人IL18和抗CD20抗体癌症联合治疗.pdf

一般而言，本发明涉及人IL-18组合在癌症治疗中的用途。具体地，本发明涉及人IL-18和抗CD20抗体的组合。

1.  一种在患者中治疗或预防癌症的方法，包括给所述患者施用(i)人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)；和(ii)抗CD20抗体的步骤。

2.  一种在患者中治疗或预防癌症的方法，包括给所述患者施用(i)人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)；和(ii)Ofatumumab的步骤。

3.  一种在患者中治疗或预防癌症的方法，包括给所述患者施用(i)人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)；和(ii)利妥昔单抗的步骤。

4.  权利要求1、2或3的方法，其中所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗体的施用是同时的。

5.  权利要求1、2或3的方法，其中所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗体的施用是序贯的，其中先施用所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)。

6.  权利要求1、2或3的方法，其中所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗体的施用是序贯的，其中先施用所述抗体。

7.  权利要求1、2或3的方法，其中所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗体的施用是交错的。

8.  权利要求1的方法，其中所述抗体具有Fc介导的效应器功能。

9.  权利要求1、2或3的方法，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤。

10.  权利要求1、2或3的方法，其中所述癌症选自下组：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞新生物、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)包括低级、中级和高级FL、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结和脾型)、毛细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增殖性病症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、T细胞非何杰金氏淋巴瘤；和黑素瘤。

人IL-18和抗CD20抗体癌症联合治疗
对在先申请的交叉引用
本申请要求2007年3月23日提交的美国临时申请60/896855和2007年7月25日提交的美国临时申请60/952002的优先权。
发明领域
一般而言，本发明涉及与针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体组合的IL-18(也称为干扰素γ诱导因子(IGIF))的用途。
发明背景
活性人IL-18含有157个氨基酸残基。它具有有力的生物学活性，包括诱导T细胞和脾细胞生成干扰素-γ，增强NK细胞的杀伤活性，和促进幼稚CD4⁺T细胞分化成Th1细胞。另外，人IL-18提升GM-CSF的生成，并降低IL-10的生成。CD4⁺T细胞是所有免疫应答的中枢调控元件。它们分成两个子集，即Th1和Th2。每个子集以其分泌不同细胞因子的能力来限定。有趣的是，最有力的分化诱导物是细胞因子自身。幼稚前体发育成Th2细胞是由IL-4诱导的。在发现IL-18前，认为IL-12是主要的Th1诱导性细胞因子。
Th1细胞分泌IL-2、干扰素-γ、和TNF-β。干扰素-γ(特征性的Th1细胞因子)直接对巨噬细胞起作用以增强它们杀微生物的和吞噬细胞的活性。结果，活化的巨噬细胞能有效地破坏胞内病原体和肿瘤细胞。Th2细胞生成IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，它们通过帮助B细胞发育成抗体生成细胞而起作用。总之，Th1细胞主要负责细胞介导的免疫，而Th2细胞负责体液免疫。
基于广谱的免疫刺激特性，已经在多种临床前肿瘤模型中研究了IL-18。在免疫原性肿瘤中观察到作为单一疗法使用的IL-18的抗肿瘤活性。在MOPC-315浆细胞瘤(高度免疫原性肿瘤)的晚期肿瘤(大于100cm³)模型中观察到最有力的抗肿瘤效果。在这种模型中，每日施用鼠IL-18(5mg/Kg)持续约30天导致可再现的肿瘤消退和治愈。用亲本肿瘤再次考验导致肿瘤排斥，提示对免疫记忆的诱导。关于此模型中牵涉细胞免疫的别的证据来自在携带晚期MOPC-315肿瘤的重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)中进行的实验，所述晚期MOPC-315肿瘤在使用类似的IL-18日程表后未能消退。关于IL-18介导细胞免疫的进一步支持还来自对对照和经IL-18处理的小鼠中建立的MOPC-315肿瘤实施的免疫组织化学。这表明相对于对照而言，经IL-18处理的动物中由CD8⁺T淋巴细胞、NK细胞、活化的巨噬细胞、和树突细胞组成的细胞浸润增加。在体外，来自用IL-18处理的动物的PBMC或脾细胞显示了针对肿瘤的NK和CTL细胞毒性。另外，看起来完整的Fas/Fas配体途径对抗肿瘤应答是有益的。
利妥昔单抗(rituximab)是一种嵌合单克隆抗体，其由识别人CD20抗原的鼠抗原结合位点与人IgG1恒定区融合而组成。利妥昔单抗(作为单一药剂)在无痛性NHL中具有显著活性。在166名复发性或顽固性无痛性NHL患者的枢要(pivotal)单臂临床研究中，总体应答率是48％，而完全应答(CR)率是6％。McLaughlin等，J.Clin.Oncol.16：2825-2833(1998)。在先前未治疗的无痛性NHL患者中，利妥昔单抗疗法具有64-73％的总体应答率和15-26％的CR率。Hainsworth等，Blood 95：3052-3056(2000)；Colombat等，Blood 97：101-106(2001)。此外，多项随机化III期研究显示了，向常规化疗添加利妥昔单抗改善了NHL患者的存活。Marcus等，Blood 105：1417-1423(2005)；Marcus等，Blood 104：3064-3071(2004)；Hiddemann等，Blood 106：3725-3732(2005)；Feugier等，J.Clin.Oncol.23：4117-4126(2005)。然而，由于化疗的毒性较高，利妥昔单抗单一疗法仍被认为是无痛性淋巴瘤患者中的一个选项。
正在进行研究，以确定增强抗肿瘤活性的方式，并改善利妥昔单抗的功效。数种机制可有助于利妥昔单抗的体内功效。利妥昔单抗对淋巴瘤细胞表面上的CD20的结合能触发胞内信号传导途径，导致凋亡或程序性细胞死亡。Shan等，Blood 91：1644-1652(1998)；Pedersen等，Blood 99：1314-1319(2002)。此外，利妥昔单抗能活化补体种类，引起补体依赖性细胞溶解。Cragg等，Blood 101：1045-1052(2003)；Manches等，Blood 101：949-954(2003)。越来越多的证据提示，在施用利妥昔单抗后ADCC与CDC在消除肿瘤细胞方面协作。Manches等，见上文；Golay等，Haematologica 88：1002-1012(2003)；Clynes等，Nat.Med.6：443-446(2000)。在抗体的恒定(Fc)区结合至效应细胞(诸如NK细胞或单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)表面上的Fc受体时，ADCC被触发。在人B细胞淋巴瘤的鼠模型中，在缺乏活化性Fc受体的小鼠中，利妥昔单抗的功效被消除。相比之下，在缺乏抑制性Fc受体的小鼠中，单克隆抗体疗法得到增强。携带Fc受体的效应细胞对于利妥昔单抗在此模型中的功效是至关重要的。人体内的主要活化性Fc受体是CD16a(FcγRIIIa)，其由NK细胞和单核细胞表达。已经显示了，人FcγRIIIa基因中第158位的多态性(苯丙氨酸对缬氨酸)与对利妥昔单抗的响应相关。158VV纯合基因型与在体外较强的IgG结合人NK细胞和触发通过NK细胞进行的ADCC有关(Koene等，Blood90：1109-1114(1997)；Dall’Ozzo等，Cancer Res.64：4664-4669(2004))，而且还与利妥昔单抗疗法后较高的应答率有关。Weng等，J.Clin.Oncol.21：3940-3947(2003)；Cartron等，Blood 104：2635-2642(2004)。这些数据支持如下假设，即NK细胞介导的ADCC对于利妥昔单抗疗法在淋巴瘤患者中的效力也是重要的。
一种用于改善利妥昔单抗功效的策略是施用能引起携带Fc受体的效应细胞(包括NK细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)扩充和/或活化的细胞因子。I期临床试验显示了，利妥昔单抗能安全地与IL-2、IL-12、或GM-CSF组合地给予淋巴瘤患者。Rossi等，Blood 106：2760(摘要2432)(2005)；McLaughlin等，Ann.Oncol.16(增刊5)：v68(摘要104)(2005)；Ansell等，Blood99：67-74(2002)；Eisenbeis等，Clin.Cancer Res.10：6101-6110(2004)；Gluck等，Clin.Cancer Res.10：2253-2264(2004)；Friedberg等，Br.J.Haematol.117：828-834(2002)。在这些研究中观察到22-79％的总体客观应答率(overallobjective response rate)和5-45％的完全应答率(complete response rate)。另外，生物标志(诸如绝对NK计数和离体ADCC活性)与应答率相关。这些研究中的大多数主要包括患有复发性和顽固性疾病的和患有攻击性淋巴瘤亚型(DLBCL和套细胞淋巴瘤)的患者。
