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本发明涉及一种细胞培养系统，包括一种三维的生物相容性的框架结构和生物相容性的纳米颗粒，一种用于培养细胞的方法，以及通过这样一种细胞培养系统制备细胞或细胞产物和组织本身。

1.  一种细胞培养系统，包括一种三维的生物相容性的框架结构和生物相容性的纳米颗粒。

2.  根据权利要求1所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒包括至少一活性组分。

3.  根据权利要求1或2所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒具有直径50至1000nm，较佳地60至600nm。

4.  根据权利要求1、2或3所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒具有直径80至150nm，较佳地50至150nm。

5.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒由无机聚合物、金、贵金属、金属、金属氧化物、磷酸钙、磷酸氢钙、混合磷酸盐、基于硅的氧化材料如硅酸盐、氧化硅、二氧化硅组成。

6.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒由有机聚合物组成。

7.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒由生物可降解的聚合物组成。

8.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒由聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚甘醇酸(PLGA)、聚己酸内酯、聚羟基乙酸(PCL)、二和三嵌段聚合物，如PCL/PGA二嵌段体系、聚原酸酯(POE)、聚酸酐、聚羟基脂肪酸酯(PHA)或聚吡咯(Ppy)、聚碳酸亚丙酯、聚碳酸亚乙基酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(Polyalkylcyanonitril)或聚乙二醇组成。

9.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒装载有活性组分或活性组分附着在它们的表面上。

10.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒由确保装载在纳米颗粒中的活性组分的一确定的释放曲线的具有不同分子量和不同极性的聚合物组成。

11.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒通过使用乳液聚合方法产生。

12.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中活性组分装载入纳米颗粒中通过水包油技术发生。

13.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中活性组分是生长因子、细胞因子、趋化因子、维生素、矿物质、脂肪、蛋白质、营养物、纤维形成蛋白、碳水化合物、粘附蛋白、整合素、细胞受体，药物、DNA、RNA、适体、血管生成因子、凝集素、抗体、抗体片段、染料、氨基荧光素或抑制剂。

14.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒包括稳定剂。

15.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中稳定剂是碳水化合物、蛋白质、聚乙二醇或洗涤剂。

16.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒通过与官能团偶联官能化。

17.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中一第一官能团1A应用于纳米颗粒的表面上，其能够和在活性组分上的互补基团2A形成一亲合键，较佳地共价键。

18.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中在纳米颗粒的表面上的第一官能团1A和活性组分的互补基团2A选自由氨基、羧基、环氧基、马来酰亚胺基、烷酮基、醛基、肼基、酰肼基、硫醇基和硫酯基组成的组合。

19.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中一第二官能团1B应用于纳米颗粒的表面上，其能够和在活性组分上的互补基团2B形成一亲合键，较佳地非共价键。

20.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中在纳米颗粒的表面上的第二官能团1B和活性组分的互补基团2B选自由寡组胺基、链球菌标记I(Strep-Tag I)、链球菌标记II(Strep-Tag II)、脱硫生物素、生物素、几丁质、几丁质衍生物、几丁质结合区、金属离子螯合物、链霉亲和素、亲和素和中性链亲和素组成的组合。

21.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中三维的框架结构选自由层粘连蛋白、糖胺聚糖(GAG)、蛋白聚糖、弹性蛋白、胶原蛋白I至IV型、巢蛋白(Nidogen)、玻璃粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、基底膜蛋白多糖、粘附蛋白和纤维粘连蛋白组成的组合。

22.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中框架结构以纤维形式存在。

23.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中框架结构以三维的水凝胶状形式或海绵状形式存在。

24.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中三维的生物相容性的框架结构是一种细胞外基质。

25.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒在细胞培养体系中以整体地分布的方式或以分层形式存在。

26.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中处于分层形式的纳米颗粒置于框架结构下面。

27.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒，特别是装载有活性组分的纳米颗粒，在框架结构中以增加或减少量呈梯度形式分布。

28.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中在框架结构中的活性组分梯度形成，因为每一粒均具有相同浓度的装入的或携带的活性组分的纳米颗粒在框架结构中在限定的区域以不同数量存在。

29.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中在框架结构中的活性组分梯度形成，因为纳米颗粒在框架结构中在均匀分布方式存在，具有不同浓度的装入的或携带的活性组分。

30.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中活性组分梯度形成在框架结构中，因为具有不同浓度的装入的或携带的活性组分的纳米颗粒在框架结构中在限定的区域以不同数量存在。

31.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中细胞培养系统是一种带有活性组分可控定时释放的系统。

32.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒连接至框架结构。

33.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒通过静电相互作用连接至框架结构。

34.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒通过离子键合连接至框架结构。

35.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中纳米颗粒通过紫外交联连接至框架结构。

36.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中细胞培养系统用于进行迁移试验，特别是在体内的迁移试验。

37.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中细胞培养系统通过非接触式印刷方法生产。

38.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中细胞培养系统通过浸渍法生产。

39.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中细胞培养系统通过LIFT法生产。

40.  根据前述任一权利要求所述的细胞培养系统，其中细胞培养系统通过电纺(旋涂)方法生产。

41.  一种用于生产根据权利要求1-40任一所述的细胞培养系统的方法，其中使得生物相容性的纳米颗粒与三维的生物相容性的框架结构相接触。

42.  根据前述任一权利要求所述的生产细胞培养系统的方法，其中细胞培养系统通过使用非接触式印刷方法生产。

43.  根据前述任一权利要求所述的生产细胞培养系统的方法，其中细胞培养系统通过使用纳米颗粒浸渍框架结构方法生产。

44.  根据前述任一权利要求所述的生产细胞培养系统的方法，其中细胞培养系统通过LIFT方法生产。

45.  根据前述任一权利要求所述的生产细胞培养系统的方法，其中细胞培养系统通过电纺(旋涂)方法生产。

46.  一种用于培养细胞的方法，其中细胞置于含有根据权利要求1-45任一所述的细胞培养系统的细胞培养容器中，并在细胞培养基中在允许培养的合适条件下进行培养。

47.  根据权利要求46所述的方法，其中细胞是原代细胞。

48.  根据权利要求46或47所述的方法，其中原代细胞是胚胎干细胞，特别地来自脐带血的全能或多能干细胞。

49.  根据权利要求46或47所述的方法，其中原代细胞是成体干细胞，特别是上皮细胞、树突状细胞、基质细胞、脂肪细胞、间质细胞或骨髓细胞。

50.  根据权利要求46或47所述的方法，其中原代细胞是肿瘤细胞，特别是肿瘤细胞株，如MCF-7、HeLa、HepG2、PC3、CT-26、A125、A549、MRC-5、CHO、MelJuso28、Nalm6或Jurkat。

