一种辽东楤木原生质体培养方法 【技术领域】
本发明涉及一种辽东楤木原生质体培养方法。背景技术 辽东楤木 [Aralia elates(Miq.)Seem] 是一种食药兼用型经济植物， 主要分布于 中国东北地区。 辽东楤木的食药用价值较高， 其嫩芽含有丰富的营养成分 ； 其植株根、 茎、 叶 等器官均含有多种楤木皂苷， 主要皂苷元为齐墩果酸类化合物， 可作为生产中药制剂的原 料。
原生质体具有细胞全能性， 能够再生细胞壁并进行细胞分裂并再生成完整植株。 辽东楤木原生质体的培养可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞及细胞系、 开展细胞融合与再 生植株培养， 以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。目 前关于辽东楤木相关报道研究均在外植体再生愈伤组织、 植株再生方面， 现今尚未见到利 用辽东楤木的愈伤组织、 叶片等来源的原生质体培养及植株再生的相关报道。
发明内容 本发明提供一种辽东楤木原生质体培养方法， 可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞 及细胞系、 开展细胞融合与再生植株培养， 以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传 分析与操作提供基础材料。
本发明辽东楤木原生质体培养方法， 按以下步骤进行 ： 一、 取培养 20 ～ 30 天的 辽东楤木无菌苗叶片， 放入含有 600mmol/L 甘露醇的 CPW 溶液中密封， 于 2 ～ 6 ℃暗处理 6 ～ 8h ； 二、 再将无菌苗叶片放入含有 600mmol/L 甘露醇的酶解液中密封， 于 23 ～ 27℃暗 处理 2 ～ 14h， 得混合液 ； 三、 将步骤二得到的混合液经 240 目筛网过滤， 再以 1500r/min 离 心 3min， 去掉上清， 将所得沉淀加入到 750 ～ 900mmol/L 的蔗糖溶液中， 以 500r/min 离心 1min， 然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出， 放入 CPW 溶液中洗涤 2 ～ 3 次， 得 到纯化后的原生质体 ； 四、 将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中， 将培 养皿封口， 再将培养皿放入摇床中， 在 25℃、 60 ～ 80r/min 条件下进行暗培养， 每隔 3 天更 换一次培养基， 培养 13 ～ 17 天后， 获得微小愈伤组织 ； 五、 将微小愈伤组织移植到芽分化培 养基中培养， 诱导成苗， 即完成辽东楤木原生质体培养方法 ； 其中步骤四所述培养基为含有 1.0mg/L 的 2， 4-D、 1.0mg/L 的 BA 和质量浓度 3％蔗糖的 MS 培养基 ； 步骤五所述芽分化培 养基为含有 1.0mg/L 的 6-BA、 0.1mg/L 的 NAA、 质量浓度 3％蔗糖 和 6.5g/L 琼脂的 MS 培养 基。
本发明操作简便， 设备要求低， 污染率极低， 制备的原生质体具有鲜艳的颜色， 形 7 态较圆且透明， 原生质体的活性为 80.5％～ 87.7％， 产量为 1.0 ～ 3.2×10 个 /g。原生质 体培养过程中细胞增殖较快， 形成的微型愈伤组织活力高， 生长迅速， 转接到固体培养基上 成活率可达 95％以上。
本发明着重于探索影响原生质体分离和培养的因素， 完善原生质体稳定高效的分
离与培养体系， 以提高原生质体培养的重复性， 使原生质体培养更为简单化和实用化。 以此 获取的大量高活性原生质体及诱导的愈伤组织可以满足楤木皂苷高产细胞系筛选培育和 细胞融合等实验的需要。 附图说明 图 1 为具体实施方式二十八得到的原生质体的形态照片 ； 图 2 为具体实施方式 二十八中原生质体培养过程中形成的细胞 ； 图 3 为具体实施方式二十八中原生质体培养过 程中形成的细胞团。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。
具体实施方式一 ： 本实施方式辽东楤木原生质体培养方法， 按以下步骤进行 ： 一、 取培养 20 ～ 30 天的辽东楤木无菌苗叶片， 放入含有 600mmol/L 甘露醇的 CPW 溶液中密封， 于 2 ～ 6℃暗处理 6 ～ 8h ； 二、 再将无菌苗叶片放入含有 600mmol/L 甘露醇的酶解液中密封， 于 23 ～ 27℃暗处理 2 ～ 14h， 得混合液 ； 三、 将步骤二得到的混合液经 240 目筛网过滤， 再 以 1500r/min 离心 3min， 去掉上清， 将所得沉淀加入到 750 ～ 900mmol/L 的蔗糖溶液中， 以 500r/min 离心 1min， 然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出， 放入 CPW 溶液中洗 涤 2 ～ 3 次， 得到纯化后的原生质体 ； 四、 将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到 培养皿中， 将培养皿封口， 再将培养皿放入摇床中， 在 25℃、 60 ～ 80r/min 条件下进行暗培 养， 每隔 3 天更换一次培养基， 培养 13 ～ 17 天后， 获得微小愈伤组织 ； 五、 将微小愈伤组织 移植到芽分化培养基中培养， 诱导成苗， 即完成辽东楤木原生质体培养方法 ； 其中步骤四所 述培养基为含有 1.0mg/L 的 2， 4-D、 1.0mg/L 的 BA 和质量浓度 3％蔗糖的 MS 培养基 ； 步骤 五所述芽分化培养基为含有 1.0mg/L 的 6-BA、 0.1mg/L 的 NAA、 质量浓度 3％蔗糖和 6.5g/L 琼脂的 MS 培养基。
本实施方式所述 CPW 溶液由 101mg/L 的 KNO3、 27.2mg/L 的 KH2PO4、 0.025mg/L 的 CuSO4·5H2O、 246mg/L 的 MgSO4·7H2O、 0.16mg/L 的 KI、 1.48mg/L 的 CaCl2·2H2O 和蒸馏水组 成， CPW 溶液的 pH 值为 5.8。
本实施方式中 BA 为苄氨基嘌呤， 6-BA 为 6- 苄氨基嘌呤， NAA 为 a- 萘乙酸。
本实施方式操作简便， 设备要求低， 污染率极低， 制备的原生质体具有鲜艳的颜 色， 形态较圆且透明， 原生质体的活性为 80.5％～ 87.7％， 产量为 1.0 ～ 3.2×107 个 /g。 原 生质体培养过程中细胞增殖较快， 形成的微型愈伤组织活力高， 生长迅速， 转接到固体培养 基上成活率可达 95％以上。
具体实施方式二 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 步骤一中于 2℃暗处 理。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 步骤一中于 6℃暗处 理。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 步骤一中于 3 ～ 5℃暗 处理。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 步骤一中于 4℃暗处 理。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是 ： 步骤一中暗 处理 6h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是 ： 步骤一中暗 处理 8h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是 ： 步骤一中暗 处理 7h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式九 ： 本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是 ： 步骤二所 述酶解液为含有质量浓度 2％的纤维素酶 (Cellulase R-10) 和质量浓度 0.4％的离析酶 (MacerozymeR-10) 的 CPW 溶液。其它与具体实施方式一至八之一相同。