发明概述
一方面，本发明涉及一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，包括同时或序贯地给所述患者施用(i)人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)；和(ii)针对CD20抗原的抗体(其它地方简称为抗CD20抗体)的步骤，用于预防和/或治疗致瘤性疾病。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，包括交错施用(i)人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)；和(ii)针对CD20抗原的抗体(其它地方简称为抗CD20抗体)的步骤，用于预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)。
一方面，本发明涉及在预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)中使用的人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗CD20抗体。
一方面，本发明涉及在预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)中同时或序贯使用(施用)的人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗CD20抗体。
一方面，本发明涉及人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)在制备药物中的用途，所述药物与抗CD20抗体组合地用于预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)。
一方面，本发明涉及抗CD20抗体在制备药物中的用途，所述药物与人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)组合地用于预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)。
一方面，本发明涉及人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)和抗CD20抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)。
一方面，本发明涉及在预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)中与抗CD20抗体组合使用的人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)。
一方面，本发明涉及在预防和/或治疗致瘤性疾病(癌症)中与人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)组合使用的抗CD20抗体。人IL-18多肽和抗CD20抗体可以分开、序贯和/或同时施用。此外，人IL-18多肽和抗CD20抗体可以以交错方式施用。
在一个实施方案中，在所述抗CD20抗体前施用所述人IL-18多肽。
在一个实施方案中，在所述人IL-18多肽前施用所述抗CD20抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD20抗体是单克隆的。
在一个实施方案中，所述抗CD20抗体具有Fc介导的效应器功能。
在一个实施方案中，所述抗CD20抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD20抗体是嵌合的、人源化的或人的单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的单克隆抗体(抗CD20抗体)是选自下组的全长抗体：全长IgG1抗体、全长IgG2抗体、全长IgG3抗体、全长IgG4抗体、全长IgM抗体、全长IgA1抗体、全长IgA2抗体、全长分泌性IgA抗体、全长IgD抗体、和全长IgE抗体，其中所述抗体在真核细胞中糖基化。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD20抗体是全长抗体，诸如全长IgG1抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD20抗体是抗体片段，诸如scFv或UniBody^TM(如WO 2007/059782中所披露的单价抗体)。在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体是结合域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的处于SEQ ID NO：1的重链可变区或SEQ IDNO：2的轻链可变区形式的结合域多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体以至少与对人CD20相同的亲和力结合突变型P172S CD20(第172位脯氨酸突变成丝氨酸)。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体结合CD20上的如下表位：
(i)其不包含或者不需要氨基酸残基第172位脯氨酸；
(ii)其不包含或者不需要氨基酸残基第170位丙氨酸或第172位脯氨酸；
(iii)其包含或者需要氨基酸残基第163位天冬酰胺和第166位天冬酰胺；
(iv)其不包含或者不需要氨基酸残基第172位脯氨酸，但是其包含或者需要氨基酸残基第163位天冬酰胺和第166位天冬酰胺；或
(v)其不包含或者不需要氨基酸残基第170位丙氨酸或第172位脯氨酸，但是其包含或者需要氨基酸残基第163位天冬酰胺和第166位天冬酰胺。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体结合人CD20的第一胞外小环中的表位。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体结合CD20上的不连续表位。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体结合CD20上的不连续表位，其中所述表位包含第一胞外小环的一部分和第二胞外环的一部分。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体结合CD20上的不连续表位，其中所述表位具有第一胞外小环的残基AGIYAP和第二胞外环的残基MESLNFIRAHTPYI。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体具有一项或多项选自下组的特征：
(i)能够在存在补体的情况中对表达CD20的细胞诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)；
(ii)能够在存在补体的情况中对表达CD20和高水平的CD55和/或CD59的细胞诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)；
(iii)能够对表达CD20的细胞诱导凋亡；
(iv)能够在存在效应细胞的情况中对表达CD20的细胞诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)；
(v)能够对表达CD20的细胞诱导同型粘附；
(vi)能够在结合CD20后移位入脂筏中；
(vii)能够消减表达CD20的细胞；
(viii)能够消减表达低水平CD20的细胞(低CD20细胞)；和
(ix)能够有效地消减人组织中原位的B细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体包含选自SEQ ID NO：5、9、或11的VH CDR3序列。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体包含SEQ ID NO：3的VH CDR1、SEQ ID NO：4的VH CDR2、SEQ ID NO：5的VH CDR3、SEQ IDNO：6的VL CDR1、SEQ ID NO：7的VL CDR2和SEQ ID NO：8的VL CDR3序列。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体包含SEQ ID NO：10的VH CDR1-CDR3跨越序列。
在本发明的一个实施方案中，所述针对CD20的抗体具有这样的人重链可变区和人轻链可变区，它们分别包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所列出的氨基酸序列；或分别与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所列出的氨基酸序列至少95％同源，且更优选至少98％，或至少99％同源的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述CD20结合分子选自WO 2004/035607中所披露的抗CD20抗体之一，诸如Ofatumumab(2F2)、11B8、或7D8；WO2005/103081中所披露的抗体之一，诸如2C6；WO 2004/103404中所披露的抗体之一，AME-133(一种人源化的且经过优化的抗CD20单克隆抗体，由Applied Molecular Evolution所开发的)；US 2003/0118592中所披露的抗体之一，TRU-015(CytoxB20G，自抗CD20抗体上的关键域衍生的小模块免疫药学融合蛋白，由Trubion Pharmaceuticals Inc所开发的)；WO 2003/68821中所披露的抗体之一，IMMU-106(一种人源化抗CD20单克隆抗体)；WO2004/56312中所披露的抗体之一，Ocrelizumab(2H7.v16、PRO-70769、R-1594)；(托西莫单抗(Tositumomab))；和(利妥昔单抗)。
