一种提取生漆多糖的方法 【技术领域】
本发明涉及一种提取具有抑制肿瘤的天然生漆多糖的方法。
背景技术
多糖广泛存在于生命体中，其结构多样性使其可以携带大量信息，并参与了生命的众多过程。近年来研究表明，多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗衰老、抗血管增生、激活补体或抗补体和降脂等功能。不同结构多糖有其特殊生物活性。然而从植物、动物及真菌中提取的多糖，往往由于其收率低而限制了其研究开发和应用。
生漆多糖是生漆液中的主要成分，它具有促进白细胞生长等免疫方面的作用，有望用作一种新型药剂的开发。文献提取多糖主要采用丙酮沉淀得到粉末、水浸提及阳离子树脂柱分离的方法。此方法多糖得率低(约1％)，且分离纯化效率差等缺点，也不适于大批量生产。采用乙醇、丙酮系统沉淀分级或柱层析分级操作麻烦，周期长。
【发明内容】
本发明就是针对上述问题提出了一种快速、便捷的提取生漆多糖的方法，该方法提取多糖适用于工业生产，不仅多糖得率高，而且纯度好。
本发明提供的技术方案是：一种提取生漆多糖的方法，将天然生漆液用丙酮或二甲苯制得粉末(亦可是工业上从天然漆中用二甲苯处理提取漆酚后的残渣)，粉末用浸提液浸提，经盐析除糖蛋白和酶，离心过滤，滤液经超滤或透析脱盐后柱层析，层析液中和后经浓缩、乙醇沉淀、真空干燥得生漆多糖纯品。
所述的浸提液为水、硫酸铵溶液、硫酸钠溶液、硫酸钾溶液、氯化钠溶液中的一种或两种的混合物，盐溶液地浓度为0至饱和。
上述盐析所用的盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾或/和氯化钠。
所述的柱层析指凝胶柱层析或/和阳离子柱层析，凝胶特脂G-100。
上述超滤脱盐使用的超滤膜为3k-10kDa膜。
所得生漆多糖纯品用100kDa膜超滤分级得重均分子量分别为16.9×104和6.85×104，多分散度分别为1.39和1.36的生漆多糖。
本发明工艺简单，操作便捷，得率高(高达3.35-6.56％)，纯度好，成本低，适用于工业生产。所得多糖具有显著抑制S-180肿瘤的生物活性，具有医药开发应用前景。
【附图说明】
图1为按本发明制得的生漆多糖纯品(A)和粗品(B)的UV光谱图；
图2为按本发明制得的生漆多糖纯品的GPC谱图；
图3为按本发明制得的生漆多糖高低两级分LPH(A)和LPL(B)的GPC谱图。
【具体实施方式】
实施例1：1kg漆树液加5倍量的丙酮浸泡并充分搅拌，静止后多糖和糖蛋白等以灰色粉末沉淀出来，倾去黑色丙酮溶液，用丙酮反复洗涤沉淀数次，直至丙酮洗出液近无色。抽滤除去丙酮溶液，室温快速晾干沉出物，得灰色丙酮粉末102g。丙酮粉末加适量蒸馏水，搅拌过夜后离心并抽滤除去不溶物。滤液加(NH4)2SO4至饱和，静止一段时间后，离心、抽滤除去沉淀物，滤液用3kDa膜超滤脱去盐分，然后于50℃下旋转蒸发减压浓缩后加无水乙醇沉出多糖，P2O5真空干燥得生漆多糖粗品B。生漆多糖粗品经0.1mol/l NaCl水溶液溶解后，上Sephadex G-100凝胶柱，以0.1mol/l NaCl溶液洗脱，恒流泵控制流速7-10ml/h，等体积收集流出液(4ml/tube)，苯酚-硫酸法检测多糖含量，收集主要成分。
从Sephadex柱流出的溶液用3kDa膜超滤除去NaCl并适当浓缩后过732(H+型)阳离子交换树脂柱，流速10-15ml/h，苯酚-硫酸法检测收集多糖溶液，以稀NaON溶液中和至pH6-7，用3kDa膜超滤浓缩溶液，然后在50℃以下减压浓缩，无水乙醇沉淀，P2O5真空干燥得生漆多糖纯品A，得率3.35％。
