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单倍体油棕和双单倍体油棕的生产方法
发明领域
本发明涉及单倍体棕榈植物和纯合的双单倍体棕榈植物。本发明还涉及生产和选择单倍体植物和双单倍体植物的方法。更具体地，所述方法可以用于选择单倍体和纯合的双单倍体油棕和海枣(date palm)植物，但不限于此。
发明背景
虽然世界性的植物育种项目已经在培育产量增大、抗害虫和疾病能力提高并具有其它有用性状的新变种方面取得了显著进步，但是育种在整体上还依赖于大量的植物筛选以鉴定出新的期望性状。通常，为了选择一株或少数几株具有期望性状组合的植物，必须对通过杂交得到的数量非常巨大的子代进行数年的培养和评价。
在常规的植物育种过程中，使两株亲本植物杂交，对所产生的子代进行筛选，并鉴定和选择具有期望表型性状组合的一株或多株植物。然后可以使具有期望性状的植物自交或杂交以产生大量子代植物，其中必须对所述子代植物逐个进行分析以确定哪株植物具有最初从第一代引入的期望表型性状组合。如果期望的表型性状源自多个基团的组合作用(多数情况下都如此)，则必须进行筛选的子代植物的数量取决于亲本植物间遗传差异的数量。因此，亲本间由遗传控制的差异数量越多，必须进行培养和评价的子代数量就越多，获得具有所有期望性状的子代的可能性就越小。当这些性状中的一些(例如产量)需要所述植物成熟后才能进行评估时，这种问题就更加严重。
对于筛选期望性状分离的大量子代这一难题，一个可能解决方法依赖于产生或鉴定源自亲本个体配子细胞的单倍体植物的能力。这些单倍体的染色体组有时自发加倍产生二倍体植物，或者可以利用秋水仙碱或其它方法人工使其加倍。具体地，可以通过在体外培养通常产生花粉粒的小孢子来产生双单倍体，但不限于此。无论其来源如何，所产生的双单倍体植物即刻且完全为纯合的。这意味着由此类植物自交产生的种子子代在遗传上与亲本克隆相同，因此可以通过种子快速繁殖。另外，当两个所述双单倍体进行有性杂交时，所产生的种子子代在遗传上没有变化，并且在两个亲本间不同的所有基因座都是杂合的(即，它们是遗传上均一的F1子代)。
体细胞的倍性水平定义为其包含染色体基因组的数量。染色体的基因组数量(也称作基数x)多被简单地描述为细胞核基因组中存在的异源染色体的数量，并等于二倍体生物的配子体中存在的异源染色体的数量。例如，人为二倍体生物，在其体细胞中具有2n＝2x＝46条染色体，在其配子(卵子和精子)中n＝x＝23。当倍性水平大于1时，通过显性作用进行遗传分析较为困难；当基因存在多于一个拷贝时，仅有一个拷贝(显性拷贝)可以影响表型，或者两个拷贝都作用于所表达的表型(部分显性或无显性)。通过显性，基因的另一个拷贝(隐性等位基因)由于其存在没有体现在表型水平上，而被表观“掩蔽”。单倍体生物的体细胞中包含的染色体(n)数量与该物种的正常配子相同。术语“单倍体孢子体”通常用于表示具有配子染色体数量的孢子体(Palmer和Keller，2005a)，并且在二倍体生物中，这个组(complement)与基数(x)相同。
可以以多种方式区分高等植物的单倍体和其二倍体等同物。最明显地，从表型的角度，它们通常外观较小，这部分是由于其细胞体积较小：通常情况下，植物细胞体积与倍性水平正相关。暂定植物单倍体状况的多个方法都使用了这种关系。虽然没有绝对可信的单倍体表型预测方法，但这些表型方法中得到最广泛使用的是计算气孔保卫细胞的长度以及这些细胞中的叶绿体含量(例如，Sari等，1999；Stanys等，2006)。直接测量基因组大小的方法所提供的单倍体状况的判断的可信性大很多。这些方法包括利用常规染色体计数技术的染色体数量直接测量法和利用微密度测定法的DNA含量测量法(例如Zhang等，1999)或更具体的流式细胞术(Coba de la Pena和Brown，2001；Bohanec，2003；Eeckhaut等，2005)。后一技术尽管不能检测单倍体植物或组织，但还可用于表征油棕材料各组织中的细胞周期阶段(Srisawat和Kanchanapoom 2005；Srisawat等，2005)。也可以利用各种共显性遗传分子标记法，借助于单倍体和双单倍体中杂合性的绝对存在检测所述植物(例如，Chani等，2000；Tang等，2006)。
由于单倍体的体积整体比二倍体减小，单倍体可以具有其特有的价值。单倍体的价值还在于允许突变的分离，这种突变在二倍体中被掩蔽，尤其当突变的等位基因没有功能时。单倍体还在转化过程中具有价值。如果直接转化单倍体，则通过随后的染色体加倍就可以一步产生纯种系(true breeding)的二倍体转基因植物。应该注意到，大量的染色体加倍技术(Kasha，2005和并入其中的参考文献)都是已知的，并且这些技术及其改进均可在本发明中应用并与本发明的内容相关。已经报道了一些关于油棕染色体加倍技术开发的研究，并且如果这些数据与二倍体材料的加倍(从而产生多倍体)相关，所阐述的方法也可用于单倍体加倍(Madon等，2005a)。
单倍体的一个主要应用是基于以下事实：由于通过提供原种纯种系(纯合)的多个后代可以显著提高选择和其它程序的效率，所以可以通过双单倍体的产生实现植物育种经济性的显著提高(Nei，1963；Choo，1981；Melchers，1972；Hermsen和Ramanna，1981；Snape，1984)。利用双单倍体产生系统，一代就可以获得纯合体。因此，育种人员可以避免在常规方法中为获得实用的纯合水平而通常必须进行的多轮近交。事实上，通过常规育种方法不能获得所有性状的绝对纯合体。因此，相对于常规育种方法，高效的双单倍体技术可以帮助育种人员减少新变种培育所需的时间和资金。
虽然频率较低，但多种植物都可以产生自发单倍体。对于有重要经济价值的热带多年生作物种类，相关的总述如下：油棕(没有任何来源的报道)，橡胶(没有自发单倍体的报道，虽然Maluszynski等，2003b的表3-1中引用了Chen等，1988和Jayasree等，1999关于花药和卵巢培养的两篇报道)，甘蔗(没有自生单倍体，虽然Maluszynski等，2003b中引用了Liu等，1980以及Fitch和Moore 1996的两篇报道)，咖啡(例如，Lashermes等，1994关于自发单倍体的报道)，棉花(许多自生单倍体的实例)，可可(Dublin 1972关于自发单倍体的报道)。重要的是，应注意在本发明中没有阐述自发单倍体可能随后累积显著数量的单倍体或双单倍体从而可用于改良作物的情况，换句话说，极少发生这些情况。因此，重点转变为产生单倍体和双单倍体的其它方法。虽然多年生作物(尤其是习惯于远交的热带物种)的进展较少，但在多种实验室操作(包括单性生殖、雄性单性生殖、染色体丢失和基于组织培养的方法)中也产生了多种其它物种的单倍体植物。
木本物种普遍缺乏在单倍体和双单倍体生产方面的进展(Stettler和Howe，1966)，这主要是由于目前重点集中在涉及体外阶段的生产方法；而在这种条件下存在与木本物种生长整体不协调相关的许多问题。
纯合植物本身具有作为潜在新品种的价值，并且还可用于在所选择的纯合雄性和雌性间进行杂交来产生F₁杂交植物。这些F₁植物通常具有所谓的杂交优势(杂交优势)，即与任一亲本相比通常与在产量上显著增加相关的特性，并首次由Shull(1908)阐述。另外，F₁杂种的产生可以使育种人员生产大量包含来自纯合亲本系的包含单基因型的种子。与遗传上异种混合的基因型相比，这种特性由于具有选择产量高和/或具有其它期望特性的原种单基因型的潜能而具有许多优势。通过选择适合特定环境的基因型以及优化农业实践和管理实践，还具有获得更高产量的潜能。在许多作物中，产生商业数量的单基因型的唯一现实方法是通过无性克隆。对于一些作物(例如橡胶、可可和咖啡)，有使用根出条(suckers)、插条或接枝产生克隆的完善的无性繁殖方法，但这并不适用于所有的作物(例如油棕和椰子)。
根据Hermsen和Ramanna(1981)，“与自花授粉相同，单倍体在杂交授粉的二倍体作物中的应用是基于DH系(双单倍体系)的使用。然而，由于近交衰退(提示：在常规情况下远交的物种，其纯合个体的活性通常较低，而这被称为近交衰退)，这些系不能直接使用，仅能作为亲本近交系(parental inbred line)用于产生杂交种。当通过单倍体培育近交系时，可以绕过所有重复自交的障碍(其是天然异花授粉植物的特征)，例如雌雄异株、自交不亲和性和幼年期长。在两年生作物和幼年期长的作物中，对时间的节省尤其明显。在这些作物中，只有通过单倍体才可以培育近交系。”
因此，单倍体植物(和双单倍体植物)显示其所有的遗传信息，或者换句话说，其基因型通过其表型得到完整的显示。由此可以直接识别并选择对害虫和疾病或不利外部因素(干旱、盐度、重金属毒性等)的抗性。单倍体植物可以检测不能通过胚期的突变。基于类似原因，单倍体植物组织是遗传转化的理想载体，其可通过任何相关基因操作技术产生经过遗传修饰的材料，从而在加倍后给出所引入的一个或多个基因的纯合形式。
