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卡贝缩宫素鼻用制剂和治疗孤独症的方法.pdf

上传人：奻奴 文档编号：367496 上传时间：2018-02-12 格式：PDF 页数：86 大小：4.51MB
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摘要
申请专利号：

CN200780053262.2

 申请日：

2007.09.28
公开号：

CN101677948A

 公开日：

2010.03.24
当前法律状态：

驳回

 有效性：

无权
法律详情：

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A61K 38/11申请公布日:20100324|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 9/08申请日:20070928|||公开
IPC分类号：

A61K9/08; A61K9/12; A61K38/11; A61K9/00

 主分类号：

A61K9/08
申请人：

纳斯泰克制药公司
发明人：

亚历克西斯·凯斯·莱昂纳多; 乔舒亚·O·谢斯塔克; 亨利·R·康斯坦丁诺; 安东尼·P·西莱诺; 拉利特·拉伊·佩达科塔; 卡文·埃米尔·沙尔基; 加兰·M·贝拉米; 詹森·菲利普·格斯蒂
地址：

美国华盛顿州
优先权：

2007.6.7 US 60/942,607
专利代理机构：

隆天国际知识产权代理有限公司

 代理人：

吴小瑛;吕俊清
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内容摘要

本发明提供用于预防和治疗孤独症谱系病症、相关病症和这种病症的症状的方法和组合物，所述组合物包含催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素。本发明的方法和组合物可有效地治疗社会退缩、目光接触回避、重复性行为、焦虑、注意力缺陷、多动、抑郁、失语、言语交流困难、厌恶碰触、视觉困难、理解困难和声音敏感及光敏感。本发明提供另一种组合物和方法，其应用催产素或催产素类似物与第二种或辅助治疗剂的组合来获得抗孤独症谱系病症和相关病症更有效的治疗工具。

权利要求书

1.  一种用于鼻内递送卡贝缩宫素的药物制剂，其包含卡贝缩宫素、增溶剂、螯合剂、张力调节剂和两种或多种缓冲剂。

2.  权利要求1的制剂，其中所述增溶剂为甲基-β-环糊精，所述螯合剂为EDTA，所述张力调节剂为氯化钠，所述缓冲剂为精氨酸和乙酸盐。

3.  权利要求1的制剂，其进一步包含防腐剂，所述防腐剂为苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯。

4.  权利要求1的制剂，其进一步包含为氯代丁醇的防腐剂。

5.  权利要求1的制剂，其进一步包含增粘剂，所述增粘剂为甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC)、纤维素、明胶、淀粉、羟乙基淀粉、泊洛沙姆、普流尼克、羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、阿拉伯胶、聚维酮、卡波普、聚卡波非、壳聚糖、壳聚糖微球、海藻酸盐微球、壳聚糖谷氨酸盐、琥石树脂、透明质酸、乙基纤维素、麦芽糖糊精DE、鼓式干燥玉米淀粉(DDWM)、可降解的淀粉微球(DSM)、脱氧甘氨胆酸盐(GDC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、微晶纤维素(MCC)、聚甲基丙烯酸和聚乙二醇、磺基丁基醚B环糊精、交联依地索姆淀粉生物球、牛磺二氢夫西地酸钠(STDHF)、N-三甲基壳聚糖盐酸盐(TMC)、降解的淀粉微球、琥石树脂、壳聚糖纳米颗粒、喷雾干燥的交聚维酮、喷雾干燥的葡聚糖微球、喷雾干燥的微晶纤维素或交联依地索姆淀粉微球。

6.  权利要求1的制剂，其进一步包含增粘剂HPMC。

7.  权利要求1-6中任一项的制剂，其中所述制剂的pH为4.5±0.3。

8.  权利要求1-6中任一项的制剂，其中所述制剂的重量克分子渗透浓度为200-250mOsm/kgH2O。

9.  权利要求1-6中任一项的制剂在制备用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的药物中的用途。

10.  权利要求1-6中任一项的制剂在制备用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的药物中的用途，其中所述药物减少孤独症的症状，所述症状为社会退缩、目光接触回避、重复性行为、焦虑、注意力不足、多动、抑郁、失语、言语交流困难、厌恶碰触、视觉困难、理解困难、声音敏感或光敏感。

11.  权利要求1-6中任一项的制剂在制备用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的药物中的用途，其中所述药物与辅助治疗剂一起使用，所述辅助治疗剂为5-羟色胺再摄取抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、抗精神病药、抗惊厥药、兴奋药物、抗病毒药、抗焦虑药、维生素或免疫治疗剂。

12.  权利要求1-6中任一项的制剂在制备用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的药物中的用途，其中所述药物与行为调节和饮食调节一起使用。

13.  权利要求1-6中任一项的制剂在制备配制用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的药物中的用途。

14.  卡贝缩宫素在用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的权利要求1-6中任一项的制剂中的用途。

15.  一种用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任一项的制剂。

16.  一种用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任一项的制剂，其中所述方法减少孤独症的症状，所述症状为社会退缩、目光接触回避、重复性行为、焦虑、注意力不足、多动、抑郁、失语、言语交流困难、厌恶碰触、视觉困难、理解困难、声音敏感或光敏感。

17.  一种用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任一项的制剂，所述制剂进一步包含辅助治疗剂。

18.  一种用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任一项的制剂，所述制剂进一步包含辅助治疗剂，所述辅助治疗剂为5-羟色胺再摄取抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、抗精神病药、抗惊厥药、兴奋药物、抗病毒药、抗焦虑药、维生素或免疫治疗剂。

19.  一种用于预防或治疗哺乳动物受试者的孤独症病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-6中任一项的制剂，所述方法进一步包括行为调节或饮食调节。

说明书

卡贝缩宫素鼻用制剂和治疗孤独症的方法
技术领域
本发明涉及用于治疗神经性和精神性病症的方法和组合物。在具体实施方案中，本发明涉及使用卡贝缩宫素(carbetocin)和相关催产素类似物治疗神经性和精神性病症。
背景技术
孤独症谱系病症为一组以交流技能、人际互动的不同程度的损害，和限制性的、重复性的和刻板的行为模式为特征的疾病。这些疾病的区别在于发病时间、症状发展的速率、症状的严重度和症状的准确性质。这些病症从轻度到重度损害，包括这样的疾病例如孤独症、阿斯伯格综合征、PDD-NOS、雷特病症、儿童崩解症、语言交往障碍、非语言学习障碍、高功能自闭症、超读症和一些方面的注意力不足多动障碍。虽然患有孤独症谱系病症的儿童的准确数字还不清楚，但在美国局部地区的比例为3.4名/千儿童至6.7名/千儿童。进一步，最新研究估计，在美国15,000名三至五岁的儿童，和78,000名六至二十一岁的儿童和青年患有孤独症。在欧洲和亚洲的比例相当，每一千名儿童中六名患有至少一种孤独症谱系病症。另外，存在大量的显示出与孤独症谱系病症表现出的症状类似的症状的相关病症，包括焦虑症、强迫症、社交困难病症(social deficit disorders)、重复性病症(repetitive disorders)和认知缺陷病症，这些极大地增加了患病人群的数量。
孤独症谱系病症的特征包括社会退缩和不能进行目光接触的移开凝视(averted gaze)、重复性行为和强迫行为、刻板动作、焦虑、注意力不足、多动、抑郁、隐遁人格和感情理解不能。受孤独症谱系病症烦扰的患者可以具有对身体情感或接触的厌恶、忽视与其他人的交往，或者如果从事社交，表现出明显地不能交往或与其他人联系。交往困难可以表现为单调的声音，不能控制他们的音量、模仿言语或根本不能交谈。患有孤独症谱系病症的个体也可患有视觉困难、理解困难、声音敏感和光敏感及智力迟钝。
患有孤独症谱系病症的儿童没有遵循典型的儿童发育模式。在一些儿童中，未来问题的迹象可能从出生就很明显。在大多数情况下，交往和社会技能的问题变得更值得注意，因为这些儿童落在同龄的其他儿童的后面。一些儿童最初发育正常，之后开始在他们对人或其他异常行为的反应方面出现发育差异。一些父母报告变化是突然的，他们的孩子开始排斥人，行为怪异，并且丧失了他们以前获得的语言和社会技能。在其它情况下，在变得逐渐值得注意的发展中，存在平台期。
孤独症谱系和相关病症的根本原因不清楚。尸检和MRI研究推断在许多重要脑结构中存在异常，所述脑结构包括小脑、大脑皮层、边缘系统、胼胝体、基底神经节和脑干。其它研究检查了神经递质比如5-羟色胺、多巴胺和肾上腺素的作用。
目前，使用应用的行为分析或其它行为改变技术治疗孤独症谱系病症；饮食调节(diet modification)，比如不含谷蛋白或酪蛋白的饮食，或大剂量的维生素B6与镁的组合。对于孤独症所开处方的药物针对的是具体症状比如焦虑和抑郁，其包括药物比如氟西汀、氟伏沙明、舍曲林和氯米帕明。抗精神病药比如氯丙嗪、硫利达嗪和氟哌啶醇被用于治疗行为问题。抗惊厥药比如卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯和丙戊酸被用于预防发作。
报道的研究结果(Hollander等人，American College ofNeuropsychopharmacology Annual Meeting，2006年12月)表明向孤独症成年人施用静脉内剂量的催产素统计学上显著地减少与孤独症相关的重复性行为。
令人遗憾的是，目前对于孤独症谱系和相关病症的治疗主要是针对症状，并且已经证实其在使这样的儿童和成年人无症状或病症方面没有成功。因此，本领域存在对其他用于治疗孤独症谱系病症和相关病理的治疗法的未被满足的需要。
发明简述
本发明的一个目的是提供用于治疗神经性和精神性病症的方法和组合物。
本发明的另一个目的是提供用于治疗孤独症谱系病症和包括相关症状的病症的方法和组合物，所述包括相关症状的病症比如发育障碍、焦虑病症、重复性病症和认知缺陷病症。
本发明的另一个目的是提供用于治疗孤独症谱系病症和相关病症的催产素和包括卡贝缩宫素在内的相关类似物的新制剂。
本发明的一个进一步的目的是提供用于治疗和预防孤独症谱系病症和相关病症的症状的组合物和方法，所述症状包括但不限于社会退缩(socialwithdrawal)、目光接触回避(eye contact avoidance)、重复性动作(repetitivebehaviors)、焦虑(anxiety)、注意力不足(attention deficit)、多动(hyperactivity)、抑郁(depression)、失语(loss of speech)、言语交流困难(verbal communicationdifficulties)、厌恶碰触(aversion to touch)、视觉困难(visual difficulties)、理解困难(comprehension difficulties)和声音敏感及光敏感(sound and lightsensitivity)。
本发明通过提供使用催产素和催产素类似物的新的且令人惊奇地有效的方法和组合物实现了这些目的和满足了另外的目的和优点，所述方法和组合物用于治疗和/或预防孤独症谱系病症、相关病症和这些病症的症状。
在本发明的制剂和方法内的有用的催产素和催产素类似物包括但不限于4-苏氨酸-1-羟基-脱氨基催产素、9-脱氨基催产素，包含代替甘氨酰胺残基的甘氨酸残基的催产素类似物；7-D-脯氨酸-催产素及其脱氨基类似物；(2，4-二异亮氨酸)-催产素，具有促尿钠排泄和利尿活性的催产素类似物；脱氨基催产素类似物；长效催产素(OT)类似物，1-脱氨基-1-单卡巴-E12-[Tyr(OMe)]-OT(dCOMOT)；卡贝缩宫素(carbetocin)，(1-丁酸-2-(O-甲基-L-酪氨酸)-1-卡贝催产素(1-butanoic acid-2-(O-methyl-L-tyrosine)-1-carbaoxytocin)，或者，脱氨基-1单卡巴-(2-O-甲基酪氨酸)-催产素(deamino-1monocarba-(2-O-methyltyrosine)-oxytocin)[d(COMOT)])；[Thr4-Gly7]-催产素(TG-OT)；催产加压素；Ile-conopressin；阿托西班；脱氨基-6-卡巴-催产素(dC60)，d[Lys(8)(5/6C-荧光素)]VT、d[Thr(4)，Lys(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Lys(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Thr(4)，Lys(8)(5/6C荧光素)]VT、d[Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、d[Thr(4)，Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Thr(4)，Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、去氨加压素和1-脱氨基-催产素，其中残基1和6之间的二硫键被硫醚替代。用于本发明中的其它有用形式的催产素或催产素类似物包括所述化合物的其它药学可接受的活性盐、以及所述化合物的活性异构体、对映异构体、多晶型物、溶剂化物、水合物和/或前药。
在一个示例性的实施方案中，本发明的组合物和方法应用催产素和/或催产素类似物治疗和/或预防孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状。
使用本发明的组合物和方法可治疗的哺乳动物受试者包括但不限于患有精神性病症或神经性病症的人和其他哺乳动物受试者，所述精神性病症或神经性病症包括孤独症谱系病症。例如孤独症(autism)、阿斯伯格综合征(Asperger’s syndrome)、其他未明确的广泛性发育障碍、雷特病症、儿童崩解症、语义语用交流障碍(semantic pragmatic communication disorder)、非语言学习障碍、高功能自闭症、超读症和注意力不足多动障碍(ADHD)。使用本发明的组合物和方法可治疗的哺乳动物受试者还包括但不限于患有相关病症的人和其他哺乳动物受试者，所述相关病症包括Landau-Kleffner综合征；多系统紊乱(multi-systems disorder)；焦虑症，包括但不限于社交恐怖症、一般性焦虑症、惊恐障碍、创伤后应激病症、恐怖症、广场恐怖症、强迫症；社交困难病症，包括但不限于偏执型人格障碍、分裂型人格障碍、精神分裂样人格障碍、回避型人格障碍、品行障碍、边缘型人格障碍、表演型人格障碍；重复性病症，包括但不限于冲动控制障碍和成瘾病症，和进食障碍比如食欲过盛、神经性食欲缺乏、暴食症；认知缺陷病症，包括但不限于痴呆、阿尔茨海默氏病、Creutzfeld-Jakob疾病、注意力不足障碍、注意力不足多动障碍、轻度认知衰退和其他未明确的认知障碍。
通过向所述受试者施用有效量的催产素或催产素类似物化合物可有效地预防性和/或治疗性地治疗这些及其它受试者，所述有效量足够预防或减少孤独症谱系病症和相关病症的发生或症状。本发明的治疗有用的方法和制剂将有效地使用如上所述的多种形式的催产素和催产素类似物，包括所述化合物的任何活性药学可接受的盐、以及其活性异构体、对映异构体、多晶型物、溶剂化物、水合物、前药和/或其组合。卡贝缩宫素用作本发明在下面本文实施例中的一个示例性的实施方案。
在本发明的另一个方面中，提供组合制剂和方法，其包括有效量的催产素或包括卡贝缩宫素在内的催产素类似物与一种或多种第二辅助剂的组合，所述第二辅助剂与所述催产素或催产素类似物组合配制或共同给药以在患有孤独症谱系病症和相关病症的个体中获得有效反应。在该情况下，示例性的组合制剂和共同治疗方法应用催产素或催产素类似物与一种或多种另外的第二种或辅助治疗剂的组合。在这些实施方案中，与例如卡贝缩宫素组合的第二或辅助治疗剂可以单独或与例如卡贝缩宫素的组合具有直接或间接的抗焦虑活性。在这些实施方案中，与例如卡贝缩宫素组合的第二或辅助治疗剂可以单独或与例如卡贝缩宫素的组合具有直接或间接的抗精神病活性。在这些实施方案中，与例如卡贝缩宫素组合的第二或辅助治疗剂可以单独或与例如卡贝缩宫素的组合具有直接或间接的抗惊厥活性。在这些实施方案中，与例如卡贝缩宫素组合的第二或辅助治疗剂可以单独或与例如卡贝缩宫素的组合具有直接或间接的抗病毒活性。在这些组合制剂和共同治疗方法中有用的辅助治疗剂包括，例如5-羟色胺再摄取抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，其包括但不限于氟西汀、氟伏沙明、舍曲林、氯米帕明；抗精神病药，包括但不限于氟哌啶醇、硫利达嗪、氟非那嗪、氯丙嗪、利培酮、奥氮平、齐拉西酮；抗惊厥剂，包括但不限于卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯、丙戊酸，兴奋药物(stimulant medication)包括但不限于哌甲酯、α2-肾上腺素能激动剂、金刚烷胺和可乐宁；抗抑郁药，包括但不限于纳屈酮、锂和苯二氮抗病毒药，包括但不限于伐昔洛韦；胰泌素；抗焦虑药，包括但不限于丁螺环酮；免疫治疗剂。另外的辅助治疗剂包括维生素，其包括但不限于B族维生素(B6、B12、硫胺素)、维生素A和必需脂肪酸。辅助治疗剂也可包括行为调节(behavioral modification)和饮食改变比如不含谷蛋白、酪蛋白的饮食。
根据下述详细说明，本发明的前述目的和另外的目的、特征、方面和优点将变得清楚。
附图说明
图1：显示药代动力学研究1的体外-体内相互关系的图。
图2：代表在50℃，卡贝缩宫素鼻喷雾剂在不同缓冲剂(柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、磷酸盐和精氨酸)和3.0至10.0的不同pH下随时间所有肽相关杂质的柱状图。
图3：为代表在参与第一人临床研究的受试者中检测的卡贝缩宫素血浆水平的图。
图4：为代表从兔研究3获得的卡贝缩宫素PK结果的图。
发明详述
本发明提供用于预防和/或治疗哺乳动物受试者中精神性病症和神经性病症的新的方法和组合物，所述精神性病症和神经性病症包括孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状。在多个实施方案中，本发明使用催产素和包括卡贝缩宫素在内的催产素类似物治疗此类精神性病症和神经性病症。如本文使用的术语“类似物”或“激动剂”指表现出类似于母体分子活性的活性的任何分子。所述分子可以是能够具有与母体化合物类似活性的合成类似物、片段、药学可接受的盐或内源性生物分子。
除非另有说明，如本文使用的任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围都应当理解为包括所述范围内的任何整数值，当合适时，包括其分数(比如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另有说明，本文描述的关于任何物理特征，比如聚合物亚基、大小或厚度的任何数量范围应理解为包括所述范围内的任何整数。除非另有说明，如本文使用的“约”或“基本上由...组成”指所指范围、值或结构的±20％。如本文使用的术语“包括”和“包含”作为同义词使用。应当理解术语“一个(种)”指所列举组分的“一个或多个(一种或多种)”。使用可选择词(例如“或”)应当理解为指所述可选择的一个、两个或其任意组合。
另外，应当理解本申请公开了来源于本文描述的结构和取代基的不同组合的个体化合物或化合物组，其公开程度如同单个列出每个化合物或化合物组。因此，特定结构或特定取代基的选择在本发明的范围内。
用于治疗和预防孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状的制剂采用催产素或催产素类似物，比如卡贝缩宫素，其包括本说明书中的所有活性药学可接受的化合物，以及各种可预见的和容易提供的这些化合物的复合物、衍生物、盐、溶剂化物、异构体、对映异构体、多晶型物和前药，及其组合。作为示例性的实施方案，用于本发明中的示例性的类似物包括4-苏氨酸-1-羟基-脱氨基催产素、9-脱氨基催产素、包含替代甘氨酰胺残基的甘氨酸残基的催产素类似物；7-D-脯氨酸-催产素及其脱氨基类似物；(2，4-二异亮氨酸)-催产素，具有促尿钠排泄和利尿活性的催产素类似物；脱氨基催产素类似物；长效催产素(OT)类似物，1-脱氨基-1-单卡巴-E12-[Tyr(OMe)]-OT(dCOMOT)；卡贝缩宫素，1-丁酸-2-(O-甲基-L-酪氨酸)-1-卡贝催产素，或者，脱氨基-1单卡巴-(2-O-甲基酪氨酸)-催产素[d(COMOT)])；[Thr4-Gly7]-催产素(TG-OT)；催产加压素；Ile-conopressin；阿托西班；脱氨基-6-卡巴-催产素(dC60)、d[Lys(8)(5/6C-荧光素)]VT、d[Thr(4)，Lys(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Lys(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Thr(4)，Lys(8)(5/6C荧光素)]VT、d[Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、d[Thr(4)，Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、[HO(1)][Thr(4)，Om(8)(5/6C-荧光素)]VT、去氨加压素和1-脱氨基-催产素，其中残基1和6之间的二硫键被硫醚代替。
在所述制剂和方法中，如本文公开的催产素或催产素类似物有效地用于治疗患有下述病症的哺乳动物受试者中孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状：孤独症谱系病症和/或相关病症和此类病症的症状，其包括社会退缩、目光接触回避、重复性行为、焦虑、注意力不足、多动、抑郁、失语、言语交流困难、厌恶碰触、视觉困难、理解困难和声音敏感及光敏感。
使用本发明的制剂和方法可治疗宽范围的哺乳动物受试者，包括人受试者。这些受试者包括但不限于患有精神性病症或神经性病症的人和其他哺乳动物受试者，所述精神性病症或神经性病症包括孤独症谱系病症比如孤独症、阿斯伯格综合征、其他未明确的广泛性发育障碍、雷特病症、儿童崩解症、语义语用交流障碍、非语言学习障碍、高功能自闭症、超读症和ADHD。使用本发明的组合物和方法可治疗的哺乳动物受试者还包括但不限于患有相关病症的人和其他哺乳动物受试者，所述相关病症包括Landau-Kleffner综合征；多系统紊乱；焦虑症，包括但不限于社交恐怖症、一般性焦虑症、惊恐障碍、创伤后应激病症、恐怖症、广场恐怖症、强迫症；社交困难病症，包括但不限于偏执型人格障碍、分裂型人格障碍、精神分裂样人格障碍、回避型人格障碍、品行障碍、边缘型人格障碍、表演型人格障碍；重复性病症，包括但不限于冲动控制障碍和成瘾病症，和进食障碍比如食欲过盛、神经性食欲缺乏、暴食症；认知缺陷病症，包括但不限于痴呆、阿尔茨海默氏病、Creutzfeld-Jakob疾病、注意力不足病症、注意力不足多动障碍、轻度认知衰退和其他未明确的认知障碍。
在本发明的方法和组合物内，将如本文公开的一种或多种催产素类似物有效地配制成用于治疗孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状的精神性或神经性治疗剂或作为该治疗剂形式有效地给药。在一个示例性的实施方案中，用于示例的目的，单独使用卡贝缩宫素或将其与一种或多种辅助治疗剂组合使用。本发明进一步提供天然或合成化合物形式的另外药学可接受的催产素类似物，其包括本文公开的化合物的复合物、衍生物、盐、溶剂化物、异构体、对映异构体、多晶型物和前药，及其组合，其可有效地用作本发明的方法和组合物内的孤独症谱系病症和相关病症治疗剂。
孤独症谱系病症由可以从轻度至重度的特定行为定义。症状包括缺乏人际互动、言语和非言语交流和重复性行为及兴趣。在患孤独症的人中的损伤的发展是变化的，并且是特征性不平衡的，导致一些领域的技能良好，而在其它领域的技能差。模仿言语是一种语言损伤的常见特征，当其存在时，可能引起语言技能比他们真实具有的似乎更好。也可存在象征性思维不足、刻板的行为(例如，手和手指的重复性非生产性活动、摇摆、无意义的发声)、自我刺激、自我伤害行为和抽搐。对于孤独症的发展，尽管孪生研究以及在兄弟姐妹间复发的发病率较高提示遗传来源，，但还没有鉴定出单个原因。另外，发现在患有遗传病症，比如脆性X综合征和结节性硬化的个体中的孤独症的发病率增加。在孤独症的发展中，可能的影响因素包括感染、代谢失调、免疫失调、铅中毒和胎儿洒精综合征。本发明的组合物和方法可有效地治疗所有类型的孤独症谱系病症，而不管其病因如何。
催产素是一种由垂体腺分泌的哺乳动物激素，其起神经递质作用，已知其刺激子宫收缩和泌乳(milk let-down)。其是具有序列Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly(SEQ ID NO：1)的九个氨基酸肽。基于对动物研究的证据的评价，证实所述九肽物质-催产素和加压素(Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO：2))对于种群典型的群居习性、交流和礼节的正常表达具有独特的作用，提议催产素或加压素神经传递可能负责与孤独症相关的几个特征。(Insel等人，Biol.Psychiatry 45：145-157，1999)。关于孤独症儿童的研究报道这样的儿童具有比正常儿童显著低水平的血浆催产素。在非孤独症儿童中，提高的催产素水平与社交和发育试验的较高得分相关，但是在孤独症儿童中，与较低的得分相关，表明改变催产素水平可能与儿童孤独症有关(Modahl等人，Biol.Psychiatric 43：270-277，1998)。提高的催产素水平还另外涉及某些强迫行为，比如过度担心、性强迫和/或强迫性洗涤和清洗。(Leckman等人，Psychoneuroendocrinology 19：723-749，1994；Leckman等人，Arch Gen Psychiatry 51：782-92，1994)。提高的催产素的水平还涉及Prader-Willi综合征，一种与智力迟钝、食欲失调和发展为强迫症的危险相关的遗传病症(Martin等人，Biol.Psychiatric 44：1349-1352，1998)。
作为用于诱导哺乳动物患者的子宫收缩和泌乳的可能代替的试剂已经评价了大量催产素类似物，目标是使催产素的副作用最小化。一种这样的类似物，卡贝缩宫素(1-丁酸-2-(O-甲基-L-酪氨酸)-1-卡巴催产素，或者，脱氨基-1-单卡巴-(2-O-甲基酪氨酸)催产素[d(COMOT)])，是一种长效合成催产素类似物，其同时显示出子宫收缩和泌乳诱导活性(Atke等人，Acta Endocrinol.115：155-160，1987；Norstrom等人，Acta Endocrinol.122：566-568，1990；Hunter等人，Clin.Pharmacol.Ther.52：60-67，1992；Silcox等人，Obstet.Gynecol.82：456-459，1993；Vilhardt等人，Pharmacol.Toxicol.81：147-150，1997；Boucher等人，J.Perinatology 18：202-207，1998)。9个氨基酸的催产素包含在第一位和第六位半胱氨酸之间的二硫键，而卡贝缩宫素的环状结构衍生自N-末端的丁酸和第五位的半胱氨酸之间的C-S  键，丁酰基-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(SEQ ID NO：3)。卡贝缩宫素的结构显示如下：

