一种辽东楤木原生质体培养方法.pdf

1、10申请公布号CN102349444A43申请公布日20120215CN102349444ACN102349444A21申请号201110227434122申请日20110809A01H4/0020060171申请人中国科学院东北地理与农业生态研究所地址150081黑龙江省哈尔滨市南岗区哈平路138号72发明人赵恒田徐正莉黄福山邓中枢李富恒74专利代理机构哈尔滨市松花江专利商标事务所23109代理人韩末洙54发明名称一种辽东楤木原生质体培养方法57摘要一种辽东楤木原生质体培养方法，涉及一种辽东楤木原生质体培养方法。本发明可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养提供基础

2、材料。方法取辽东楤木无菌苗叶片，放入含甘露醇的CPW溶液中密封，暗处理；将无菌苗叶片放入含甘露醇的酶解液中密封，暗处理；过滤，离心去上清，将沉淀加入蔗糖溶液中，离心，将原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤；放入培养基中混匀后加入到培养皿中，再放入摇床暗培养，获得微小愈伤组织；然后移植到芽分化培养基，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法。本发明操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体颜色鲜艳，形态较圆且透明，原生质体的活性高，产量高。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN102349447A1/1页21一种辽东楤木原生质体培

3、养方法，其特征在于辽东楤木原生质体培养方法，按以下步骤进行一、取培养2030天的辽东楤木无菌苗叶片，放入含有600MMOL/L甘露醇的CPW溶液中密封，于26暗处理68H；二、再将无菌苗叶片放入含有600MMOL/L甘露醇的酶解液中密封，于2327暗处理214H，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经240目筛网过滤，再以1500R/MIN离心3MIN，去掉上清，将所得沉淀加入到750900MMOL/L的蔗糖溶液中，以500R/MIN离心1MIN，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤23次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中，

4、将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25、6080R/MIN条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养1317天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有10MG/L的2，4D、10MG/L的BA和质量浓度3蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有10MG/L的6BA、01MG/L的NAA、质量浓度3蔗糖和65G/L琼脂的MS培养基。2根据权利要求1所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中于35暗处理。3根据权利要求1所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中于4暗

5、处理。4根据权利要求1或2所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中暗处理7H。5根据权利要求4所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中于25暗处理。6根据权利要求5所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中暗处理412H。7根据权利要求5所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中暗处理8H。8根据权利要求6所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤三中将所得沉淀加入到850MMOL/L的蔗糖溶液中。9根据权利要求8所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤四中在25、70R/MIN条件下进行暗培养。10根据权利要求9所述的一种

6、辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤四中培养15天。权利要求书CN102349444ACN102349447A1/4页3一种辽东楤木原生质体培养方法技术领域0001本发明涉及一种辽东楤木原生质体培养方法。背景技术0002辽东楤木ARALIAELATESMIQSEEM是一种食药兼用型经济植物，主要分布于中国东北地区。辽东楤木的食药用价值较高，其嫩芽含有丰富的营养成分；其植株根、茎、叶等器官均含有多种楤木皂苷，主要皂苷元为齐墩果酸类化合物，可作为生产中药制剂的原料。0003原生质体具有细胞全能性，能够再生细胞壁并进行细胞分裂并再生成完整植株。辽东楤木原生质体的培养可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞

7、及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养，以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。目前关于辽东楤木相关报道研究均在外植体再生愈伤组织、植株再生方面，现今尚未见到利用辽东楤木的愈伤组织、叶片等来源的原生质体培养及植株再生的相关报道。发明内容0004本发明提供一种辽东楤木原生质体培养方法，可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养，以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。0005本发明辽东楤木原生质体培养方法，按以下步骤进行一、取培养2030天的辽东楤木无菌苗叶片，放入含有600MMOL/L甘露醇的CPW溶液中密封，于26暗处理6

8、8H；二、再将无菌苗叶片放入含有600MMOL/L甘露醇的酶解液中密封，于2327暗处理214H，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经240目筛网过滤，再以1500R/MIN离心3MIN，去掉上清，将所得沉淀加入到750900MMOL/L的蔗糖溶液中，以500R/MIN离心1MIN，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤23次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25、6080R/MIN条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养1317天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽

9、分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有10MG/L的2，4D、10MG/L的BA和质量浓度3蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有10MG/L的6BA、01MG/L的NAA、质量浓度3蔗糖和65G/L琼脂的MS培养基。0006本发明操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，原生质体的活性为805877，产量为1032107个/G。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达95以上。0007本发明着重于探索影响原生质体分离和培养的因素，完善原生质体稳

10、定高效的分说明书CN102349444ACN102349447A2/4页4离与培养体系，以提高原生质体培养的重复性，使原生质体培养更为简单化和实用化。以此获取的大量高活性原生质体及诱导的愈伤组织可以满足楤木皂苷高产细胞系筛选培育和细胞融合等实验的需要。附图说明0008图1为具体实施方式二十八得到的原生质体的形态照片；图2为具体实施方式二十八中原生质体培养过程中形成的细胞；图3为具体实施方式二十八中原生质体培养过程中形成的细胞团。具体实施方式0009本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。0010具体实施方式一本实施方式辽东楤木原生质体培养方法，按以下步骤

11、进行一、取培养2030天的辽东楤木无菌苗叶片，放入含有600MMOL/L甘露醇的CPW溶液中密封，于26暗处理68H；二、再将无菌苗叶片放入含有600MMOL/L甘露醇的酶解液中密封，于2327暗处理214H，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经240目筛网过滤，再以1500R/MIN离心3MIN，去掉上清，将所得沉淀加入到750900MMOL/L的蔗糖溶液中，以500R/MIN离心1MIN，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤23次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25、6080R