单倍体的农业应用集中于其在染色体加倍后快速产生纯合基因型的能力：
■缩短品种培育的时间，例如由10年减少到6年或更少；
■可以在一代而非在多代回交后培育出纯合的重组系；和
■由于隐性等位基因没有被显性等位基因的作用“掩蔽”，所以可以更高效地从重组系中选出隐性性状；
■通过快速培育纯合体，加快“外源”基因的引入。
两个纯合原种系的杂交(例如可以通过双单倍体产生的纯合原种系)可以产生在遗传上均一的、高度杂合的“杂交”种，例如二十世纪三十年代期间首先在美国产生的特别成功的杂交玉米品种。人们尝试通过培育“杂交系”在其它作物中再现在杂交玉米品种中所获得的产量提高，这并不奇怪。例如，基于商业目的，目前正广泛种植向日葵和甜菜的F₁杂交种，油菜(Canola)和水稻的杂交系也越来越常见；在中国生长的水稻超过一半为“杂交稻”，其产量比非杂交的同种物高至少20％。迄今为止，在所有油料作物中，油棕的最高产量方面还没有相应进展，尽管其4.8-7t/ha的产油量比其它油料作物高3-8倍(Wahid等，2004)。总的来说，油棕和大豆都是全世界植物油和油脂的主要来源(Abdullah，2005)，但油棕从未得益于杂交种的培育推广。
在油棕杂交种的产生方面没有进展的主要原因是由于该作物的育种系统阻止近交系的简单生成。油棕主要为远交物种，但与同时在同一株植物上产生雄花和雌花的玉米不同，每株油棕植物在任何一个时间仅产生雄花或雌花，因此仅可以利用储存的花粉通过可控授粉的方法对棕榈简单地进行自花授粉。将油棕转换为杂交作物并由此发挥潜在的杂交优势的进展依赖于开发出可靠的纯合植物生产方法。然而，迄今为止，尚没有任何单倍体或纯合二倍体油棕植物的公开实例。然而，对于油棕作物的遗传改良，现已有大量的育种(Wahid等，2004)、细胞培养(Abdullah 2005；Abdullah等，2005；Rival和Parveez，2005；Te-chato等，2005)和转化研究(美国申请20030159175)。
目前得到商业种植的油棕植物主要有两种：美洲油棕(Elaeis oleifera Kunth)和非洲油棕(Elaeis guineensis Jacq)。后者有三种亚型：硬壳型(Dura)、薄壳型(tenera)和无壳型(pisifera)。多数品种或种植种为薄壳型，其产生具有含油量较高的果实。海枣是包含枣椰(Phoenix dactylifera)和与枣椰近交的其它海枣属(Phoenix)种类的物种家族。
目前用作商业种植的所有油棕种子都产自从非纯合棕榈的遗传杂合群中选择的亲本。亲本杂合水平的改变和亲本系之间遗传差异的改变意味着在所产生的子代种子之间具有大量的遗传分离。因此，由棕榈杂交产生的种子在遗传上并不均一。这种遗传变化阻碍了油棕产业对高产量或其它期望性状的特异基因型的选择。
油棕仅具有单生长点，并且与包括海枣在内的其它一些棕榈物种不同，其不产生根出条。由于这些原因，不能通过无性繁殖的常规方法产生克隆。然而，可能通过组织培养产生体细胞克隆，在所述组织培养中，首先将来自叶、花序或根的小块组织(外植体)培养在专门的营养培养基中。然后，生长的组织可以形成愈伤组织(未分化细胞群)，其可以经处理产生自身能够缓慢发育成植物嫩芽的胚状体组织。然而，此类组织培养技术的实施通常较难且费力，而且对其中的生物学了解较少。另外，还存在由组织培养方法本身诱导的体细胞克隆变异的风险，这样变异会导致可以引起产量完全丧失的表型异常(Corley等，1986)。
需要提及的是，Maluszynski等(2003b，参见表3-1)中明确声明：Texeira等(1994)已经公开了在油棕中产生双单倍体的方法。这个声明是错误的。事实上，后一公开物阐述了源自二倍体花组织的体细胞胚胎发生，而没有阐述培养花药或其它可再生组织以产生单倍体胚和植物。
在其它棕榈物种的唯一相关研究包括通过花药培养产生椰子(Cocosnucifera)单倍体的失败尝试(Thanh-Tuyen and De Guzman，1983a，b；Monfort，1984，1985；Thanh-Tuyen，1985，1990；Pannetier and Buffard-Morel，1986；Griffisand Litz，1997；Perera，2002a，b，2003，Perera等2006)，和有关海枣(枣椰)的研究(Brochard，1981；Bouguedoura，1991；Chaibi等，2002)。有一篇关于在椰子中尝试进行胚珠培养的报道(Coconut Research Board，2002)。然而，在体外研究中没有从任何这些植物中产生单倍体植物。然而，这些体外研究都没有生产出单倍体植物。然而，有一个从双胚苗分离出单倍体椰子苗的实例(Whitehead andChapman，1962)，和由来自同一物种的单个胚观察到单倍体染色体数量(n＝16)的细胞学证据。还有主张认为：使用赤霉酸处理未授粉的雌性海枣花序诱导出了双单倍体“单性生殖”的后代(Ben Abdallah等，2001)。然而，这些出版物都没有阐述产生并选择自发单倍体或双单倍体的有效方法或提供与生产油棕单倍体或纯合油棕材料相关的教导。
油棕是具有长世代周期的多年生单子叶植物，因此，该作物的育种是一个非常漫长的过程；对于用于产生商业种子的新一代棕榈，通常需要约20年进行培育和子代试验。还没有育种人员通过近交(八代自交)产生近交系的报道，原因是由于进行杂交(6个月)、处理种子(3个月)、在温室中培育秧苗(12个月)、在田间种植植物秧苗(雄性和雌性花序将在18-24个月后发育)、收集花粉和自授粉棕榈并收获棕榈果茎(bunch)(24-30个月)都需要时间，为此在生物学上可能需要最少40年才能完成。目前，油棕的遗传改良主要通过传统方式进行。与其它主要是一年生植物的产油植物相比，向油棕中引入新性状是时间极长的过程；改良油棕或向油棕中引入性状可能需要12-14年。除世代周期长之外，多年生植物(例如油棕)的育种需要较大的面积以进行育种试验，并需要大量的一连串耗时的回交。
因此，缺乏有关油棕的进展主要是因为该植物的育种系统阻碍了近交系的简单产生。油棕主要为远交物种，但与同时在同一株植物上产生雄花和雌花的玉米不同，每株油棕植物在任何一个时间仅产生雄花或雌花，因此一棵树不能简单地进行自花授粉。将油棕转换为杂交作物并由此发挥潜在的杂交优势的进展依赖于开发出可靠的纯合植物生产方法。
发明内容
本发明第一方面提供了适用于产生种子、繁殖和改良作物的单倍体或双单倍体油棕或海枣植物的选择方法，该方法包括：
(a)提供棕榈植物群；
(b)从所述群中选择非典型表型的个体植物的子集；
(c)评估预筛子集中植物的杂合性；
(d)评估所述子集中植物的DNA含量；
(e)舍弃所述子集中发现的杂合植物；
(f)根据步骤(e)的结果将所述子集中剩余的植物归类为单倍体或二倍体。
步骤(c)和(d)的顺序可以交换。虽然由于步骤(e)依赖于步骤(c)的结果而使步骤(e)不能在步骤(c)之前进行，但类似地，步骤(e)可以在步骤(d)之前或之后进行。
优选地，利用多个分子标记进一步评价在步骤(f)中被归类为二倍体的植物的杂合性，将杂合的植物舍弃并将剩余的植物归类为双单倍体。
优选地，步骤(c)利用分子标记或生化标记(具体地2-40个，例如10-20个微卫星标记)评估所选子集的杂合性，虽然还可以使用利用基于单核苷酸多态性(SNPs)的多个标记系统之一的类似数量的标记(例如高分辨率熔体分析或焦磷酸测序)。
优选地，所述非典型表型为非典型的生长形态或生长模式，其可能在种子萌发或秧苗阶段或更晚出现。更优选地，所述非典型生长形态为胚根生长缩短，胚根与胚芽的长度比改变，胚根与胚芽的角度改变，胚根或胚芽颜色改变，在萌发过程中种子形状或大小改变，以及胚芽宽度与长度的比例改变中的一种或多种。萌发种子的非典型表型还可以是从单个种子萌发出两个胚。当非典型生长形态或生长模式可能为，例如营养生长变缓、小叶长度与宽度的比例减小、复叶节间距离缩短、复叶与植物轴的角度、叶子颜色和早熟开花中的一种或多种时，还可以在包括温室种植棕榈或田间种植棕榈的棕榈群中进行选择。