据报导卡贝缩宫素的半衰期比催产素的半衰期长4至10倍，其反映在该类似物的子宫收缩和泌乳诱导活性的大大地延长。代谢稳定性表现出的增加归因于卡贝缩宫素中N-末端的脱氨作用和亚甲基取代1-6二硫键，这一修饰被认为保护该类似物免于被氨基肽酶和二硫键酶(disulfidase)裂解(Hunter等人，Clin.Pharmacol.Ther.52：60-67，1992)。因其半衰期增加，认为卡贝缩宫素可能是用于社交障碍比如焦虑症和孤独症谱系病症的潜在治疗剂。本发明的方法和组合物包括使用在新的制剂中的催产素和催产素类似物来治疗神经性和精神性病症，其包括孤独症谱系病症和相关病症比如强迫症。
由卡贝缩宫素代表的本发明的组合物和方法可有效地治疗或预防哺乳动物中的精神性和神经性病症。特别地，本发明的组合物和方法可以施用于哺乳动物受试者，以可测量地减轻或预防孤独症谱系病症或相关病症的一种或多种症状，所述症状选自包括但不限于社会退缩、目光接触回避、重复性行为、焦虑、注意力不足、多动、抑郁、失语、言语交流困难、厌恶碰触、视觉困难、理解困难和声音敏感及光敏感。
用于治疗孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状的包含卡贝缩宫素或其它催产素类似物的组合物包含一定量的卡贝缩宫素或其它催产素类似物，所述量有效地预防和/或治疗哺乳动物受试者中孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状。典型地，有效量的卡贝缩宫素或其它催产素类似物包含一定量的活性化合物，该活性化合物在单剂型或多剂型中，经治疗介入的规定期限内，治疗有效地、可测定地减轻受试者中孤独症谱系病症和/或相关病症的一种或多种症状。在示例性的实施方案中，这些组合物在减轻孤独症谱系病症和相关病症的体内治疗方法中有效。
本发明的孤独症谱系病症和相关病症治疗组合物典型地包含有效量的或单元剂量的催产素或催产素类似物，其可以与一种或多种药学可接受的载体、辅剂、赋形剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂和/或其它添加剂制剂一起配制，所述其它添加剂可以增强稳定性、递送、吸收、半衰期、功效、药代动力学和/或药效动力学、减少不良副作用或者提供药物用途的其它优点。示例性的辅剂包括增溶剂、表面活性剂和螯合剂，例如制剂可以包含作为增溶剂的甲基-β-环糊精(Me-β-CD)、作为螯合剂的依地酸二钠(EDTA)、精氨酸、山梨糖醇、NaCl、对羟苯甲酸甲酯钠(MP)、对羟苯甲酸丙酯钠(PP)、氯代丁醇(CB)、苯甲醇、氯化锌、乙醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨醇酯、乳糖、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐和/或磷酸盐。根据临床和患者的特殊因素，本领域普通技术人员将容易地确定用于治疗神经性和精神性病症的催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素的有效量(例如，包含有效浓度/量的卡贝缩宫素、或选择的药学可接受的盐、异构体、对映异构体、溶剂化物、多晶型物和/或卡贝缩宫素的前药的单元剂量)。用于向包括人在内的哺乳动物受试者施用的活性化合物的合适的有效单元剂量可以为10至1500μg、20至1000μg、25至750μg、50至500μg、或150至500μg、10至1500mg、20至1000mg、25至750mg、50至500mg或150至500mg。在某些实施方案中，催产素或催产素类似物的有效剂量可以在如下较窄的范围内选择，所述范围例如10至25μg、30-50μg、75至100μg、100至250μg、或250至500μg、10至25mg、30至50mg、75至100mg、100至250mg、或250至500mg。这些及其它有效单元剂量可以以单剂量给药，或者以每日、每周或每月的多剂量形式给药，例如以包含1至5、或2-3剂量的给药方案每日、每周或每月给药。在一个示例性的实施方案中，每日一次、两次、三次、四次或五次的给药剂量10至25mg、30-50mg、75至100mg、100至250mg、或250至500mg。在更详细的实施方案中，每日一次或两次的给药剂量为50-75mg、100-200mg、250-400mg或400-600mg。在可选的实施方案中，剂量根据体重计算，可以给药的剂量为，例如约0.5mg/kg至约100mg/kg/天、1mg/kg至约75mg/kg/天、1mg/kg至约50mg/kg/天、2mg/kg至约50mg/kg/天、2mg/kg至约30mg/kg/天、或3mg/kg至约30mg/kg/天。
包含有效量的卡贝缩宫素或其它催产素类似物的本发明的组合物的递送量、递送时间和递送方式通常将基于个体进行调整，取决于这样的因子例如个体的体重，年龄，性别和病症，孤独症谱系病症、相关病症和/或此类病症的症状的严重度，给药是预防性还是治疗性的，并且基于已知影响药物递送、吸收、包括半衰期在内的药代动力学和功效的其它因素。
通常选择本发明制剂的有效剂量或多剂量治疗方案以与必需且足够基本上预防或减轻受试者中孤独症谱系病症、相关病症和/或此类病症的症状的最小剂量方案近似。剂量和给药方案将通常包括经几天或甚至一周或几周或几年的反复给药治疗。有效的治疗方案也可包括持续数天、数周、数月或者甚至数年的时期内基于每天或多剂量每天施用预防剂量。
可以容易地采用多种测定和模型系统来确定催产素或催产素类似物在治疗孤独症谱系病症和相关病症中的疗效。可以根据多种方法常规地证实用于这些和相关病症的组合物的功效，所述方法包括，例如通过测定标记物比如在婴幼儿孤独症检查量表(CHAT)、改良的婴幼儿孤独症检查量表(M-CHAT)、用于两岁龄孤独症的筛选工具(STAT)、社会交往调查表(SCQ)、孤独症谱系筛选调查表(ASSQ)、阿斯伯格综合征的澳大利亚量表、儿童阿斯伯格综合征试验(CAST)、孤独症诊断访谈量表修订版(ADI-R)、孤独症诊断观察图表(ADOS-G)、儿童孤独症等级量表(CARS)、听觉听力评价、给药PTSD量表、艾森克人格调查表、汉密尔顿焦虑量表中，或者各种动物模型中，比如熟知的焦虑(大鼠冲突饮水)试验、或高架十字迷宫试验(elevated plus maze test)中测定的那些来进行。催产素或催产素类似物的化合物的有效量将可测定地预防一种或多种哺乳动物受试者中前述孤独症谱系病症、相关病症或此类病症的症状，降低其严重度，或延缓其发病或持续时间。
给药有效量的催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素至具有一种或多种前述症状的受试者将可检测地减少、消除或预防受试者的症状。在示例性的实施方案中，与安慰剂治疗的受试者或其它合适的对照受试者相比，给药卡贝缩宫素化合物至合适的试验对象将获得一种或多种与神经性或精神性病症相关的目标症状减少至少10％、20％、30％、50％或更多，至多75-90％、或95％或更多地减少一种或多种目标症状或病症。对于本文确定的神经性和精神性病症的整个范围，在使用本发明的组合物和方法治疗或预防时，可预期获得相当的功效水平。在本发明的另一个方面，提供组合制剂和共同给药方法，其应用有效量的催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素和一种或多种第二种或辅助试剂，该试剂与催产素或催产素类似物组合配制或共同给药，以获得联合的、多活性试剂或共同治疗方法。在这一方面，示例性的组合制剂和共同治疗方法应用催产素或催产素类似物与一种或多种第二种精神性或神经性试剂或者一种或多种辅助治疗剂组合，所述第二种精神性或神经性试剂或辅助治疗剂在选择的组合制剂或共同治疗方案中用于治疗或预防目标疾病、病症和/或症状。对于本发明的大多数组合制剂和共同治疗方法，配制催产素或相关类似物，或者与一种或多种第二种或辅助治疗剂组合共同给药，以得到组合制剂或共同治疗方法，所述组合制剂或共同治疗方法组合对于治疗孤独症谱系病症或相关病症和/或一种或多种此类病症的症状有效或共同有用。在这一方面，示例性的组合制剂和共同治疗方法应用催产素或催产素类似物与一种或多种第二种或辅助治疗剂的组合，所述第二种或辅助治疗剂选自例如5-羟色胺再摄取抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，包括但不限于氟西汀、氟伏沙明、舍曲林、氯米帕明；抗精神病药，包括但不限于氟哌啶醇、硫利达嗪、氟奋乃静、氯丙嗪、利培酮、奥氮平和齐拉西酮；抗惊厥药，包括但不限于卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯和丙戊酸；兴奋药物，包括但不限于哌甲酯、α2-肾上腺素能激动剂、金刚烷胺和可乐宁；抗抑郁药，包括但不限于单胺氧化酶抑制剂包括苯乙肼和异卡波肼，三环抗抑郁药包括阿米替林、氯米帕明、地昔帕明和去甲替林，非典型性抗抑郁药(non-SSRI)包括安非他酮(Wellbutrin)、拉法新(Velafaxine)(Effexor)和SSRI比如西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀和舍曲林；抗焦虑药，包括但不限于苯二氮和丁螺环酮。另外的辅助治疗剂包括维生素，包括但不限于B族维生素(B6、B12、硫胺素)、维生素A和必需脂肪酸。辅助治疗可以包括行为调节和饮食改变，比如不含谷蛋白-酪蛋白饮食。
在本发明的另外的方面，提供组合制剂和共同给药方法，其应用有效量的一种或多种催产素或催产素类似物化合物、和一种或多种另外的活性剂，所述另外的活性剂与催产素或催产素类似物组合配制或共同给药，以获得治疗哺乳动物受试者中孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状、和/或减轻神经性或精神性病症的一种或多种症状的有效制剂或方法。在这一方面，示例性的组合制剂和共同治疗方法应用催产素或催产素类似物与一种或多种另外的或辅助的下述药物的组合：抗焦虑药、抗抑郁药、抗惊厥药、益智药、抗精神病药、兴奋药、抗病毒药、免疫治疗剂、麻醉药、安眠药或肌肉松弛剂。在另外的组合制剂和共同治疗方法中，将催产素或催产素类似物与一种或多种第二种治疗剂的组合配制或共同给药，所述第二种治疗剂用于治疗上列精神性或神经性病症伴有的症状。
为了实施本发明的共同给药方法，在与一种或多种本文涵盖的第二种或辅助治疗剂的共同治疗方案中，同时或顺次给药催产素或催产素类似物。所述共同给药可以以任意顺序同时或顺次进行，当仅仅一种或两种(或所有)活性治疗剂分别和/或一起发挥其生物学活性时，可以在一个时期内给药。所有这样的共同治疗方法的一个区别方面是催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素发挥至少一些可检测的治疗活性，和/或引发有利的临床反应，其可能与或可能不与所述第二种治疗剂提供的第二临床反应相关。通常，共同给药催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素与如本文涵盖的第二种治疗剂将得到高于单独的催产素类似物或催产素类似物和第二种治疗剂的二者和/或单独的第二种治疗剂引发的治疗反应的增强的治疗反应。
在示例性的实施方案之中，催产素或催产素类似物将与一种或多种第二种试剂或其它指出的治疗剂共同给药(同时或顺次，在组合的制剂中或分开的制剂中)，所述治疗剂例如选自例如5-羟色胺再摄取抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，包括但不限于氟西汀、氟伏沙明、舍曲林、氯米帕明；抗精神病药物，包括但不限于氟哌啶醇、硫利达嗪、氟奋乃静、氯丙嗪、利培酮、奥氮平、齐拉西酮；抗惊厥药，包括但不限于卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯、丙戊酸；兴奋药物，包括但不限于哌甲酯、α2-肾上腺素能激动剂、金刚烷胺和可乐宁；抗抑郁药，包括但不限于纳屈酮、锂和苯二氮抗病毒药，包括但不限于伐昔洛韦；胰泌素；抗焦虑药，包括但不限于丁螺环酮；免疫治疗剂。另外的辅助治疗剂包括维生素，包括但不限于B族维生素(B6、B12、硫胺素)、维生素A和必需脂肪酸。辅助治疗可以包括行为调节和饮食改变，比如不含谷蛋白-酪蛋白饮食。
在某些实施方案中，本发明提供组合的神经性和精神性治疗制剂，其包括催产素和一种或多种辅助试剂，所述辅助试剂对于治疗孤独症谱系病症和相关病症具有有效的活性。在这些组合制剂中，催产素和催产素类似物和辅助试剂将以有效量单独或组合存在于组合制剂中。在示例性的实施方案中，催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素以有效量存在。可选地，所述组合制剂可以包括亚治疗单剂量的一种或两种活性剂，其中所述组合制剂包括的两种试剂的特征是两种试剂一起以组合剂量有效地引发期望的反应。因此，一种或多种催产素或催产素类似物和另外的试剂可以存在于所述制剂中，或者以亚治疗剂量以共同给药方案给药，但是它们在所述制剂或方法中一起引发受试者中的可检测反应。
如上所述，在本文涵盖的本发明的所有各种实施方案中，所述制剂可以使用多种形式中任一种的催产素或催产素类似物，所述多种形式包括所述化合物的药学可接受的盐、异构体、对映异构体、多晶型物、溶剂化物、水合物和/或前药中的任一种或组合。在本发明的示例性的实施方案中，用于示例的目的，在治疗制剂和方法中应用小檗碱。
本发明的药物组合物可以通过获得其期望的治疗或预防目的的任何方式给药。合适的给药途径包括但不限于口服、含服、经鼻、气雾剂、外用(topical)、透皮、粘膜、注射、缓释、控释、离子电渗、超声促渗、及其它常规递送途径、装置和方法。还涵盖可注射的递送方法，包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、动脉内和皮下注射。
本发明的催产素类似物的药物剂型包括药物复合领域公知的作为适于制备如上讨论的剂量单元的辅剂。这样的辅剂包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、张力调节剂(tonicifier)、泡腾剂及其它常规辅剂和添加剂。
通常使用“缓冲剂”来保持溶液的pH为接近恒定的值。即使当将少量强酸或强碱加入到溶液中时，缓冲剂通过防止或中和氢离子和氢氧离子的浓度的大的改变来保持溶液的pH。缓冲剂通常由弱酸及其合适的盐(或弱碱及其合适的盐)组成。弱酸的合适的盐包含与存在于弱酸中相同的阴离子(参见Lagowski，Macmillan Encyclopedia of Chemistry，Vol.1，Simon & Schuster，NewYork，1997，第273-4页)。使用亨-哈二氏公式pH＝pka+log10[A-]/[HA]来描述缓冲剂，其基于弱酸解离的标准方程。通常使用的缓冲剂源的实例包括下述的物质：谷氨酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、乳酸盐、甲酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、磷酸盐及其混合物。
“缓冲容量”指在出现显著的pH改变之前，可以加入到缓冲溶液中的酸或碱的量。如果所述pH存在于弱酸的pK-1和pK+1的范围内，则缓冲容量是可估计的，但是在该范围之外，其下降至价值不大的程度。因此，给定的系统仅仅具有在弱酸(或弱碱)的pK两侧的一个pH单位范围内的有用的缓冲作用(参见Dawson，Data for Biochemical Research，Third Edition，OxfordScience Publications，1986，第419页)。通常，选择合适的浓度以使溶液的pH接近弱酸(或弱碱)的pKa(参见Lide，CRC Handbook of Chemistry and Physics，86th Edition，Taylor & Francis Group，2005-2006，第2-41页)。而且，通常不会将强酸或强碱的溶液归类为缓冲溶液，它们不显示出在pH值2.4至1.6之间的缓冲容量。
在一个实施方案中，将卡贝缩宫素或其它催产素类似物与增溶剂、表面活性剂、张力调节剂、防腐剂、缓冲剂和螯合剂混合。这样的辅剂包括但不限于甲基-β-环糊精(Me-β-CD)、依地酸二钠(EDTA)、精氨酸、山梨糖醇、NaCl、对羟苯甲酸甲酯钠(MP)、对羟苯甲酸丙酯钠(PP)、氯代丁醇(CB)、苯甲醇、氯化锌、乙醇、二癸酰基L-α磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨醇酯、乳糖、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐和/或磷酸盐。示例性的表面活性剂还包括但不限于DMSO、吐温TM(包括但不限于吐温80(聚山梨醇酯80)和吐温20(聚山梨醇酯20)、普流尼克TM及其它普流尼克酸，包括但不限于普流尼克酸F68(泊洛沙姆188)、PEG；基于聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)，即(PEO-PPO-PEO)，或聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)，即(PPO-PEO-PPO)的聚醚，或其组合。在另一个实施方案中，所述组合物包含增溶剂与卡贝缩宫素或其它催产素类似物的组合。在另一个进一步的实施方案中，所述组合物包含表面活性剂与卡贝缩宫素或其它催产素类似物的组合。在另一个的实施方案中，所述组合物包含螯合剂与卡贝缩宫素或其它催产素类似物的组合。本发明的组合物可以进一步包含增溶剂、表面活性剂和螯合剂的组合。例如，本发明的组合物可以包含甲基-β-环糊精和依地酸二钠与卡贝缩宫素或其它催产素类似物的组合。
因此，用于治疗包括孤独症谱系病症和相关病症的神经性和精神性病症的本发明的组合物可以包括任一种下述物质或其组合：药学可接受的载体或辅剂；其它药用试剂；药物试剂；助剂；缓冲剂；增溶剂；表面活性剂；螯合剂；防腐剂；稀释剂；和各种其它药物添加剂和本领域技术人员已知的试剂。这些另外的制剂添加剂和试剂通常为生物学非活性的，可以施用于患者而不引起有害副作用或不引起与活性剂的相互作用。
如果期望，本发明的催产素类似物可以以利用缓释载体比如亲水性缓释聚合物的控释形式给药。在这一方面，示例性的控释试剂包括但不限于具有粘度范围为100cps至约100,000cps的羟丙基甲基纤维素。
增粘剂(viscosity enhancer)或助悬剂可以影响药物从剂量制剂的释放速率和吸收速率。可以作为药学可接受的增粘剂的物质的一些实例为甲基纤维素(MC)；羟丙基甲基纤维素(HPMC)；羧甲基纤维素(CMC)；纤维素；明胶；淀粉；羟乙基淀粉(heta starch)；泊洛沙姆(poloxamer)；普流尼克(pluronic)；羧甲基纤维素钠；山梨糖醇；阿拉伯胶；聚维酮；卡波普(carbopol)；聚卡波非(polycarbophil)；壳聚糖(chitosan)；壳聚糖微球；海藻酸盐微球；壳聚糖谷氨酸盐(chitosan glutamate)；琥石树脂(amberlite resin)；透明质酸(hyaluronan)；乙基纤维素；麦芽糖糊精DE；鼓式干燥玉米淀粉(drum dried way maize starch，DDWM)；可降解的淀粉微球(DSM)；脱氧甘氨胆酸盐(deoxyglycocholate，GDC)；羟乙基纤维素(HEC)；羟丙基纤维素(HPC)；微晶纤维素(MCC)；聚甲基丙烯酸和聚乙二醇；磺基丁基醚B环糊精；交联依地索姆淀粉生物球(cross-linked eldexomer starch biosphere)；牛磺二氢夫西地酸钠(STDHF，sodiumtaurodihydrofusidate)；N-三甲基壳聚糖盐酸盐(TMC，N-trimethylchitosan chloride)；降解的淀粉微球；琥石树脂；壳聚糖纳米颗粒(chistosannanoparticles)；喷雾干燥的交聚维酮；喷雾干燥的葡聚糖微球；喷雾干燥的微晶纤维素；和交联依地索姆淀粉微球。
通常将本发明的催产素或催产素类似物组合物任选地与载体或其它添加剂组合配制成口服剂型以及以该剂型给药。药物制剂技术常见的合适的载体包括但不限于微晶纤维素、乳糖、蔗糖、果糖、右旋糖或其它糖、磷酸二氢钙、硫酸钙、纤维素、甲基纤维素、纤维素衍生物、高岭土、甘露糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇或其它糖醇、无水淀粉、糊精、麦芽糖糊精或其它多糖、肌醇或其混合物。在本发明中使用的示例性的单位口服剂型包括片剂，其可以通过可以在制备口服单位剂型中使用的制备药物口服单位剂型的任何常规方法制备。口服单位剂型，比如片剂，可以包含一种或多种常规附加制剂成分，包括但不限于释放调节剂、助流剂、压制助剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、调味剂、增香剂、甜味剂和/或防腐剂。合适的润滑剂包括硬脂酸、硬脂酸镁、滑石、硬脂酸钙、氢化植物油、苯甲酸钠、亮氨酸、聚乙二醇、月桂硫酸镁、胶态二氧化硅和单硬脂酸甘油酯。合适的助流剂包括胶态氧化硅、气相法二氧化硅(fumed silicon dioxide)、二氧化硅、滑石、热解法二氧化硅、石膏和单硬脂酸甘油酯。可以用于涂层的物质包括羟丙基纤维素、氧化钛、滑石、甜味剂和着色剂。前述泡腾剂和崩解剂可用于制备本领域技术人员已知的快速崩解片。这些典型地在口腔崩解少于一分钟，优选地少于三十秒。泡腾剂是指偶合物，典型地为有机酸和碳酸盐或碳酸氢盐。这样的快速作用的剂型将用于例如预防或治疗惊恐障碍的急性发作。
本发明另外的催产素或催产素类似物组合物可以制备成本领域已知的多种吸入或经鼻递送形式中的任一种，和以该形式给药。能够将气雾化的催产素制剂沉积在患者的鼻窦腔或肺泡的装置包括计量性剂量吸入器、喷雾器、干燥粉未发生器、喷雾器等。肺部递送至肺用于快速穿过泡腔上皮进入血流可能对于治疗抽搐或惊恐障碍的发作前时刻(impending episode)特别有用。适于肺部递送药物用于全身效应的方法和组合物是本领域已知的。用于给药的其中载体为液体的合适的制剂，如例如鼻喷雾剂或滴鼻剂，可以包括催产素或催产素类似物和任何另外的活性或非活性成分的水性或油性溶液。
鼻内递送允许在施用有效量的化合物至鼻之后，允许该化合物直接进入血流，而不需要产品沉积在肺中。另外，鼻内递送可以获得直接的、或增加的递送所述活性化合物至中枢神经系统。在这些及其它实施方案中，本发明的鼻内施用化合物可对于治疗突然发作的焦虑病症，比如惊恐障碍有利。典型地，当这样的发作逼近时，患有一般性焦虑病症和倾向于惊恐障碍发作的个体能够感知。在这样的时间，特别需要能够以甚至在公共环境中方便的形式给药本发明的化合物，而且获得快速吸收和中枢神经系统递送。
对于鼻内和肺部给药，液体气雾剂制剂通常包含本发明的活性化合物与分散剂和/或生理学可接受的稀释剂的组合。可选地，干粉气雾剂制剂可以包含所述化合物和分散剂的微细的固体形式，该形式允许容易地分散所述干粉颗粒。对于液体或干粉气雾剂制剂，为了保证雾化的剂量到达鼻通道或肺的粘膜，所述制剂必须被雾化成小的液体或固体颗粒。如本文使用的术语“气雾剂颗粒”描述适于鼻(约10微米的范围)或肺部(约2-5微米的范围)分布至目标的粘膜或肺泡膜的足够小颗粒直径的液体或固体颗粒。其它需要考虑的事项包括递送装置的结构、制剂中的其它组分和颗粒特征。鼻或肺部施用药物的这些方面是本领域众所熟知的，制剂操作、雾化方式和递送装置的结构都在本领域普通技术人员的水平之内。
还提供本发明的另外的组合物和方法，用于外用施用催产素或催产素类似物来治疗神经性和精神性病症，包括孤独症谱系病症、相关病症和此类病症的症状。
外用组合物可以包含催产素或催产素类似物和加入到皮肤或粘膜可接受的载体中的任何其它活性或非活性组分，其包括如下形式：气雾剂喷雾剂、粉剂、皮肤贴剂、棒剂(stick)、颗粒剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、洗剂、糖浆剂、软膏剂、浸渍的纱布(impregnated sponge)、卷棉子、或者作为在水成液中的溶液剂或混悬剂、非水成液体、水包油型乳剂、或油包水型液体乳剂。这些外用组合物可以包含溶解或分散在加入外用组合物或递送装置中的一部分水或其它溶剂或液体中的催产素或催产素类似物。可以容易地理解，可以通过使用本领域已知的皮肤渗透促进剂增强透皮给药途径。适于这样的剂型的制剂包括其中通常使用的辅剂，特别地指例如用于缓释药物经延长的时间例如24小时吸收的结构或基质。对于患有一般性焦虑病症的患者，每日一次透皮贴剂特别有用。
还另外提供用于肠胃外给药的催产素或催产素类似物，包括水性或非水性注射溶液，其可以任选地包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和/或使该制剂与哺乳动物受试者的血液等渗的溶质；和水性或非水性无菌混悬剂，其可以包含助悬剂和/或增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中。催产素或催产素类似物还可包括用于在肠胃外给药后延长释放的聚合物。即用注射溶液(Extemporaneous injection solution)、乳剂和混悬剂可以由之前已经描述的种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。优选的单位剂量制剂为包含如本文上述的日剂量或单元剂量、每日亚剂量，或者其合适的部分的活性成分的那些。
在更详细的实施方案中，可以将催产素或催产素类似物包囊用于以微胶囊、微粒或微球递送，所述微胶囊、微粒或微球通过凝聚技术或界面聚合制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳剂(macroemulsion)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
如上所述，在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以使用上述催产素或催产素类似物的药学可接受的盐，例如酸加成盐或碱盐。药学可接受的加成盐的实例包括无机酸和有机酸加成盐。合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐和磷酸氢盐。另外的药学可接受的盐包括但不限于金属盐，比如钠盐、钾盐、铯盐等；碱土金属盐，比如钙盐、镁盐等；有机胺盐，比如三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己胺盐、N，N′-二苄基乙二胺盐等；有机酸盐，比如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、乙酸盐、二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐和甲酸盐；磺酸盐，比如甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；和氨基酸盐，比如精氨酸盐、天冬酰胺(asparginate)、谷氨酸盐、酒石酸盐和葡糖酸盐。合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成，例如铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐和二乙醇胺盐。
本发明的药物试剂可以肠胃外给药，例如静脉内、肌内、皮下或腹膜内给药。所述肠胃外制剂可以是适于如此给药的溶液、分散体或乳剂。也可以将所述试剂配制在用于在肠胃外给药后延长释放的聚合物中。药学可接受的制剂和成分典型地为无菌的或容易灭菌的、生物学惰性的和易于给药。这样的聚合材料是药物复合领域的普通技术人员熟知的。肠胃外制剂典型地包含缓冲剂和防腐剂，并可以是冻干形式，在给药时再复制(re-constituted)。
本发明还应被理解为涵盖包括催产素或催产素类似物的方法和组合物，其使用所述化合物的体内代谢产物(在施用所述前体化合物之后在体内生成的，或以代谢产物本身的形式直接施用的)。所述产物可以例如通过从施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、糖基化等来得到，主要是由酶促方法得到。因此，本发明包括使用如下方法生成的化合物的本发明的方法和组合物，所述方法包括用催产素或催产素类似物的小檗碱相关的或衍生的化合物接触哺乳动物受试者足够得到其代谢产物的一段时间。所述产物典型地通过以下来鉴定：制备本发明的放射性标记的化合物，将其以可检测的剂量肠胃外施用于动物比如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，使经过足够发生代谢的时间，并从尿、血或其它生物样品中分离其转化产物。
可以使用任何喷雾瓶或注射器施用本发明的鼻内制剂。鼻喷雾瓶的实例为“Nasal Spray Pump w/Safety Clip”Pfeiffer SAP No.60548，其每次喷射0.1mL剂量，具有的汲取管长度为36.05mm。其可以购自Pfeiffer of America ofPrinceton，NJ。催产素或催产素类似物(例如卡贝缩宫素)的鼻内剂量可以为约50μg至约500μg，包括，例如约150μg和约300μg的剂量。当作为鼻内喷雾剂给药时，喷雾剂的粒径可以为10-100μm(微米)的尺寸，例如20-100μm的尺寸。
如本文公开的，可以使用鼻喷雾剂或气雾剂经鼻内施用催产素、催产素类似物(例如卡贝缩宫素)。在这点上，可采用下述定义：
气雾剂-在压力下包装且包含治疗活性成分的产品，当开启合适的阀门系统时，其释放所述治疗活性成分。
计量气雾剂-一种加压剂型，其包括计量的剂量阀，当每次开启时，其允许递送均匀量的喷雾剂。
粉末气雾剂-一种在压力下包装且包含粉末形式的治疗活性成分的产品，当开启合适的阀门系统时，其释放所述治疗活性成分。
喷雾气雾剂-一种使用压缩气体作为抛射剂以提供喷出为湿喷雾剂的产品所需力的气雾剂产品；其通常适于医用试剂在药学可接受的水性溶剂中的溶液。
喷雾剂-一种由空气或蒸汽喷射微细的液体。鼻喷雾剂药物产品包含溶解或悬浮在药学可接受的溶液中的治疗活性成分或在非加压分配器中的辅剂的混合物。
计量喷雾剂-一种非加压剂型，其由阀组成，当每次开启时，其允许分配规定量的(药学可接受的)喷雾剂。
混悬喷雾剂-一种药学可接受的液体制剂，其包含分散在液体载体中的固体颗粒，并且是流动的液滴或微细固体的形式。
所述药学可接受的气雾喷雾剂的流体动力学特征由计量的鼻喷雾泵作为药物递送装置(“DDD”)来递送(emitted)。喷雾剂的特征是食品和药物管理局(“FDA”)批准新的和现有的鼻喷雾泵的研究和开发、质量保证和稳定性测定方法所必需的管理呈文(regulatory submissions)的组成部分。
已经发现，喷雾剂的几何结构的全部特征是鼻喷雾泵的综合性能的最好指示物。特别地，测量当其从装置排出时的喷雾剂的扩张角(喷雾几何结构)；喷雾剂的横截面椭圆率、均匀性和颗粒/液滴分布(喷雾模式)；并且认为形成喷雾的时间演化是表征鼻喷雾泵的最代表性的性能参数。在质量保证和稳定性试验期间，对于鼻喷雾泵，喷雾几何结构和喷雾剂模式测量是用批准的数据标准验证一致性和符合度的关键标识。
在这一点上，考虑下述定义：
喷雾高度(Plume Height)-从致动器顶部至因破坏了直线流动喷雾角变成非线性的点的测量。基于数字图像的可视观察，为建立与喷雾模式的最远测量点一致的宽度测量点，对该研究定义30mm的高度。
主轴-在适合的喷雾模式内可以绘制的最大弦，其与COMw以基本单位(mm)交叉。
短轴-在适合的喷雾模式内可以绘制的最小弦，其与COMw以基本单位(mm)交叉。
椭圆率-主轴与短轴的比例。
D10-10％的样品的总液体体积由较小直径液滴组成的液滴的直径(μm)。
D50-50％的样品的总液体体积由较小直径液滴组成的液滴的直径(μm)，也称为质量中位直径。
D90-90％的样品的总液体体积由较小直径液滴组成的液滴的直径(μm)。Span-分布的宽度、较小值、较窄分布的量度。Span根据下式计算
％RSD-％相对标准偏差，标准偏差除以组的平均值，再乘以100，也称为％CV。
可以根据工业常规或健康管理机构(regulatory health authorities)可接受的那些来选择鼻喷雾装置。合适的装置的一个实例描述在美国申请10/869,649(S.Quay和G.Brandt：用于增加粘膜递送Y2受体结合肽的组合物和方法和用于治疗和预防肥胖症的方法(Compositions and methods for enhancedmucosal delivery of Y2 receptor-binding peptides and methods for treating andpreventing obesity)，2004年6月16日申请)中。
本发明公开的内容还理解为涵盖用于诊断哺乳动物受试者中的催产素或催产素类似物的危险水平、存在、严重性或治疗指标(treatment indicia)或控制其的诊断组合物，其包括用标记的(例如同位素标记的、荧光标记的或以允许使用常规方法检测标记化合物的其它方法标记的)催产素或催产素类似物接触哺乳动物受试者(例如细胞、组织、器官或个体)，该受试者正处于危险中或表现出一种或多种孤独症谱系病症或相关病症的症状，此后使用任一种宽范围的已知测定和标记/检测方法来检测标记化合物的存在、位置、代谢和/或结合状态。
在示例性的实施方案中，催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素是由具有不同原子质量或质量数的原子代替一种或多种原子的同位素标记的。可以加入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，比如分别为2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。然后，将同位素标记化合物施用于个体或其它受试者，接着如上所述根据常规方法进行检测，得到有用的诊断和/或治疗控制数据。
实施例
提供下述实施例用于阐述，而不是限制。
实施例1
卡贝缩宫素制剂的渗透性
使用气管/支气管上皮细胞膜插入物(insert)完成不同的卡贝缩宫素制剂的渗透性研究。评价样品的外观、颜色、透明度、pH、重量克分子渗透浓度(osmolality)、细胞生存力(使用MTT测定)、细胞毒性(使用LDH测定)和跨上皮电阻(TER)和渗透性。
根据表1的配方制备样品。试验辅剂所使用的缩写包括：Me-β-CD为甲基β环糊精(Wacker，Munich，Germany)，DDPC为二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(NOF Corp.，White Plains，NY)，EDTA为依地酸二钠(JTBaker，Phillipsburg，NJ)，MP/PP为对羟苯甲酸甲酯钠/对羟苯甲酸丙酯钠(Spectrum，Gardena，CA)，CB为氯代丁醇，和Arg为精氨酸。
表1
卡贝缩宫素制剂的样品组合物