51.  根据权利要求46或47所述的方法，其中原代细胞是粘细胞，特别是粘细胞株，如HUVEC或HaCaT。

52.  根据权利要求46或47所述的方法，其中细胞是分化细胞。

53.  一种用于生产细胞产物的方法，其中细胞用根据权利要求46-52任一所述的方法进行培养，获得表达产物。

54.  一种用于生产分化细胞或细胞簇的方法，其中未分化的细胞用根据权利要求46-52任一所述的方法进行培养，获得分化细胞或细胞簇。

55.  根据权利要求54的方法，其中细胞簇是移植体或试验系统。

56.  根据权利要求54的方法，其中细胞簇是器官或器官部件，特别是气管。

57.  一种细胞的表达产物，使用根据权利要求46-56任一所述的方法生产。

58.  分化细胞或细胞簇，使用根据权利要求46-56任一所述的方法生产。

59.  移植体或试验系统，使用根据权利要求46-56任一所述的方法生产。

60.  器官或器官部件，特别是气管，使用根据权利要求46-56任一所述的方法生产。

细胞培养系统
技术领域
本发明涉及一种细胞培养系统，包括一种三维的生物相容性的框架结构(dreidimensionalebiokompatible Gerüststruktur)和纳米颗粒(Nanopartikel)。本发明还涉及一种用于制备这样一种细胞培养系统的方法和一种用于利用所述细胞培养系统培养细胞的方法。
背景技术
细胞在体内被复杂的、动态的特别是由细胞外基质(Matrix，ECM)、生长因子(Wachstumsfaktoren)、细胞因子(Cytokinen)和邻近细胞(benachbarten Zellen)组成的微观环境所包围。细胞外基质以总共四种基本组织类型存在，即上皮的、肌肉的、神经的、及结缔与支撑组织。除了它们作为一种支撑框架的功能外，该功能长期被认为是它们的主要功能，ECM主要用于通过细胞的跨膜受体进行交互式信号交换。由于这种通信形式，ECM还对基因表达的调节有影响。这在基本的细胞特性如粘附、增殖、分化、迁移、凋亡和重组中起着重要的作用。ECM并不代表一种静态的系统，实际上ECM的组分处于一种“流动平衡”状态中。ECM的组分由细胞分泌和合成在细胞间隙(细胞之间的空间)中，但是也可以同时被细胞再次降解。细胞外基质由三种主要组分：胶原纤维、锚定蛋白和充填空间的碳水化合物组成。基底膜(Basalmembran)是一蛋白层，其可以被认为是特异的细胞外基质。它代表一种稳定层，将表面上皮从结缔组织分离。这防止这些层的细胞滑脱开。
细胞外基质的一种组分是由纤维形成蛋白组成的。为此，胶原蛋白是ECM的占主导地位的蛋白家族。它们形成不同类型的纤维，并存在于几乎所有的组织中。ECM的许多大的部分是由纤维状胶原蛋白I型形成，而胶原蛋白IV型在基底膜中起重要作用。弹性纤维是由原纤维蛋白(Fibrillin)和弹性蛋白(Elastin)组成。碳水化合物代表ECM中另外一种重要的组分。这些碳水化合物也包括糖胺聚糖(Glycosaminoglykane，GAG)。糖胺聚糖是与某些单个单元的长链多糖关联的蛋白。如果糖胺聚糖聚集成更大的大分子，就形成了蛋白聚糖(Proteoglykane)。从蛋白，糖胺聚糖和蛋白聚糖，的多元化和相互作用可以看出，ECM的重要特性和特征是非常明显的。另外，ECM的碳水化合物组分由透明质酸硫酸乙酰肝素(Heparansulfat)、硫酸皮肤素(Dermatansulfat)、硫酸软骨素(Chondroitinsulfat)和硫酸角质素(Keratansulfat)代表。
细胞外基质的另一种特征性组分包括粘附蛋白。通过将它们自己粘附至特定细胞受体，粘附蛋白、衔接蛋白或其它粘连蛋白两者均可以和基质的其它部分相互作用，也可以和其它细胞相互作用。粘附蛋白的例子是层粘连蛋白(Laminine)、玻璃粘连蛋白(Vitronektin)和纤维粘连蛋白(Fibronektin)蛋白家族。
作为一种特异的细胞外基质的基底膜含有各种各样的基本组分。首先，也是首要的，这些组分包括胶原蛋白I-IV型，其中IV型具有特别重要的意义。层粘连蛋白代表基底膜的另一部分。它们具有剑状的形状。它们的末端被主要结合至整合素(Integrine)的细胞受体占据。层粘连蛋白1是最重要的粘附组分，层粘连蛋白5作为基底膜的重要部分具有另一特殊意义。巢蛋白(Entactin，Nidogen)作为基底膜的另一组分具有一种特殊意义，因为其将胶原蛋白层连接至层粘连蛋白层。最后，基底膜的单个组分利用蛋白聚糖如基底膜蛋白多糖(Perlecan)进行连接，因为基底膜蛋白多糖在其结构中包括用于胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白和它自己的结合位点。
最后，但不是最不重要的，作为细胞外基质的另外的重要成分，细胞受体应该被提及。细胞膜蛋白如整合素家族在本文中对细胞粘附起着重要作用。整合素是异二聚体蛋白(heterodimere Proteine)，其可能由不同的α和β亚基构成。取决于整合素的α或β亚基的组成，整合素可以结合至细胞外基质如层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白或纤维粘连蛋白。
培养细胞的一个目的是以一种尽可能准确的方式去重新构建细胞外基质作为细胞的天然环境。除了细胞外基质的多个部分外，也期望能够进一步将生物学上的重要试剂比如生长因子结合进所述ECM结构中。
目前，从组织中分离的原代细胞的培养经常发生在用塑料覆盖的细胞培养器皿中。然而，该环境不对应细胞的天然生理状况，并通常导致功能的丧失，细胞去分化，在最坏情况中，导致细胞的死亡。目前已知的细胞培养容器的改进是用细胞外基质的单个的、天然的组分如胶原纤维或纤维粘连蛋白覆盖表面。但是，该环境不是特异调节至细胞类型，也以非限定方式应用。在含有一种活性剂的胶体类结构中培养细胞也是已知的。除了别的以外，一个缺点是随着可选择的必需的培养基更换，活性剂以不受控制的方式被洗掉。
还可能在细胞培养基中培养细胞，其中活性剂已经以溶解形式存在。因此，对于细胞，活性剂是直接可得到的，但是，一个缺点是活性剂可能很快用光，它的浓度不能以可控的方式调整至培养的细胞的各自的分化和生长阶段。
从德国专利DE10144252A1和DE10031859A1已知纳米颗粒及其用于鉴定和筛选方法的用途。根据所述披露内容，纳米颗粒也可以检测或携带某些生物学上的活性物质。
因为纳米颗粒乳液聚合(Emulsionspolymerisation)的制备代表聚合的一种特殊方法，其中水溶性单体在水中通过乳化剂乳化，并使用水溶性引发剂(Initiatoren)如过硫酸钾(Kaliumpersulfat)进行聚合。在乳液聚合期间形成的聚合体分散，如胶乳分散(Latex-Dispersionen)，可以用于许多应用。美国专利US 4,521,317和US 4,021,364表明了乳液聚合的可能和缺陷。
