胞不分化而增殖的培养基的配制:
培养基的配制,取收集的大鼠心肌细胞培养上清直接作为鼠ES培养基。
5.3 鼠ES细胞培养 复苏ES细胞,用明胶预处理的培养板培养细胞,37℃,5%CO2中培养24小时后换液,以后隔天换液。接种ES时应注意将ES细胞吹打成单个细胞,因为ES细胞团的存在可刺激细胞分化。
5.4 验证:采用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES细胞AKP阳性(细胞染成兰色);分化细胞AKP阴性(细胞染成黄色)。
上述培养好的鼠胚胎干细胞放在显微镜下观察。
5.5 结果
显微镜下观察到上述ES细胞生长均非常迅速,24~48h可观察到有小的ES细胞集落形成,细胞体积小,核大,核浆比例大,细胞排列紧密。AKP染色阳性。