实施例2：将上述丙酮粉末加适量蒸馏水，加硫酸铵至30％(w/w)，搅拌过夜后离心并抽滤除去不溶物。滤液用3kDa膜超滤脱去盐分，过732(H+型)阳离子交换树脂柱，流速10-15ml/h，苯酚-硫酸法检测收集多糖溶液，以稀NaON溶液中和至pH6-7，用3kDa膜超滤浓缩溶液，然后在50℃以下减压浓缩，无水乙醇沉淀，P2O5真空干燥得生漆多糖纯品，得率5.44％。
实施例3：将上述丙酮粉末加适量蒸馏水，加硫酸铵至饱和，搅拌过夜后离心并抽滤除去不溶物。滤液用3kDa膜超滤脱去盐分，过732(H+型)阳离子交换树脂柱，流速30-45ml/h，苯酚-硫酸法检测收集多糖溶液，以稀NaON溶液中和至pH6-7，用3kDa膜超滤浓缩溶液，然后在50℃以下减压浓缩，无水乙醇沉淀，P2O5真空干燥得生漆多糖纯品A，得率6.56％。纯多糖UV光谱图中230-270nm处水溶性糖蛋白吸收峰消失(附图1)，表明多糖纯度高。
实施例4：将上述丙酮粉末用饱和硫酸钠浸提，搅拌过夜后离心并抽滤除去不溶物。滤液用3kDa膜超滤脱去盐分，过732(H+型)阳离子交换树脂柱，流速30-45ml/h，苯酚-硫酸法检测收集多糖溶液，以稀NaON溶液中和至pH6-7，用3kDa膜超滤浓缩溶液，然后在50℃以下减压浓缩，无水乙醇沉淀，P2O5真空干燥得生漆多糖纯品，得率6％。
实施例5：二甲苯在110-140℃从生漆液中提取漆酚后的沉淀物，用饱和氯化钠浸提，搅拌过夜后离心并抽滤除去不溶物。滤液用3kDa膜超滤脱去盐分，以浓氨水将pH值调至8.0左右，50℃以下滴加H2O2至浅黄色，然后保温两小时，再用3kDa膜超滤脱去盐分，过732(H+型)阳离子交换树脂柱，流速30-45ml/h，苯酚-硫酸法检测收集多糖溶液，以稀NaON溶液中和至pH6-7，用3kDa膜超滤浓缩溶液，然后在50℃以下减压浓缩，无水乙醇沉淀，P2O5真空干燥得生漆多糖纯品，得率约为沉淀物的51％。
实施例6：纯多糖中存在两个级分，见图2。在谱图中除了主峰之外在保留时间较短处还有一肩峰，表明多糖中存在两个级分。将多糖溶于水中，用100kDa膜超滤可快速将二级分分离。高低分子量两级分LPH和LPL在多糖中的含量分别为18.3％和81.7％，分子量Mw分别为16.9×104和6.85×104，多分散度分别为1.39和1.36。它们的GPC谱图见图3，两个多糖级分的GPC谱图皆为单峰。
以上分级产品和从残渣中得到的多糖利用健康昆明小鼠在体内测定了抗S-180腹水肿瘤活性。所有多糖都显示显著的抑瘤活性，抑瘤率达到29.9-63.5％，见附表1。
附表1：生漆多糖抗S-180腹水瘤活性
Sample Route Dose Tumor weight Inhibition ratio
(mg/kg×days) (Mean±SD) (％)
LPH i.p. 150×7 1.70±0.77 37.9*
i.p. 300×7 1.92±1.37 29.9*
LPL i.p. 150×7 1.00±0.61 63.5**
i.p. 300×7 1.43±1.10 47.8*
LPW i.p. 1.68±0.95 38.7*
150×7
i.p. 1.22±0.73 55.5**
300×7
Control i.p. 2.74±1.30
*P＜0.05，**P＜0.01