在乳液聚合范围内，一般可以使用两种类型的乳液：油在水中的乳液和水在油中的乳液也已知为反相乳液(inverse Emulsion)。在两种情况中，在反应介质中可溶的一种单体通过加入一种乳化剂同时搅拌进行分散，反应通过加入一种引发剂开始。
发明内容
本发明是基于提供一种细胞培养系统的技术问题，该细胞培养系统尽可能接近天然的细胞外基质作为细胞的天然环境，并能够使生长因子和细胞因子受控制地加入，从而以一种可控的方式调节细胞生长和细胞分化，以及还调节细胞符合商业要求。本发明还基于提供适于移植体(Transplantationen)的细胞，特别还有组织和器官的技术问题。另外，在所谓的组织工程范围内和用于研究目的，存在对特殊组织的需求。
通过提供一种包括一种三维的生物相容性的框架结构和生物相容性的纳米颗粒的细胞培养系统，和通过一种通过提供细胞或细胞产物和组织、及利用这样一种细胞培养系统提供在其中的或其的细胞或细胞产物和组织用于培养细胞的方法，本发明解决了该技术问题。
因此，本发明提供一种细胞培养系统，其能够在对应体内情形的条件下或在期望的综合调节环境中培养细胞，特别是真核细胞，在一特别优选的实施例中是动物或人的细胞。
本发明特别基于提供一种细胞培养系统，其具有生物相容性的纳米颗粒，连同一种三维的生物相容性的框架结构。这样一种系统能够使目标细胞培养在其中置于由纳米颗粒的存在特别提供的影响和条件下，并依赖于培养目标，影响细胞关于它们的生物学行为即生长或分化行为。在一特别优选的具体实施例中，纳米颗粒可以包括活性剂，例如，其中纳米颗粒包括附在纳米颗粒表面上或自身内的活性剂。当然，活性剂也可以这样提供，其既存在纳米颗粒的表面上也存在纳米颗粒的内部。以这种方式连接到纳米颗粒的活性剂是可控制的和/或可调节的，特别是在使用细胞培养系统实施细胞培养方法的过程中，以一种按时间顺序定时的方式可释放的，并可以以这样一个剂量以可控的方式在一段较长的时间内添加至细胞。采用这种方式，通过将纳米颗粒耦联，例如，生长因子，在一段限定的时间内确保所述生长因子的可控输送。
已经表明纳米颗粒，例如用聚合物材料制成的，作为例如生长因子的载体，具有令人惊讶的优势。因此，纳米颗粒，特别是聚合物纳米颗粒，作为载体控制活性剂如细胞因子的可控释放，例如，使用确定的，通常定时释放的动力学。这种效果也称为可控释放(controlledrelease)。本发明的一优选的具体实施例提供，活性剂的释放以一种可以被预定为时间函数的方式进行调节，从而提供了期望的和特定的活性剂释放动力学。本发明可以提供，期望的活性剂释放动力学通过纳米颗粒材料的选择而实现，以便活性剂的释放以细胞特异的方式发生。例如，活性剂的恒定释放率可以基于整个释放持续时间发生。当然，本发明也可以提供，例如，在一第一阶段的一个起初低的活性剂释放速率，和在时间的某一点后开始的一个增加的释放速率。在另一优选的具体实施例中，本发明也提供，在一初始的第一阶段提供了一相对高的活性剂释放速率，其在时间的某一点后由一低释放速率代替。通过利用合适的聚合物材料用于制备纳米颗粒，根据本发明，在细胞培养方法的范围内，也可能在时间的某一点以一种爆发效果的形式从纳米颗粒释放一种活性剂的期望的高浓度。在一优选的具体实施例中，纳米颗粒可以具有这样一种活性剂装载以便活性剂浓度在释放后在1ng/ml至10μg/ml的优选范围内。
为此，活性剂释放可以通过从或由纳米颗粒扩散活性剂，或通过纳米颗粒自身降解例如通过聚合物水解两种方式来实现。
具有框架结构的特别是由细胞外基质制成的纳米颗粒特别是那些装载活性剂的纳米颗粒的联合表现出更进一步的令人惊异的优势。通过在带有特别是装载某一细胞因子的纳米颗粒的框架结构上培养细胞，可能获得干细胞的可控的和定向的分化。
还表明，特别地通过在含有与特定生长因子耦联的纳米颗粒的基质中培养的方式，原代细胞具有显著的更高的生存率，从而使得这些敏感细胞的长期培养成为可能。
令人惊讶地表明，可控的和定向的细胞迁移可以通过在根据本发明的细胞培养系统中培养的方法进行诱导。
试验表明，特别地原代细胞，其在根据本发明的细胞培养系统中培养，令人惊讶地具有显著的增加的增殖。此外，与普通细胞培养容器相比较，可以确定对根据本发明的改性的表面例如细胞培养系统的显著改善的粘附性能。即使在培养数天后，细胞仍然保持它们的典型形态特征。因此，根据本发明的细胞培养系统极大地防止了原代细胞的任何非期望的分化。
在本发明的范围内，术语“细胞培养系统”是指一种用于培养细胞的系统，其较佳地在以三维方式构造的构造物，例如，为一种基质或水凝胶内，为要培养的细胞特别地以其内含有的框架结构的形式提供附着的位置。通常这样一种细胞培养系统在其使用较佳地其在体外使用时置于人造容器中，其能通过细胞培养系统自身和培养基安置要培养的细胞。
因此本发明的细胞培养系统特别地是一种用于在体外培养细胞的系统。根据本发明的细胞培养系统可以用于在普通细胞培养容器如培养皿(Petrischalen)或细胞培养瓶或其它形状中培养细胞。在本发明的一优选的具体实施例中，细胞培养系统用于培养原代细胞。另一实施例提供，根据本发明的细胞培养系统应用在体内，即在动物实验中。
在本发明的上下文中，“框架结构”是指用于粘附细胞的结构。在本发明的范围内，框架结构的一优选的具体实施例特别地是这样一种结构，其不仅允许表面粘附或细胞粘附，而且还特别地允许细胞生长进或融入框架结构本身中。该框架结构较佳地是一种基质，较佳地具有毛孔或中间空隙。在本发明的一优选具体实施例中，所述基质具有细胞外基质的一种或多种组分，例如基底膜的多个部分、粘附蛋白、纤维形成蛋白、碳水化合物、蛋白聚糖或细胞受体。
在本发明的上下文中，“原代细胞”指的是人或动物来源的真核细胞，其是从器官或从胚胎得到的。特别地，胚胎干细胞是较佳地被提供作为原代细胞，较佳地从脐带血中获得。然而，在本发明的上下文中，较佳地，没有提供人类胚胎干细胞的使用。根据本发明使用的干细胞可以是一种全能的(totipotente)、万能的(omnipotente)或者多能的(pluripotente)细胞。此外，原代细胞较佳地是成体干细胞，例如动物的或人类的成体干细胞。
在本发明的上下文中，“原代细胞”也指人类或动物来源的真核细胞。原代细胞可以从器官如皮肤、肾脏或肝脏，或从整个胚胎获得。根据本发明使用的原代细胞的一个例子是一种成纤维细胞(Fibroblast)。原代细胞较佳地是万能的或者多能的。一种原代细胞也可以是一种成体干细胞。细胞通过使用胰蛋白酶或其它蛋白酶处理，从而从组织分离，也通过细胞间化合物例如紧密连接物(Tight Junctions)降解的方式分离。上皮细胞的原代细胞培养是用于原代细胞的另一个例子。一般来说上皮细胞包覆组织和器官的外部和内部表面。上皮细胞具有非常高的分化程度，表现在带有一顶端表面和一基底外侧表面的细胞的极化。各种表面呈现不同的功能。例如，肠的上皮细胞的顶端表面用于吸收营养，而基底外侧表面输送所述营养至血液，并形成与邻近细胞和基底膜的连接。但是，来自血液、骨髓或脾脏的原代细胞仍可以悬浮培养。用胰蛋白酶处理后，存在其它方法用于进一步从分离的原代细胞选择分离的亚型。例如，通过磁性细胞分离方法或通过荧光激活细胞分选方法FACS从例如骨髓分离B细胞作为原代细胞是可能的。