“非典型表型”是指单倍体和双单倍体显示的、落入非单倍体材料(即，通常为二倍体，但对于一些作物为多倍体)期望的正常表型范围之外的任何异常表型。由“正常范围”构成的置信区间随物种不同而不同，但非典型个体通常可代表小于1％的筛选群。例如，在油棕中，在胚芽和胚根发育后即可从萌发种子中选出候选的单倍体秧苗。在萌发室中培育约10天后，开始进行萌发。萌发油棕秧苗的群(cohort)通常显示清楚的同步发育途径和合理的同源表型(参见图1)。异常萌发的种子可能以多种方式之一背离特性表型(参见图2)，并可以包括以下多种不同特性：胚根生长缩短、胚根与胚芽的长度比改变，胚根与胚芽的角度改变(通常在正常类型中为约180°)、胚根或胚芽颜色改变、种子形状或大小改变、胚芽宽度与长度的比例改变以及从单个种子萌发出两个胚(双胚苗)。本文新颖性的关键要素在于对用于定义非典型特征进行选择的逻辑重复性实质。另外，随着鉴定的单倍体数量的增加，可使用分类方法鉴定对识别非典型组(atypical set)最为重要的那些性状并将其用于重新定义检索标准。由于单倍体数量的增加而增强了统计力度以及不再考虑不提供信息的性状，这个方法将逐渐提高表型筛选的准确性，并将继续直至单倍体频率不再提高。因此，本发明的特点是使用在之前的试验显示与单倍体或二倍体性状相关的一个或多个非典型表型作为选择植物的非典型表型。
优选地，利用多个分子标记进一步评估所选植物(例如萌发秧苗)纯合性的步骤包括使用50-200个，例如70-120个微卫星标记。更优选地，使用混合的标记样本进行这个步骤。如果所选植物对所使用的所有分子标记都是纯合的，则将其鉴定为双单倍体。
优选地，所述植物群包含至少1,000,000株个体。更优选地，所述植物群包含5,000,000-20,000,000株个体。更优选地，萌发的个体植物群为萌发种子或幼苗群。
“提供萌发种子或秧苗”表示使种子萌发和秧苗开始生长的任何方法。就油棕而言，其包括商业上经常使用的萌发技术和植物育种种子产生单元：湿热法和干热法。前一个方法目前很少使用：整个过程较短(95天，而干热法需要120天)，但在加热期内将发生一些萌发从而产生均一性较差的秧苗组。油棕种子在收获时是休眠的，并且在天然条件下要历经数年才偶尔萌发。打破休眠主要需要将种子在39-40℃的较高温度下保持达80天。
可以根据环境调整所使标记系统的性状或者以上使用的元素或行为的顺序。
使用标记物(优选为共显性分子标记)可以鉴定半纯合单倍体和纯合二倍体个体。单倍体和双单倍体在其细胞核基因组的所有基因座内仅具有一个等位基因。因此，可以将在任何基因座中显示两个等位基因的任何个体作为潜在的单倍体或双单倍体植物舍弃。根据本发明，优选提供低成本的预筛，从而舍弃大量的假候选成员，并提供高分辨率基因组表征法(参见下文)，从而在DNA含量评估(例如流式细胞术，参见下文)后确定单倍体或双单倍体状态。
使用流式细胞术评估植物或动物细胞内的基因组含量，还可以将其用于区分二倍体材料和单倍体材料。“流式细胞术”是指用于计数、检测并分选液体流中悬浮分析物的任何方法。其可以对流过光学或电子检测设备的单细胞的期望特性进行同步的多参数分析。因此，在这个步骤中，将流式细胞术应用于显示异常表型以及高水平的纯合性(在步骤b和c中鉴定)的个体，从而区分单倍体和二倍体。因此，在完成这个步骤时首次鉴定单倍体植物。
使用对基因组杂合性更全面的分子评价来提供单倍体植物身份的遗传确认，并鉴定出为二倍体且源自单倍体个体的染色体加倍的个体(所谓双单倍体植物)。在两种情况下，评价都基于单倍体和双单倍体分别为完全半纯合的和纯合的事实。虽然可以等同地使用许多其它的标记系统，但优选将微卫星标记用于这个目的。通过这个方式，确认单倍体的身份，并鉴定双单倍体植物。
这个方法的新颖之处部分在于表型筛选的反复性特性和使用连接-克隆法产生用于确认单倍体身份的大量标记物，还在于组合步骤从而产生从大量有性杂交的产物种子中系统地鉴定稀有单倍体的方法，而这种方法在早先一直被认为是不切实际的。
本发明第二方面提供了通过本发明第一方面的方法选出的植物。
本发明第三方面提供了产生纯合双单倍体油棕植物的方法，所述方法包括：
(a)利用本发明第一方面的方法选择单倍体油棕植物；
(b)通过自发染色体加倍；或通过对单倍体植物施加外部刺激使染色体数量加倍；或通过对从单倍体植物分离出的一个或多个细胞施加外部刺激，然后利用组织培养再生植物；或通过对单倍体植物进行授粉或克隆，或利用雄性或雌性生殖细胞中偶然自发加倍的染色体数量通过单倍体植物自交，从而获得双单倍体油棕植物。
本发明第四方面提供了产生二倍体F₁杂交油棕的方法，所述方法包括：
(a)利用本发明第一方面的方法选择至少两个纯合的双单倍体油棕植物，或者利用本发明第三或第八方面的方法获得至少两个纯合的双单倍体油棕植物；
(b)利用以上鉴定出的两个在遗传上不同的纯合双单倍体油棕植物，并使其进行有性杂交以产生在遗传上均一的F₁杂交子代。
本发明的第五方面提供了通过本发明第三方面和第四方面的方法产生的油棕植物。
本发明第六方面提供了单倍体油棕植物。
本发明第七方面提供了纯合的双单倍体油棕植物。
在上述方法中引入非典型表型使该方法对单倍体植物的选择优于对双单倍体植物的选择，这是因为后者的原种实例可能在实际上显示正常的表型。基于这个原因，我们还提供了优先从相同起始材料选出双单倍体子代的第二方法。这是可应用于油棕和海枣以及其它作物的通用方法。
因此，本发明第八方面还提供了从单个母本的子代中鉴定出双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)优选使用共显性分子标记(如微卫星或基于SNP的标记)，在母本中鉴定出至少20个杂合的非连锁基因座；
(b)利用1-5个选择标记进行初筛，舍弃杂合体，将剩余的作为候选双单倍体保留；
(c)将流式细胞术用于保留的候选成员，舍弃单倍体，将二倍体作为潜在的双单倍体保留；
(d)将至少其它15个保留标记用于保留的候选成员，并将二倍体和对于所使用的所有标记都为纯合的个体归类为双单倍体(通过独立分配发生这种情况的可能性为2²⁰＝1/1,048,576，如果使用的标记大于20个，则该可能性更低)。
我们尚未发现任何旨在从有性子代中选择双单倍体(绝对纯合的植物)的此类研究，所述研究引入对母本的预先表征，以及选择固定数量的未连锁杂合基因座作为后续筛选的基础。因为即便使用不同的标记，分析力度仍保持相同(在这种情况下，根据独立分配，发现一个假阳性纯合二倍体的几率为1/1,048,576)，所以该步骤可以确保试验、基因型和物种之间的标准化。因此，所述第二方法的该步骤是新颖的，同样由该步骤组合产生的方法也是新颖的。
尽管单倍体(或直接加倍的单倍体)具有产生纯种系的亲本系和由此产生F₁杂种的内在价值，但商业和官方的油棕育种项目并没有投资于鉴定单倍体基因型的研究项目。由于可以采用来自诸如水稻、小麦和玉米等的世界性粮食作物的成熟且得到验证的育种策略，在任何作物中有关获得单倍体的方法的发现都具有改变育种过程速率的潜能。另外，可以产生遗传上纯合的商业种植材料，其通过在选择在具体位点的特异的F1杂种、管理实践进一步提高其价值，或具有某些选择的性状。
相反，油棕产业在过去的30年内花费了数百万美元用于通过体细胞胚胎发生来产生油棕克隆。其遇到的主要问题是开花异常，其可能导致零果茎产量，而且研究人员也尚不能完全理解导致开花异常的内在生物学原理(这被普遍认为是“表观遗传”现象：从一个细胞世代到下一个细胞世代的基因表达修饰)。尽管存在这些困难，但油棕产业仍持续在油棕克隆技术中进行新投资，以产生在遗传上更均一的植物。因此，迄今为止尚未开发出可以避免这些问题的自发单倍体和双单倍体的筛选方法，这一点令人惊讶。据我们的了解，马来西亚油棕研究局(Malaysian oil palm research stations)曾试图在温室中筛选单倍体秧苗，但没有明显的成功，其结果也没有公开。
附图说明
为了完全理解本发明并容易地用于实践，本文将通过非限制性实施例(仅优选本发明的实施方案)的方式进行阐述，该阐述将参考所附的图示。
在所述附图中：
图1表示萌发后的正常秧苗。
图2表示萌发后的异常秧苗。
图3显示转移到温室后的秧苗。
图4A显示用于鉴定个体的凝胶实例，其中所述个体对于所选标记为纯合的(一条带)和杂合的(两条带)。
图4B为显示用于鉴定纯合植物的分级筛选的流程图。
图5显示二倍体(a)和单倍体(b)基因型样本的典型流式细胞图谱。
图6为显示确认的单倍体的亲本的图表。
图7A显示单倍体植物和相应的杂合二倍体植物。
图7B显示在同一天播种的典型二倍体杂合油棕(下)和两株双单倍体油棕(上)的图片。
图8显示利用流式细胞术测定的单倍体和二倍体植物的DNA含量。
图9显示表示使用分子标记从杂合的二倍体(两条带)中鉴定出单倍体/纯合的二倍体(一条带)的凝胶照片。
图10显示在种植2年7个月后，由第一花序确认的单倍体50-03060260_0002(左图为花序的照片，右图为单倍体秧苗的照片)。
图11为本发明的单倍体油棕细胞的显微照片。
定义
以下对说明书和权利要求书中使用的词汇进行定义：
“植物”包括任何发育阶段的完整植物，例如种子、萌发的种子、秧苗(seedling)、在温室和田间种植的棕榈；及其子代。
“单倍体”表示包含配子染色体数量的任何细胞或包含此类细胞的任何组织或植物。
“纯合”(纯合的)表征包含两套或更多相同染色体组的任何细胞，或由此类细胞构成的任何组织或植物。