使用具有Orion 520Aplus pH计的Cole Parmer半微量NMR管玻璃pH探针(Thermo Electron Corp，Waltham，MA)测量pH。根据需要，使用2N HCL或2N NaOH调节pH，以符合制剂中规定的参数。
用Advanced多道渗透压计(Advanced multichannel osmometer，型号2020，Advanced Instruments，Inc.，Norwood，MA)测量重量克分子渗透浓度。
在试验前一天，收到气管/支气管上皮细胞膜插入物(EpiAirway，MatTekCorp.，Ashland，MA)。将各个组织插入物放置在6孔板的孔中，所述孔包含0.9ml的无血清培养基，并在37℃培养24小时，以使组织平衡。试验当天，对于各个插入物，使用连接到上皮电压计(Epithelial Voltohmeter)的组织电阻测量室(Tissue Resistance Measurement Chamber)(World Precision Instruments，Inc.，Sarasota，FL)进行跨上皮电阻测量。
在测定本底跨上皮电阻之后，将1ml的培养基放置在6孔板的各个孔底部。倒转插入物，并吸出(drain)，将其置于含有新鲜培养基的新孔中。然后，对于样品1-12，将100μl要试验的制剂加入到插入物中。对于样品13-92，将25μl的制剂加入到各个插入物中。将所述插入物放置在培养箱中，以100rpm振摇，保持在37℃一小时。然后，从培养箱中移出组织插入物。将200μl的新鲜培养基放置在24孔板的各个孔中，并转移插入物。在移出所述插入物后，收集保留在六孔板中的底侧(basolateral)溶液，并贮存在2-8℃，直到用EIA(催产素酶免疫测定试剂盒(Oxytocin Enzyme Immunoassay Kit)：High Sensitivity，Peninsula Laboratories Inc，San Carlos，CA)测定。制剂5具有的渗透性为21.2％，制剂1、2、3和4具有的渗透性分别为15.7％、14.4％、9.6％和17.9％。这些渗透性水平显著地高于没有增强辅剂的卡贝缩宫素的渗透性。单独的卡贝缩宫素(在只有缓冲剂和盐中)的渗透性为低于1.0％。
将200μl的新鲜培养基轻轻地加入到在24孔板中的各个组织插入物中，将该板放置在室温下的摇台上5分钟。从各个插入物中移出150μl的顶部溶液，贮存用于乳糖酶脱氢酶测定。然后，用300μl的培养基洗涤该插入物；将300μl的新培养基加入到各个插入物中，在室温下培养所述插入物20分钟，并测量跨上皮电阻。
然后，将该插入物转移到新的不含培养基的24孔板中，将合适量的培养基加入到顶部表面，以使总量达到300μl。然后，在室温下，以100RPM振摇该插入物五分钟。然后，除去50-100μl的顶部培养基，放置在0.5至1.5mL管中，并保存在2-8℃直至需要时。
然后，以1000rpm离心样品5分钟。移出2μl的上清液，并加入到96孔板中。然后，使用48μl的培养基稀释上清液，达到25x稀释，使用CytoTox96细胞毒测定试剂盒(CytoTox 96 Cytotoixcity Assay Kit，Promega Corp.，Madison，WI)测定各个样品的LDH损失，一式三份。
为了分析底侧的培养基，将贮存的150μl溶液中的50μl装入96孔测定板中并测定，一式三份。
使用MTT测定试剂盒(MatTek Corp.，Ashland，MA)评价细胞生存力。融化MTT浓缩物，并以2ml MTT：8ml培养基的比例用培养基稀释。将300μl的MTT-培养基混合物加入到24孔板的各个孔中。吸出组织培养插入物，转移到包含MTT的孔中，并在37℃下，于暗处培养三小时。在培养之后，从板中移出各个插入物，然后浸入包含2ml提取剂溶液的新24孔板的各孔中。然后，盖住所述板，在室温下，于暗处培养过夜。然后，将各个插入物中的液体轻轻倒回盛其的孔中，弃去所述插入物。然后，将来自各孔的提取剂溶液用移液器移至96孔板中，一式三份，并加入150μl新鲜提取剂溶液来稀释。然后，使用SpectraPro软件在Spectramax板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上在550nm处测量样品的光密度。
渗透性结果表明EDTA为增加渗透性的重要因素，山梨糖醇似乎降低卡贝缩宫素的渗透性。如DOE预测的最佳制剂包括EDTA和Me-β-CD。另外，EDTA是细胞毒性的最重要因素。乙醇与Me-β-CD和EDTA组合也增加渗透性。
实施例2：
兔中的第一药代动力学研究
通过鼻内给药药物组合物用卡贝缩宫素处理兔。表2显示了试验的制剂：
表2
PK研究的卡贝缩宫素制剂