一种原代细胞也可以较佳地是一种非人类胚胎干细胞，较佳地，在一特别优选的具体实施例中，是一种已经从脐带血中获得的胚胎干细胞。在一优选的具体实施例中，胚胎干细胞是一种已经从处于一个多达8个细胞的阶段的胚胎分离的细胞。来自8细胞阶段的所述胚胎干细胞是一种全能细胞，可以分化成主要组织类型的所有细胞形式，例如，内胚层的(endodermal)-如肠道的壁细胞-，中胚层(mesodermal)-如肌肉、骨骼、血液细胞-，和外胚层的(ektodermal)如皮肤细胞和神经组织。在另一优选的具体实施例中，胚胎干细胞是一种已经从一个处于胚泡(Blastozyste)阶段的胚胎分离的细胞。所述从胚泡阶段分离的胚胎干细胞是一种多能细胞，除了可能不能再形成的胎盘组织(plazentalem Gewebe)的形成之外，可以分化成主要组织类型的所有类型的体细胞，例如，内胚层的和外胚层的。干细胞的一个特殊的特点是所述细胞能够在细胞分裂过程中自我复制，从而获得干细胞库，并同时产生一种分化的细胞，在这种情况下具有较低的分化潜能。干细胞通过所谓的标记将自己与分化的细胞区分开来。标记可以是由干细胞增强的或低水平表达的特殊的蛋白质。对小鼠胚胎干细胞，SSEA-1、阶段特异性胚胎抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1)、AP活性、碱性磷酸酶活性和转录因子Oct-3/4的表达称为标记。标记蛋白的表达取决于干细胞的来源。
然而，本发明也涉及细胞培养的方法和实施细胞培养方法的装置，其涉及到，特别是利用，非胚胎干细胞。成体干细胞是一种在胚胎阶段后形成的细胞。成体干细胞可以从器官和组织分离，如骨髓、皮肤、脂肪组织、脐带血液、脑、肝或胰腺，而且通常是预先确定的，例如，它们具有较低的分化潜力，是多或单能的。通常来自胚胎或成年哺乳动物的分离的原代细胞具有非常有限的生长能力。在人类胎儿细胞中，在其分离和培养后最初出现良好的细胞生长。此外，原代细胞也可以从肿瘤中分离和培养。调控机制，例如细胞凋亡，通过遗传改变消除，致癌性转化或生长受体的正生长信号被分别放大。因此，许多，特别是原代肿瘤细胞，往往会显示出无限的生长。在肿瘤细胞下的一种特别的亚群体的原代细胞代表所谓的肿瘤干细胞。其被确定为在某些肿瘤细胞中占非常小的细胞部分。肿瘤干细胞已经从乳腺癌肿瘤分离和培养。用于这些乳腺癌干细胞的特征标志蛋白是高CD44表达、没有或低量CD24表达，及没有所谓的线性标记(Linienmarkern)。
在本发明的上下文中，“成体干细胞”特别是指一种已在胚胎阶段后形成的细胞，与完全分化相对，具有还没有耗尽的分化潜力，是预先确定的，并特别从上皮细胞(Epithelzellen)、内皮细胞(Endothelzellen)、树突状细胞(dendritischen Zellen)、间质细胞(mesenchymalenZellen)、脂肪细胞(Adipocyten)或特别地从心脏、骨骼肌肉、脂肪组织、皮肤和大脑的各自的前体细胞分离的。
在本发明的上下文中，“三维”是指向所有三个空间坐标的立体扩展。扩展在这三个方向可以基本上一致，以便呈现，例如，圆柱形状、柱状的、立方形的或立方基质结构。不过，也可能，例如，扩展以更大的程度出现在两个方向，但在第三个方向只有较低的程度，以便三维结构看上去是平面的，例如，表示膜或层。
在本发明的范围内，术语“生物相容性的”是指关于材料组成和关于结构，框架结构和纳米颗粒不会在细胞、组织或在一生物体中，特别是试验动物的生物体中导致有毒的、细胞凋亡的、非期望的免疫的或其它非期望的反应，不会或几乎不干扰细胞和分子过程，即使在纳米颗粒的可能的内移过程或纳米颗粒和/或框架结构的降解后。
在一特定的具体实施例中，本发明较佳地提供，纳米颗粒是生物可降解的或生物可吸收的，例如：利用生物影响，特别是培养细胞的作用，逐渐分解，并可以释放较佳地其内含有的活性剂。
在本发明的范围内，纳米颗粒是具有直径为1至1000nm的颗粒。这种纳米颗粒可能由不同的材料如无机或有机物质组成。在一优选的具体实施例中，其表面可以包括化学活性官能团，其与要结合的活性剂的互补官能团形成亲合键，例如共价和/或非共价键，从而能够可靠地将活性剂固定到其表面上。在另一优选的具体实施例中，本发明提供，纳米颗粒也能与框架结构形成化学键。这些化学键较佳地是静电相互作用。
在一优选的具体实施例中，本发明提供了一种细胞培养系统，其中纳米颗粒具有直径50-1000nm，较佳地50nm至900nm，更佳地60nm至600nm。在另一优选的具体实施例中，本发明提供了一种细胞培养系统，其中纳米颗粒具有直径80-150nm，较佳地50nm至150nm。
另一具体实施例提供，根据本发明的细胞培养系统含有纳米颗粒，其由无机物质如金或其它责重金属组成，或由金属或金属氧化物、磷酸钙、及磷酸氢钙或它们的混合磷酸盐、基于硅的氧化材料，如硅酸盐、氧化硅，如二氧化硅组成。在一优选的具体实施例中，纳米颗粒也可以是磁珠DynaBeads。
一优选的具体实施例提供，根据本发明的细胞培养系统含有纳米颗粒，其由有机物质，特别是有机聚合物组成。较佳地，纳米颗粒可以通过乳液聚合的方法制备。
较佳地，纳米颗粒使用在由生物可降解的聚合物组成的根据本发明的细胞培养系统中。更优选地是使用具有直径50nm的纳米颗粒和包括一种生物可降解的基质。
一优选的具体实施例提供，根据本发明的细胞培养系统含有纳米颗粒，其由聚乳酸(Polylactiden，PLA)、聚乳酸-聚甘醇酸(Poly(lactid-co-glycolid)，PLGA)、聚己酸内酯(Polycaprolactonen，PCL)、聚羟基乙酸(Polyglycoliden)、二和三嵌段聚合物，如PCL/PGA二嵌段体系，聚原酸酯(Polyorthoestern，POE)、聚酸酐(Polyanhydride)、聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoaten，PHA)、聚吡咯(Polypyrrolen，PPy)，聚碳酸亚丙酯(Polypropylencarbonat)、聚碳酸亚乙基酯(Polyethylencarbonat)、聚氰基丙烯酸烷基酯(Polyalkylcyanonitril)或聚乙二醇(Polyethylenglycol)。
较佳地，本发明提供，根据活性剂的期望释放曲线，纳米颗粒包括具有不同分子量和变极性的聚合物。用于纳米颗粒构建的材料的选择较佳地可以根据活性物质以何种形式和动力学进行释放来进行。