术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在经CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体、同等型和物种同系物。如本领域中所公认的，CD20的同义词包括B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16和Bp35。人CD20具有UniProtKB/Swiss-Prot条目P11836。
如本文中所使用的，术语“免疫球蛋白”指一类结构上相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成，即一对低分子量的轻(L)链和一对重(H)链，所有四者通过二硫键而相互连接。免疫球蛋白的结构已经被充分表征。参见例如Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编，第2版Raven Press，N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区CH通常由三个结构域(即CH1、CH2、和CH3)构成。每条轻链通常由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区通常由一个结构域(即CL)构成。VH区和VL区可以进一步细分成高变异性的区域(或可在结构限定环的形式和/或序列方面高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，其用更保守的、称为框架区(FR)的区域点缀。
每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，以如下次序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还可参见Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196，901-917(1987))。典型地，通过Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中所描述的方法来实施此区域中氨基酸残基的编号(诸如如Kabat中的或依照Kabat的可变域残基编号(方式)等短语在本文中指用于重链可变域或轻链可变域的这种编号系统)。使用此编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以含有较少或额外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含VH CDR2残基52后的单一氨基酸插入(例如依照Kabat的残基52a)及重链FR残基82后的多个插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
如本文中所使用的，术语“抗体”指这样的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其中任一者的衍生物，其具有在典型的生理学条件下特异性结合抗原达显著的一段时间的能力，诸如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长、约3天、4天、5天、6天、7天或更长等，或任何其它有关的功能限定的时间段(诸如足以诱导、促进、增强、和/或调控与抗体结合抗原有关的生理学应答的时间和/或足以让抗体募集Fc介导的效应器活性的时间)。
免疫球蛋白分子的重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(诸如效应细胞)和补体系统的成分，诸如C1q(补体激活经典途径中的第一种成分)。
抗CD20抗体可以是单特异性的、双特异性的、或多特异性的。实际上，在CD20的一部分之外，本发明所提供的双特异性抗体、双抗体等还可以结合任何合适的靶物。
如上文所指明的，术语“抗体”在本文中使用时(除非另有说明或者内容明显相矛盾)包括通过任何已知技术(诸如酶促切割、肽合成和重组技术)所提供的保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。已经显示了，可以通过全长(完整)抗体的片段来实施抗体的抗原结合功能。术语“抗体”内所涵盖的抗原结合片段的例子包括但不限于(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab)₂和F(ab’)₂片段，即包含由铰链区处的二硫桥相连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其基本上由VH和CH1域组成；(iv)Fv片段，其基本上由抗体单臂的VL和VH域组成；(v)dAb片段(Ward等，Nature 341，544 546(1989))，其基本上由VH域组成，也称为域抗体(Holt等(2003年11月)Trends Biotechnol.21(11)：484-90)；(vi)羊驼(camelid)抗体或纳米体(nanobody)(Revets等(2005年1月)Expert Opin Biol Ther.5(1)：111-24)；(vii)分离的互补决定区(CDR)，诸如VH CDR3；(viii)UniBody^TM(WO2007/059782中所披露的一种单价抗体)；(ix)单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird等，Science 242，423-426(1988)和Huston等，PNAS USA 85，5879-5883(1988)；(x)双抗体(scFv二聚物)(其可以是单特异性的或双特异性的)(关于双抗体的说明参见例如PNAS USA 90(14)，6444-6448(1993)、EP 404097或WO 93/11161)、三抗体或四抗体。虽然此类片段一般包括在抗体的定义之内，但是它们共同地和各自独立地是本发明的独特特征，展现出不同的生物学特性和效用。在本文中进一步讨论了本发明语境中的这些和其它有用的抗体片段。
应当理解的是，术语抗体一般包括单克隆抗体以及多克隆抗体。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的、鼠的等。所生成的抗体可以拥有任何同种型。
如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而导入的突变)。不过，如本文中所使用的，术语“人抗体”并不意图包括如下的抗体，其中自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系衍生的CDR序列已经被嫁接入人框架序列中。
如本文中所使用的，若人抗体是自使用人免疫球蛋白序列的系统获得的，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者通过筛选人免疫球蛋白基因文库来实现，且其中选定的人抗体与由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列方面至少90％，诸如至少95％，例如至少96％，诸如至少97％，例如至少98％，或诸如至少99％相同，则所述人抗体“衍生自”特定的种系序列。典型地，自特定人种系序列衍生的人抗体会展示出相对于由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列的不超过10处氨基酸差异，诸如不超过5处，例如不超过4处、3处、2处、或1处氨基酸差异。对于VH抗体序列，VH CDR3域不包括在此比较之中。
术语“嵌合抗体”指含有一个或多个来自一种抗体的区域和一个或多个来自一种或多种其它抗体的区域的抗体。术语“嵌合抗体”包括单价的、二价的、或多价的抗体。单价嵌合抗体是由经由二硫桥与嵌合L链相联合的嵌合H链所形成的二聚物(HL)。二价嵌合抗体是由经由至少一个二硫桥相联合的两个HL二聚物所形成的四聚物(H2L2)。也可以生成多价嵌合抗体，例如通过采用装配成具有2个以上结合位点的分子的CH区(例如来自IgM H链，或μ链的)来实现。典型地，嵌合抗体指如下的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与自特定物种衍生或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如US 4,816,567和Morrison等，PNAS USA 81，6851-6855(1984))。通过本领域中公知的重组方法来生成嵌合抗体(参见例如Cabilly等，PNAS USA 81，3273-3277(1984)；Morrison等，PNAS USA 81，6851-6855(1984)；Boulianne等，Nature 312，643-646(1984)；EP125023；Neuberger等，Nature 314，268-270(1985)；EP171496；EP173494；WO 86/01533；EP184187；Sahagan等，J.Immunol.137，1066-1074(1986)；WO 87/02671；Liu等，PNAS USA 84，3439-3443(1987)；Sun等，PNAS USA 84，214-218(1987)；Better等，Science 240，1041-1043(1988)和Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988))。