  组#  卡贝缩宫  素  (mg/ml)  Me-β-  CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  Arg  (mM)  山梨糖  醇  (mM)  NaCl  (mM)  CB(mg/ml)  pH  卡贝缩宫素  ％标示量  1  0.03  0  0  10  0  150  0  7  87.1  2  2  0  3.5  10  0  57  5  4  101.2  3  2  10  3.5  10  0  52  5  4  110.2  4  2  10  3.5  10  104  0  5  4  103.0  5  2  20  3.5  10  0  50  5  4  102.0  6  4  10  3.5  10  0  52  5  4  99.2

PK数据的结果、％生物利用度(％BA)和％CV分别显示在表3、表4和表6中。下述结果从平均血液水平的测量获得：
表3
兔中卡贝缩宫素的PK结果
  组#  制剂  剂量(μg/kg)  Tmax(min)  Cmax(pg/mL)  AUC最终(min*pg/mL)  1  IM  3  9  5070.40  184237.00  2  IN  30  29  1244.80  46724.50  3  IN  30  27  1098.80  67283.50  4  IN  30  30  692.80  32378.00  5  IN  30  27  1678.20  51911.50  6  IN  60  30  3090.40  169038.00

表4
兔中卡贝缩宫素的％生物利用度
  组#  制剂  剂量(μg/kg)  AUC最终(min*pg/mL)  ％BA  1  IM  3  184237.00  N/A  2  IN  30  46724.50  2.54  3  IN  30  67283.50  3.65  4  IN  30  32378.00  1.76  5  IN  30  51911.50  2.82  6  IN  60  169038.00  4.59

制剂(组号6)“10Me-β-CD，高剂量”产生了最高的卡贝缩宫素暴露，以及最高的相对生物利用度(约4.6％的相对BA)。在该情况下，通过保持剂量体积恒定和增加药物浓度获得较高剂量。所有其它制剂显示出在约1.8至约3.7％范围内的相对生物利用度。
0和20mg/ml的Me-β-CD浓度(分别为组号2和5)的比较显示出较高浓度Me-β-CD的Cmax(分别为1245和1678pg/ml)和AUC最终(分别为46725和51912min*pg/ml)增加。然而，当与“0Me-β-CD”和“20Me-β-CD”相比时，含有中等浓度的Me-β-CD(组#3)″10Me-β-CD”的样品得到了最低的Cmax(1099pg/ml)和最高的AUC最终(67284min*pg/ml)。
观察到，在体外，与包含盐的制剂相比，包含山梨糖醇的制剂降低卡贝缩宫素渗透性(参见表5中列出的结果)。如在实施例1中所公开进行这些体外研究。在目前体内测定中，还观察到令人意料不到的张力调节剂的作用。特别地，组3和4的比较显示出所述盐-张力调节的制剂产生比包含山梨糖醇的制剂(分别为32378min*pg/ml和693pg/ml)更高的AUC最终和Cmax(分别为67284min*pg/ml和1099pg/ml)。
表5
体外渗透性研究

随着卡贝缩宫素的浓度从2mg/ml增加至4mg/ml，观察到剂量反应，AUC最终从67284min*pg/ml(组3)增加到169038min*pg/ml(组6)。这相当于相对BA从约3.7轻微增加至约4.8％。另外，增加剂量使IN卡贝缩宫素制剂与IM剂量的AUC最终相当(分别为169038vs.184237min*pg/ml)。还观察到IN制剂的Tmax比较长(在该研究中，与典型的IN给药的～15min相比，Tmax＝27-30min)。
表6
兔中卡贝缩宫素的％CV
  组#  制剂  剂量(μg/kg)  Tmax(min)  Cmax(pg/ml)  AUC最终  (min*pg/ml)  1  IM  3  46.48  27.04  12.73  2  IN  30  42.93  101.09  67.41  3  IN  30  24.85  30.94  42.83  4  IN  30  0.00  27.25  33.13  5  IN  30  24.85  46.69  51.75  6  IN  60  35.36  27.64  15.86

体内数据的统计学分析表明，除“10Me-β-CD，高剂量”之外的所有制剂的AUC最终都与IM对照有统计学差异。另外，所有给药剂量为2mg/ml卡贝缩宫素的IN制剂都与IM对照有统计学差异，彼此的Cmax、AUC最终和Tmax没有统计学差异。所述“高剂量”4mg/ml卡贝缩宫素制剂与IM对照在统计学上相似，与所有其它制剂的Tmax没有统计学差异。例如，组2-5的AUC最终和Cmax的P值为＜0.0001，组6的AUC最终和Cmax分别为0.8119和0.0091。组2的Tmax的P值为0.0023，组2的Tmax的P值为0.0062，组3的Tmax的P值为0.0014，组5的Tmax的P值为0.0062和组6的Tmax的P值为0.0014。制剂#6具有最高的生物利用度(约5％)。结果表明可以通过本发明的鼻内药物制剂获得约4-5％的卡贝缩宫素的生物利用度。
结合表3、4和6中列出的体内数据与表5中列出的体外数据评价可能的体内-体外相关性(IVIVC)，图示在图1中。观察卡贝缩宫素的体内生物利用度和体外渗透性之间的相关性(R2＝0.7608，图1)。另外，比较体内AUC最终或Cmax与体外卡贝缩宫素渗透性(R2分别为0.9236和0.9881)来观察强的IVIVC。这些相关性表明在该研究中观察到的体外渗透性可预测在兔中体内观察到的暴露。显著地，张力调节剂(盐vs.糖)影响体外渗透性的非显而易见作用也可预测体内观察到的张力调节剂的作用；含有氯化钠的制剂在体外产生较高的渗透性和在体内产生更大的暴露。
实施例3
在兔中的肌内第二药代动力学研究和卡贝缩宫素的鼻内给药
为了重复试验在我们的第一人临床研究中评价的制剂，进行第二兔PK研究，以试验增加Me-β-CD(约10至约40mg/ml)的含量的作用，评价在张力调节剂山梨糖醇和NaCl的存在下卡贝缩宫素的生物利用度，试验增加重量克分子渗透浓度(约170至约220mOsm/kgH2O)的影响和试验乙醇对％BA的作用。在该研究中，卡贝缩宫素的剂量浓度也增加至60μg/kg(即4μg/ml的卡贝缩宫素)。试验的制剂显示在表7中。
在开始该第二体内研究之前，我们根据在实施例1中列出的方法，使用气管/支气管上皮细胞膜系统(EpiAirway，MatTek Corp.，Ashland，MA)，评价在体外，在表7中列出的制剂降低跨上皮电阻(TER)的能力，以及其对细胞生存力、细胞毒性和渗透性的影响。
在该上皮细胞的体外研究的结果表明所有的制剂显著地降低TER，具有高水平的细胞生存力、低水平的细胞毒性和约2.5％至约24％的卡贝缩宫素渗透性水平。例如，关于％渗透性，包含10mg/ml Me-β-CD+CMC的制剂(样品号8)具有最好的性能，％渗透性为约24％。命名为10mg/ml Me-β-CD的制剂(样品号2)显示％渗透性为约9％，命名为10mg/ml Me-β-CD+山梨糖醇的制剂(样品号3))提供约5％的渗透性，命名为20mg/ml Me-β-CD的制剂(样品号4)和40mg/ml Me-β-CD的制剂(样品号5)提供约12％的渗透性，命名为10mg/ml Me-β-CD hi osm(10mg/ml Me-β-CD高重量克分子渗透浓度)的制剂提供约4％的渗透性(样品号6)，和命名为EDTA+EtOH的制剂(样品号7)提供约15％的渗透性。在该试验中，阴性对照提供的％渗透性为约2％。来自该试验的结果表明相对于在本文给出的我们的第一人临床研究中使用的制剂，高重量克分子渗透浓度和张力调节剂两者似乎降低了渗透性(参见实施例8)。
对于该第二兔PK研究，通过肌内(IM)或鼻内(IN)施用药物组合物用卡贝缩宫素处理新西兰白兔。该研究是在每组5只禁食的雄性兔的八组中进行的随机的、单次治疗平行研究。在给药前一天，对所有的动物禁食，在第0天下午移走任何剩余的食品，并使动物保持禁食状态至研究结束。给鼻内组(组2-8)的所有动物施用60μg/kg的卡贝缩宫素(给药浓度为4.0mg/ml，给药体积为0.015ml/kg)。给肌内组(组1)施用3.0μg/kg的卡贝缩宫素(给药浓度为0.03mg/ml，给药体积为0.10ml/kg)。
制备25mL的各种IN制剂。所有的组包含10mM的精氨酸。组2-8包含5mg/ml的氯代丁醇(CB)。将IN制剂保存在1cc棕色玻璃瓶中。制备IM制剂，并保存在3cc透明玻璃瓶中。所有的制剂(除1号外)还包含5mg/ml的氯代丁醇，并贮存在2-8℃。表7显示试验的制剂(缩写：PG＝丙二醇；CMCLV＝羧甲基纤维素钠(低粘度，10-50cps)；乙醇＝EtOH)。
表7
PK研究的卡贝缩宫素制剂
  #  ID  卡贝缩  宫素  (mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  CMC  LV(mg/ml)  山梨糖  醇  (mM)  NaCl  (mM)  EtOH  (mg/ml)  PG  (mg/ml)  pH  1  IM  0.03  0  0  0  0  150  0  0  7.0  2  1％MBCD  4  10  3.5  0  0  52  0  0  4.0  3  1％MBCD-山梨糖醇  4  10  3.5  0  104  0  0  0  4.0  4  2％MBCD  4  20  3.5  0  0  50  0  0  4.0  5  4％MBCD  4  40  3.5  0  0  40  0  0  4.0

  #  ID  卡贝缩  宫素  (mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  CMC  LV(mg/ml)  山梨糖  醇  (mM)  NaCl  (mM)  EtOH  (mg/ml)  PG  (mg/ml)  pH  6  1％MBCD  4  10  3.5  0  0  86  0  0  4.0  7  0％MBCD-0.2％ETOH  4  0  3.75  0  0  50  2  0  4.0  8  1％MBCD-0.1％CMCLV  4  10  3.5  1.0  0  0  0  10  4.0

以单次快速推注到一侧后肢来施用组1的制剂。在插入之前，夹住针插入部位周围的毛皮，用70％的异丙醇擦拭皮肤。将针从侧面且对着尾部的方向插入股骨后侧的肌群中，以避开坐骨神经。对每个动物用其自己的针/注射器给药。获得给药注射器的皮重和最后重量，计算给药剂量的净重。
使用移液器(pipetteman)和一次性塑料吸头将组2-8给药至左侧鼻孔。当递送剂量时，稍微将动物的头部向后倾斜。通过使给药同允许毛细作用的吸气一致来进行给药，以将所述溶液吸入鼻孔。在每次给药或试图给药之间，使用新的吸头。在鼻内给药之后，限制动物的头部至向后倾斜的位置约15秒，以防止试验制品制剂从左侧鼻孔流失。
在给药之后，在给药后第0(预剂量)、5、10、15、30、45、60、120和240分钟，通过直接静脉穿刺边缘耳静脉获得十一次系列血样。将50μl的抑肽酶溶液加入到各个包含作为抗凝剂的K2EDTA的血样中。对于IM剂量组，预剂量、给药后5分钟和1小时，进行注射部位的肉眼目测观察，对于IN剂量组，预剂量、给药后5分钟和1小时，进行两个鼻孔的检查。在施用不同的卡贝缩宫素制剂之后，测定卡贝缩宫素的PK血浆水平。
将在该第二PK研究中给药兔卡贝缩宫素的PK结果的概述显示在表8中。将IN％生物利用度结果显示在表9中。通过测量平均血液水平获得下述结果：
表8
卡贝缩宫素在兔中的PK结果概述
  参数  制剂ID  观  测  号  平均值(STD)  中值  范围  CV(％)

  参数  制剂ID  观  测  号  平均值(STD)  中值  范围  CV(％)  AUCinf  (min*pg/mL)  IM  5  142393(19607.88)  138920  (121680-173400.6)  13.77  1％MBCD  5  140363.3(75055.11)  110774.4  (92990.2-273337.4)  53.47  1％MBCD-山梨糖醇  3  101175.1(40816.59)  79138.3  (76113.3-148273.7)  40.34  2％MBCD  4  398767.4(277545.41)  354820.4  (109565.2-775863.8)  69.60  4％MBCD  5  182847.7(89881.53)  202467.9  (56431.6-263761.4)  49.16  1％MBCD  5  152980.5(59363.49)  156198.7  (85466.5-217339.4)  38.80  0％MBCD-0.2％ETOH  5  137436.2(79285.95)  151533.5  (44080.2-223647.4)  57.69  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  267524.7(257835.72)  195123.4  (68559.9-713829.8)  96.38  AUC最终  (min*pg/mL)  IM  5  138324(18875.93)  136967.5  (114945-166632.5)  13.65  1％MBCD  5  133581(75529)  98692.5  (88840-267310)  56.54  1％MBCD-山梨糖醇  4  155472.5(119604.55)  111097.5  (71617.5-328077.5)  76.93  2％MBCD  5  216248(117463.71)  239155  (81542.5-334190)  54.32  4％MBCD  5  169762(78456.6)  199710  (56392.5-236257.5)  46.22  1％MBCD  5  146853.5(57136.36)  150340  (82572.5-203460)  38.91  0％MBCD-0.2％ETOH  5  133916(78288.02)  150162.5  (39725-221157.5)  58.46  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  259976.5(254979.86)  189120  (67955-700310)  98.08  Cmax(pg/mL)  IM  5  3625(1195.63)  3577  (2230-5355)  32.98  1％MBCD  5  2946.2(2673.56)  1462  (1334-7558)  90.75  1％MBCD-山梨糖醇  4  1928.3(507.11)  1907.5  (1459-2439)  26.30  2％MBCD  5  4185(3771.23)  2861  (1167-10428)  90.11  4％MBCD  5  2885(1157.06)  3041  (1272-4264)  40.11  1％MBCD  5  4527.8(4167.31)  3133  (2003-11880)  92.04  0％MBCD-0.2％ETOH  5  3078.6(1759.24)  3558  (1072-5351)  57.14  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  4508.8(3495.99)  3374  (1848-10416)  77.54