本发明特别提供了一优选的具体实施例，根据该实施例，一种纳米颗粒由不同的材料，特别是不同的聚合体构造成，以在对要释放的活性剂的释放曲线的控制中获得特别高的可变性。当然，另一具体实施例也可以提供，根据本发明的细胞培养系统具有由不同材料组成的纳米颗粒，其在另一优选具体实施例中转而具有不同的活性剂。活性剂按照时间和/或空间的特定的限定的释放也可以以这种方式发生。
本发明的一特别优选的具体实施例还提供，纳米颗粒是至少一种活性剂的载体。在本发明的上下文中，活性剂是这样的试剂，其对要培养的细胞产生影响。较佳地作为这样的活性剂的试剂是那些涉及要培养的细胞的生长和分化过程的调控的试剂。尤其，这些活性剂控制、调节、确定、启动或结束生长和分化过程。这种活性剂也可能涉及迁移(Migrations)、侵袭(Invasions)、再分化或分离活动。在一特别优选的具体实施例中，活性剂是以期望的和特异的特定应用动力学被添加到培养的细胞。
本发明的另一优选的具体实施例提供，细胞培养系统含有纳米颗粒，它们具有装载在框架结构中和/或在其表面上的活性剂。
本发明的另一优选的具体实施例提供，为了纳入活性剂，如生长因子，使用油包水技术作为优选方法用于制备装载有活性剂的纳米颗粒，特别是PLA和PLG颗粒。
为此，本发明较佳地还提供了一种细胞培养系统，其中装载在纳米颗粒中的活性剂是生长因子、细胞因子、细胞粘附蛋白，如整合素、染料，如氨基荧光素(Fluorescenamine)、趋化因子(Chemokine)、维生素、矿物质、脂肪、蛋白质、营养物、纤维形成蛋白、碳水化合物、粘附蛋白、细胞受体，药物、DNA、RNA、适体(Aptamere)、血管生成因子(angiogeneFaktoren)、凝集素(Lektine)、抗体、抗体片段或抑制剂。
本发明的一优选的具体实施例提供，细胞培养系统包含具有稳定剂的纳米颗粒。为此，稳定剂较佳地是碳水化合物，如海藻糖、蛋白质、聚乙二醇或洗涤剂。
本发明的另一优选的具体实施例提供，细胞培养系统包含纳米颗粒，其已经通过耦合至官能团的方式功能化。一特别优选的具体实施例提供。纳米颗粒自身在其表面上包括官能团。
本发明特别提供一第一官能团1A连接在纳米颗粒的表面上，其能够与要被固定的活性剂的互补基团2A形成一亲合键，较佳地共价键。
本发明提供第一官能团1A是选自由氨基、羧基、环氧基、顺丁烯二米多基团(Maleinimidogruppe)、烷酮基(Alkylketongruppe)、醛基(Aldehydgruppe)、肼基(Hydrazingruppe)、酰肼基(Hydrazidgruppe)、硫醇基(Thiolgruppe)和硫酯基(Thioestergruppe)组成的组合。
本发明提供活性剂的官能团2A是选自由氨基、羧基、环氧基、顺丁烯二米多基团、烷酮基、醛基、肼基、酰肼基、硫醇基和硫酯基组成的组合。根据发明的一种纳米颗粒在其表面上还具有一第一官能团1A，其共价连接到要固定的活性剂的一官能团2A，其中，表面官能基1A是一种与蛋白官能团2A不同的基团。形成键的两个基团1A和2A必须互补，例如能够形成共价键。
本发明的另一优选的具体实施例提供，根据本发明的纳米颗粒的表面具有官能团1B，要被固定的一种活性剂具有结合官能团1B的互补官能团2B，其中，根据本发明的官能团1B和2B特别地可以形成一个非共价键。
根据本发明的一优选的具体实施例，纳米颗粒的表面的第二官能团1B是选自由寡组胺基(Oligohistidingruppe)、链球菌标记I(Strep-Tag I)、链球菌标记II(Strep-Tag II)、脱硫生物素(Desthiobiotin)、生物素、几丁质(Chitin)、几丁质衍生物(Chitinderivate)、几丁质结合区、金属离子螯合物、链霉亲和素(Streptavidin)、亲和素(Avidin)和中性链亲和素(Neutravidin)组成的组合。
根据本发明，要被固定的一种活性剂的官能团2B是选自由寡组胺基、链球菌标记I(Strep-Tag I)、链球菌标记II(Strep-Tag II)、脱硫生物素、生物素、几丁质、几丁质衍生物、几丁质结合区、金属离子螯合物、链霉亲和素、亲和素和中性链亲和素组成的组合。根据本发明的一种纳米颗粒在其表面上还具有官能团1B，其以非共价方式连接至一种分子的官能团2B，其中纳米颗粒的表面官能团1B是一种与分子官能团2B不同的官能团。形成非共价键的两基团必须互补，例如能够相互形成非共价键。
当然，本发明还可以提供，根据本发明的纳米颗粒的表面和要固定的活性剂可选择地具有官能团1A和1B，及2A和2B。
本发明的一特别优选的具体实施例提供，三维的框架结构包含一个或更多个下列组件，即纤维形成蛋白，如胶原蛋白，弹性纤维形成原纤维蛋白(Fibrilline)，和/或弹性蛋白，碳水化合物，如糖胺聚糖，长链多糖，特别是透明质酸，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和硫酸角质素，粘附蛋白，如衔接蛋白或其它粘连蛋白，如层粘连蛋白，玻璃粘连蛋白和纤维粘连蛋白，基底膜的组分，如层粘连蛋白，巢蛋白和蛋白聚糖，和用于ECM组分的细胞受体，如细胞膜蛋白。
本发明的一优选的具体实施例提供，三维的框架结构包含细胞外基质的组分，或由细胞外基质的组分组成，选自由层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、弹性蛋白、胶原蛋白I、II、III、IV型、巢蛋白、玻璃粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素(Dermatansulfat)、硫酸软骨素、硫酸角质素、基底膜蛋白多糖、粘附蛋白和纤维粘连蛋白组成的组合。在本发明的一优选的具体实施例中，框架结构可以由一框架基础结构如胶原蛋白，特别是胶原纤维构成，其中所述框架基础结构以一种有利的和可选的方式用来自先前提及的形成框架结构的组合的其它组分来具体实施。以这种方式，框架结构，尤其是胶原蛋白框架结构，还可以，例如，用促进细胞特征如粘附和增殖的组分，如锚定蛋白和/或碳水化合物来具体实施。
在根据本发明的细胞培养系统的一优选的具体实施例中，框架结构，特别是由胶原蛋白制成的框架结构，在纤维形式和/或网格形式存在。
另一优选具体实施例提供，框架结构，特别是由胶原蛋白制成的框架结构，以网格状的、有分支的形式以三维方式呈现。在一优选具体实施例中，框架结构可以以水凝胶或海绵状形式存在。
较佳地，在根据本发明的细胞培养系统中的三维的生物相容性的框架结构是一种细胞外基质。
一优选的具体实施例提供，在纳米颗粒中的活性剂浓度在1ng/ml至10μg/ml的范围内。
本发明的另一优选的具体实施例提供，细胞培养系统包含纳米颗粒，其在细胞培养体系中以整体地分布的方式存在。然而，在一优选的具体实施例中，也可以存在纳米颗粒的异质的、不均匀的分布。在另一优选的具体实施例中，纳米颗粒以在框架结构上和/或下至少一层的形式存在。在另一优选的具体实施例中，纳米颗粒以在框架结构上至少一层的形式存在。