12、/MIN条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养1317天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有10MG/L的2，4D、10MG/L的BA和质量浓度3蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有10MG/L的6BA、01MG/L的NAA、质量浓度3蔗糖和65G/L琼脂的MS培养基。0011本实施方式所述CPW溶液由101MG/L的KNO3、272MG/L的KH2PO4、0025MG/L的CUSO45H2O、246MG/L的MGSO47H2O、016MG/L的KI、148MG/L的CACL22

13、H2O和蒸馏水组成，CPW溶液的PH值为58。0012本实施方式中BA为苄氨基嘌呤，6BA为6苄氨基嘌呤，NAA为A萘乙酸。0013本实施方式操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，原生质体的活性为805877，产量为1032107个/G。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达95以上。0014具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中于2暗处理。其它与具体实施方式一相同。0015具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中于6暗处理。其它与具体实施方式一相同。0016具

14、体实施方式四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中于35暗处理。其它与具体实施方式一相同。说明书CN102349444ACN102349447A3/4页50017具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中于4暗处理。其它与具体实施方式一相同。0018具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中暗处理6H。其它与具体实施方式一至五之一相同。0019具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中暗处理8H。其它与具体实施方式一至五之一相同。0020具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中暗处理7H。其它与具体实施方式一

15、至五之一相同。0021具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤二所述酶解液为含有质量浓度2的纤维素酶CELLULASER10和质量浓度04的离析酶MACEROZYMER10的CPW溶液。其它与具体实施方式一至八之一相同。0022本实施方式所述CPW溶液由101MG/L的KNO3、272MG/L的KH2PO4、0025MG/L的CUSO45H2O、246MG/L的MGSO47H2O、016MG/L的KI、148MG/L的CACL22H2O和蒸馏水组成，CPW溶液的PH值为58。0023本实施方式的酶解液使用前需要经过022M混合纤维素微孔滤膜过滤除菌，其PH为58。0024具

16、体实施方式十本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中于23暗处理。其它与具体实施方式一至九之一相同。0025具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中于27暗处理。其它与具体实施方式一至九之一相同。0026具体实施方式十二本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中于25暗处理。其它与具体实施方式一至九之一相同。0027具体实施方式十三本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是步骤二中暗处理2H。其它与具体实施方式一至十二之一相同。0028具体实施方式十四本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是步骤二中暗处理14H。其它与具体实施方式一至十二之一相

17、同。0029具体实施方式十五本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是步骤二中暗处理412H。其它与具体实施方式一至十二之一相同。0030具体实施方式十六本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是步骤二中暗处理610H。其它与具体实施方式一至十二之一相同。0031具体实施方式十七本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是步骤二中暗处理8H。其它与具体实施方式一至十二之一相同。0032具体实施方式十八本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是步骤三中将所得沉淀加入到750MMOL/L的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式一至十七之一相同。0033具体实施方式十九本实施方式与具体实施方式一至十七

18、之一不同的是步骤三中将所得沉淀加入到900MMOL/L的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式一至十七之一相同。0034具体实施方式二十本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是步骤三中将所得沉淀加入到850MMOL/L的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式一至十七之一相同。0035具体实施方式二十一本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是步骤说明书CN102349444ACN102349447A4/4页6四中在25、60R/MIN条件下进行暗培养。其它与具体实施方式一至二十之一相同。0036具体实施方式二十二本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是步骤四中在25、80R/MIN条件下进行暗培养。

19、其它与具体实施方式一至二十之一相同。0037具体实施方式二十三本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是步骤四中在25、70R/MIN条件下进行暗培养。其它与具体实施方式一至二十之一相同。0038具体实施方式二十四本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是步骤四中培养13天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。0039具体实施方式二十五本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是步骤四中培养17天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。0040具体实施方式二十六本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是步骤四中培养1416天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。0041具体实施

20、方式二十七本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是步骤四中培养15天。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。0042具体实施方式二十八本实施方式辽东楤木原生质体培养方法，按以下步骤进行一、取培养30天的辽东楤木无菌苗顶部叶片1G，放入20ML含有600MMOL/L甘露醇的CPW溶液中密封，于4暗处理7H；二、再将无菌苗叶片放入10ML含有600MMOL/L甘露醇的酶解液中密封，于25暗处理8，得混合液；三、将混合液经240目筛网过滤，再以1500R/MIN离心3MIN，去掉上清，将所得沉淀加入到850MMOL/L的蔗糖溶液中，以500R/MIN离心1MIN，然后用吸管将处于离心管中部的原

21、生质体带吸出，放入5MLCPW溶液中洗涤3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中，将培养皿用PARAFILM膜封口，再将培养皿放入摇床中，在25、70R/MIN条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养15天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法。0043原生质体活性测定采用曲利本蓝染色法，原生质体活性及原生质体产量的计算公式如下0044原生质体活性未被染色的原生质体数有活性/原生质体总数100。0045原生质体产量个/G原生质体总数个/材料鲜重G0046本实施方式制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，如图1所示。图2为原生质体培养过程中形成的细胞，图3为原生质体培养过程中形成的细胞团。0047本实施方式原生质体的活性为8413，产量为212107个/G。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达97。说明书CN102349444ACN102349447A1/1页7图1图2图3说明书附图CN102349444A