  参数  制剂ID  观  测  号  平均值(STD)  中值  范围  CV(％)  Tmax(min)  IM  5  6(2.24)  5  (5-10)  37.27  1％MBCD  5  30(0)  30  (30-30)  0.00  1％MBCD-山梨糖醇  4  52.5(46.64)  37.5  (15-120)  88.83  2％MBCD  5  47(42.66)  30  (10-120)  90.77  4％MBCD  5  25(15.41)  30  (5-45)  61.64  1％MBCD  5  36(8.22)  30  (30-45)  22.82  0％MBCD-0.2％ETOH  5  30(0)  30  (30-30)  0.00  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  33(6.71)  30  (30-45)  20.33  LogAUC最终  IM  5  11.8(0.13)  11.8  (11.7-12)  1.14  1％MBCD  5  11.7(0.45)  11.5  (11.4-12.5)  3.87  1％MBCD-山梨糖醇  4  11.8(0.7)  11.6  (11.2-12.7)  5.97  2％MBCD  5  12.1(0.65)  12.4  (11.3-12.7)  5.35  4％MBCD  5  11.9(0.61)  12.2  (10.9-12.4)  5.12  1％MBCD  5  11.8(0.42)  11.9  (11.3-12.2)  3.54  0％MBCD-0.2％ETOH  5  11.6(0.74)  11.9  (10.6-12.3)  6.34  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  12.1(0.89)  12.2  (11.1-13.5)  7.31  LogCmax  IM  5  8.2(0.33)  8.2  (7.7-8.6)  4.10  1％MBCD  5  7.7(0.75)  7.3  (7.2-8.9)  9.74  1％MBCD-山梨糖醇  4  7.5(0.27)  7.5  (7.3-7.8)  3.54  2％MBCD  5  8(0.87)  8  (7.1-9.3)  10.89  4％MBCD  5  7.9(0.47)  8  (7.1-8.4)  5.99  1％MBCD  5  8.2(0.73)  8  (7.6-9.4)  8.89  0％MBCD-0.2％ETOH  5  7.9(0.68)  8.2  (7-8.6)  8.60  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  8.2(0.69)  8.1  (7.5-9.3)  8.44  Cl(mL/min)  IM  5  21.4(2.75)  21.6  (17.3-24.7)  12.87  1％MBCD  5  496.3(164.29)  541.6  (219.5-645.2)  33.10

  参数  制剂ID  观  测  号  平均值(STD)  中值  范围  CV(％)  1％MBCD-山梨糖醇  3  650.4(213.33)  758.2  (404.7-788.3)  32.80  2％MBCD  4  241.3(209.12)  170  (77.3-547.6)  86.68  4％MBCD  5  456.4(353.04)  296.3  (227.5-1063.2)  77.35  1％MBCD  5  449.8(189.37)  384.1  (276.1-702)  42.10  0％MBCD-0.2％ETOH  5  642.2(472.78)  396  (268.3-1361.2)  73.62  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  401.7(301.59)  307.5  (84.1-875.1)  75.07  T1/2(min)  IM  5  44.3(17.05)  48.1  (16.1-62.5)  38.46  1％MBCD  5  33.6(13.41)  32.2  (18.3-47.4)  39.90  1％MBCD-山梨糖醇  3  27.3(11.93)  24.7  (16.9-40.3)  43.66  2％MBCD  4  151.8(253.49)  28.4  (18.5-531.8)  167.02  4％MBCD  5  37.1(22.54)  34.8  (9-61.9)  60.74  1％MBCD  5  44.8(14.66)  46.1  (22.3-59.4)  32.75  0％MBCD-0.2％ETOH  5  23.9(13.73)  15.4  (13.4-45.1)  57.44  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  39(18.67)  37.2  (16.1-64.9)  47.85  Kel(1/min)  IM  5  0.02(0.013)  0.0144  (0.011-0.043)  67.77  1％MBCD  5  0.024(0.01)  0.0215  (0.015-0.038)  42.53  1％MBCD-山梨糖醇  3  0.029(0.012)  0.028  (0.017-0.041)  41.51  2％MBCD  4  0.023(0.017)  0.0272  (0.001-0.037)  72.97  4％MBCD  5  0.03(0.027)  0.0199  (0.011-0.077)  90.15  1％MBCD  5  0.017(0.008)  0.015  (0.012-0.031)  45.28  0％MBCD-0.2％ETOH  5  0.036(0.016)  0.045  (0.015-0.052)  44.52  1％MBCD-0.1％CMCLV  5  0.022(0.013)  0.0186  (0.011-0.043)  57.18

表9
卡贝缩宫素在兔中的％生物利用度
  制剂  剂量(μg/kg)  ％生物利用度  1％MBCD  60  4.83

  制剂  剂量(μg/kg)  ％生物利用度  1％MBCD-山梨糖醇  60  5.62  2％MBCD  60  7.82  4％MBCD  60  6.14  1％MBCD  60  5.31  0％MBCD-0.2％ETOH  60  4.84  1％MBCD-0.1％CMCLV  60  9.40

这些结果显示出本发明的鼻内药物制剂获得的卡贝缩宫素的生物利用度为约4％至约9％。
在该第二兔PK研究中，通过测量(施用调节Me-β-CD浓度的制剂的)兔的平均血液水平得到的结果(即Tmax、Cmax、AUC最终和％生物利用度)也显示在表10中，包括有关张力调节剂的作用，调节重量克分子渗透浓度的结果和新的制剂的结果。
表10
药代动力学研究2的结果

在表10中列出的数据表明，当改变Me-β-CD的浓度时，似乎对于BA没有显著的作用，当改变张力调节剂(NaCl或山梨糖醇)时，似乎对于BA没有显著的作用，当重量克分子渗透浓度增加时，BA有轻微的增加，当使用这些新的制剂时，BA也没有显著的增加；因为在CMC+PG组中的一只兔子可被认为是异常值。
更详细地，重复临床对照(“10Me-β-CD”)和“10Me-β-CD，山梨糖醇”，数据显示出各自产生与在第一PK研究中观察到的那些类似的卡贝缩宫素暴露水平。所述“10Me-β-CD”临床制剂产生4.8％的相对BA(与之相比，在第一PK研究中为4.6％)，而“10Me-β-CD，山梨糖醇”相对于“10Me-β-CD”降低Cmax。尽管“10Me-β-CD，山梨糖醇”的AUC最终值(155500min*pg/ml)稍微高于“10Me-β-CD”的值(133600min*pg/ml)，但是这一结果主要是由于单个数据点(来自在前的剂量组中，在120分钟时测定的单只动物)导致的。PK数据的初次分析表明最好的实施制剂为“10Me-β-CD+CMC+PG”(9.4％的相对BA)和“20Me-β-CD”(7.8％的相对BA)。由于在30和240分钟的值升高，对包含20Me-β-CD的制剂的个体动物数据进行分析。发现这些值是一只作为高应答者的动物在30分钟时间点和另一只作为高应答者的动物在240分钟时间点的结果。另外，当分析“10Me-β-CD+CMC+PG”的个体结果时，暴露增加应归于一只高应答者动物。当除去该只动物之后，重新计算“10Me-β-CD+CMC+PG”制剂的结果，相对BA从9.4％的初始值降低至5.4％，其与其它制剂是相当的。
所述数据也显示出与第一PK研究一致的类似趋势，Me-β-CD从低水平(10mg/ml)增加至高水平(40mg/ml)，引起增加的相对BA(分别为4.8和6.1)、AUC最终(分别为133600和169800min*pg/ml)和Cmax(分别为2950、4190、2890pg/ml)。然而，中等水平剂量(20mg/ml)提供了最高水平的相对BA(7.8％)、AUC最终(216200min*pg/ml)和Cmax(4190pg/ml)。与该增加一致，所有的结果都显示出统计学上的类似。增加所述制剂的重量克分子渗透浓度则轻微增加相对BA(5.3vs.4.8％)、AUC最终(133600vs.146900min*pg/ml)和Cmax(2950vs.4530pg/ml)。该结果与对于作为制剂重量克分子渗透浓度的函数的体外渗透性所观察到的趋势形成对比。所述“EDTA+EtOH”制剂产生与“10mg/ml Me-β-CD”(4.8％相对BA)类似的卡贝缩宫素暴露。
体内数据的统计学分析表明所有制剂都与IM对照，在AUC最终和CmaxAUC最终和Cmax方面没有统计学差异。例如，组2、3、6和7的AUC最终的P值为1.0000，组4为0.8408，组5为0.9985和组8为0.4516。类似地，组2的Cmax的P值为0.9989，组3为0.8914，组4为0.9997，组5为0.9981，组6为0.9939，组7为0.9997和组8为0.9946。
将来自该第二体内PK研究的数据概述在表10中，并检查在该实施例3中公开的体外渗透性研究以找出体外-体内相关性(IVIVC)的可能性。当比较体内生物利用度和体外卡贝缩宫素渗透性的AUC最终(分别地，R2＝0.4939和0.4973)时，提示具有微小的相关性。在卡贝缩宫素的体内Cmax和体外渗透性之间观察到差的IVIVC(R2＝0.1185)。任何体内参数与体外渗透性之间相关性的缺乏表明体外观察到的渗透性对于在兔体内观察到的暴露是不完全可预测的。
在兔中，IM和IN给药所有试验制品制剂都是良好耐受的。在IM给药(组1)或IN给药(组2-8)之后，没有观察到不良的临床征兆。对于组1中的所有动物，在肌内给药后5分钟和1小时进行的注射部位的观察结果都是正常的。对于组2-8中的所有兔，在鼻内给药后5分钟和1小时进行的鼻腔观察结果都是正常的；在任一只兔鼻孔中都没有观察到相应制剂的鼻腔刺激和/或沉淀。
总之，如本文所公开的，注意到我们没有观察到体外结果和体内结果之间的显著相关性。在该研究中，我们采用卡贝缩宫素的体外试验对于体内获得的结果没有可预测性。
实施例4
大鼠中卡贝缩宫素和催产素的抗焦虑作用
如在Holmes，A.等人，Behav.Neurosci.115(5)：1129-44，2001中描述的，在大鼠中，使用高架十字迷宫试验来测定卡贝缩宫素和催产素的抗焦虑作用。另参见Sahuque，L.等人，Psychopharmacology 186(1)：122-132，Berl.，2006；Carvalho，M.C.等人，Braz.J.Med.Biol.Res.38(12)：1857-66，2005；和Langen，B.等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.314：717-724，2005。在该研究中，还包括一种已知的焦虑药物阿普唑仑。将从Charles River laboratories获得的六十只雄性6-10周龄的实验性幼稚大鼠(rat)分成六组，每组10只动物。遵照国家研究委员会(the National Research Council)的标准饲养所有的动物，并饲喂经检验的啮齿类饮食(Teklad，，Madison，WI)，随意饮水。将所有动物豢养在专用研究室中，给予12小时光照/12小时黑暗，RT 18至26℃，30-70％的湿度。在给药第一天之前，使研究动物适应它们豢养环境至少5天。给药途径包括脑室内(ICV)、腹膜内(IP)或肌内(IM)。
对于抗焦虑研究，向所有组注射施用包含在0.9％盐水溶液中的合适的API的制剂。阿普唑仑为口服溶液剂型，将阿普唑仑IntensolTM口服溶液(浓缩液)1mg/ml(每ml包含1mg阿普唑仑)在0.9％生理盐水中稀释至期望的浓度用于抗焦虑研究。所述阿普唑仑不含乙醇，且包含下述非活性成分：丙二醇、琥珀酸、琥珀酸二钠盐和水。将用API的动物处理组及其在制剂中的浓度显示在表11中。
表11
组分配和剂量水平
  组  途经  治疗API  剂量  (mg/kg)  体积  (mL/kg)  浓度  (mg/ml)  1  ICV  赋形剂(vehicle)  0  0.03  0  2  IP  阿普唑仑  0.5  5  0.1  3  ICV  催产素  0.05  0.03  1.7  4  IM  催产素  1.0  0.2  5  5  ICV  卡贝缩宫素  0.25  0.03  8.3  6  IM  卡贝缩宫素  5  0.2  25

将给药制剂一次性推注施用于每只大鼠。在ICV给药组中，通过已经植入ICV套管中的口，将试验剂量给药进入侧脑室。在ICV后20分钟以及在IM和IP之后30分钟，进行试验。从饲养笼放出后，立即在所述迷宫中试验动物15分钟。
所述高架十字迷宫由具有4个臂的平台组成，其中两个开臂和两个闭臂(有开顶的围成的50x10x50cm)。每次试验大鼠两只，用手放置在两个分开的迷宫的平台中心，4个臂的十字路口，面向一个开臂。在十五分钟之后，留置第一只大鼠几秒，直到完成第二只大鼠的十五分钟。遥控监测大鼠。
在每只大鼠试验之前，打扫所述高架十字迷宫表面和闭侧。用戴手套的手处理大鼠。从饲养笼移走至开始试验的时间少于15秒。从饲养笼中轻轻地移出大鼠，放置在开臂和闭臂之间的中央方格上，面向相反的开臂。使大鼠远离实验者。实验者离开所述迷宫，到大鼠看不见的区域，并经由电视监视器观察大鼠。在试验结束时，停止记录器，从迷宫中移出大鼠。
在开臂花费的时间表示低焦虑，而在闭臂花费的时间表示较高焦虑。评估大鼠在开臂探索花费的时间(开时间)、在闭臂探索花费的时间(闭时间)，并根据在开臂探索花费的时间百分数([在开臂花费的时间/(在开臂花费的时间+在闭臂花费的时间)×100])(开时间％)；在开臂探索花费的绝对时间；和进入开臂的百分数([进入开臂的次数/(进入开臂的次数+进入闭臂的次数)]×100)进行评分。使用进入所有臂的次数作为全部运动活动的量度。使用单向ANOVA然后进行合适的事后比较检验(post-hoc test，Bonferroni/Dunnets)比较该得分与赋形剂对照和基准值，p＜0.05被认为是统计学显著的。抗焦虑研究的结果显示在表12中。
表12
抗焦虑研究的迷宫时间结果
  组  途径  处理  开时间  闭时间  开时间(％)  SD  1  ICV  赋形剂  38.78  124.41  24  13.5  2  IP  阿普唑仑  46.07  116.55  27.9  25  3  ICV  催产素  17.89  158.42  11.3  31  4  IM  催产素  14.54  159.47  8.6  11.1  5  ICV  卡贝缩宫素  64.68  113.49  36  36.6  6  IM  卡贝缩宫素  34.31  117.57  23.6  14.3

在开臂探索花费的时间(开时间)和开臂探索花费的时间％(开时间％)的结果表明，在使用高架十字迷宫试验中，与催产素相比，ICV给药大鼠卡贝缩宫素降低了焦虑。
实施例5
卡贝缩宫素鼻喷雾剂的制备
通过将下述成分(按顺序)加入灭菌冲洗用水或纯净水中制备卡贝缩宫素鼻喷雾剂：L-精氨酸盐酸盐(L-arginine hydrochloride)，依地酸二钠(EDTA)，甲基-β-环糊精(M-β-CD)，氯化钠(NaCl)，和氯代丁醇(CB)。搅拌各个成分，直到获得目测确认的溶解。除了M-β-CD和CB之外的所有成分在10min或更少的时间内获得溶解。如有必要，一旦溶解所有的成分，用氢氧化钠或盐酸调节pH至4.0±0.3。用灭菌冲洗用水或纯净水使溶液达到体积(目标重量)，以制备出卡贝缩宫素鼻喷雾剂的“稀释剂”。然后，将合适量的卡贝缩宫素溶于～85％的所述稀释剂中，用稀释剂达到体积(目标重量)以制备卡贝缩宫素鼻喷雾剂，如有必要，用氢氧化钠或盐酸调节pH。
所述卡贝缩宫素鼻喷雾剂的可能包装组件的说明显示在表13中。
表13
用于卡贝缩宫素鼻喷雾剂的包装组件

将卡贝缩宫素鼻喷雾剂贮存在5℃。卡贝缩宫素鼻喷雾剂的贮存期限为在5℃至少9个月，预期在在5℃和在25℃稳定期超过2年。
实施例6
卡贝缩宫素鼻喷雾剂的稳定性
卡贝缩宫素IN制剂的稳定性
进行稳定性研究，以鉴定已经证明增加卡贝缩宫素渗透性的卡贝缩宫素制剂的稳定性。所有的制剂包含终浓度10mg/ml的卡贝缩宫素。试验制剂显示在表14中。
表14
稳定性研究中的试验制剂
  #  卡贝缩宫  素  (mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  DDPC  (mg/ml)  NaCl  (mM)  山梨糖  醇  (mM)  精氨酸  mM)  氯代丁醇  (mg/mL)  pH  1  10  40  5  0  40  0  10  5  4.5  2  10  0  2.5  0  0  131  0  5  4  3  10  30  2  1  70  0  10  0  4

在温度5℃、25℃和40℃，在第1天、4天、2周、1个月、2个月、3个月和6个月的时间点，收集下述数据：外观、pH、重量克分子渗透浓度、肽含量、纯度和氯代丁醇含量。
结果概述：
在5℃：在冷藏条件下，外观、pH、重量克分子渗透浓度、肽含量、纯度和氯代丁醇含量没有显著地改变。所有的样品保持澄清。t＝0时，总肽杂质为1.0-1.1％，t＝6个月时，其为1.1-1.3％。
在25℃：在25℃，外观、pH、重量克分子渗透浓度、肽含量和氯代丁醇含量没有显著地改变。对于pH 4.5的制剂(1号)，观察到总肽杂质稍微增加，达到1.9％，对于pH 4.0制剂(2、3号)，达到2.9-3.0％。
在40℃：所有的制剂保持澄清。在pH 4.5，制剂#1保持pH、肽含量和氯代丁醇含量。重量克分子渗透浓度从183增加至202mosm/kg H2O，增加～10％。在t＝6个月，制剂1号的总肽杂质增加至5.7％，这在所有样品中最小，氯代丁醇含量和肽含量没有显著地变化。在pH 4.0，制剂#2号显示出最大的变化，pH改变约-0.4pH单位(pH 4.0至3.6)，重量克分子渗透浓度增加约20％(197至239mOsm/kg H2O)，总肽杂质增加至17.5％。也在pH 4.0，制剂3号显示出pH从pH 4.1至4.2的一些微小变化，重量克分子渗透浓度增加26％(204至257mOsm/kg H2O)，总肽相关杂质增加至10.3％，肽含量似乎没有改变，而氯代丁醇含量稍微减少。
在25℃和40℃，制剂1号在所有时间点都具有最少的总肽杂质。基于25℃数据的预期提出在pH 4.5，制剂1号可具有＞4年的贮存期限(假定10％的总杂质)，并且在室温条件下，在pH 4.0，制剂2和3号可具有＞2年的贮存期限。
包含防腐剂的卡贝缩宫素IN制剂的稳定性
进行进一步的稳定性研究，以监测包含防腐剂的制剂的稳定性。将基本配方(不含防腐剂)列在表15中。所有的制剂包含3mg/ml的卡贝缩宫素。
表15
用于防腐剂稳定性研究的基本配方
  组#  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  精氨酸  (mM)  pH  张力调节剂  1  0  3.5  10  4.0  NaCl  2  10  3.5  10  4.0  NaCl  3  10  3.5  10  4.0  山梨糖醇  4  20  3.5  10  4.0  NaCl

采用下述不同的防腐剂系统制备各个制剂：单独的对羟苯甲酸甲酯/对羟苯甲酸丙酯(MP/PP)、氯代丁醇(CB)和苯甲醇(BA)及它们的组合。将试验的防腐剂水平显示在表16中：
表16
防腐剂水平和组合
  防腐剂  在制剂中的终浓度  试验组  MP/PP 1  0.33mg/mL MP/0.17mg/mL PP  1、2、3、4  CB 1  2.5mg/mL  1、2、3、4  CB 2  5mg/mL  1、2、3、4  MP/PP 1+CB2  0.33mg/mL MP，0.17mg/mL PP，5mg/mL  CB  1、2、3、4  MP/PP2+BA  2mg/mLMP，2mg/mLPP，5mg/mLBA  1、4