“苗(plantlet)”表示没有完全生长的任何小植物。
所使用材料的来源
在以下试验中使用的油棕种质(非洲油棕Elaeis guineensis Jacq)从印度尼西亚苏门答腊岛获得，本方法的第一阶段(选择表型异常的材料)在这里进行。人们认为，在历史上油棕(非洲油棕)来源于西非，并已经在此栽培多年：该物种在上世纪前叶从西非引入到太平洋区域，此后在该区域内广泛种植。
优选实施方案
实施例
以下实施例用于进一步举例说明和解释本发明，但不应以任何方式解释为对本发明的限制。其显示本发明在油棕方面的应用，但同样也可应用于海枣。
所有参考文献都通过引用并入本文。
(1a)种子处理
1.通过机械方法除去油棕种子的中果皮，并将所述种子在室温下风干24小时，然后在25℃的空调室中风干24小时，从而使种子的水分含量达到15-18％。然后贮存种子，通常置于塑料袋或盘子中在空调室(25℃)中持续1-3个月(虽然按照这种方法可将种子贮存长达1年)。
2.将所述种子浸泡3天，以使其水份含量提高至18-20％，然后在塑料袋或盘子中以38-40℃热处理40-60天。
3.加热后，将种子浸泡5天，以将其水分含量提高至＞22％，然后在室温下干燥约4小时。
4.将种子转移到萌发室，通常在处于室温的萌发室中7-10天后开始发芽，并持续2-3个月。
(1b)形态筛选
对形态变异型的油棕秧苗，进行两次大规模的形态筛选。第一次筛选由10,900,000粒萌发的种子组成，其中3,854粒被鉴定为形态异常(3,801)或双胚苗(53)，其余的个体都视为“正常”(参见图1和2中两个类型的实例)。因此，在这种情况中，所评价99.96％的种子被归类为具有正常表型，而0.035％被归类为异常。在第二次筛选中，筛选约10,000,000个商品秧苗，以及约1,000,000个取自育种试验的秧苗。该试验产生5,704个形态候选成员，其中5,601个表型异常，且103个为双胚秧苗。因此在这个筛选中，在向温室转移前，99.95％的秧苗被归类为正常，0.05％的秧苗被归类为异常(图3)。
(1c)分子预筛
排除杂合个体的分子预筛
用以对显示异常表型的秧苗进行分子预筛以舍弃杂合子的方法包括以下步骤：
1.DNA提取
2.通过PCR扩增微卫星标记
3.通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物
4.对结果进行评价以舍弃具有一个或多个杂合基因座的个体
以下对各个步骤进行阐述：
1.DNA提取
从秧苗取下约0.5cm的胚根(约50mg)，并利用Qiagen 96DNeasy提取试剂盒根据如下所述的厂商说明提取DNA，当然，也可以使用其它DNA提取系统。
A.准备工作
1.对于新的试剂盒，向AP3/E缓冲液和AW缓冲液中加入100％的乙醇
2.将水浴设定为65℃
3.将AE和AP1缓冲液预热至65℃
4.如果AP1缓冲液外观浑浊，则加热至65℃并振荡直至溶液变澄清
B.方法
1.向两排微量收集管架中的每个管中加入50mg植物材料。保留清洁盖片(clean cover)。
2.向每个微量管中加入1个碳化钨珠子。
3.制备裂解溶液：(400μl AP1+1μl RNAse+1μl Reagent DX)/反应，和15％的各种成分。
4.利用MM 300，30Hz破碎样本1.5分钟。
5.3000rpm脉冲离心。
6.摘去并舍弃盖子，向每个微量收集管中加入130μl AP2缓冲液。
7.用新的盖子封闭微量试管。将清洁盖片(来自步骤1)放置在96孔板上。将平板剧烈振动15s。3000rpm脉冲离心。
8.将微量试管架在-20℃孵育10分钟。
9.摘去并舍弃盖子。从每管转移400μl上清液到新的微量收集管平板中(已提供)。不要转移沉淀和漂浮颗粒。保持分层状态(strips)并使用最低的移液速度。回收钨珠子。
10.加入1.5体积(通常为600μl)的AP3/E缓冲液。
11.用新的盖子封闭微量试管并剧烈混合。
12.脉冲离心(3000rpm)以收集溶液。
13.将96孔板放置在所提供的S-Blocks上。
14.向96孔板的每个孔内转移1ml样品。
15.用Airpore Tape膜密封，并在6000rpm离心4分钟。
16.向每个样品中加入800μlAW缓冲液。
17.在6000rpm离心15分钟。
18.向每个样品中加入100μl AE缓冲液，并用新的AirPore膜密封。
19.在室温(15-25℃)下孵育1分钟。
20.在6000rpm离心2分钟。
2.通过PCR扩增微卫星标记
引物
使用以下的微卫星标记：

  正向引物 反向引物 标记1  GAGATTACAAAGTCCAAACC  (SEQ ID NO：1) TCAAAATTAAGAAAGTATGC (SEQ ID NO：16) 标记2  ACGCATGCAGCTAGCTTTTC  (SEQ ID NO：2) CGCGTGAAAGATATGAATCAAC (SEQ ID NO：17) 标记3  CACGCACGCAGTTTATTCTT  (SEQ ID NO：3) GGATGTATGCTTTACCTCCGAAT (SEQ ID NO：18)
  标记4  CCCCTTTTGCTTCCCTATTT  (SEQ ID NO：4)  CTCCTTTTCCCCATCACAGA  (SEQ ID NO：19)  标记5  GACACAAGCAAAAACAAAAGCA  (SEQ ID NO：5)  ATTCTGAAAGGAGGGGGAAA  (SEQ ID NO：20)  标记6  ATATGTGTGGGTGTGCGTGT  (SEQ ID NO：6)  TGCCTCTGGTTGTTAGTCTGG  (SEQ ID NO：21)  标记7  TCTCTCTCTCTCTCTCTATGTGTG  TGT(SEQ ID NO：7)  TGGCAATCAGCACACATTCT  (SEQ ID NO：22)  标记8  GCAGCTCTTTCCACACCTCT  (SEQ ID NO：8)  TGTGGTCTCCTGAGGAAGATG  (SEQ ID NO：23)  标记9  TTTTCCCCATCACAGAATTG  (SEQ ID NO：9)  CCCCTTTTGCTTCCCTATTT  (SEQ ID NO：24)  标记10  TAGCCGCACTCCCACGAAGC  (SEQ ID NO：10)  CCAGAATCATCAGACTCGGA  CAG(SEQ ID NO：25)  标记11  AGCTCTCATGCAAGTAAC  (SEQ ID NO：11)  TTCAACATACCGTCTGTA  (SEQ ID NO：26)  标记12  CCTTCAAGCAAAGATACC  (SEQ ID NO：12)  GGCACCAAACACAGTAA  (SEQ ID NO：27)  标记13  GTAGCTTGAACCTGAAA  (SEQ ID NO：13)  AGAACCACCGGAGTTAC  (SEQ ID NO：28)  标记14  GCTCGTTTTTGTTTAGGTGA  (SEQ ID NO：14)  TTTTCTCCATAGTCCGTTAC  (SEQ ID NO：29)  标记15  CCTCGGGTTATCCTTTTTACC  (SEQ ID NO：15)  TGGCTGGCTTCGGTCTTAG  (SEQ ID NO：30)
注意：标记10-15得自于Billotte等，(2005)
反应混合物
所有情况下，10μl PCR反应混合物包含以下反应物：1.0μl 10x PCR缓冲液(Bioline)、0.3μl MgCl₂(10mM)、0.4μl dNTPs(每种10mM)、每对引物0.2μl(10μM)、1-5ng DNA(如上提取的DNA)和1U Taq DNA聚合酶(5Uμl^-1Bioline)。
PCR条件
对所有微卫星标记都使用以下条件进行聚合酶链式反应：起始变性步骤：94℃2分钟；然后94℃30秒、52℃30秒和72℃45秒共35个循环，最后的延伸步骤：72℃7分钟。
3.通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物
按照常规方式，使用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色对通过微卫星PCR产生的产物进行分离和观察。
(1)试剂
TBE电泳缓冲液：              0.089M Tris碱、0.089M硼酸
                             (pH 8.3)和2mM Na₂EDTA
上样缓冲液：                 0.23％(w/v)溴酚蓝