术语“人源化抗体”指最低限度含有自非人抗体衍生的序列的人抗体。典型地，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物的高变区残基替换得到的抗体。
此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分人免疫球蛋白恒定区。更多细节参见Jones等，Nature 321，522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332，323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的、展示单一结合特异性的抗体。人单克隆抗体可以由包括与永生化细胞融合的B细胞的杂交瘤生成，所述B细胞自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因或转染色体非人动物(诸如转基因小鼠)获得。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”包括通过重组手段所制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如(a)自人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(诸如小鼠)或自其制备的杂交瘤(在本文中别处进一步描述的)分离的抗体，(b)自为了表达该抗体而转化的宿主细胞(诸如转染瘤)分离的抗体，(c)自重组的、组合的人抗体文库分离的抗体，和(d)通过牵涉将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它手段所制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，在使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，如此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下的序列，所述序列虽然衍生自人种系VH和VL序列并与其相关，但是可以并非天然存在于体内人抗体种系全集内。
术语“转基因的非人动物”指具有包含一种或多种人重链和/或轻链转基因或转染色体(或是整合入或是未整合入动物的天然基因组DNA中)的基因组且能够表达完全人的抗体的非人动物。例如，转基因小鼠可以具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得该小鼠在用CD20抗原和/或表达CD20的细胞免疫时生成人抗CD20抗体。可以将人重链转基因整合入小鼠的染色体DNA中，正如转基因小鼠的情况，例如诸如HCo7或HCo12小鼠，或者可以将人重链转基因在染色体外维持，正如WO02/43478中所记载的转染色体的情况。此类转基因和转染色体小鼠(在本文中统称为“转基因小鼠”)能够通过经历V-D-重组和同种型转换而生成针对给定抗原的人单克隆抗体的多种同种型(诸如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。转基因的非人动物还可以用于生成针对特定抗原的抗体，其通过导入编码此特定抗体的基因来实现，例如通过将所述基因可操作连接至动物乳汁中所表达的基因。
能预防和/或治疗的致瘤性疾病(癌症)包括B细胞淋巴瘤，例如非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)，包括前体B细胞成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(precursor B cell lymphoblastic leukemia/lymphoma)和成熟B细胞新生物(mature B cell neoplasm)，诸如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B cellchronic lymhocytic leukemia，CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyticlymphoma，SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病(B cell prolymphocyticleukemia)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤滤泡中心淋巴瘤(cutaneous follicle centerlymphoma)、边缘区B细胞淋巴瘤(marginal zone B cell lymphoma)(MALT型、结和脾型)、毛细胞性白血病(hairy cell leukemia)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、浆细胞瘤(plasmacytoma)、浆细胞性骨髓瘤(plasma cell myeloma)、移植后淋巴增殖性病症(post-transplant lymphoproliferative disorder)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlarge-cell lymphoma，ALCL)、T细胞非何杰金氏淋巴瘤(T-cell Non-Hodgkin’slymphoma)；何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)；和黑素瘤(melanoma)。

附图简述
图1显示了天然人IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。
图2显示了鼠IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
图3显示了与组合的mIL-18(SEQ ID NO：17)在人B细胞淋巴瘤鼠模型中的抗肿瘤活性。CR代表完全消退。
图4显示了在使用GraphPad对来自图3的数据进行绘图和分析时的统计显著性。具体地，此图比较植入后第19天的肿瘤体积。
图5显示了人B细胞淋巴瘤模型中鼠IL-18(SEQ ID NO：17)/组合的植入后第25天肿瘤体积。
图6A和图6B显示了人B细胞淋巴瘤模型中鼠IL-18(SEQ ID NO：17)/组合的肿瘤生长体积中值和均值。
图7和图8显示了人B细胞淋巴瘤模型中鼠IL-18(SEQ ID NO：17)/组合的植入后第27天肿瘤体积，与任一单独的药剂相比。
图9显示了作为单一疗法或与鼠IL-18(SEQ ID NO：17)组合的Ofatumumab对皮下Ramos人淋巴瘤在SCID小鼠中生长的影响(n＝6只小鼠/组；均值和SD)。(HuMax指Ofatumumab。)
图10显示了接种后第28天作为单一疗法或与鼠IL-18(SEQ ID NO：17)组合的Ofatumumab在SCID小鼠中在皮下Ramos人淋巴瘤模型中的效果(n＝6只小鼠/组；均值+/-SD)。(HuMax指Ofatumumab。)
发明详述
因为肿瘤通常是非免疫原性的，所以临床前研究的焦点聚焦于IL-18与单克隆抗体的联合疗法。组合两种不同药剂(每种药剂具有不同的肿瘤杀伤机制)导致协同性抗肿瘤活性。下文呈现IL-18联合疗法的例子。
实施例1聚焦于与组合的IL-18在人B细胞淋巴瘤中的应用。此研究的目的是调查IL-18和的组合在人B细胞淋巴瘤模型中是否提供超过单独的IL-18或的单一疗法的益处。IL-18与单克隆抗体的组合(例如IL-18与利妥昔单抗)在晚期肿瘤模型(SCID小鼠异种移植物)中显示协同性抗肿瘤活性。因为利妥昔单抗仅结合表达CD20的人肿瘤细胞，所以在SCID小鼠中在人淋巴瘤异种移植物模型中实施抗肿瘤活性的评估。
另一个实施例是调查IL-18与其它临床上有关的癌症治疗的组合是否会导致优于单独的单一疗法的增强的抗肿瘤活性。现在我们已经证明了，Ofatumumab与IL-18一起在联合疗法中使用时在Ramos人异种移植物模型中具有协同效应。如此，抗CD20抗体与IL-18的组合提供超过单独的IL-18或抗CD20抗体的单一疗法的益处。
与单克隆抗体的组合提供增强杀死肿瘤细胞的ADCC机制的潜力。针对CD20的抗体在与mIL-18(SEQ ID NO：17)组合时显示抗肿瘤活性的增强。数种机制可能促成例如的功效；然而，越来越多的证据提示，ADCC在施用后的肿瘤细胞消除中起重要作用。在抗体的恒定(Fc)区结合至效应细胞(诸如天然杀伤(NK)细胞或单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)表面上的Fc受体后ADCC被触发。缺乏Fc受体的小鼠中的一项研究显示了，Rituxan对人B细胞淋巴瘤的效果被消除(Uchida等2004；199(12)：1659)。如此，携带Fc受体的效应细胞对于的功效是至关重要的。CD16a(FcγRIIIa)是人体内的重要Fc受体，其由NK细胞和巨噬细胞表达。实施例1中的数据支持如下假说，即NK细胞介导的ADCC对于疗法在淋巴瘤患者中的效力是重要的。
一种用于改善功效的有希望的策略是施用能引起携带Fc受体的效应细胞(包括NK细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)扩充和/或活化的细胞因子，诸如IL-18。实施例1中用IL-18与组合进行的临床前小鼠肿瘤模型研究显示了超过单一疗法的益处。在这种模型中，无法测试IL-18的全部益处，因为该模型要求仅具有NK功能性细胞的SCID免疫受损小鼠中的人异种移植物。实施例1中的数据支持的是，这些ADCC NK效应细胞的扩充在IL-18和组合中显示益处。作为单一疗法在所测试的最高剂量是有活性的。然而，在与mIL-18(SEQ ID NO：17)联合使用较低剂量的时能看到类似水平的活性，指明两点，即该模型对的机制敏感，和响应能由IL-18增强。此外，我们在这里(图9，图10)显示了，另一种抗CD20抗体(Ofatumumab，HuMax-CD20)具有类似的与IL-18的协同效应。因此，认为IL-18与任何其它抗CD20抗体的组合会显示相同协同效应。