较佳地，在根据本发明的细胞培养系统中的纳米颗粒排列在框架结构下面的多层中。
较佳地，在根据本发明的细胞培养系统中的纳米颗粒排列在框架结构上面的多层中。
在本发明的一优选的具体实施例中，纳米颗粒的平均直径总是小于或等于框架结构的平均厚度。在另一优选的实施例中，纳米颗粒的平均直径总是小于框架结构的平均厚度。在另一优选的实施例中，所有的纳米颗粒较佳地嵌入，优选主要地或完全地，在框架结构中。较佳地，纳米颗粒的尺寸与框架结构的厚度的比例为1∶1或更小，优选1∶10或更小，更优选地1∶100或更小，更优选地1∶1000或更小。
本发明的一优选的具体实施例提供，在根据本发明的细胞培养系统中的纳米颗粒在框架结构中以梯度形式存在。
另一具体实施例提供，在根据本发明的细胞培养系统中的较佳地提供的活性剂在框架结构中以梯度形式存在。
在本发明的上下文中，术语“梯度”因此可以指在根据本发明的细胞培养系统特别是框架结构中的纳米颗粒和/或活性剂的不同浓度的形成，特别是纳米颗粒或活性剂的空间渐变的，增加或减少的浓度。
在本发明的一优选的具体实施例中，一种活性剂梯度是通过具有不同浓度活性剂的纳米颗粒的使用形成的。在该优选的具体实施例中的活性剂可以以不同浓度装载在纳米颗粒中或附着在纳米颗粒上。此外，活性剂也可以通过经由官能团的连接以不同浓度附着到纳米颗粒上。依赖于所述纳米颗粒在框架结构中不同浓度的排列，如均匀分布，用这种方式可以获得在细胞培养系统中的活性剂的浓度降低的渐增浓度。本发明的一优选的具体实施例提供，活性剂梯度通过纳米颗粒在框架结构内以均匀分布的方式存在来具体实施，其中纳米颗粒具有不同的活性剂浓度，并这样排列以便形成一种活性剂梯度。一优选的具体实施例还提供，在框架结构中以空间不均衡方式例如异质的方式分布具有不同活性剂浓度的纳米颗粒，尤其是以纳米颗粒梯度的形式将这种纳米颗粒结合进去。
本发明的另一优选的具体实施例提供，活性剂梯度是在细胞培养系统中通过形成纳米颗粒梯度来具体实施，即其中纳米颗粒，在其中所使用的纳米颗粒的某一浓度及其中的活性剂的相同的浓度装载在或附着在其表面上，以一种空间异质的如不同的分布的方式存在于框架结构上。用这种方式，少量的所述纳米颗粒，例如，在框架结构的上部区域中，接着较多量的所述纳米颗粒在处于其下的框架结构的一个区域中，导致在框架结构中斜线式浓度增加。反之，较多量的所述纳米颗粒在框架结构的上部区域中，较少量的所述纳米颗粒在处于其下的框架结构的一个区域中，导致在框架结构中斜线式浓度下降。
本发明的另一优选的具体实施例提供，一种可控的和定时的活性剂的释放特别地通过生物可降解的纳米颗粒的使用发生。根据本发明的活性剂的较佳地可控释放可以另外地或可选地通过从纳米颗粒分散进周围的细胞培养系统，特别地分散进纤维或网格状框架结构中来确保。
本发明的另一优选的具体实施例提供，纳米颗粒结合到框架结构上。在一优选的具体实施例中，键是这样实现的以便培养基的改变不会导致纳米颗粒从框架结构分离。在一优选的具体实施例中，键是可冲洗的(waschstabil)，例如纳米颗粒将不会脱离框架结构，即使在培养基更换并选择性地使用普通冲洗介质如缓冲液进行清洗的步骤中。
较佳地，本发明提供，纳米颗粒通过静电相互作用，特别地通过一离子键结合到框架结构。
本发明的另一优选实施例提供，纳米颗粒通过紫外交联(UV Crosslinking)结合到框架结构。
本发明的另一优选实施例提供，细胞培养系统用于进行迁移试验，特别是在体内的迁移试验。
此外，本发明还涉及一种用于制备包括一种三维的生物相容性的框架结构的细胞培养系统的方法，其中，例如，按照下列方法之一，框架结构与纳米颗粒相接触。
本教导的一优选的具体实施例提供，细胞培养系统是通过一种“非接触式印刷方法”制备。
在本发明的上下文中，术语“非接触式印刷方法”是一种方法，其中纳米颗粒转移至基板上而没有与表面的任何接触。有不同的可能性去实现这一目标。在一第一优选的具体实施例中，所谓的按需点滴技术由一种喷墨方法提供。在一第二优选的具体实施例中，提供了一种通过按钮或多根单针的方法。在两具体实施例中，悬浮液的一滴或多滴转移到期望位置。较佳地由Dimatrix公司提供的商业上可得到的机器FujiFilm用于喷墨方法。其它优选的也是由microdrop technologies、MicroFab TECHNOLOGIES、Scienion AG和GeSIM mbH公司制造的机器，它们包括单针，可以通过计算机进行调节用于以点精确方式释放液滴。在本方法的上下文中，“点精确”指的是在所有方法中的定位精度规定在+/-25微米下。在定位精度的上下文中，还应考虑液滴体积。液滴体积在Dimatix公司的DMC-11601设备中可以调整至1pL，在GeSIM公司的Nano-Plotter NP1.2设备中可以调整至100pL。在本发明的范围内，本发明较佳地提供，纳米颗粒悬浮液的释放通过气动方法、真空方法或通过压电方法实现。本发明特别提供，在根据本发明的方法的各个具体实施例中，纳米颗粒进入基体特别是细胞培养系统的框架结构的穿透深度是由液滴体积或液滴速度来控制的。非接触式印刷方法较佳地导致纳米颗粒在框架结构中层状附着。
在本发明的另一优选的具体实施中提供了一种细胞培养系统，其是通过浸渍法制备的，特别地在其中，一个框架结构用含有纳米颗粒的悬浮液进行渗透，例如通过用含有纳米颗粒的悬浮液饱和。
在本发明的另一优选的具体实施中提供了一种细胞培养系统，其是通过激光诱导向前转移(Laser Induced Forward Transfer，LIFT)方法制备的。为此，本发明特别提供，要运输的材料，特别地细胞外基质的一个或多个部分，通过激光能量切开并附着至靶材料。
本发明的另一优选的具体实施提供，细胞培养系统是通过电纺(Elektrospinning，旋涂(Spincoating))技术制备的。通过电纺，较佳地，聚合物结构可以以较佳地2至20μm的纤维直径进行制备，非常类似于细胞的天然环境，即细胞外基质。
本发明因此涉及用于制备一种细胞培养系统的方法，其中一特别优选的具体实施例提供，例如，通过自乳化溶剂挥发(Spontanoues Emulsifaction Solvent Diffusion，SESD)方法的溶剂蒸发、盐析、喷雾干燥或相分离的方法去生产生物相容性的纳米颗粒。
一特别优选的具体实施例提供，通过溶液蒸发方法，特别地通过油包水技术去生产纳米颗粒。根据这种方法，依据本发明，将多种亲水的活性剂也纳入纳米颗粒较佳地是可能的。为此，在水中的活性剂乳化在含有聚合物的油相中。所述混合物乳化在另一水相中，并移除有机溶剂，例如，通过减少压力的方法。根据另一具体实施例，也可以使用油/水乳液(O/W)，特别是为了纳入疏水性的活性剂。在该具体实施例中，油相同时作为聚合物的溶剂和作为活性剂。