                             60mM EDTA
                             40％(w/v)蔗糖
溴化乙锭染料：               1％(w/v)溴化乙锭
Ladder 100bp(Gibco Life Science BRL)
(2)凝胶制备和上样
在1xTBE缓冲液中制备1.0-1.5％(w/v)的琼脂糖溶液，并在微波炉内以最大功率(700W)加热2x1分钟以形成凝胶溶液。将所述凝胶溶液冷却至约55℃，然后加入溴化乙锭(3.5μl/100ml凝胶)。用胶带封闭合适的凝胶盘设备(100ml凝胶用中等凝胶盘，250ml凝胶用最大凝胶盘)的末端，并在相应的位置放入孔数和类型适当的梳子。最常使用的是16x20μl孔的梳子。小心地将凝胶溶液倒入制备好的盘中，并冷却至少20分钟。然后取下梳子和胶带并将凝胶盘浸入含1xTBE缓冲液的容器中。
通常，在上样前将5μl样品与2μl溴酚蓝缓冲液混合。所述上样缓冲液具有两个功能：首先，其提高样品的比重从而防止DNA从孔上方扩散至周围缓冲液中，其次，其表示产物通过电泳在凝胶中迁移的进程(蓝色染料的迁移位置与长度为200bp的DNA片段大致相同)。为了估测扩增产物的大小，将4μl 100bpGibco’s ladder(Gibco Life Science BRL)与待分析样品一起上样。
中等凝胶(100ml)的电泳在1X TBE缓冲液中于120伏进行约1h。电泳之后，将凝胶从所述设备中移出并在5mg/l溴化乙锭水溶液中后染色40分钟，在去离子水中脱色2分钟，然后利用UVP Bio-Doc系统在紫外光下观察。通过UVP Bio-Doc系统获得jpeg格式的凝胶图像，并用于评价。
4.对结果进行评价以舍弃具有一个或多个杂合基因座的个体
在琼脂糖凝胶电泳分离(上述步骤1-3)后，针对出现一条或两条不同的带评价通过各个微卫星-基因型组合产生的PCR产物。将在任一微卫星基因座获得两个产物的任何基因型视为杂合的，并且因为其不是可能的候选单倍体或双单倍体植物而将其舍弃。将剩余的个体送往所述过程的步骤(d)(流式细胞术)
结果
从上述两次形态筛选鉴定为表型异常的秧苗中随机选择2000个以上进行分子筛选。另外，还有150个具有正常表型的个体。还有24个二倍体薄壳型克隆作为对照(均为二倍杂合体)。
当利用多达15个微卫星标记(1-15)进行筛选时，117个基因型(参见流式细胞术部分的表中的鉴别码)对所有基因座都显示单等位基因(图4中显示了使用标记物09的实例)，因此被认为是高度纯合的。
因此，这些个体作为候选的单倍体/双单倍体，并进入步骤d(流式细胞术)。
图4显示25个油棕基因型对标记09产生的条带图。从筛选中舍弃显示两个等位基因(标为′2′)的个体。
(1d)通过流式细胞术评价细胞核基因组含量
流式细胞术
利用经鉴定为形态异常且高度纯合的个体(步骤b和c)进行流式细胞术，从而利用以下方法确定其倍性水平。
样品制备
利用锋利刀片在含冰冷缓冲液的塑料皮氏培养皿中粉碎植物材料(每cm²为20-50mg的多个碎片)，从而从新鲜植物材料(叶或根)中分离细胞核。所述DNA缓冲液(4℃贮存)基于：Arumuganathan，K.and Earle，E.D.Estimation ofNuclear DNA Content of Plants by Flow Cytometry.Plant Molecular BiologyReporter，Vol 9(3)1991，Pages 229-233。
5mM Hepes
10mM七水合硫酸镁
50mM氯化钾
0.2％Triton X-100
2％DTT(二硫苏糖醇)
2mg/LDAPI
pH 8
向所述溶液中加入DAPI，其为荧光染料，能够与双链DNA选择性地结合形成复合物，从而获得在465nm发射荧光的产物。DAPI具有特异的DNA结合性状，优选结合富含腺嘌呤-胸腺嘧啶(AT)的序列。粉碎后，使含细胞成分和大块组织残留物的缓冲液(ca.2ml)通过40微米网孔的尼龙滤膜。这个方法将从几平方厘米的叶片中获得数千个细胞核。
使含经染色细胞核的溶液通过流式细胞仪。需要使用倍性(DNA含量)已知的对照物作为参照，对于油棕，使用来自二倍体薄壳型棕榈的组织，这是因为这样的壳厚度必然为杂合的，因此这样的棕榈不可能是单倍体。
利用光电倍增器测定通过高压水银灯光束中心的染色细胞核的荧光，并将其转化成电压脉冲。
对这些电压脉冲进行电子处理，产生可由计算机处理的整体和峰信号。当用于处理所述样品的激发和发射过滤设置恰当时，可以产生DNA的直方图。
材料
流式细胞仪：CyFlow ML(Partec GmbH，Otto Hahnstrasse 32，D-4400Münster，Germany)，具有高压水银灯，OSRAM HBO 100寿命长。目镜：40x N.A.0，8空气(Partec)
与DAPI组合的滤镜：
高温防护滤镜KG-1
激发滤镜：UG-1和BG-38。
二色镜：TK 420和TK 560。
发射-滤镜：GG 435
软件：Flomax Version 2.4d(Partec)
结果
在步骤c中鉴定为高度纯合的117个基因型中，经流式细胞术，83个被鉴定为单倍体，剩余的34个个体被鉴定为二倍体(参见以下表1)。
表1.利用标记1-15鉴定纯合克隆的倍性水平(x或2x；单倍体或二倍体)
  候选成员  DNA样品号  筛选中使用的  引物总数  流式细胞术  结果  50-Mix5-7  11260406301  9个引物  x  50-03060367C  07280501801  15个引物  x  50-03060260C-2  07280501901  15个引物  x  53-03080954C-2  09270500101  10个引物  x  53-03090761C-5  09280504501  10个引物  x  BATCH 51；03060318C；1  060728_0010_01_a  15个引物  x  BATCH 53；03090761C；5  060728_0018_01_a  15个引物  x  0623/172；05095508C；1  060728_0021_01_a  15个引物  x  BATCH 50；03060260C；2  060728_0027_01_a  15个引物  x  0611/32；05050248C；1  060728_0032_01_a  15个引物  x  0611/16；05050228C；1  060728_0034_01_a  15个引物  x  BATCH 53；03080954C；2  060728_0035_01_a  15个引物  x  06 412；04059061B；3  060728_0050_01_a  14个引物  2x  0628/152；05100720C；1  060729_0021_01_a  15个引物  x  0628/185；05100351C；1  060729_0063_01_a  15个引物  x  BATCH 51；03060626C；1  060729_0127_02_a  15个引物  x  BATCH 67；0409034MC；2  060729_0130_02_a  14个引物  2x  BATCH 67；0409034MC；4  060729_0131_02_a  15个引物  2x  BATCH 67；0409034MC；15  060729_0132_02_a  15个引物  2x  BATCH 65；0409034MC；7  060729_0134_02_a  15个引物  2x  BATCH 65；0409034MC；35  060729_0138_02_a  15个引物  2x  BATCH 65；0409034MC；56  060729_0139_02_a  15个引物  2x  BATCH 65；0409034MC；50  060729_0141_02_a  15个引物  2x  BATCH 65；0409034MC；47  060729_0142_02_a  15个引物  2x  0628/53；05090595C；1  060731_0043_01_a  15个引物  x  0627/125；05090717C；2  060731_0065_01_a  15个引物  x  0627/12；05080220C；1  060731_0080_01_a  15个引物  x  0627/6；05080095C；1  060731_0086_01_a  14个引物  x  0631/Normal；05039033B；31  060731_0265_01_a  14个引物  x