因此，制备总共18个活性制剂及其安慰剂。将得到的包含防腐剂的制剂显示在表17中。用星号标记仅包含5mg/ml的氯代丁醇作为防腐剂的制剂。
表17
用于稳定性研究的包含防腐剂的制剂
  #  组#  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  Arg  (mM)  pH  MP  (mg/ml)  PP  (mg/ml)  CB  (mg/ml)  BA  (mg/ml)  山梨  糖醇  (mM)  NaCl  (mM)  1  1  0  3.5  10  4.0  0.3  0.17  0  0  0  70.0  2  1  0  3.5  10  4.0  0  0  2.5  0  0  65.0  3*  1  0  3.5  10  4.0  0  0  5.0  0  0  57.0  4  1  0  3.5  10  4.0  0.3  0.17  5.0  0  0  55.0  5  1  0  3.5  10  4.0  2.0  2.00  0  5.0  0  25.0  6  2  10  3.5  10  4.0  0.3  0.17  0  0  0  65.0  7  2  10  3.5  10  4.0  0  0  2.5  0  0  60.0  8*  2  10  3.5  10  4.0  0  0  5.0  0  0  52.0  9  2  10  3.5  10  4.0  0.3  0.17  5.0  0  0  50.0  10  3  10  3.5  10  4.0  0.3  0.17  0  0  130.0  0  11  3  10  3.5  10  4.0  0  0  2.5  0  120.0  0  12*  3  10  3.5  10  4.0  0  0  5.0  0  104.0  0  13  3  10  3.5  10  4.0  0.3  0.17  5.0  0  100.0  0  14  4  20  3.5  10  4.0  0.3  0.17  0  0  0  60.0

  #  组#  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  Arg  (mM)  pH  MP  (mg/ml)  PP  (mg/ml)  CB  (mg/ml)  BA  (mg/ml)  山梨  糖醇  (mM)  NaCl  (mM)  15  4  20  3.5  10  4.0  0  0  2.5  0  0  55.0  16*  4  20  3.5  10  4.0  0  0  5.0  0  0  50.0  17  4  20  3.5  10  4.0  0.3  0.17  5.0  0  0  47.0  18  4  20  3.5  10  4.0  2.0  2.00  0  5.0  0  20.0

收集在温度5℃、25℃和40℃和时间点0天、2周、1个月、1.5个月、2个月、3个月和6个月的下述数据：外观、pH、重量克分子渗透浓度、肽含量和纯度。
结果概述：
在5℃：除了一个例外，其余所有的制剂保持澄清。制剂18号(含有MP/PP/BA)在t＝3和6个月含有沉淀物。所有的制剂保持pH、重量克分子渗透浓度、肽含量和纯度至t＝6个月。在t＝6个月的总杂质为1.2％至1.3％。
在25℃：除了一个例外，其余所有的制剂保持澄清。制剂18号(含有MP/PP/BA)在t＝3和6个月含有沉淀物。所有的制剂保持pH、重量克分子渗透浓度和肽含量至t＝6个月。在t＝6个月的总杂质稍微增加至3.1-3.9％。
在40℃：所有的制剂保持澄清。在t＝2个月，一些制剂开始显示出pH移动-0.1个pH单位，除了含有2.5mg/ml CB的制剂或含有20mg/ml Me-β-CD的制剂之外。重量克分子渗透浓度没有显著地增加。对于一些制剂，在t＝2个月，肽含量稍微降低(96.2-103.1％的肽含量)。与上述在pH 4.0的制剂类似，总肽相关杂质增加到5.0-7.2％(表12)。
基于40℃的数据，含有MP/PP防腐剂系统的制剂似乎具有最好的稳定性，而含有5mg/ml CB的制剂和含有MP/PP/CB组合的制剂具有最差的稳定性。不过，基于收集的数据，在该研究中具有最低稳定性的IN制剂将具有在5℃＞2年的贮存期限，和在室温≥1.5年的贮存期限。
缓冲剂和pH范围对卡贝缩宫素IN制剂的稳定性
进行进一步的研究，以监测pH范围为3-10的卡贝缩宫素制剂的稳定性。所有的制剂包含在等渗的NaCl中的10mM缓冲剂中的2mg/ml卡贝缩宫素。将试验制剂显示在表18中。收集在温度25℃、40℃和50℃和时间点0天、2周、1个月、1.5个月、2个月和3个月的下述数据：pH、重量克分子渗透浓度、外观、卡贝缩宫素含量和纯度(HPLC)。
表18
在pH稳定性研究中试验制剂
  #  制剂pH  缓冲剂  缓冲剂的pKa  1  3.0  柠檬酸盐  3.12(pK1)  2  3.0  酒石酸盐  2.96(pK1)  3  3.5  柠檬酸盐  3.12(pK1)  4  3.5  酒石酸盐  2.96(pK1)  5  4.0  乙酸盐  4.74  6  4.0  柠檬酸盐  4.76(pK2)  7  4.5  乙酸盐  4.74  8  4.5  柠檬酸盐  4.76(pK2)  9  5.0  乙酸盐  4.74  10  5.0  柠檬酸盐  4.76(pK2)  11  6.0  柠檬酸盐  6.40(pK3)  12  6.0  磷酸盐  7.10(pK2)  13  7.0  柠檬酸盐  6.40(pK3)  14  7.0  磷酸盐  7.10(pK2)  15  8.0  磷酸盐  7.10(pK2)  16  9.0  精氨酸  9.09(pK2)  17  10.0  精氨酸  9.09(pK2)

结果概述：
在25℃：在所有的时间点，所有的制剂保持澄清，并保持pH和重量克分子渗透浓度。在pH范围的端值处，总肽相关杂质增加。最好的肽纯度保持在pH 4.5至6.0(在t＝3个月，总肽相关杂质为1.1至1.4％)。在t＝3个月，在pH 4.0，肽纯度增加至2.2％。肽含量有类似的趋势。缓冲剂类型也有助于肽的稳定性；缓冲剂的电离位点越少，卡贝缩宫素的稳定性越好(即，稳定性趋势如下：乙酸盐＞酒石酸盐＞柠檬酸盐＞磷酸盐)。
在40℃：所有的制剂保持澄清。在t＝1个月，低于pH 7的制剂保持好的pH，而高于pH 7的制剂显示出明显的移动(＞0.2个pH单位)。在试验的时间点，重量克分子渗透浓度保持不变。最好的肽纯度保持在pH 5.0(在t＝3个月，1.9-2.1％的总肽相关杂质)。在50℃，关于pH和缓冲剂对肽纯度的作用，观察到与在25℃看到的趋势类似。
在50℃：所有的制剂保持澄清。在t＝1个月，低于pH 7的制剂保持pH较好，而高于pH 7的制剂显示出明显的移动(＞0.2个pH单位)。在试验的时间点，重量克分子渗透浓度保持不变。最好的肽纯度保持在pH 5.0(在t＝1.5个月，2.9-3.1％的总肽相关杂质)。在40℃，关于pH和缓冲剂对肽纯度的作用，观察到如在25℃看到的类似趋势。
图2显示了pH稳定性研究中的总肽相关杂质。最好的肽纯度保持在pH4.5至6.0。肽含量具有类似的趋势。缓冲剂类型也有助于肽的稳定性；缓冲剂的电离位点越少，卡贝缩宫素的稳定性越好(即，稳定性趋势如下：在乙酸盐中的稳定性＞在酒石酸盐中的稳定性＞在柠檬酸盐中的稳定性＞在磷酸盐中的稳定性)。
(巧特欣)稳定性
将贮存在5℃、25℃和40℃的1ml安瓿(市售)中。收集在0天、2个月、3个月、6个月、12个月和24个月时间点的下述数据：pH、重量克分子渗透浓度、外观和肽含量及纯度(HPLC)。
在25和40℃下，观察到中的pH保持恒定长达6个月(在25℃，在t＝0，pH 4.2，在t＝6个月，pH 4.2)。观察稳定性达1年；制剂pH仅仅有微小变化(在25℃，在t＝0，pH 4.2，在t＝12个月，pH 4.4)，并且在5℃，保持未改变。重量克分子渗透浓度和外观达12个月没有变化。在t＝6个月，在25℃下，总肽相关杂质从最初1.2％稍微增加至2.5％，在40℃下，增加至4.6％；在12个月，在25℃下，增加至3.4％，在40℃下，增加至4.6％。在50℃下，总杂质保持不变12个月。
卡贝缩宫素IN制剂的稳定性
在5℃、25℃和40℃，和在1个月、2个月、3个月和6个月时间点，测定在表19中显示的IN卡贝缩宫素制剂的稳定性：外观、pH、重量克分子渗透浓度、肽含量、纯度和氯代丁醇含量。所有的组都包含10mM精氨酸。组2-8包含5mg/ml的氯代丁醇。组8包含CMC LV＝羧甲基纤维素钠(低粘度，10-50cps)和PG＝丙二醇。
表19
用于IN卡贝缩宫素稳定性研究的制剂
  #  卡贝缩宫  素  (mg/ml)  Me-β-  CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  CMCLV  (mg/mL)  山梨  糖醇  (mM)  NaCl  (mM)  EtOH  (mg/ml)  PG  (mg/ml)  pH  2  4  10  3.5  0  0  52  0  0  4.0

  #  卡贝缩宫  素  (mg/ml)  Me-β-  CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  CMCLV  (mg/mL)  山梨  糖醇  (mM)  NaCl  (mM)  EtOH  (mg/ml)  PG  (mg/ml)  pH  3  4  10  3.5  0  104  0  0  0  4.0  4  4  20  3.5  0  0  50  0  0  4.0  5  4  40  3.5  0  0  40  0  0  4.0  6  4  10  3.5  0  0  86  0  0  4.0  7  4  0  3.75  0  0  50  2  0  4.0  8  4  10  3.5  1.0  0  0  0  10  4.0

结果概述：
在5℃：迄今为止，所有的制剂都保持澄清。所有的制剂保持pH和重量克分子渗透浓度至t＝6个月。
在25℃：迄今为止，所有的制剂都保持澄清。所有的制剂保持pH和重量克分子渗透浓度至t＝6个月。在t＝6个月，总杂质稍微增加至2.8-3.3％。所有的制剂表现类似。
在40℃：所有的制剂保持澄清。在t＝3个月，一些制剂开始显示出pH移动±0.1个pH单位。在t＝3个月，重量克分子渗透浓度没有显著地增加。在t＝2个月，一些制剂的肽含量稍微降低(97.4-102.1％的肽含量)。在t＝3个月，没有检测到含量降低。在t＝3个月，总肽相关杂质增加至6.8-9.1％，类似于包含防腐剂的研究中在pH 4.0的制剂，或比其更好(表17)。
卡贝缩宫素IN制剂的光稳定性
测定卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂在琥珀色和透明玻璃非硅烷化的小瓶中的光稳定性(即光和能量暴露)。使卡贝缩宫素鼻喷雾剂样品接受至少1.2百万勒克司小时和总共不少于200瓦时/m2光强的近紫外能量。用纯度-指示HPLC测定法来测定该暴露的影响。将在光稳定性研究中试验的制剂显示在表20中。
表20
在光稳定性研究中试验的制剂
  组#  卡贝缩宫素  (mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  精氨酸  (mM)  NaCl  (mM)  CB  (mg/ml)  pH  1  0  10  3.5  10  52  5  4.0  2  1.5  10  3.5  10  52  5  4.0  3  3.0  10  3.5  10  52  5  4.0  4  5.0  10  3.5  10  52  5  4.0

通过“日照试验”评价光对“市售”结构(configuration)和水平(测向)位置的产品的作用。样品暴露不少于1.2百万勒克司小时和总共非紫外能量200瓦时/平方米。在暴露于“1X ICH光”条件之后，从阳光盒中移出样品，使其平衡至室温条件，之后进行试验。对于各个制剂，评价5个子样品(A-E)，如在表21中所述。
表21
光稳定性子样品组
  子样品  描述  A  2.0mL，装在透明的、非-硅烷化的3-cc小瓶中  B  2.0mL，装在透明的、非-硅烷化的3-cc小瓶中，用箔盖住  C  2.0mL，装在琥珀色的、非-硅烷化的3-cc小瓶中  D  2.0mL，装在琥珀色的、非-硅烷化的3-cc小瓶中，用箔盖住  E  未处理的对照(没有放置在光箱中)，2.0mL，装在透明的、非硅烷化的3-cc  小瓶中

结果概述：
在不同的条件下光暴露后，肽和氯代丁醇含量没有改变。在试验后，所有样品的总肽相关杂质为1.2-1.7％。对于所有的制剂，未处理的对照样品(E)具有1.2-1.3％的总杂质。样品B、C、D相对于所有样品的对照(E)，没有显示出总杂质的变化，然而，样品A(在透明小瓶中)显示总杂质稍微增加至1.5-1.7％。
临床卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂的稳定性
如在实施例5中描述的那样制备卡贝缩宫素鼻喷雾剂。卡贝缩宫素鼻喷雾剂的结构为2ml，装入3cc透明1-型U-Save玻璃瓶中，该玻璃瓶具有trifoil衬里的聚丙烯帽。配制所述产品，装入瓶子中并盖帽，贮存在不同温度条件下不同的时间，以研究卡贝缩宫素的浓度和纯度(HPLC)、氯代丁醇浓度(HPLC)和制剂的pH、外观及重量克分子渗透浓度的变化。将试验制剂显示在表22中。对于5℃/环境RH、25℃/60％RH和40℃/75％RH，稳定性试验进度表包括1个月和2个月的试验。
表22
临床卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂
  组分  #1：  #2：  #3：  #4：  安慰剂

  组分  #1：  #2：  #3：  #4：  安慰剂  卡贝缩宫素(mg/mL)  1.5  3.0  5.0  0  甲基-β-环糊精  (Cavasol W7M Pharma)(mg/mL)  10  10  10  10  依地酸二钠，USP(mg/mL)  3.5  3.5  3.5  3.5  L-精氨酸盐酸盐()，USP(mM)  10  10  10  10  氯化钠，USP(mM)  52  52  52  52  氯代丁醇(无水)，NF(mg/mL)  5.0  5.0  5.0  5.0  10％的稀盐酸，NF(mg/mL)  TAP  TAP  TAP  TAP  氢氧化钠，NF(mg/mL)  TAP  TAP  TAP  TAP  Nastech纯净水  qs  qs  qs  qs  目标pH  4.0  4.0  4.0  4.0

结果概述：
在t＝6个月，制剂表现为与之前包含防腐剂的稳定性研究(表17)和卡贝缩宫素IN制剂稳定性研究(表19)中的类似制剂相当，或比其更好。在25℃，总杂质的范围为2.7-3.4％。在40℃，总杂质的范围为6.4-8.7％。将HPLC数据的概述显示在表23中。
表23
临床卡贝缩宫素鼻喷雾剂的HPLC数据

实施例7
卡贝缩宫素制剂的增强性辅剂
测定辅剂浓度的变化，以测定体外对卡贝缩宫素渗透性、MTT和LDH的影响。变化下述辅剂：CMC LV、CMC MV、EtOH。调节氯化钠浓度以保持重量克分子渗透浓度在～200mOsm/kg H2O。
根据初步的渗透性结果选择Me-β-CD(20mg/ml)、EDTA(3.5mg/ml)和精氨酸(10mM)的浓度，所述初步的渗透性结果表明当其它辅剂保持恒定时，相对于10mg/ml的Me-β-CD，20mg/ml的Me-β-CD产生稍微改善的渗透性。根据稳定性数据，将DOE制剂的pH设定在pH 4.5，所述稳定性数据表明卡贝缩宫素在pH 4.5比在pH 4.0更稳定。每个制剂包含4mg/ml的卡贝缩宫素，装载体积为25uL。将在该研究中试验的制剂显示在表24中。
表24
卡贝缩宫素制剂

结果表明所有的试验制剂均降低TER(＞90％)，所有的制剂均获得＞80％的MTT，所有的制剂均获得＜20％百分数的LDH(顶部和底侧的LDH)。渗透性结果表明EtOH正性地影响渗透性。样品#4(不含EtOH)具有最低的渗透性(0.73mg/ml EtOH)，约为3％。样品2、5和6(所有的都包含＞4.0mg/ml的EtOH)显示出渗透性增加，＞8％。加入CMC-LV，没有观察到渗透性结果的显著性差异。
进行第二研究，以测定辅剂浓度变化的影响。变化下述辅剂：CMC-MV、HPMC和EtOH。调节氯化钠浓度以保持重量克分子渗透浓度为～200mOsm/kg H2O。基于之前研究预测的最好制剂设定CMC-MV和EtOH的浓度，其预测CMC-MV为1.8mg/ml和EtOH为3.3mg/ml。本文使用中心复合DOE，其设定这两种辅剂在DOE软件预测的最佳值的中心点。对于HPMC和EtOH试验，使用稍微宽范围的EtOH浓度，HPMC浓度基于中心复合设计的中心点3.0mg/ml。
每个制剂包含4mg/ml的卡贝缩宫素，装载体积为25uL。测试所有样品的LDH、MTT、TER降低和卡贝缩宫素渗透性。将试验制剂显示在表25中。
表25
卡贝缩宫素制剂(第二研究)


结果表明所有的试验制剂都导致TER降低(＞90％)。所有的制剂均获得＞80％MTT。对于顶部测定，制剂显示的％LDH值为约4％至约39％。样品1-6、9、11-14、16、17、19具有少于20％的LDH。样品7、8、10和15具有～20％的LDH值。样品18和20具有的％LDH值分别为33％和39％。对于底侧的样品测定，所有的制剂均获得～0％的LDH。
对于EtOH、CMC MV和HPMC的所有试验组合，样品1-20显示出相对高的渗透性(＞20％)。将渗透性结果显示在表26中。
表26
渗透性结果
  样品  平均％渗透性  ％标准偏差  1  45.3  14.1  2  39.9  5.5  3  26.9  3.0  4  21.4  6.8  5  28.8  11.1  6  21.5  6.7  7  22.9  6.5  8  26.2  10.7  9  20.7  3.8  10  18.3  5.9

  样品  平均％渗透性  ％标准偏差  11  22.6  5.9  12  52.4  3.1  13  32.8  5.4  14  39.8  15.1  15  24.8  10.7  16  25.3  2.4  17  27.0  13.5  18  18.7  5.9  19  27.2  16.5  20  21.2  3.2  21  13.3  4.3  22  32.6  5.6  23  20.0  3.2  24  超出范围  超出范围

实施例8
第一人临床卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂的药代动力学研究
用于在人临床研究中评价的包含不同浓度的卡贝缩宫素的鼻喷雾剂给药制剂公开在实施例6、表22中。在该实施例中，给药第一(1期)临床研究的志愿者人受试者相关制剂，如在表31中所列出的。
在开始第一人临床研究之前，我们根据美国(即USP)和欧洲(EP)的抗微生物试验标准测试了包含防腐剂的IN卡贝缩宫素制剂。将USP抗微生物有效性试验(AET)要求显示在表27中，试验结果显示在表28中。将EP抗微生物有效性试验(AET)要求显示在表29中，试验结果显示在表30中。
表27
USP试验要求

表28
USPAET的结果

对羟苯甲酸甲酯(MP)，对羟苯甲酸丙酯(PP)，和氯代丁醇(CB)，和苯甲醇(BA)
表30中列出的数据显示出包含一种或多种防腐剂的制剂符合AET的USP标准。
表29
EPAET试验要求