另一具体实施例提供，根据本发明的纳米颗粒的制备特别地通过基于溶剂蒸发的自乳化溶剂挥发(SESD)方法。为此，本发明提供在有机混合物中，较佳地在二氯甲烷和丙酮中溶解聚合物和活性剂，转移所述溶液到一具有稳定剂的水相中，并通过搅拌方法乳化。为此，本发明特别提供，亲水性溶剂，较佳地丙酮，分散到周围的水相中，根据本发明的纳米颗粒通过在减压下搅拌方式形成。一优选的具体实施例提供，通过增加可以混合在水中的溶剂的比例来减小粒径。
另一具体实施例提供，特别地通过盐析生产根据本发明的纳米颗粒。本发明特别提供，在该制备方法中省略了溶剂的使用。为了制备，聚合物，较佳地聚乙烯醇(PVA)添加到一种饱和溶液特别是氯化镁或醋酸镁中，从而以这种方式获得一种粘性凝胶作为水相。本发明还特别提供，较佳地在作为有机相的丙酮中溶解带有活性剂的生物可降解的聚合物。水相和有机相的混合提供通过在形成的两相系统中搅拌将有机相乳化在凝胶中。较佳地，本发明提供，通过添加足够水和较佳地丙酮扩散后，根据本发明的纳米颗粒沉淀在水相中。
另一具体实施例提供，通过喷雾干燥方式生产根据本发明的纳米颗粒。本发明较佳地提供，根据本发明的纳米颗粒是通过分别溅射或雾化其中溶解有生物可降解的聚合物和活性剂的溶液和乳液的方法制备的，特别地通过在热空气流中的二级喷嘴。
另一具体实施例提供，根据本发明的纳米颗粒特别地通过相分离-聚析的方法制备。为此，本发明提供，较佳地在二氯甲烷中溶解生物可降解的聚合物，以及在其中分散或乳化活性剂。本发明还提供，较佳地硅油，其不与有机聚合物相相混合，逐步加入同时搅拌，从而实现相分离。所述混合物进一步搅拌，同时较佳地加入庚烷(Heptan)，其中可以获得根据本发明的纳米颗粒。
用于制备根据本发明的一种细胞培养系统的方法较佳地涉及一种通过非接触式印刷方法制备的细胞培养系统。
在另一优选的具体实施例中，本发明涉及一种用于制备一种通过浸渍法制备的细胞培养系统的方法。
在另一优选的具体实施例中，本发明涉及一种用于制备一种通过LIFT方法制备的细胞培养系统的方法。
在另一优选的具体实施例中，本发明涉及一种用于制备一种细胞培养系统的方法，其中细胞培养系统通过电纺(旋涂)方法制备。
另外，本发明还涉及到一种用于培养细胞的方法，其中细胞插入到根据本发明的一种细胞培养系统中，及插入含有合适培养基的细胞培养容器中，在那里在促进培养的合适的条件下进行培养。
较佳地，培养的细胞是真核细胞，特别地人或动物来源的。较佳地，培养的细胞是原代细胞。
本发明的另一具体实施例提供，要培养的细胞是一种肿瘤细胞，特别是一种肿瘤细胞株，如MCF-7、HeLa、HepG2、PC3、CT-26、A125、A549、MRC-5、CHO、MelJuso28、Nalm6或Jurkat。
本发明的另一具体实施例提供，要培养的细胞是一种粘细胞，特别地一种建立的细胞株，如HUVEC或HaCaT。
本发明的另一具体实施例涉及一种用于通过根据本发明的细胞培养系统培养细胞的方法，其中，要培养的细胞是一种完全分化的细胞。
在另一优选的具体实施例中，本发明涉及一种方法，特别地一种非治疗的方法，用于制备分化的细胞或由非分化的细胞组成的联合的细胞结构，其中，非分化的细胞用根据本发明的细胞培养方法培养，分化的细胞或联合的细胞结构以这种方式获得。
在另一优选的具体实施例中，本发明涉及一种方法，特别地一种非治疗的方法，用于保持分化前或分化的细胞的分化阶段，其中分化前或分化的细胞是用根据本发明的细胞培养方法培养的。在另一具体实施例中，本发明涉及一种上述的、较佳地非治疗的方法，其中非分化的细胞是是用根据本发明的细胞培养方法培养的，并保持在所述的非分化状态。
较佳地，本发明提供，联合的细胞结构是移植体或试验系统。
本发明进一步提供，联合的细胞结构也可以是器官，器官部件，特别是气管或其部件。
本发明还涉及分化的细胞和联合的细胞结构，它们是在分化或非分化的细胞或联合的细胞结构采用根据本发明的培养后获得的，例如移植体、试验系统、器官、器官部件，尤其是气管或其部件。
本发明，特别是本细胞培养方法，使干细胞和前体细胞的长期培养成为可能，它们可以用于各种应用领域如移植体和试验系统，也可以用在基础研究中。
本发明，特别是本细胞培养方法，使功能细胞特别是原代细胞的增殖成为功能。
本发明，特别是本细胞培养方法，使定向分化成功能细胞和组织成为可能，例如在移植体的制备中，或为医药研发中的试验系统。
本发明，特别是本细胞培养方法，使用于治疗慢性/糖尿病伤口的移植体的制备成为可能，如通过由纳米颗粒诱导的细胞迁移的方法。
此外，本发明还涉及一种用于制备一种细胞的表达产物的方法，其中细胞可以用根据本发明的细胞培养方法进行培养，表达产物可以从所述细胞培养获得。
本发明还涉及一种细胞的表达产物，细胞是用根据本发明的细胞培养方法进行培养的，其表达产物可以获得。
根据其它权利要求，另外的具体实施例是显而易见的。
附图说明
本发明基于下列实施例和附图作进一步的详细说明。这些实施例应被理解为非限制性的。
图1表明生物可降解的纳米颗粒的REM图像。
图2表明来自实施例1的装载有8％BSA的PLGA颗粒的释放的结果。
图3表明在用PAH+羧基纳米颗粒包被的载玻片上第1天的细胞；A)反映试验1，B)试验2。
图4表明来自试验2的细胞，其在细胞培养瓶中培养作为对照；A)第1天，和B)第3天。
图5表明用具有氨基官能化的纳米颗粒在表面上进行培养，随后用具有平面形和球形表面的羧基纳米颗粒进行包被的细胞；A)PAA，第1天，试验1，B)PAH+羧基纳米颗粒，第1天，试验1，C)PAA，第3天，试验2，D)PAH+羧基纳米颗粒，第3天，试验2。
图6表明用具有氨基官能化的纳米颗粒在表面上进行培养，随后用具有平面形和球形表面的羧基纳米颗粒进行包被的细胞；A)PAH，第1天，方法3，B)PAA+氨基纳米颗粒，第1天，方法3，C)PAH，第3天，方法2，D)PAA+氨基纳米颗粒，第3天，方法2。
缩写：
PLGA＝聚乳酸-聚甘醇酸(Poly(Lactid-co-glycolid))
PLA＝聚乳酸(Polylactid)
PCL＝聚己酸内酯(Polycaprolacton)
PGA＝聚羟基乙酸(Polyglycolid)
PAA＝聚丙烯酸
PAH＝聚丙烯胺盐酸盐(Polyallylamin-hydrochlorid)
EGF＝表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)
BMP＝骨形成蛋白(Bone Morphogenic Protein)
SESD＝自乳化溶剂挥发方法(Spontaneous emulsification solvent diffusion method)
MES＝脂肪酸甲酯磺酸盐
具体实施方式
实施例1：
利用油包水、水再包油(W/O/W)技术从装载有BSA的PLGA制备纳米颗粒