  64-0409021MC-34  02130604301  15个引物  2x  64-0410040MC-1  02130604801  15个引物  2x  51-03060626C  02130605301  15个引物  x  64-0410040MC-20  02140600401  15个引物  2x  64-0410040MC-16  02140600801  15个引物  2x  65-0409021MC-2  02140601001  15个引物  2x  06 412B-04059061B-3  02170605501  15个引物  2x  06 412B-04129091B  02170605801  15个引物  2x  0550-15/05010827C  02200602401  15个引物  x  0550-17/05010442C-1  02200602601  15个引物  x  0550-23/05020059C  02200603101  15个引物  x  0550-33/05020568C  02200603401  15个引物  x  0550-36/05020420C-2  02200603701  15个引物  x  0550-40/05010880C  02200607501  14个引物  x  0551-36/05020511C  02200607601  15个引物  x  0551-32/05020361C-1  02210600401  15个引物  x  0552-4/05010836C-2  02210600901  15个引物  x  0552-38/05020501C  02210603101  14个引物  x  0552-39/05020415C  02210603201  15个引物  x  0552-31/05020858C  02210603701  15个引物  x  0552-91/05020375C  02210603901  15个引物  x  0552-111/05020626C  02210607201  15个引物  x  0552-128/05020558C-1  02210607701  15个引物  x  0601-35/05020946C  02210608201  15个引物  x  0601-42/05030201C-6  02210609501  15个引物  x  0601-51/05030224C-2  02220600201  15个引物  x  0607-21/05040317C-3  02220601801  14个引物  x  0606-32/05040240C  02220606201  13个引物  x  0601-77/05020961C  02230600701  15个引物  x  0601-62/05030147C  02230601401  15个引物  x  0601-54/05030462C  02230601901  15个引物  x  0551-21/05020271C-1  02200605801  14个引物  x  0601-9/05020843C-2  02230603101  15个引物  x  0602-17/05020631C-1  02230605501  16个引物  x  0607-111/05040970C-1  03010600201  15个引物  x  0607-81/05040578C-1  03010600501  15个引物  x
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图5显示了直方图的实例。
基因组的表征
使用基因组表征具有两个目的。第一是为了确认由形态评估、分子筛选和流式细胞术鉴定为单倍体的植物之间没有杂合性。第二是为了在二倍体并缺乏任何可检测杂合性的基础上鉴定双单倍体。用于评价两组植物的方法相同，并在以下进行阐述。
标记策略
利用96个微卫星基因座进行基因组表征(用于杂合性)。并未采纳利用标记引物，由所有引物对所有候选样品进行筛选的策略，而是采用了汇集策略(pooling strategy，由Cryer等在2005年提出)，从而不再需要大量昂贵的标记SSR引物。该方法包括利用未标记引物扩增所有单倍体候选成员的每个微卫星基因座，将产物混合(bulking)并一起连接到载体中，然后利用荧光标记的载体引物进行第二次扩增以揭示等位基因的形式。然后在毛细管测序仪上通过分离评估所有个体在每个基因座的等位基因数量。可以对利用汇集策略产生的图谱和使用24个标记的微卫星标记子集通过常规毛细管电泳分离和检测而从10个代表性样品(二倍体和单倍体)获得的图谱进行比较，从而证明该方法获得的结果的准确性。
利用PCR产物的混合连接(bulk ligation)进行基因组表征
筛选的第一步包括利用表2(下文)中列出的96个微卫星标记扩增12个候选样品。对于所有反应，10μl微卫星反应混合物包含以下试剂：1.0μl 10x PCR缓冲液(Bioline)、0.3μl MgCl₂(10mM)、0.4μl dNTPs(每种10mM)、每对引物2.0μl(1μM)、1-5ng DNA(在BLRS提取的DNA)和lU Taq DNA聚合酶(5Uμl^-1Bioline)。热循环仪的程序设定为：起始变性步骤：94℃2分钟，然后94℃30秒、52℃30秒和72℃45秒共35个循环，最后的延伸步骤：72℃7分钟。通过在120V通过1％w/v琼脂糖凝胶电泳30分钟，对PCR产物的大小进行评估。
表2.用于混合连接筛选的微卫星标记(Billote等2005)
  标记  正向引物  反向引物  标记16  GACCTTTGTCAGCATACTTGGTGTG  (SEQIDNO：31)  GCAGGCCTGAAATCCCAAAT  (SEQIDNO：127)  标记17  ATGCATGTGATTTTATTAGGTGAGA  (SEQIDNO：32)  CGACCCTCAGTCAATCAGTAAG  (SEQIDNO：128)  标记18  AAGCTAGCGACCTATGATTTTAGA  (SEQIDNO：33)  AAACAAGTAATGTGCATAACCTTTC  (SEQIDNO：129)  标记19  CCCACCACCCCTAGCTTCTC  (SEQIDNO：34)  ACCCCGGTCCAAATAAAATC  (SEQIDNO：130)  标记20  AGAGAGAGAGAGTGCGTATG  (SEQIDNO：35)  GTCCCTGTGGCTGCTGTTTC  (SEQIDNO：131)  标记21  GGGTAGCAAACCTTGTATTA  (SEQIDNO：36)  ACTTCCATTGTCTCATTATTCT  (SEQIDNO：132)  标记22  CGAGGCCCAAAAACATTCAC  (SEQIDNO：37)  GGTCCCGATCCCGTCTACTG  (SEQIDNO：133)  标记23  TTGCGGCCCATCGTAATC  (SEQIDNO：38)  TCCCTGCAGTGTCCCTCTTT  (SEQIDNO：134)  标记24  AGGGAATTGGAAGAAAAGAAAG  (SEQIDNO：39)  TCCTGAGCTGGGGTGGTC  (SEQIDNO：135)  标记25  AGCAAGAGCAAGAGCAGAACT  (SEQIDNO：40)  CTTGGGGGCTTCGCTATC  (SEQIDNO：136)  标记26  TAGCCATGCCGCCACCACTT  (SEQIDNO：41)  CAATCCATTAGCGTGCCCTTCT  (SEQIDNO：137)  标记27  CTTACCCCGCCTCCTCTCCT  (SEQIDNO：42)  CGAAATGCCCTTCCTTTACACTA  (SEQIDNO：138)