实施例3是I期临床方案，用以评估IL-18与利妥昔单抗组合在CD20⁺B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者中的安全性和生物学活性。此研究使用利妥昔单抗与剂量渐增的IL-18的组合的标准治疗方案以鉴定安全的且可耐受的，而且给出最大限度的生物学效应(如由选定的生物标志例如活化的NK细胞所表明的)的剂量。鉴于IL-18在以单一疗法给转移性黑素瘤患者施用时优良的安全性和耐受性概况，预期不会在该研究中达到组合的最大限度耐受剂量(MTD)；然而，若在非何杰金氏淋巴瘤患者中鉴定出剂量限制性毒性，则将此研究设计成限定MTD。
实施例1中的这些数据显示了，抗癌剂与IL-18的组合具有临床益处，因为这些组合提供了两种不同作用机制：一种是对肿瘤细胞的直接作用，而IL-18能够提升患者的免疫细胞。这两种机制能彼此互补，而且潜在地导致持久的、卓越的抗肿瘤活性，这是由于IL-18产生免疫记忆的能力。总的来说，实施例1证明IL-18与针对CD20的抗体的组合导致协同性和卓越的活性。
人IL-18多肽披露于EP 0692536A2、EP 0712931A2、EP0767178A1、和WO 97/2441。天然人IL-18(“hIL-18”)的氨基酸序列列于SEQ ID NO：16中。人IL-18多肽是干扰素-γ诱导多肽。它们在对细胞介导的免疫的诱导中起主要作用，包括诱导T细胞和脾细胞生成干扰素-γ、增强NK细胞的杀伤活性、和促进未接触抗原的CD4⁺T细胞分化成Th1细胞。
IL-18多肽
可以通过公知方法自重组细胞培养物回收并纯化本发明的IL-18多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、凝集素层析、和高效液相层析。若多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中变性，则可采用用于重折叠蛋白质的公知技术来重建活性构象。用于纯化和生成活性人IL-18的方法在WO01/098455中列出。
本发明还提供了包含人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)的药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的化合物，并可进一步包含药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类药用载体可以是无菌的液体，诸如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成起源的，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。可在静脉内施用药物组合物时使用水作为载体。也可采用盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液作为液体载体，例如用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。若想要的话，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放配制剂等形式。组合物可用传统的粘合剂和载体(诸如甘油三酸酯)配制成栓剂。口服配制剂可包括标准的载体，诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体的例子记载于E.W.Martin的REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES。此类组合物会含有治疗有效量的化合物(通常以纯化形式)以及合适量的载体，以便提供用于向患者正确施用的形式。配制剂应当适合施用模式。
在本申请中，具体例示人或鼠IL-18(分别为SEQ ID NO：16或17)。然而，本发明的精神不限于具体的人和鼠IL-18。如此，与SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：17的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的任何多肽可以替代任一SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17。如此，在另一个实施方案中，与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的任何多肽定义为IL-18(或IL-18多肽)。
对于氨基酸(多肽)序列，术语“同一性”指明在用合适的插入或删除最佳地比对和比较时两种氨基酸序列之间的同一性程度。
两种序列之间的百分比同一性是序列所共享的相同位置的数目的函数(即％同一性＝相同位置数/位置总数乘100)，其考虑缺口的数目，和每处缺口的长度，这些缺口是实现两种序列的最佳比对而需要导入的。可以使用数学算法来实现两种序列之间的序列比较和百分比同一性测定，如下文非限制性实施例中所描述的。
可以使用已经收入ALIGN程序(第2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))算法来测定两种氨基酸序列之间的百分比同一性，其使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4来进行。另外，可以使用已经收入GCG软件包(在http://www.gcg.com可获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法来测定两种氨基酸序列之间的百分比同一性，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、和缺口权重16、14、12、10、8、6、或4和长度权重1、2、3、4、5、或6来进行。
在本发明的一个实施方案中，依照常规规程将组合物配制成适应向人类静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌的、等张的水缓冲液中的溶液。在合适的情况中，组合物还可以包括增溶剂和在注射位置减轻疼痛的局部麻醉剂诸如利多卡因(lignocaine)。一般而言，以单位剂量形式分开地或混合在一起地提供各成分，例如指明活性剂数量的密封容器诸如安瓿或小袋(sachette)中的干的冻干粉或无水浓缩液。若要通过输注来施用组合物，则其可用装有无菌的药用级水或盐水的输液瓶来分配。若通过注射来施用组合物，则可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可在施用前混合各成分。
因而，可以在药物制造中使用所述多肽。本发明的药物组合物可以配制成供胃肠外施用的溶液或冻干粉。使用前可通过添加合适的稀释剂或其它药学可接受载体来使粉末重建。液体配制剂可以是缓冲的、等张的水溶液。合适的稀释剂的例子是正常的、等张的盐水溶液、水中的标准的5％右旋糖或缓冲的醋酸钠或醋酸铵溶液。此类配制剂尤其适合于胃肠外施用，但也可用于口服施用或装在供吸入用的定量吸入器或雾化器中。可能希望向此类药物组合物添加赋形剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、或柠檬酸钠。
或者，可以以乳剂或糖桨包囊、制片或制备多肽，供口服施用。可添加药学可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂、或明胶。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水、和水。载体还可包括单独的或与蜡一起的持续释放物质，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固体载体的量有所不同，但是会在每剂量单位约20mg至约1g之间。药物制剂遵循常规药学技术来制备，对于片剂形式，在合适时牵涉碾磨、混合、粒化、和压紧；或者对于明胶硬胶囊形式，牵涉碾磨、混合和填料。在使用液体载体时，制剂会采取糖浆、酏剂、乳剂、或水的、或非水的悬浮液形式。这样的液体配制剂可通过口(p.o.)直接施用或填充入明胶软胶囊中。
人IL-18多肽可制备为在药学可接受载体中含有有效量的作为活性成分的多肽的药物组合物。在本发明的组合物中，可以采用含有多肽的、缓冲于生理学pH的、准备好进行注射的形式的水悬浮液或溶液。供胃肠外施用的组合物通常会包含在药学可接受的载体(诸如水性载体)中溶解的本发明多肽或其混合物的溶液。可以采用多种水性载体，例如0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，且通常没有颗粒物。这些溶液可以通过常规的、公知的灭菌技术(例如过滤)来灭菌。组合物可以含有接近生理学条件所要求的药学可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂等。依照选定的特定施用模式，本发明的多肽在此类药物配制剂中的浓度可以有广泛变化，即从小于约0.5％，通常为或至少约1％，至多达15或20％(按重量计)，并且主要会根据液体体积、粘度等来选择。
如此，用于肌肉内注射的本发明药物组合物可以制备成含有1mL无菌缓冲水，和约1ng-约100mg之间(例如约50ng-约30mg，或约5mg-约25mg)的本发明多肽。类似地，用于静脉内输注的本发明药物组合物可以制成含有约250mL无菌林格氏(Ringer)溶液，和约1mg-约30mg、或约5mg-约25mg的本发明多肽。用于制备可胃肠外施用的组合物的现行方法是公知的或者对于本领域技术人员会是显而易见的，而且更详细地记载于例如REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCE，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。