表30
EPAET的结果

表30中列出的数据显示出包含防腐剂组合的两个制剂符合AET的EP标准。
在进一步的研究中，我们使用气管/支气管上皮细胞膜系统(EpiAirway，MatTek Corp.，Ashland，MA)，如在实施例1中给出的，评价在表27和30中列出的包含防腐剂的制剂降低跨上皮电阻(TER)的能力以及其对细胞生存力、细胞毒性和渗透性的影响。
来自该上皮细胞体外研究的结果表明所有的制剂显著地降低TER，具有高水平的细胞生存力、低水平的细胞毒性和约20％至约44％的卡贝缩宫素渗透性水平。例如，包含MP/PP/Me-β-CD(10mg/ml)的制剂提供约22％的渗透性。在Me-β-CD(10mg/ml)的存在下，包含高和低浓度的CB的制剂提供约44％的渗透性，而MP/PP/CB/Me-β-CD的组合(10mg/ml)提供约24％的渗透性。在不含Me-β-CD或在20mg/ml Me-β-CD的存在下，包含MP/PP的制剂提供的渗透性水平为约24％。在该实验中，阴性对照显示出非常低水平的渗透性(约1.5％)。来自该实验的数据表明使用体外EpiAirway模型系统，包含CB的制剂提供最好的卡贝缩宫素的渗透性。
基于在实施例2中给出的第一体内兔PK研究以及来自AET试验(表28和30)及渗透性实验的结果，制备在表31中给出的制剂，并将其用于我们的第一人临床研究(1期)。
表31
人临床鼻喷雾剂卡贝缩宫素制剂

在该人临床研究(交叉组，剂量逐步升高)中，施用于12名健康人受试者(18-65岁)(单剂量)三种强度(150、300和500μg/剂量)的卡贝缩宫素的鼻内(IN)制剂，并与肌肉注射(IM)施用50μg剂量的相比较。在t＝0(预剂量)和给药后6小时，按时采集血样。IN和IM卡贝缩宫素的PK分布图显示在图3中。明显地，如图3所示，IN施用卡贝缩宫素制剂证实了系统检测血浆中卡贝缩宫素的剂量反应，Cmax和AUC最终都增加(参见表32)。而且，也观察到变化性(如由变异系数(％CV)描述的)随着药物吸收的增加而降低。在该实验中，500μg剂量的生物利用度(BA)为7.0％。出人意料地，这样的％BA大于在我们的第一兔(即临床前)PK研究中检测的3-5％BA。
表32
人给药IN卡贝缩宫素的PK参数(％CV显示在括号中)
  剂量  AUC最终  (min*pg/ml)  Cmax  (pg/ml)  Tmax  (min)  T1/2  (min)  Kel  (1/min)  生物利用度  50μg IM  64000(17)  930(19)  24(54)  35(22)  0.02(24)  150μg IN  12000(79)  320(89)  38(175)  33(83)  0.03(50)  6(74)  300μg IN  15000(75)  430(60)  10(47)  46(79)  0.03(69)  4(68)  500μg IN  43000(63)  740(40)  18.6(79)  42(56)  0.02(43)  7(72)

在进一步的研究中，评价施用于人受试者的IN给药制剂在5℃、25℃和40℃的稳定性，表明预期这样的制剂提供在冷冻条件下2年的贮存期限。经6个月的时间期间，检测在5℃、25℃或40℃，外观、pH或重量克分子渗透浓度没有变化。数据表明，在冷冻和环境条件(即，分别为5℃和25℃)下，卡贝缩宫素超过在6个月的时间期间保持稳定。在6个月的时间点，在冷冻条件下，总杂质增加约0.2％，在环境条件下，增加约1.2％(即，在t＝0的％杂质)。对于贮存在40℃的样品，总杂质显著地增加(6-9％)。另外，表明卡贝缩宫素稳定性随着卡贝缩宫素的浓度增加而增加。
实施例9
兔PK研究3，改善的卡贝缩宫素生物利用度
在该实施例中，试验评价用于贮存稳定性改善的制剂用于改善体内卡贝缩宫素BA的能力。此处提供的结果是意想不到的，显示出随着pH增加(从pH 4.0增加至4.5±0.3)、重量克分子渗透浓度增加(从约170mOsm/kg H2O至约220mOsm/kg H2O)和作为缓冲剂的乙酸盐的加入(加入以保持pH为约4.5±0.3)，卡贝缩宫素的体内生物利用度和化学稳定性增加。制剂的这一变化引起在兔血浆(即体内)生物利用度增大＞2倍(参见表33和图4)。这一结果是意想不到的，因为存在或不存在缓冲剂(即乙酸盐)以及pH的轻微改变(＜1-2个pH单位＝和重量克分子渗透浓度的轻微改变(约50mOsm/kg H2O)通常不影响鼻粘膜的药物吸收。缓冲剂和张力调节剂比如盐通常不认为是渗透促进剂(permeation enhancer)。
表33
兔PK研究3，卡贝缩宫素的生物利用度
  #  制剂  生物利用度(％)  2  1％Me-β-CD(第一临床制剂)  2.90  3  1％Me-β-CD+OPT  5.90  4  1％Me-β-CD+EtOH+OPT  5.81  5  1％Me-β-CD+0.1％CMC+OPT  6.16  6  2％Me-β-CD+EtOH+OPT  6.90  7  2％Me-β-CD  +EtOH+0.5％HPMC+OPT  7.97  8  2％Me-β-CD  +EtOH+0.5％CMC+OPT  6.04

OPT＝10mM乙酸盐缓冲控制试剂
在该实施例中，对八组兔施用表34中列出的制剂；组1接受30μg剂量的肌内(IM)卡贝缩宫素注射剂，而其余7组接受60μg剂量的鼻内(IN)卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂。组1的重量克分子渗透浓度为约350mOsm/kgH2O，组2的重量克分子渗透浓度为约180mOsm/kgH2O，组3至8的重量克分子渗透浓度为约215mOsm/kgH2O。
表34
在兔PK研究3中给药的制剂
  #  卡贝缩宫素  (mg/ml)  Me-β-  CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  HPMC  (mg/ml)  CMC LV  (mg/ml)  NaCl  (mM)  EtOH  (mg/ml)  PG  (mg/ml)  pH  1  0.03  0  0  0  0  150  0  0  7.0  2  4  10  3.5  0  0  52  0  0  4.0  3  4  10  3.5  0  0  70  0  0  4.5  4  4  10  3.5  0  0  0  6  0  4.5  5  4  10  3.5  0  1  0  0  10  4.5  6  4  20  3.5  0  0  0  6  0  4.5  7  4  20  3.5  5  0  0  6  0  4.5  8  4  20  3.5  0  5  0  6  0  4.5

所有的组包含10mM的精氨酸。
组2-8包含5mg/ml的氯代丁醇。
组3-8包含10mM的乙酸盐。
缩写：EDTA＝依地酸二钠，Me-β-CD＝任意的甲基-β-环糊精，CB＝氯代丁醇，PG＝丙二醇，CMCLV＝羧甲基纤维素钠(低粘度，10-50cps)，HPMC＝羟丙基甲基纤维素10cps，EtOH＝乙醇，NaCl＝氯化钠。
将来自第三兔PK研究的结果概述在表35中。简而言之，在该兔PK研究3中，组1代表对照肌内注射；组2代表我们的第一人临床研究使用的制剂。制剂3-5各自包含10mg/ml的Me-β-CD、3.5mg/ml的EDTA、10mM的精氨酸、10mM的乙酸盐缓冲剂(pH 4.5±0.3)，因此，其可以彼此直接比较，并且，在采用制剂3(其可以被认为是改良的第一人临床制剂)的情况下，可以看到测试pH、缓冲剂和重量克分子渗透浓度对生物利用度(BA)的作用。简而言之，pH增加到4.5和加入用于增加稳定性的乙酸盐缓冲剂，重量克分子渗透浓度也增加至200-250mOsm/kg H2O的目标。部分地评价制剂4，以证实EtOH对BA的影响，如在体外看到的渗透性改善以及如EtOH制剂w/oMe-β-CD之前表明的产生与包含Me-β-CD w/o EtOH的制剂类似的BA。在采用制剂#5的情况下，该方案是用来进一步证实CMC-LV对BA的影响。
制剂6-8号各自包含20的mg/ml Me-β-CD、3.5mg/ml的EDTA、10mM的精氨酸、10mM的乙酸盐缓冲剂(pH 4.5±0.3)，因此，其可以彼此直接比较。在采用制剂6号的情况下，基于在体外看到的渗透性改善和在兔PK研究1和2中观察到的结果，我们评价增加Me-β-CD对渗透性的影响。在该实验中，也可以直接将制剂6号与制剂4号比较。在制剂7号中，我们评价HPMC作为增粘剂的作用(如之前在体外试验的)。在制剂8号的情况下，我们评价CMC-LV作为增粘剂的作用(如之前体外试验)。
表35
兔药代动力学研究3的结果

如在表35中所示，只改进制剂的稳定性产生卡贝缩宫素暴露的最大变化，引起相对BA增加超过两倍(2.9vs.5.9％)。也可看到AUC最终(99300vs.201900min*pg/ml)和Cmax(1970vs.4140pg/ml)的两倍增加。将Me-β-CD从10mg/ml增加至20mg/ml和/或加入EtOH都不进一步使相对BA(5.9-6.9％)、AUC最终(198900-236400min*pg/ml)或Cmax(4270-5280pg/ml)增加至高于用单独的稳定性改进产生的水平。这些结果与相应的体外渗透性结果没有相关性(参见表36)。
表36
兔药代动力学研究3制剂的体外渗透性数据

TER结果用ohmx cm2表示
在该研究中，增粘剂对卡贝缩宫素渗透性的作用表明加入CMC至“20Me-β-CD+EtOH，opt”制剂稍微降低BA(含有CMC为6.0％vs.不含有CMC为6.9％)、AUC最终(206800vs.236400min*pg/ml)和Cmax(4090vs.5280pg/ml)。类似地，向“10Me-β-CD opt”制剂中加入CMC降低卡贝缩宫素的暴露。相反，含有HPMC的制剂产生最高的相对BA和AUC最终；“20Me-β-CD+EtOH+HPMC opt”的Cmax为第二，仅次于“Me-β-CD+EtOH opt”制剂。
表明制剂(10Me-β-CD+CMC+PG)具有改善的稳定性，且具有6.7％的相对BA。制剂“20Me-β-CD+EtOH+HPMC，opt”产生最高的相对BA(8.0％)和AUC最终(272800min*pg/ml)。然而，“20Me-β-CD+EtOH，opt”具有最高的Cmax(5280pg/ml)和与包含HPMC的制剂相当的相对BA(6.9％)及AUC最终(236400min*pg/ml)。这表明至少在该研究中，HPMC没有提供卡贝缩宫素暴露的大的增加。
进行所述数据的统计学分析来评价制剂性能的统计学差异。已测定，所有IN制剂与IM对照的AUC最终、Cmax和生物利用度没有统计学差异(参见表37)。
表37
在兔药代动力学研究3中IN制剂相对于IM对照的P值概述

对于该实验，制备25ml的各鼻内(IN)制剂。将所有的IN制剂以3x1ml等分试样贮存在1cc琥珀色玻璃瓶中。另外，还制备400ml的肌内(IM)制剂，并以3x3mL等分试样贮存在3cc透明玻璃瓶中。将所有的制剂贮存在2-8℃。
总之，该兔PK研究3的结果(参见图4)提供的生物利用度比所述OPT制剂增加2倍，可以表明加入HPMC提高性能。与在之前的兔PK研究中观察的5-6％相比，来自该兔PK研究3的数据表明卡贝缩宫素的BA为约9％。进一步，基于统计学分析，在该试验中的IN BA与从IM注射获得的BA没有显著差异。
将来自该第三体内PK研究的数据概述在表35中，并且检查表36中提供的相应体外渗透性研究的体外-体内相关性(IVIVC)的可能性。比较卡贝缩宫素的体内生物利用度、AUC最终或Cmax与其体外渗透性，没有观察到相关性(分别为R2＝0.0188，0.0203，0.0042)。这些PK参数中的任一个均缺乏相关性表明，体外观察的渗透性对于兔的体内暴露没有预测性。
总之，这样的数据引导我们提出用于第二人临床研究的制剂(参见表38)。
表38
用于人PK临床研究2的制剂

加入用于pH调节以符合目标pH4.5±0.3。*使用的平均MW为～1317-1359Da。
提议的人PK临床研究2的设计(例如，IM-比较、剂量范围)可以包括12名18-65岁的健康人受试者；处理组比如巧特欣(Duratocin)IM，24IU的催产素(Syntocin)，150、250和400μg/剂量的卡贝缩宫素IN。
由于与之前临床制剂相比，在体内看到AUC最终增加，因而选择命名为″10Me-β-CD，opt″的制剂。在此时用于临床评价时，不选择更复杂的制剂，因为统计分析表明另外的辅剂的作用不提供AUC或Cmax的显著差异的增加。尽管体内数据表明所述制剂“20Me-β-CD+EtOH+HPMC opt”可能具有更大的BA，但是由于缺乏体内数据的统计学显著性，因此此时不再继续该制剂，但其在随后研究中可非常好地被试验。
在该第二临床试验中，基于在表38中公开的制剂制备三种浓度的卡贝缩宫素，以提供150μg、250μg和400μg的卡贝缩宫素剂量。将用于PK分析卡贝缩宫素和催产素水平的患者血样收集在EDTA涂层的血液收集管中。立即加入抑酶肽，离心该样品以获得血浆样品。使用100μl致动器(actuator)，将卡贝缩宫素的鼻内(IN)制剂以三种强度(1.5、2.5和4.0mg/ml)剂量施用于12名健康的人受试者，和与给药肌内(IM)剂量的(卡贝缩宫素注射剂)相比较。也进行与商购可获得形式的鼻内催产素(Syntocinon)的另外的比较。在t＝0(预剂量)和6小时，定期采集血样。
IN卡贝缩宫素的PK分布图证实了剂量反应趋势；随着剂量增加，Cmax和AUC最终两者都增加(表39)。这是之前在本文公开的我们的第一临床研究中观察到的。150和400μg剂量的生物利用度相对于IM剂量为7％，而250μg剂量的生物利用度为6％。该生物利用度与之前在我们的第一临床研究中给药的卡贝缩宫素制剂的类似。
表39
第二临床研究的PK参数
  AUC最终(min*pg/ml)  Cmax(pg/ml) Tmax(min)  生物利用度  50μgIM  62049(23)  839(22) 23(26)  150μg  13697(121)  222(87) 15(47)  7  250μg  18113(46)  377(32) 18(46)  6  400μg  32500(95)  608(66) 13(39)  7

基于用于选择所评价制剂的兔PK研究(其显示兔PK研究的生物利用度相对于评价的第一临床制剂增加大于两倍)，描述的临床研究结果有些意想不到。在第二人研究中，该结果没有重复，反而观察到相当的生物利用度。值得注意的是在两次临床研究中IM对照剂量的AUC最终值非常好地相当(在第一研究中64000min*pg/ml vs.在第二研究中62049min*pg/ml)，表明数据的好的可靠性。
在正在进行的对照稳定性研究中评价在第二临床研究中评价的制剂稳定性。在IN制剂中卡贝缩宫素的早期稳定性结果表明，所述制剂甚至在40℃贮存两个月后仍非常稳定，而总杂质不超过2.5％，肽含量的变化不超过1％。
进一步，相对于在人临床研究1中试验的制剂，公开的改进制剂具有显著改善的稳定性，如在40℃贮存2个月之后，总杂质减少约一半。在40℃贮存2个月之后，在我们的第一人临床研究中使用的制剂具有约5％的总杂质，然而，相反，在40℃贮存2个月之后，所述改进的制剂具有约2.5％的总杂质。对于改进的制剂，在40℃贮存2个月之后，总杂质比在T＝0时检测到的增加约1.25％。所述增加的稳定性可能归因于pH增加。
为了该稳定性试验(改进的制剂)，放置14瓶所制备的制剂以测定稳定性。六瓶放置在5℃(包括三个额外瓶(extra))，四瓶放置在25℃(包括一个额外瓶)和四瓶放置在40℃(包括一个额外瓶)。用于测试而取出的每个样品的时间点定义为规定日期±3天(参见表40的取样时间表)。对于每个时间点，记录规定日期和实际取出日期(pull date)。在40℃的样品在3个月后和5℃和25℃的样品在6个月后，评价结果以确定所述研究是否继续进行另外的其它时间点：40℃的样品6个月，25℃的样品12个月，以及5℃的样品12、18或24个月。
按照取样时间表，在各个条件/时间点取样(即取出)一瓶，测量pH、重量克分子渗透浓度、透明度、肽含量和纯度(RP-HPLC)和氯代丁醇含量。如果在任何时间点，样品显示出可鉴定的物理不稳定性(即沉淀)，则记录，并且此时间点，只对样品进行透明度、pH和重量克分子渗透浓度试验。在所有预期的试验时间点，取出这样的样品。也按照相同的取样时间表，进行各个制剂的安慰剂的稳定性测定。目测检查安慰剂的外观，如果需要，可以用于HPLC检测。在所述评价的时间点，外观、pH、重量克分子渗透浓度、卡贝缩宫素或CB含量都没有改变。在5℃和25℃，总杂质保持恒定。
在该稳定性试验中，使用具有Orion 520Aplus pH计(Thermo ElectronCorp(USA))或等效物的Cole Parmer半微量NMR管玻璃pH探针(目录号：05990-30)测量pH。用来自Advanced Instruments Inc.(Norwood，MA)的Advanced Multichann el Osmometer，型号2020或等效物测量重量克分子渗透浓度。在测量每个样品前进行校准。通过目测检查确定透明度。
表40
用于稳定性试验的取样时间表
  时间点： 1个月 2个月 3个月  6个  月  5℃  (#取出的瓶号) 1 0 1  1  25℃  (#取出的瓶号) 1 0 1  1

  40℃  (#取出的瓶号)  1  1  1  0

更详细地，列出在该第二临床研究中评价制剂的稳定性数据(参见表38以及我们的第一临床研究(参见表31))。完成零时间点样品作为释放试验的一部分。在所述第二临床研究中评价的制剂改善的稳定性很可能提供可以制备的市售产品，其能够提供以“销售的”以及“使用中”形式室温贮藏达到两年。在多个实验中报道的一个非显而易见的结果是在25℃的物理稳定性与在5℃的相当。这是意想不到的，因为对于肽而言可能更期望稳定性随着贮存温度的降低而增加。将在该稳定性研究中评价的制剂显示在表41中。
表41
稳定性试验的卡贝缩宫素制剂
  #  卡贝缩宫  素(mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  HPMC  (mg/ml) CMC LV (mg/ml)  NaCl  (mM)  EtOH  (mg/ml)  PG  (mg/ml)  pH  2*  4  10  3.5  0 0  52  0  0  4.0  3**  4  10  3.5  0 0  70  0  0  4.5  4  4  10  3.5  0 0  0  6  0  4.5  5  4  10  3.5  0 1  0  0  10  4.5  6  4  20  3.5  0 0  0  6  0  4.5  7  4  20  3.5  5 0  0  6  0  4.5  8  4  20  3.5  0 5  0  6  0  4.5