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  标记71  TGTAGGTGGTGGTTAGG  (SEQIDNO：86)  TGTCAGACCCACCATTA  (SEQIDNO：182)  标记72  AGCAAGACACCATGTAGTC  (SEQIDNO：87)  GACACGTGGGATCTAGAC  (SEQIDNO：183)  标记73  AAAAGCCGATAGTGGGAACA  (SEQIDNO：88)  ATGCTGAGAGGTGGAAAATAGAG  (SEQIDNO：184)  标记74  GTCCATGTGCATAAGAGAG  (SEQIDNO：89)  CTCTTGGCATTTCAGATAC  (SEQIDNO：185)  标记75  AGCCAATGAAGGATAAAGG  (SEQIDNO：90)  CAAGCTAAAACCCCTAATC  (SEQIDNO：186)  标记76  CAATTCCAGCGTCACTATAG  (SEQIDNO：91)  AGTGGCAGTGGAAAAACAGT  (SEQIDNO：187)  标记77  GGGCTTTCATTTTCCACTAT  (SEQIDNO：92)  GCTCAACCTCATCCACAC  (SEQIDNO：188)  标记78  GACAGCTCGTGATGTAGA  (SEQIDNO：93)  GTTCTTGGCCGCTATAT  (SEQIDNO：189)  标记79  ACTTGTAAACCCTCTTCTCA  (SEQIDNO：94)  GTTTCATTACTTGGCTTCTG  (SEQIDNO：190)  标记80  CCTTCAAGCAAAGATACC  (SEQIDNO：95)  GGCACCAAACACAGTAA  (SEQIDNO：191)  标记81  CCACTGCTTCAAATTTACTAG  (SEQIDNO：96)  GCGTCCAAAACATAAATCAC  (SEQIDNO：192)  标记82  GGGAGAGGAAAAAATAGAG  (SEQIDNO：97)  CCTCCCTGAGACTGAGAAG  (SEQIDNO：193)  标记83  AGCAGGGCAAGAGCAATACT  (SEQIDNO：98)  TTCAGCAGCAGGAAACATC  (SEQIDNO：194)  标记84  GCCTATCCCCTGAACTATCT  (SEQIDNO：99)  TGCACATACCAGCAACAGAG  (SEQIDNO：195)  标记85  CATCAGAGCCTTCAAACTAC  (SEQIDNO：100)  AGCCTGAATTGCCTCTC  (SEQIDNO：196)  标记86  ATTCATTGCCATTCCCTTCA  (SEQIDNO：101)  TTGTCCCCTCTGTTCACTCA  (SEQIDNO：197)  标记87  ATTGCAGAGATGATGAGAAG  (SEQIDNO：102)  GAGATGCTGACAATGGTAGA  (SEQIDNO：198)  标记88  TCTCCCAAATCACTAGAC  (SEQIDNO：103)  ATCTGCAAGGCATATTC  (SEQIDNO：199)  标记89  ACGTTTTGGCAACTCTC  (SEQIDNO：104)  ACTCCCCTCTTTGACAT  (SEQIDNO：200)  标记90  TCCACTCTGGCAACTCC  (SEQIDNO：105)  AAGGATGGGCTTTGTAGT  (SEQIDNO：201)  标记91  TTTAGAGGACAAGGAGATAAG  (SEQIDNO：106)  CGACCGTGTCAAGAGTG  (SEQIDNO：202)  标记92  AGCAAAATGGCAAAGGAGAG  GGTGTGTGCTATGGAAGATCATAGT
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对12个个体中的每一个构建两组混合物(bulk)，每组混合物包含48个标记。然后，按照厂商的说明，利用QIAquick PCR纯化柱(QIAGEN)对混合的PCR产物进行纯化。接着，将纯化产物连接到pDrive克隆载体(QIAGEN)上，以提供第二轮PCR的通用结合位点。选择pDrive载体是因为其连接频率高，并且考虑到其包含M13正向引物结合位点和M13反向引物结合位点的事实。通过在插入位点包含互补碱基(U碱基)，所设计的线性载体可以利用Taq聚合酶在所得PCR片段上产生单个腺嘌呤核苷酸悬端的特性。利用简单的连接反应将PCR产物的腺嘌呤碱基和载体的U碱基连接在引起，产生环化质粒。这可以通过向0.2ml eppendorf试管中加入5μl 2x Ligation Master Mix，4μl PCR产物和1μlpDrive载体(50ng μL^-1)来完成。通过脉冲离心收集反应物，连接反应在4℃进行约15h。用超纯水以1∶10对连接产物进行稀释，从而形成第二次PCR的模板，其包含单微卫星基因座特异性引物和荧光标记的通用引物M13(正向或反向)。用荧光染料(FAM)标记正向M13(-40)，用HEX(两者皆由SIGMAALDRICH提供)标记反向M13。PCR的条件与初次扩增步骤中的条件相同，第二次使用稀释的连接产物作为DNA模板。对产物进行1∶5稀释，并根据片段的预期大小和所使用的荧光染料进行有序的混合，这样可以在毛细管测序仪的单次运转中评价多个样品。在ABI Prism 3100测序仪上通过毛细管电泳分离这些产物。所述测序仪利用线性流动介质，即POP-6^TM聚合物(Applied Biosystems)，从而在毛细管中分离片段，并通过Genescan Version 3.1^TM软件程序(Applied Biosystems)记录引入的标记引物发射的荧光。输出文件可通过描绘代表AFLP-DNA片段的峰，从而对个体的遗传图进行比较。利用ABI PRISM3.6NT软件(Applied Biosystems)进行片段分析，其可以分析片段的大小(以碱基对表示)并可以评估扩增产物的强度。利用ABI PRISM3.6NT软件(AppliedBiosystems)对等位基因的大小进行评估。对任何微卫星标记产生两个等位基因峰的任何个体都被认为是部分杂合，并且由于不是可能的单倍体或双单倍体(根据流式细胞术结果)而被舍弃。
结果
基因组的表征利用80个其它微卫星标记通过上述混合连接技术(e)，对在分子筛选后鉴定出的包括二倍体和单倍体个体的24个候选成员中的8个成员的子集(下表所列)进行更广泛的分子表征。
表3
  基因型参考  样品号  倍性水平  2  批号53；03090761C；5  060728_0018_01_a  单倍体  4  批号50；03060260C；2  060728_0027_01_a  单倍体  7  批号53；03080954C；2  060728_0035_01_a  单倍体  13  批号67；0409034MC；4  060729_0131_02_a  单倍体  16  批号65；0409034MC；35  060729_0138_02_a  二倍体  18  批号65；0409034MC；50  060729_0141_02_a  二倍体  22  0627/125；05090717C；2  060731_0065_01_a  单倍体  24  0629/97；05100048C；3  060731_0105_01_a  单倍体
与预期相同，通过流式细胞术鉴定为单倍体的所有个体在试验的所有80个基因座上都仅包含单个等位基因。因此，这些个体在共计95个基因座(包括筛选中使用的15个标记物)上都为半纯合的，由此视为确定了其单倍体身份。与之相比，两个二倍体在所筛选的多个基因座上都为杂合的。
混合连接技术的验证
当通过传统毛细管电泳并利用标记微卫星引物对10个个体的图谱进行微卫星分析时，所获得的图谱显示24个标记的等位基因状态的分值相同。
双单倍体的鉴定
此处，通过在ABI Prism 3100DNA测序仪上进行常规毛细管电泳，我们使用了其它32个荧光标记的微卫星标记(以下列出)筛选了对所有15个上述标记都为纯合的所有34个二倍体候选成员。有两个基因型(65-0409034MC-144和65-0409034 MC-114)对所有的标记都为纯合的。因此，这些植物对于共计47个微卫星标记都为纯合的，因此被认为是双单倍体油棕植物。
以下是用于该表征步骤的微卫星：
  微卫星  标记  正向引物序列  反向引物序列  标记16  GACCTTTGTCAGCATACTTGGTGTG  (SEQ ID NO：31)  GCAGGCCTGAAATCCCAAAT  (SEQ ID NO：127)  标记21  GGGTAGCAAACCTTGTATTA  ACTTCCATTGTCTCATTATTCT