本发明的多肽在以药物制剂制备时可以以单位剂量形式存在。本领域技术人员能容易地确定合适的治疗有效剂量。若合适的话，可以在响应期期间以内科医生酌情选定的合适时间间隔重复这样的剂量。另外，任选的是，可以采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。配制剂中要采用的精确剂量还会取决于施用路径、和疾病或病症的严重性，并且应当依照从业人员的判断和每名患者的情况决定。有效剂量可以从自体外或动物模型测试系统推导的剂量-响应曲线外推。
对于多肽，给患者施用的剂量通常是0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。给患者施用的剂量可以在0.1mg/kg和20mg/kg患者体重之间，或者，1mg/kg至10mg/kg患者体重。一般而言，人多肽具有比来自其它物种的多肽要长的人体内半衰期，这是由于对外来多肽的免疫应答。如此，人多肽的较低剂量和较不频繁的施用通常是有可能的。此外，可通过修饰诸如例如脂化(lipidation)来增强抗体的摄取和组织穿透(例如进入脑中)，从而降低本发明多肽的施用剂量和频率。
本发明还提供了药物包或试剂盒，其包含装有本发明药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。任选地，此类容器可以结合有由管理药物或生物产品的制备、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映该机构对针对人体施用的制备、使用或销售的批准。在本发明的另一个实施方案中，试剂盒可以装备有满足用于治疗特定适应症的剂量要求所需要的合适数目的容器。
在另一个实施方案中，化合物或组合物可以在媒介物(特别是脂质体)中投递(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，于LIPOSOMESIN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，New York，页353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，页317-327；通常参见同上)。
在又一个实施方案中，化合物或组合物可以在受控释放系统中投递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，见上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；CONTROLLED DRUGBIOAVAILABILITY，DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger等，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还可参见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在又一个实施方案中，受控释放系统可放置在治疗靶(即脑)的附近，如此仅需要系统剂量的一部分(参见例如Goodson，于MEDICALAPPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，见上文，卷2，页115-138(1984))。Langer(Science 249：1527-1533(1990))的综述中讨论了其它受控释放系统。
人IL-18多肽(SEQ ID NO：16)可以通过任何合适的内部路径施用，而且可以根据需要重复，例如频率为每天1-3次持续1天-约3周之间至每周一次或两周一次。或者，可改变所述肽以降低电荷密度，如此容许口服生物利用度。治疗的剂量和持续时间与本发明的分子在人循环中的相对持续时间有关，并且可由本领域技术人员根据所治疗的疾患和患者的一般健康来调整。
本发明提供了通过给人患者施用有效量的包含人IL-18多肽(SEQ IDNO：16)的本发明药物组合物或化合物来治疗、抑制和预防的方法。在本发明的一个实施方案中，化合物是基本上纯化的(例如基本上没有限制其效果或产生不想要的副作用的物质)。可在化合物包含上文所描述的多肽时采用配制剂和施用方法；可从那些下文中所描述的之中选择别的合适的配制剂和施用路径。
多种投递系统是已知的，并且可用于施用本发明的化合物，例如脂质体、微粒、微胶囊中的包囊，能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。导入方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口服路径。化合物或组合物可通过任何便利路径，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。另外，可能想要的是，通过任何合适的路径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统中；可用例如附接至贮器(诸如Ommaya贮器)的脑室内导管来促进脑室内注射。还可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和含雾化剂的配制剂实现。
抗CD20抗体
具有本领域普通技术的内科医生或兽医能容易地确定和规定有效量的包含抗CD20抗体的药物组合物。例如，内科医生或兽医可以以低于实现想要的治疗效果所要求水平的水平开始药物组合物中所采用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量，直至实现想要的效果。一般而言，本发明组合物的合适的日剂量会是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。优选的是，施用是静脉内的、肌肉内的、腹膜内的、或皮下的。若想要的话，可以作为一整天中以合适的时间间隔分开施用的2个、3个、4个、5个、6个或更多亚剂量，任选地，以单位剂量形式施用治疗组合物的有效日剂量。虽然抗CD20抗体可能被单独施用，但是优选以药物配制剂(组合物)施用该化合物。
在一个实施方案中，可以通过输注以周剂量10至2000mg/m²，通常10至500mg/m²，诸如200至400mg/m²，诸如375mg/m²施用依照本发明的人单克隆抗体。此施用可以重复，例如1至8次，诸如3至5次。可以通过连续输注在2至24小时，诸如2至12小时的一段时间里实施施用。
在另一个实施方案中，通过缓慢的连续输注在一长段时间(诸如大于24小时)里施用抗体以降低毒副作用。
在又一个实施方案中，以周剂量250mg至2000mg，诸如例如300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mg或2000mg施用抗体达多至8次，诸如4至6次。可以通过连续输注在2至24小时，诸如2至12小时的一段时间里实施施用。此方案可以根据需要重复一次或多次，例如在6个月或12个月后。通过使用靶向抗CD20抗体的抗独特型抗体来测量施用后生物学样品中的循环抗CD20抗体量，能测定或调节剂量。
在又一个实施方案中，通过维持疗法(诸如例如一周一次持续6个月或更长的一段时间)来施用抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了包含治疗有效量的抗CD20抗体的药物组合物。可以用药学可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂依照常规技术(诸如那些披露于Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第19版，Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995的)来配制药物组合物。
本发明的药物组合物可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如非离子型去污剂，诸如Tween-80)、稳定剂、稳定剂(例如糖类或无蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或其它适合于包含于药物组合物中的物质。
各活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以有所变化，以便获得这样的活性成分量，其有效实现特定患者、组合物、和施用模式的想要的治疗应答，而对该患者没有毒性。选定的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括本发明所采用的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、处理的持续时间、与所采用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前的医学史、及医学领域中公知的类似因素。
可以经由任何合适的路径来施用本发明的抗CD20抗体，诸如口服、鼻、可吸入、支气管内、肺泡内、表面(包括口腔、经皮和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外的路径。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是胃肠外施用的。
如本文中所使用的，短语“胃肠外施用”和“胃肠外施用的”指除肠施用和表面施用之外的施用模式，通常通过注射实现，且包括表皮、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，通过静脉内或皮下注射或输注来施用药物组合物。例如，可以在2-8小时，诸如4小时里施用药物组合物，以便降低副作用。
在一个实施方案中，通过吸入来施用药物组合物。抗CD20抗体的Fab片段可以适合于此施用路径，参见Crowe等(1994年2月15日)Proc Natl Acad SciUSA，91(4)：1386-1390。
在一个实施方案中，通过皮下注射以晶体形式施用药物组合物，参见Yang等，PNAS USA 100(12)，6934-6939(2003)。