最初120mg的聚乳酸-聚甘醇酸溶解在3.1ml的二氯甲烷(油相(O-Phase))中。在该相中，要被封装的蛋白(牛血清白蛋白(Bovin Serum Albumin，BSA))的水溶液通过超声波处理进行乳化(油包水(W/O))，另外，10mgBSA溶解在100μL的PBS缓冲液中，pH7.4。为了保护活性剂，各种稳定剂加入到水溶液中，如糖、蛋白、聚乙二醇和其它洗涤剂。制备的W/O相通过超声手段分散在另一水相(100ml水+500mg聚乙烯醇(Polyvinylalkohol))中以便形成油包水、水再包油的(W/O/W)乳液。含有聚合物的油相的有机溶液通过蒸发方法除去，因此聚合物沉淀下来作为纳米颗粒。颗粒的大小约为150至350nm。因此活性剂的纳入为大约5-8％重量。通过使用更大量的活性剂，也可以获得更大装载。
实施例2：
利用油包水、水再包油(W/O/W)技术从装载有BMP-2的PLA制备生物可降解的纳米颗粒
10mg聚乳酸溶解在300μl二氯甲烷中。10μl的BMP-2(骨成形蛋白-2(bone morphogenicprotein-2)，浓度为200mg/mL)的水溶液和0.05％泊洛沙姆188(Lutrol F 68)一起加入到该相中，然后通过超声进行乳化。
所述油包水1相(W1/O相)通过超声手段分散在一第二水相(10ml的0.5％PVA溶液)中。从油包水1、水2包油的乳液(W1/O/W2乳液)中去除二氯甲烷/丙酮混合物通过在真空下蒸发实现。大小为100-250nm的纳米颗粒沉淀出来。活性剂装载大约是10-15％重量(图1)。
实施例3：
利用油包水、水再包油(W/O/W)方法制备装载有BSA的PLA纳米颗粒
最初120mg的聚乳酸-聚甘醇酸溶解在3.1ml的二氯甲烷/丙酮(8/2)(油相(O-Phase))中。在该相中，要被封装的蛋白(牛血清白蛋白(Bovin Serum Albumin，BSA))的水溶液通过超声波处理进行乳化(油包水(W/O))，另外，10mgBSA溶解在100μL水中。制备的W/O相通过超声手段分散在另一水相(含0.5％聚乙烯醇的100ml水)中，形成油包水、水再包油的(W/O/W)乳液。含有聚合物的油相的有机溶液通过蒸发方法除去，因此聚合物沉淀下来作为纳米颗粒。颗粒的大小约为150至300nm。因此活性剂的纳入为大约7-8％重量。
测定释放动力学
50mg装载有BSA的聚乳酸-聚甘醇酸颗粒(502H)悬浮在5ml的PBS缓冲液(pH 7.4)中，并在37℃油浴中搅拌。每批样移除300μl，并离心。沉淀重悬浮在PBS缓冲液中，并返回到实验中。
从颗粒释放的活性剂的定量测定通过不同的方法实现，如高效液相色谱法(HPLC)、差异蛋白定量(Lowry或BCA定量法)、电子自旋共振(Elektronenspinresonanz，ESR)等(图2)。
实施例4：
在纳米颗粒表面偶联染料和蛋白
10mg(从实施例1)制备的生物可降解的PLGA纳米颗粒悬浮在0.4ml的0.1M的MES缓冲液中。300μl的氨基荧光素溶液(3mg/ml)加入其中。然而，蛋白，如整合素，也可以结合到颗粒表面。160μl的EDC溶液(浓度为110mg/ml)逐滴加入，并在室温下振动过夜。悬浮液离心，沉淀在缓冲液中洗涤。能够实现每g颗粒连接3μmol氨基荧光素。
实施例5：
为随后进行的使用细胞的实施例制备表面改性的二氧化硅纳米颗粒。
二氧化硅颗粒的合成：
12mmol四乙氧基硅烷(Tetraethoxysilan)和90mmol氨(NH₃)加入到200ml乙醇中。室温搅拌随后，颗粒采用多次离心的方式多次洗涤。结果是650mg具有平均粒径125nm的二氧化硅颗粒。
二氧化硅颗粒的氨基官能化：
1％重量的二氧化硅颗粒的悬浮水溶液加入到10％体积的25％氨水中。然后加入基于颗粒的20％重量的氨丙基三乙氧基硅烷(Aminopropyltriethoxysilan)，然后室温搅拌颗粒采用多次离心的方式多次洗涤，在其表面携带氨基官能团(在0.1M的醋酸缓冲液中的ζ电位：+35mV)。
二氧化硅颗粒的羧基官能化：
10ml的2％重量的氨基官能化的纳米颗粒的悬浮液加入到四氢呋喃(Tetrahydrofuran)中。加入260mg琥珀酸氢化物。5分钟超声波处理后，室温搅拌颗粒采用多次离心的方式多次洗涤，在其表面携带羧基官能团(在0.1M的醋酸缓冲液中的ζ电位：-35mV)。平均粒径为170nm。
实施例6：
通过纳米颗粒改性表面的方法优化细胞培养条件
对原代细胞在改性表面上的粘附、增殖、迁移和分化进行比较研究。除了纳米颗粒，改性表面也包括纤维状框架结构。接种的纳米颗粒以10至1000nm的距离存在于这个纤维状框架结构中。
对于表面改性，载玻片(OT)起先在40℃水浴中用2％(v/v)Hellmanex II溶液洗涤。表面的随后的羟基化在70℃在一种氨(30％)和过氧化氢(25％)3∶1(v/v)的溶液中进行，以产生负电荷。在羟基化之前或之后，以普遍已知方式用例如胶原蛋白溶液，如胶原蛋白I型，浓度为0.1至6mg/ml，进行包被。
表面的聚电解质包被通过所谓的逐层(Layer-by-Layer)技术形成。在这种方法中，起先将刚冲洗的、带负电荷的载玻片置于阳离子的聚烯丙基胺盐酸盐(Poly(allylamin-hydrochlorid))溶液(PAH溶液)(0.01M；基于单体)，或聚二甲基二烯丙基氯化铵(Poly(diallyl-dimethyl-ammoniumchlorid))溶液(PDADMAC溶液)(0.02M；基于单体)中，并在室温下孵育至少20分钟。仅一层阳离子聚乙烯层的构建足够用于随后的用羧基纳米颗粒包被。对于用氨基纳米颗粒包被，有必要在PAH包被后在阴离子的聚丙烯酸溶液(PAA溶液)(0.01M；基于单体)中孵育载玻片20分钟。二氧化硅纳米颗粒的连接通过静电吸引力实现。羧基纳米颗粒被阳离子聚电解质PAH吸引，氨基纳米颗粒被阴离子聚电解质PAA吸引。随后，表面的杀菌用70％乙醇实现。
不同表面改性的结果详细说明在表1中。表1显示人类角质细胞(Keratinozyten)在羧基和氨基纳米颗粒上的形态观察。在改性表面上的试验重复进行3次每次使用n＝3个样本。除了形态，以及因此原代细胞的分化状态以外，已经估计克隆的密度，以及因此细胞和增值的粘附数量。与培养瓶(图4)相反，角质细胞的明显加快的粘附和扩展(图3)发生在具有纤维状框架结构的改性表面上。特别地，用纳米颗粒改性的表面诱导更快的扩展，仅仅几个小时后即可见。
在这些改性的基体上的原代表皮细胞的形态类似于细胞培养瓶的原代表皮细胞。此外，在氨基官能化的表面上观察到原代细胞的更快的分化(图6)，而在羧基表面上的角质细胞的分化相当于对照的角质细胞(图5)。
表1

K＝克隆密度：0：没有克隆，或每个克隆小于5个细胞，+：克隆＜每个克隆20个细胞，++：克隆＞每个克隆20个细胞，+++：细胞层
M＝形态：-：细胞处于非常晚的分化阶段，或死亡的、非粘连的细胞，0：分化的细胞，细长形，细胞质大于核，+：细胞处于较早的分化阶段，一些较晚的分化细胞，++：所有细胞处于较早的分化阶段，立方形，细胞质/核比例平衡
^*OT＝载玻片