本实施方式所述 CPW 溶液由 101mg/L 的 KNO3、 27.2mg/L 的 KH2PO4、 0.025mg/L 的 CuSO4·5H2O、 246mg/L 的 MgSO4·7H2O、 0.16mg/L 的 KI、 1.48mg/L 的 CaCl2·2H2O 和蒸馏水组 成， CPW 溶液的 pH 值为 5.8。
本实施方式的酶解液使用前需要经过 0.22μm 混合纤维素微孔滤膜过滤除菌， 其 pH 为 5.8。
具体实施方式十 ： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是 ： 步骤二中于 23 ℃暗处理。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一 ： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是 ： 步骤二中 于 27℃暗处理。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十二 ： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是 ： 步骤二中 于 25℃暗处理。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十三 ： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是 ： 步骤二 中暗处理 2h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十四 ： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是 ： 步骤二 中暗处理 14h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十五 ： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是 ： 步骤二 中暗处理 4 ～ 12h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十六 ： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是 ： 步骤二 中暗处理 6 ～ 10h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十七 ： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是 ： 步骤二 中暗处理 8h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十八 ： 本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是 ： 步骤三 中将所得沉淀加入到 750mmol/L 的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式一至十七之一相同。
具体实施方式十九 ： 本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是 ： 步骤三 中将所得沉淀加入到 900mmol/L 的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式一至十七之一相同。
具体实施方式二十 ： 本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是 ： 步骤三 中将所得沉淀加入到 850mmol/L 的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式一至十七之一相同。
具体实施方式二十一 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是 ： 步骤四中在 25℃、 60r/min 条件下进行暗培养。其它与具体实施方式一至二十之一相同。
具体实施方式二十二 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是 ： 步骤 四中在 25℃、 80r/min 条件下进行暗培养。其它与具体实施方式一至二十之一相同。
具体实施方式二十三 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是 ： 步骤 四中在 25℃、 70r/min 条件下进行暗培养。其它与具体实施方式一至二十之一相同。
具体实施方式二十四 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是 ： 步 骤四中培养 13 天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。
具体实施方式二十五 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是 ： 步 骤 四中培养 17 天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。
具体实施方式二十六 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是 ： 步 骤四中培养 14 ～ 16 天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。
具体实施方式二十七 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是 ： 步 骤四中培养 15 天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。
具体实施方式二十八 ： 本实施方式辽东楤木原生质体培养方法， 按以下步骤进行 ： 一、 取培养 30 天的辽东楤木无菌苗顶部叶片 1g， 放入 20mL 含有 600mmol/L 甘露醇的 CPW 溶液中密封， 于 4℃暗处理 7h ； 二、 再将无菌苗叶片放入 10mL 含有 600mmol/L 甘露醇的酶 解液中密封， 于 25℃暗处理 8， 得混合液 ； 三、 将混合液经 240 目筛网过滤， 再以 1500r/min 离心 3min， 去掉上清， 将所得沉淀加入到 850mmol/L 的蔗糖溶液中， 以 500r/min 离心 1min， 然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出， 放入 5mLCPW 溶液中洗涤 3 次， 得到纯化 后的原生质体 ； 四、 将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中， 将培养皿用 Parafilm 膜封口， 再将培养皿放入摇床中， 在 25℃、 70r/min 条件下进行暗培养， 每隔 3 天更 换一次培养基， 培养 15 天后， 获得微小愈伤组织 ； 五、 将微小愈伤组织移植到芽分化培养基 中培养， 诱导成苗， 即完成辽东楤木原生质体培养方法。
原生质体活性测定采用曲利本蓝染色法， 原生质体活性及原生质体产量的计算公 式如下 ：
原生质体活性＝未被染色的原生质体数 ( 有活性 )/ 原生质体总数 ×100％。
原生质体产量 ( 个 /g) ＝原生质体总数 ( 个 )/ 材料鲜重 (g)
本实施方式制备的原生质体具有鲜艳的颜色， 形态较圆且透明， 如图 1 所示。图 2 为原生质体培养过程中形成的细胞， 图 3 为原生质体培养过程中形成的细胞团。
本实施方式原生质体的活性为 84.13％， 产量为 2.12×107 个 /g。原生质体培养 过程中细胞增殖较快， 形成的微型愈伤组织活力高， 生长迅速， 转接到固体培养基上成活率 可达 97％。