不管所选定的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法来将抗CD20抗体(其可以以药学可接受的盐的形式或者以合适的水合形式使用)配制成药学可接受的剂量形式。“药学可接受的盐”指保持母体化合物想要的生物学活性，且不给予任何不想要的毒物学效应的盐(参见例如Berge，S.M.等，J.Pharm.Sci.66，1-19(1977))。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些衍生自非毒性无机酸的，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自非毒性有机酸的，诸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括那些衍生自碱土金属的，诸如钠、钾、镁、钙等，以及衍生自非毒性有机胺的，诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
药学可接受的载体包括在生理学上与本发明的化合物相容的任何及所有合适的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等张力(调节)剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物中可采用的合适的水性和非水性载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、和芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)、和/或多种缓冲剂。其它载体是药学领域中公知的。
药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容，涵盖其在本发明的药物组合物中的应用。
可以例如通过使用涂层物质(诸如卵磷脂)、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
含有抗CD20抗体的药学组合物还可以包含药学可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠/偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可以包含该组合物中的等张剂，诸如糖类、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。
药学可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
含有抗CD20抗体的药物组合物还可以含有一种或多种适合于选定施用路径的佐剂(诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂)，其能增强该药物组合物的保存期或效力。例如，本发明的抗CD20抗体可以与乳糖、蔗糖、粉剂(例如淀粉)、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷、和/或聚乙烯醇混合。佐剂的其它例子是QS21、GM-CSF、SRL-172、二盐酸组胺、胸腺卡汀(thymocartin)、Tio-TEPA、单磷酰脂质A/细杆菌组合物(microbacteria composition)、明矾、不完全弗氏佐剂、MontanideISA、Ribi佐剂系统、TiterMax佐剂、Syntex佐剂配制剂、免疫刺激复合物(ISCOM)、Gerbu佐剂、CpG寡脱氧核苷酸、脂多糖、和聚肌苷酸：聚胞苷酸。
可以通过以下两点来确保阻止微生物的存在，即灭菌规程及包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸等。另外，可以通过包含延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药学形式的吸收延长。
含有抗CD20抗体的药物组合物可以处于多种合适的形式。此类形式包括例如液体、半固体和固体剂量形式，诸如液体溶液(例如可注射的和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、乳液、微乳液、凝胶、乳剂、粒剂、粉剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体、树状聚体和其它纳米颗粒(参见例如Baek等，Methods Enzymol.362，240-9(2003)，Nigavekar等，Pharm Res.21(3)，476-83(2004))、微粒、和栓剂。
最佳形式取决于选定的施用模式和组合物的性质。配制剂可以包括例如粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子的或阴离子的)囊泡、DNA偶联物、无水吸收糊剂、水包油乳液和油包水乳液、乳液Carbowax(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有Carbowax的半固体混合物。以上各项之任一项在依照本发明的处理和疗法中可能是适合的，只要药物组合物中的抗CD20抗体不会由于该配制剂而失活，并且该配制剂在生理学上与施用路径相容且可耐受。还可参见例如Powell等，“Compendiumof excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52，238-311(1998)及其中关于涉及对药物化学工作者公知的赋形剂和载体的别的信息的引用。
抗CD20抗体可以与保护该化合物免于快速释放的载体一起制备，诸如受控释放配制剂，包括植入物、透皮贴、和微囊化投递系统。此类载体可以包括明胶、甘油单硬脂酸酯、甘油二硬脂酸酯、生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯、聚(酸)酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯、和单独的或者与蜡一起的聚乳酸、或本领域中公知的其它材料。用于制备此类配制剂的方法是本领域技术人员一般所知道的。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为了通过某些依照本发明的施用路径来施用含有抗CD20抗体的药物组合物，可能有必要用某种物质包被抗CD20抗体，或者共施用抗CD20抗体及某种物质，以阻止抗CD20抗体失活。例如，抗CD20抗体可以在合适的载体(例如脂质体)或稀释剂中向受试者施用。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规的脂质体(Strejan等，J.Neuroimmunol.7，27(1984))。
根据施用路径，可以以某种物质包被抗CD20抗体以保护该抗体免于能使该化合物失活的酸及其它天然条件的作用。例如，抗CD20抗体可以在合适的载体(例如脂质体)中向受试者施用。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规的脂质体(Strejan等，J.Neuroimmunol.7，27(1984))。
供胃肠外施用的药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容，涵盖其在本发明的药物组合物中的应用。还可以将辅助的活性化合物掺入该组合物。
注射用的药物组合物在制备和贮存条件下通常必须是无菌且稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)、和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用涂层(诸如卵磷脂)、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况中，会优选在组合物中包含等张剂，例如糖类、多元醇诸如甘油、甘露醇、山梨醇、或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来引起可注射组合物的吸收延长。可以如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有一种成分或成分组合(例如如上文所列举的)的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着灭菌微滤。
一般而言，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介中而制备，所述无菌媒介含有基础分散介质及其它所需成分，例如来自那些上文所列举的。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法的例子是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其自先前经过无菌过滤的溶液产生含有活性成分和任何别的所需成分的粉末。
可以如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有上文所列举的一种成分或成分组合的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着灭菌微滤。一般而言，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介中而制备，所述无菌媒介含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其它所需成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法的例子是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其自先前经过无菌过滤的溶液产生含有活性成分和任何别的所需成分的粉末。
在不背离本发明的精神或本质属性的前提下，本发明可以以其它特定的形式体现，因而，应当参考指明本发明范围的所附的权利要求书，而非上述说明书或下列实施例。