*组2＝在临床研究#1中给药的制剂。
**组3＝在临床研究#2中给药的制剂。
所有的组都包含10mM的精氨酸。
组2-8包含5mg/ml的氯代丁醇。
组3-8包含10mM的乙酸盐。
缩写：EDTA＝依地酸二钠，Me-β-CD＝任意的甲基-β-环糊精，CB＝氯代丁醇，PG＝丙二醇，CMCLV＝羧甲基纤维素钠(低粘度，10-50cps)，HPMC＝羟丙基甲基纤维素10cps，EtOH＝乙醇，NaCl＝氯化钠。
从贮存中取出每种样品的时间点窗(基于在表40中提供的时间表)定义为规定日期±3天。对于每个时间点，记录规定日期和实际取出日期。在40℃的样品在3个月后和5℃和25℃的样品在6个月后，评价结果以确定所述研究是否继续进行另外的其它时间点：40℃的样品六个月，和25℃的样品12个月，以及5℃的样品12、18或24个月。对于该稳定性研究，使用具有Orion520Apluwas pH计(Thermo Electron Corp，USA)或等效物的Cole Parmer半微量NMR管玻璃pH探针(目录号：05990-30)测量样品的pH。用来自AdvancedInstruments Inc.(Norwood，MA)的Advanced Multichannel Osmometer，Model2020或等效物测量重量克分子渗透浓度。在测量样品前进行校准。通过目测观察来测量样品的透明度。通过HPLC分析测定纯度和含量。
将贮存在5℃、25℃和40℃的所有样品在达3个月的所有试验时间点的化学试验结果的概述以及通过其中数据可以产生足够的R2(＞0.7)的线性回归预测的预期未来值的概述分别显示在表42、43和44中。
在三个月的时间点，样品的pH和和重量克分子渗透浓度保持与t＝0时一致。与在冷冻条件下t＝0值显示出的优良稳定性相比，当贮存在5℃三个月时，所有的制剂显示出总杂质增加约＜0.1％。由于缺乏迄今为止收集的实际数据的有意义的斜率，使用线性回归不能预测预期的总杂质。
表42
样品在5℃贮存条件下的HPLC数据概述

*组2＝在临床研究#1)中给药的制剂
**组3＝在临床研究#2)中给药的制剂
对于在该稳定性研究中试验的所有制剂，相对于t＝0，贮存在5℃下三个月肽含量的损失(％标示量)为4％。更重要地，制剂3号(最新临床制剂)的肽含量的损失为在制剂2号(第一临床制剂)中看到的一半，表明第二临床制剂比第一临床制剂的稳定性具有显著改善。在贮存在25℃和40℃的样品中，进一步证实了稳定性的改善。而且，在最终产品中API含量的标准规格是80-120％标示量。通过线性回归预测第二临床制剂(组3)在5℃下2年(24个月)，具有89％的卡贝缩宫素标示量，其保持在规定之内，而第一临床制剂(组2)不可能达到保持所述规定2年的目标。氯代丁醇含量保持在1％的初始浓度之内，表明该化合物保持稳定。
对于在25℃的贮存条件下评价的样品，在三个月的时间点中pH和重量克分子渗透浓度保持与t＝0时一致。将代表纯度和含量的相应HPLC分析显示在表43中。数据显示贮存在25℃三个月，pH 4.5的制剂(样品3-8)中样品的％总杂质增加至多约0.6％，而对于制剂2号(第一临床制剂)，增加约为两倍(增加1.4％)。对25℃总杂质数据进行线性回归，除7号外的其它所有组产生的R2值≥0.8。在25℃贮存24个月之后，制剂2号的预测％总杂质为11.4％，其为制剂3号(目前的临床制剂)的预测％总杂质5.8％的两倍。这是第二临床制剂比第一临床制剂的稳定性改善的进一步证据。而且，预测在25℃2年之后的总杂质远低于10％，其是能够在室温下长期贮存的市售产品的可行的选择。
对于在25℃贮存三个月的样品，当与t＝0的值相比时，肽含量损失＜4％(％标示量)，表明良好的稳定性。明显地，这与贮存在冷冻条件下的肽含量结果非常类似，表明冷冻不显著地改善这些卡贝缩宫素制剂的物理稳定性。基于除了样品5的其它所有样品的具有R2值＞0.8的线性回归，贮存在25℃2年的预测肽含量值表明在该稳定性研究中，几乎所有的制剂都接近具有80％标示量的卡贝缩宫素。在冷冻和室温下的类似结果是意想不到的，因为贮存在低温下的大多数肽的稳定性得到改善。在这些稳定性研究中，在25℃的贮存条件下，氯代丁醇含量保持在初始浓度的1％内，表明该化合物保持稳定。
表43
样品在25℃贮存条件下的HPLC数据概述


*组2＝在临床研究#1中给药的制剂
**组3＝在临床研究#2中给药的制剂
对在40℃的贮存条件下的样品进行稳定性分析(参见表44)，尽管在三个月的时间点，重量克分子渗透浓度与t＝0时保持一致，但是对于贮存在40℃的所有样品，pH显著地降低。在该研究中，例如，对于所有的制剂，在三个月的时间点，观察到样品的pH降低0.1-0.3个pH单位。40℃的贮存条件可以被认为是室温(即25℃)贮存的加速温度条件。在40℃，制剂2号(第一临床制剂)的总杂质为6.3％，其为在制剂3号(第二临床制剂)中观察到的2.9％总杂质的两倍。在pH 4.5的所有制剂(样品3-8)表现出相对于在pH 4.0的制剂2号的稳定性具有显著的改善。另外，对于制剂2号，在12个月的预测总杂质(根据线性回归确定)差不多约为对于制剂3号所预测的2.5倍(分别为22％vs.9％总杂质)。
当在40℃贮存三个月时，与t＝0时的值相比，制剂2号的肽含量损失约8％。制剂3号中的该损失显著地少约4％。注意，制剂6和7号实际表现出浓度的显著增加。该作用很可能是由于当将样品贮存在40℃时，盖子松弛引起蒸发的结果。
表44
样品在40℃贮存条件下的HPLC数据概述

*组2＝在临床研究#1中给药的制剂
**组3＝在临床研究#2中给药的制剂
对与在表38中公开的制剂(如在我们的14天非临床毒性研究中所使用的)一致的非临床制剂，以两种卡贝缩宫素浓度(参见表45)进行随后的“长期”稳定性研究(在该实施例中的稳定性研究2)。评价贮存t＝0和t＝1、2和3个月时的样品。对于每种制剂，进行零时间试验作为释放试验的一部分。对于该研究，进行14瓶的稳定性检测：六瓶在5℃(包括三个额外瓶)、四瓶在25℃(包括一个额外瓶)和四瓶在40℃(包括一个额外瓶)。将从贮存中取出的每种样品的时间点窗定义为规定日期±3天。对于每个时间点，记录规定日期和实际取出日期。
按照取出时间表在每个条件/时间点取出一瓶，测量pH、重量克分子渗透浓度、透明度、肽含量和纯度(RP-HPLC)以及氯代丁醇含量。如果在任何时间点，样品显示出可鉴定的物理不稳定性(即沉淀)，记录在分析者的笔记本中，并且在此时间点，只对样品进行透明度、pH和重量克分子渗透浓度试验。从试验的所用未来时间点取出样品。在研究期间的任何时间点，可以停止任一种样品的稳定性研究。将终止的说明记录在笔记本中。使用来自STAB07072的安慰剂作为用于这些研究的比较物。目测检查安慰剂的外观，如果确定需要，则可以使用HPLC测试。
表45
长期稳定性研究的制剂
  制剂#  批号  卡贝缩  宫素  (mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  精氨  酸  (mM)  乙酸  盐  (mM)  NaCl  (mM)  CB  (mg/ml)  pH  NF-CARB07001-2.0  CTM07048  2  10  3.5  10  10  70  5  4.5  NF-CARB07001-4.0  CTM07050  4  10  3.5  10  10  70  5  4.5

缩写：EDTA＝依地酸二钠，Me-β-CD＝任意的甲基-β-环糊精，CB＝氯代丁醇，NaCl＝氯化钠。
来自该研究的数据表明在三个月的时间点，所有的样品保持透明无色。另外，在所有的贮存条件下，与t＝0相比，在t＝3个月，制剂pH和重量克分子渗透浓度值保持稳定。将这些数据分别概述在表46和47中。
表46
在长期贮存条件下的制剂pH测定
  样品  温度  t＝0  t＝1个月  t＝2个月  t＝3个月  NF-CARB07001-2.0  5  4.50  4.50  4.61  4.46  25  4.50  4.49  4.57  4.44  40  4.50  4.47  4.49  4.35  NF-CARB07001-4.0  5  4.60  4.57  4.64  4.52  25  4.60  4.57  4.63  4.52  40  4.60  4.55  4.56  4.43

表47
在长期贮存条件下的制剂重量克分子渗透浓度测定


在5、25和40℃贮存下，在该研究中的两种样品在所有贮存条件下达两个月时间点的HPLC测定的含量和纯度的概述可以分别在表48、49和50中找到。
表48
样品在5℃贮存条件下的HPLC结果的概述

表49
样品在25℃贮存条件下的HPLC结果的概述

表50
样品在40℃贮存条件下的HPLC结果的概述

贮存在25℃两个月的样品的总杂质增加为＜0.1％，在40℃为～1％，表明制剂在两种强度下优良的化学稳定性。甚至贮存在40℃下两个月的样品中肽含量(％标示量)降低＜1.5％，这对以下在对临床研究#2中评价的制剂所显示的稳定性研究中的意想不到的观察结果提供进一步证据：物理稳定性至少在早期时间点不受贮存温度的极大影响。
实施例10
在第一临床研究中所评价制剂的九个月稳定性研究
在该实施例中，评价在表22中列出的制剂在5、25和40℃的稳定性；所列出的数据涉及九个月的稳定性时间点。该研究的接受标准提供在表51中。简而言之，将51瓶各制剂用于初始(释放)试验和该稳定性研究。对于每个制剂，使用5瓶用于初始(释放)试验，24瓶用于在为长期贮存条件的5℃/环境湿度下直立贮存(其包括额外的4瓶)，14瓶用于在为加速稳定性贮存条件的25℃/60％RH下直立贮存(其包括额外的4瓶)，和8瓶用于在也为加速稳定性贮存条件的40℃/75％RH下直立贮存(其包括额外的2瓶)。
表51
第一临床制剂的稳定性评价的试验方法和接受标准
  试验 方法  活性批次的接受标准  安慰剂批次的接受标准  外观 目测  透明至微混浊的、无色的溶液  透明至微混浊的、无色的溶液  pH USP <791> SOP403  pH 3.5-4.5  pH 3.5-4.5  重量克分子渗透  浓度 SOP437 或 SOP4000  140-240mOsm/kg H2O  140-240mOsm/kg H2O  HPLC的卡贝缩宫  素鉴定 TM-0027  指定的活性峰值的保留时间相  当于参考标准的那些  ≤10μg/mL，与卡贝缩宫素标准具  有相同保留时间  HPLC的卡贝缩宫  素纯度 TM-0027  第十个小数位的报道结果  没有测定  HPLC的卡贝缩宫  素个体杂质 TM-0027  第十个小数位的报道结果  没有测定  HPLC的卡贝缩宫  素含量 TM-0027  卡贝缩宫素的80.0至120.0％标  示量  没有测定  HPLC的氯代丁醇  含量 TM-0027  氯代丁醇的80.0至120.0％标示  量  氯代丁醇的80.0至120.0％标示  量

  试验 方法  活性批次的接受标准  安慰剂批次的接受标准  微生物限度 USP<61>  总需氧量：  ≤100cfu/mL  总的混合霉菌和酵母量：≤50  cfu/mL  不存在：  -金黄色葡萄球菌  -铜绿假单胞菌  -大肠杆菌  -沙门氏菌  总需氧量：  ≤100cfu/mL  总的混合霉菌和酵母量：≤50  cfu/mL  不存在：  -金黄色葡萄球菌  -铜绿假单胞菌  -大肠杆菌  -沙门氏菌

将在我们的第一临床研究中所评价样品的九个月HPLC稳定性数据(参见实施例6，6个月时间点的表23)列在表52中。
表52
第一临床样品中九个月稳定性样品的概述

简而言之，在表52中列出的数据表明，当将制剂在5℃贮存九个月时，观察到总杂质从t＝0的值增加少于0.1％。该数据与相同制剂在贮存6个月时的预测值很好地一致。然而，肽含量被明显地改善。如该实施例所示，在九个月的贮存后，肽含量仅仅比t＝0时少3％，表明在5℃长期贮存的化学稳定性甚至比早期时间点(例如6个月)更好。
实施例11
在第二临床研究中所评价的制剂的两个月稳定性时间点
在该实施例中，将关于在表39中列出的四种浓度的如在表38中所示临床制剂(第二临床研究)的两个月稳定性数据显示在下表53中。
表53
用于临床研究2的九个月稳定性时间点的样品组
 #  制剂说明  制剂号  批号  批量 1  1.5mg/mL卡贝缩宫素  NF-CARB07001-1.5  CTM07056  92瓶 2  2.5mg/mL卡贝缩宫素  NF-CARB07001-2.5  CTM07058  92瓶 3  4.0mg/mL卡贝缩宫素  NF-CARB07001-4.0  CTM07061  92瓶 4  8.0mg/mL卡贝缩宫素  NF-CARB07001-8.0  CTM07053  66瓶 5  安慰剂  NF-CARB07001-PL  CTM07062  75瓶

如之前所述制备制剂。用2.0ml的卡贝缩宫素鼻喷雾剂-制剂1、2、3、4和5号装瓶-将各制剂装入至少五十五个3-cc非硅烷化1型螺帽透明玻璃瓶中用于稳定性目的。用trifoil衬里的聚丙烯帽给瓶子加盖。将物理和化学稳定性结果的概述显示在表54中。
表54
在t＝2个月对临床研究2样品的物理和化学试验


这些数据表明当与样品t＝0时的值相比，样品贮存在25℃2个月的肽含量损失(％标示量)不超过1％。对于所有样品，总杂质增加＜0.1％。证实了之前对于相同制剂得到的稳定性数据，表明稳定性可能比预期的更好。
实施例12
通过LC-MS分析鉴定热应力(thermal stress)诱导的卡贝缩宫素降解产物
在该实施例中，通过LC-MS分析鼻内递送的卡贝缩宫素制剂在加速条件(例如40-50℃)下产生的热应力诱导的降解产物的存在。该信息可用于预测市售卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂的贮存期限，和解释在正常情况(例如5-25℃)下出现的降解产物和降解途径。
因此，该实施例提供一系列通过分子量和相应的HPLC相对保留时间(RRT)(用于归类卡贝缩宫素HPLC样品杂质)鉴定的卡贝缩宫素降解产物。特别地，该信息将有助于鉴定存在于在临床和临床前研究中所评价卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂的稳定性试验中的降解产物。分析的制剂在表55、56和57中提供。
表55
分析的CARB-006样品
 CARB-00 #  卡贝缩  宫素  (mg/ml)  Me-β-CD  (mg/ml)  EDTA  (mg/ml)  DDPC  (mg/ml)  精氨  酸  (mM)  山梨糖  醇  (mM)  NaCl  (mM)  CB  (mg/ml)  pH  贮存温  度/时期 1  10  40  5.0  0  10  0  40  5  4.5  40℃/6M 2  10  0  2.5  0  0  131  0  5  4.0  40℃/6M 3  10  30  2.0  1.0  10  0  70  0  4.0  40℃/6M

缩写：DDPC＝二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱，EDTA＝依地酸二钠，Me-β-CD＝任意的甲基-β-环糊精，CB＝氯代丁醇。
表56
分析的CARB-013样品
  CARB-013  #  制剂pH  缓冲剂  缓冲剂pKa  贮存温度/时期  2*  3.0  酒石酸盐  2.96(pK1)  25℃/3M  3*  3.5  柠檬酸盐  3.12(pK1)  25℃/3M  4*  3.5  酒石酸盐  2.96(pK1)  25℃/3M  5*  4.0  乙酸盐  4.74  40℃/3M  6*  4.0  柠檬酸盐  4.76(pK2)  40℃/3M  13*  7.0  柠檬酸盐  6.40(pK3)  40℃/3M  14*  7.0  磷酸盐  7.10(pK2)  40℃/3M  15*  8.0  磷酸盐  7.10(pK2)  25℃/3M

*样品包含在10mM缓冲剂中的2mg/ml卡贝缩宫素和和等渗NaCl(138-141mM)
表57
分析的CARB-052样品
  试剂  等级  出售商  目录号  批号#  卡贝缩宫素  研究用  PPL  41004  105005-01  氯化钠  USP  Spectrum  SO155  QJ1142，UC0016  冰乙酸  USP  Spectrum  AC110  RF0177，TA0912  乙酸钠，无水  USP  Spectrum  SO104  UB1152

每次使用在UPLC仪器上的C18反相柱进行HPLC分析。MS分析参数：pos.，扫描方式100-1100amu范围，1.2秒/扫描。鉴定出12种卡贝缩宫素降解产物，归类为四种降解种类：氧化、脱酰胺、水解和API异构体。另外，观察到两种未归类的降解产物。
在1.16和1.23RRT的脱酰胺产物具有与天然卡贝缩宫素+1amu的差异(Δamu)，以最大的丰度存在。提议的卡贝缩宫素脱酰胺的可能位点包括天冬酰胺、谷氨酰胺残基和C末端胺。在RRT 0.22、0.24-0.25(水解产物，+18Δamu，图2)、0.57-0.59、0.73-0.74(氧化产物，+16Δamu)、0.92、0.95-0.96、1.08-1.09(API异构体，0Δamu)、0.78、1.18、1.26(脱酰胺产物，+1Δamu)和0.29、0.53(未归类的产物，+19Δamu)观察到可检测水平的其它降解产物。表VII概述了本节中讨论的RRT和Δamu结果。将观察到的降解产物概述在表59中。
表59
卡贝缩宫素制剂相关降解产物的概述
  脱酰胺  氧化  水解  API异构体  未归类的

 RRT  0.78、1.16、1.18、  1.23、1.26  0.57-0.59、  0.73-0.74  0.22、  0.24-0.25  0.92、0.95-0.96、  1.08-1.09  0.29、0.53 质量差异(Δ am μ)  +1  +16  +18  0  +19

根据在CARB-052中的各种pH和缓冲条件，检查热应力的影响。比较包含柠檬酸盐vs.乙酸盐的样品，这两种缓冲剂都未引起出现不同的降解产物。然而，在50℃，t＝1M(CARB-052-3和4)vs.40℃，t＝1M(CARB-052-1和2)的培养引起未归类的0.29RRT降解产物以及脱酰胺产物的水平提高。氧化以及另外的脱酰胺和水解产物在40℃，t＝11M样品(CARB-052-5和6)中存在，其在40℃和50℃，t＝1M样品中没有发现。而且，在t＝1、2和3M稳定性时间点，CARB-033、I期临床研究卡贝缩宫素鼻喷雾剂制剂CARB-011-3-XX和NF-CARB07001-XX显示出具有存在于所有样品中的主要水平的1.18RRT卡贝缩宫素脱酰胺产物。
虽然为清楚地理解，已经通过实施例对本发明前述内容进行了详细说明，但技术人员清楚，某些变化和修饰可以在所附的权利要求书的范围内实施，权利要求的提出是为说明而不是限制。将在本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利出版物、图、表和网址的全部内容明确地引入本文作为参考。
然而，应当指出，对于本文讨论的各种出版物仅仅引入它们在本申请的申请日之前的公开内容，本发明人保留有根据在先公开预期这样的公开内容的权利。
序列表
<110>纳斯泰克制药公司
<120>卡贝缩宫素鼻用制剂和治疗孤独症的方法
<130>00-03PCT2
<140>
<141>
<150>60/942,607
<151>2007-06-07
<160>3
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>1
Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly
  1               5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>2
Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly
  1               5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Tyr(Me)
<220>
<223>C末端酰胺化
<400>3
Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly
  1               5

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本发明提供用于预防和治疗孤独症谱系病症、相关病症和这种病症的症状的方法和组合物，所述组合物包含催产素或催产素类似物比如卡贝缩宫素。本发明的方法和组合物可有效地治疗社会退缩、目光接触回避、重复性行为、焦虑、注意力缺陷、多动、抑郁、失语、言语交流困难、厌恶碰触、视觉困难、理解困难和声音敏感及光敏感。本发明提供另一种组合物和方法，其应用催产素或催产素类似物与第二种或辅助治疗剂的组合来获得抗孤独症谱系病症。

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