术语表
提供了下列定义以便于理解上文中频繁使用的某些术语。
如本文中所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”和“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能”都属于细胞介导的免疫的机制，由此免疫系统的效应细胞活跃地裂解已经被特异性抗体所结合的靶细胞。ADCC是抗体(作为体液免疫应答的一部分)可经由它们而起作用以限制并遏制感染的机制之一。经典的ADCC是由天然杀伤(NK)细胞介导的，但是嗜曙红细胞使用另一种ADCC来杀死某些称为蠕虫的寄生虫。由于ADCC依赖于在先抗体应答，其是适应性免疫应答的一部分。
典型的ADCC牵涉NK细胞的活化，并依赖于NK细胞表面上的Fc受体对被抗体包被的受感染细胞的识别。Fc受体识别结合至被病原体感染的靶细胞的表面的抗体(诸如IgG)的Fc(恒定的)部分。NK细胞表面上存在的Fc受体称为CD16a或FcγRIIIa。一旦结合至IgG的Fc受体，天然杀伤细胞便释放细胞因子(诸如IFN-γ)和细胞毒性颗粒(诸如穿孔素和粒酶)，它们进入靶细胞并通过触发凋亡来促进细胞死亡。这种ADCC效应器功能类似于，但独立于细胞毒性T细胞(CTL)的应答。
如本文中所使用的，术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
“分离的”指自其天然状态“人为”改变的，即若它在自然界中存在，则它已经自其最初环境改变或取出，或改变和取出两者。例如，在本文中采用该术语时，活生物体中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态中至少一种与其共存的细胞物质分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。此外，通过转化、遗传操作或通过任何其它重组方法导入生物体中的多核苷酸或多肽是“分离的”，即使它仍存在于所述生物体中，所述生物体可以是活的或无生命的。
如本文中所使用的，术语“药物的”或“药学的”或“药用的”包括本发明的兽医应用。术语“治疗有效量”指对缓和选定的疾患有用的治疗剂量。
如本文中所使用的，术语“药学可接受的”意味着获得联邦或州政府管理机构批准的或美国药典或其它普遍认可的药典中所列的在动物中，更具体地在人中使用的。
“多肽”指任何包含两个或更多个彼此由肽键或修饰的肽键(即肽等排体)相连接的氨基酸的多肽。“多肽”指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和较长的链(通常称为蛋白质)两者。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰详细记载于基础教科书和更详细的专著，以及多卷的研究文献中。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以领会的是，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。还有，给定多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的、有分支的或没有分支的。环状的、分支的和分支环状的多肽可以源自翻译后天然过程或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、黄素的共价附着、血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)、和遍在蛋白化(参见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，Post-translational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，1-12，于POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，编，Academic Press，New York，1983；Seifter等，Meth Enzymol，182，626-646，1990；Rattan等，Ann.NY Acad.Sci.，663：48-62(1992))。
生物学方法/实施例
实施例1：用于鼠人B细胞淋巴瘤模型中IL-18与联合疗法的实验方案
人IL-18(SEQ ID NO：16)是在大肠杆菌(Escherichia coli)的非病原性菌株中表达的人白介素-18的重组成熟形式。IL-18是18Kd的非糖基化单体，具有与IL-1三叶(trefoil)亚家族的IL-1β最紧密相关的一级结构。鼠和人IL-18cDNA编码由192个和193个氨基酸组成的前体蛋白(分别是SEQ ID NO：17和16)。IL-18原要求由胱天蛋白酶加工成有生物活性的成熟蛋白质(157个氨基酸)，以便介导其生物学活性。人和鼠IL-18之间的同源性是65％。在下文所概述的临床前研究中，使用鼠IL-18(SEQ ID NO：17)，以便提供体内同基因系统，在那里能分析IL-18的全部免疫学潜力。
在缺乏T细胞和B细胞两者的远交雌性纯合SCID小鼠(ICR-Prkdc^scid)中实施该研究。使用远交系与使用近交系相比的优点在于远交的ICR SCID系不展现泄漏(leakiness)(即使在10-12月龄小鼠中)。
给小鼠注射最初自患有伯基特氏淋巴瘤的3岁患者衍生的人Ramos B细胞淋巴瘤系(ATCC目录，CRL 1596)。将肿瘤1∶10匀浆物以每只小鼠0.5ml的剂量接种入6-8周龄小鼠中。一周2-3次测量肿瘤体积，并将小鼠随机分配入处理组中以使得各组具有相等的肿瘤体积分配(distribution)。在每组肿瘤体积中值达到80-150mm³时(接种肿瘤后第12天时)启动疗法。另外，从该研究中排除那些生长有体积在设置限度以外的肿瘤的小鼠。
在第一项研究中，处理组(n＝6)包括对照组(没有疗法)、3个单一疗法组(分别为12.5、25、和50μg/小鼠BIW)、鼠IL-18S.C.单一疗法组(100μg/小鼠q.d.)、和3个联合疗法组，每组分别接受100μg/小鼠IL-18S.C.q.d.加上12.5、25、或50μg/小鼠
在第二项研究中，剂量给药由以SID日程表的100μg/小鼠mIL-18(SEQ IDNO：17)和以qd4/3日程表的25和12.5μg组成。动物数目增加至n＝12，以便具有测量统计学显著性的更好窗口。使用viener测径器一周2-3次测量肿瘤体积。
在人B细胞淋巴瘤模型中IL-18和的联合疗法提供超过单独的IL-18或的单一疗法的益处。下文详述的两个实验显示联合疗法在此模型中的统计学显著益处。
在图3中所捕获的第一项实验中，高剂量的(100μg/剂)显示了作为单一药剂疗法的强烈抗肿瘤活性，而在较低的剂量(12.5g/剂)，没有活性。鼠IL-18(SEQ ID NO：17)作为单一药剂(100μg/剂)没有活性。然而，在与较低剂量的组合时，mIL-18(SEQ ID NO：17)显示加性/协同性活性(12.5μg/剂与100μg mIL-18(SEQ ID NO：17)组合)。
在使用GraphPad对数据绘图并分析后，在下文图4和图5中表明统计学显著性。在这些图的第一幅(图4)中，在植入后第19天比较肿瘤体积。统计学分析显示与未处理对照组相比所有处理组中肿瘤生长的显著降低(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)。第二幅图(图5)显示了联合疗法比单独的单一疗法更有效(统计学上显著的，^*p＜0.05，^**p＜0.01)。
在第二项实验中，将动物数目从n＝6增加至n＝12提高确定响应联合疗法的加性/协同性抗肿瘤活性的统计学显著性的能力(power)。图6A和图6B中的图代表肿瘤生长体积中值和均值。图7和图8描绘了对植入肿瘤后第27天肿瘤体积的统计学分析。数据表明与单独的Rituxan(25μg/小鼠)或单独的mIL-18(SEQ ID NO：17)单一疗法(100μg/小鼠)相比，用联合疗法(25/100μg/小鼠)处理的小鼠中肿瘤体积的统计学显著降低。
此临床前数据表明IL-18与利妥昔单抗的组合导致协同性抗肿瘤活性。利妥昔单抗作为单一疗法在所测试的最高剂量是有活性的。然而，在与鼠IL-18联合使用较低剂量的利妥昔单抗时能看到类似水平的活性，指明该模型对利妥昔单抗是敏感的，并且该响应能由IL-18增强。鼠IL-18增强利妥昔单抗的活性，推测通过提升NK细胞中的ADCC活性来实现。因为SCID小鼠缺乏B和T细胞应答两者，所以IL-18经由NK细胞活化来提升抗肿瘤应答。
实施例2：人淋巴瘤异种移植物模型中IL-18与Ofatumumab的联合疗法。
我们的目的是确定用IL-18(鼠的)和Ofatumumab的联合疗法治疗皮下人Ramos淋巴瘤(SCID小鼠中的异种移植物)是否会导致协同性抗肿瘤活性。
背景和方法
·在已建立的Ramos人淋巴瘤异种移植物模型(也称为“实体瘤”模型，或“皮下肿瘤”模型)中测试Ofatumumab单抗的剂量-应答。
·SCID(ICR背景，Taconic)雌性小鼠在第0天皮下接受Ramos淋巴瘤匀浆物(0.5ml来自供体SCID雌性小鼠的1∶8匀浆物)。观察小鼠，并使用测径器一周两次地测量肿瘤体积。使用以下公式确定肿瘤体积：(0.5×L)×W²(肿瘤长度＝L，肿瘤宽度＝W)。
·在植入后第17天在大多数肿瘤达到约100-150mm³体积时将小鼠随机化成治疗组(从该研究中排除较大/较小体积的肿瘤)。一周两次静脉内施用Ofatumumab疗法，而一天一次皮下施用IL-18细胞因子疗法。治疗组列于表1(下文)中。我们在此项研究中每组使用了6只小鼠。
·来自该模型的读出是肿瘤体积测量和％治愈的/消退的/未治愈的肿瘤。
·治愈的小鼠定义为3次连续测量的肿瘤体积都小于10mm³的小鼠。具有部分消退的小鼠定义为那些具有3次连续测量都显示小于50％起始体积的肿瘤体积的小鼠。未治愈的小鼠定义为没有显示肿瘤体积改善的小鼠(如上文所述的)。
表1：RAMJ10研究中的处理日程表