  (SEQ ID NO：36)  (SEQ ID NO：132)  标记23  TTGCGGCCCATCGTAATC  (SEQ ID NO：38)  TCCCTGCAGTGTCCCTCTTT  (SEQ ID NO：134)  标记29  GCAAGATGCAATGGAGTTCA  (SEQ ID NO：44)  CAAACCGCAGCAAGTCAGA  (SEQ ID NO：140)  标记36  CTCCGATGGTCAAGTCAGA  (SEQ ID NO：51)  AAATGGGGAAGGCAATAGTG  (SEQ ID NO：147)  标记44  ATGACCTAAAAATAAAATCTCAT  (SEQ ID NO：59)  ACAGATCATGCTTGCTCACA  (SEQ ID NO：155)  标记48  CGGTTTTGTCGCATCTATG  (SEQ ID NO：63)  GTCGTCAGGGAACAACAGT  (SEQ ID NO：159)  标记51  TCCAAGTAGCAAATGATGAC  (SEQ ID NO：66)  TGCCCTGAAACCCTTGA  (SEQ ID NO：162)  标记54  GATCCCAATGGTAAAGACT  (SEQ ID NO：69)  AAGCCTCAAAAGAAGACC  (SEQ ID NO：165)  标记55  TGTGGTTTGAGGCATCTTCT  (SEQ ID NO：70)  GCCCACCAAAAGAAAGTAGT  (SEQ ID NO：166)  标记62  AGGGAGGCGAACGAGAAACA  (SEQ ID NO：77)  CGACTGCTGATGGGGAAGAG  (SEQ ID NO：173)  标记67  TTTCTTATGGCAATCACACG  (SEQ ID NO：82)  GGAGGGCAGGAACAAAAAGT  (SEQ ID NO：178)  标记68  GTTTATCATTTTGGGGTCAG  (SEQ ID NO：83)  CGGTGTCCCTCAGGATGTA  (SEQ ID NO：179)  标记69  CATGCACGTAAAGAAAGTGT  (SEQ ID NO：84)  CCAAATGCACCCTAAGA  (SEQ ID NO：180)  标记71  TGTAGGTGGTGGTTAGG  (SEQ ID NO：86)  TGTCAGACCCACCATTA  (SEQ ID NO：182)  标记72  AGCAAGACACCATGTAGTC  (SEQ ID NO：87)  GACACGTGGGATCTAGAC  (SEQ ID NO：183)  标记74  GTCCATGTGCATAAGAGAG  (SEQ ID NO：89)  CTCTTGGCATTTCAGATAC  (SEQ ID NO：185)  标记77  GGGCTTTCATTTTCCACTAT  (SEQ ID NO：92)  GCTCAACCTCATCCACAC  (SEQ ID NO：188)  标记78  GACAGCTCGTGATGTAGA  (SEQ ID NO：93)  GTTCTTGGCCGCTATAT  (SEQ ID NO：189)  标记79  ACTTGTAAACCCTCTTCTCA  (SEQ ID NO：94)  GTTTCATTACTTGGCTTCTG  (SEQ ID NO：190)  标记81  CCACTGCTTCAAATTTACTAG  (SEQ ID NO：96)  GCGTCCAAAACATAAATCAC  (SEQ ID NO：192)  标记84  GCCTATCCCCTGAACTATCT  (SEQ ID NO：99)  TGCACATACCAGCAACAGAG  (SEQ ID NO：195)  标记88  TCTCCCAAATCACTAGAC  (SEQ ID NO：103)  ATCTGCAAGGCATATTC  (SEQ ID NO：199)
 标记89  ACGTTTTGGCAACTCTC  (SEQ ID NO：104)  ACTCCCCTCTTTGACAT  (SEQ ID NO：200) 标记92  AGCAAAATGGCAAAGGAGAG  (SEQ ID NO：107)  GGTGTGTGCTATGGAAGATCA  TAGT(SEQ ID NO：203) 标记96  TCTATATTTGGTTGGCTTGA  (SEQ ID NO：111)  ACTCATTTCAATCTCAGTGTC  (SEQ ID NO：207) 标记98  CCTCCACTTCTCTTCATCTT  (SEQ ID NO：113)  CTTCCTCAAGCTCAAACAAT  (SEQ ID NO：209) 标记104  CCTATTCCTTACCTTTCTGT  (SEQ ID NO：119)  GACTTACTATCTTGGCTCAC  (SEQ ID NO：215) 标记105  CCTTGCATTCCACTATT  (SEQ ID NO：120)  AGTTCTCAAGCCTCACA  (SEQ ID NO：216) 标记110  GTGCAGATGCAGATTATATG  (SEQ ID NO：125)  CCTTTAGAATTGCCGTATC  (SEQ ID NO：221) 标记111  ACAATAACCTGAGACAACAAGAAAC  (SEQ ID NO：126)  ATACATCCCCTCCCCTCTCT  (SEQ ID NO：222) 标记112  GAACTTGGCGTGTAACT  (SEQ ID NO：223)  TGGTAGGTCTATTTGAGAGT  (SEQ ID NO：224)
图7B是显示在同一天播种的一个典型的二倍体杂合油棕(下)和两个双单倍体(上)的图片。
由单倍体产生双单倍体
有些时候单倍体细胞经历“自发加倍”，通过不完整的有丝分裂使染色体的加倍。如果这发生在发育早期，则所产生的种子、苗和植物为双单倍体。如果没有发生此加倍，则获得单倍体，并且在多数情况下，此单倍体植物在本质上是不育的，这是因为这种情况下有丝分裂过程不能产生能够受精的配子。为了产生可产生有性子代的可育植物，需要通过使用外部刺激使单倍体的染色体数量加倍，或者需要依赖可使单倍体细胞自发加倍的罕见过程。前一个方法是最常采用的方法，并通常包括使用能够抑制有丝分裂的化学试剂，由此诱导二倍体细胞的形成。已知有几种能够诱导此种染色体加倍过程的化合物，其中最为熟知且最常用的是秋水仙碱。其它类似试剂包括微管抑制剂，例如除草剂氟乐灵(trifluralin)和胺磺灵(oryzalin)。此类化学品既可以用于整个植物并且可使该植物上产生可育种子，也可以用于体外的分离细胞，从而可以利用常规组织培养技术由此再生出完整的植物。对于可用化学品和其他方法以及其应用方式的完整阐述参见Kasha(2005)和其引用文献。
应用外部刺激的备选方案是利用自发加倍。例如，在单倍体中，单个细胞的细胞核可能偶然不能在有丝分裂时进行正常分裂，并由此形成产生二倍体细胞，其最后生成可以包含大多数或所有主要枝条轴(如果其在第一次胚分裂中发生)的二倍体部分，或者生成双单倍体植物。在任何一种情况下，从此类个体得到的自交种子将是完全纯合的并在遗传上与亲本一致。这个过程可以在生殖细胞的形成过程中发生，在这种情况下可能可以产生可育配子(花粉细胞或卵细胞)。如果在同一植物上形成雄性和雌性配子，则可以发生配子的成功融合并且将发育成胚。此胚将是纯合的二倍体，并且将在以后的所有自交世代中真实遗传；所有自交子代都将在遗传上相一致。在油棕中，花序通常为雄性或雌性的(虽然已知会偶然出现雌雄同体的花序)，因此特定单倍体植物的自交可能需要贮存来自雄性花序的花粉，直至可以得到合适用于授粉的雌性花序。此过程通常用于油棕育种。
在本实施例中，我们发现通过本发明的方法获得的单倍体油棕植物在营养生长约2年后产生其首批花序，并且此植物很可能以低但可用的频率产生可育配子，由此可以分离纯合的子代。此时，一株单倍体植物已经开始开花。
图10显示在种植两年零7个月后使用首批花序确认50-03060260_0002单倍体(左图为花序的照片，右图为单倍体秧苗的照片)。
单倍体候选成员的纯合性筛选
筛选6个被流式细胞术鉴定为单倍体的油棕，从而确认其纯合状态。这可以通过鉴定来自各候选成员母本的杂合标记并记录在候选成员中为纯合的这些标记物的数量来完成。对于真正的单倍体，预期所有单基因座都应包含一个等位基因(半合子)。对于每个母本棕榈(mother palm)，总共使用96个标记(表5中所列)进行筛选，然后使用显示为杂合的那些标记对子代候选棕榈进行评估。所使用的标记由用于向PCR产物中引入荧光染料的通用锚定序列构成，从而可以通过毛细管电泳分离评估等位基因的大小。对于在亲本中鉴定的所有杂合基因座，所有6个候选棕榈都显示100％的纯合。由此，如同对单倍体植物预期，所述棕榈被认为是完全纯合的。
表4.在纯合性确认筛选中使用的单倍体候选油棕和其各自母本棕榈的列表
  单倍体候选成员  母本  0710/20；06041160；0002  BL1222/33-14  0702/122；06030674；0002  BL1233/21-06  0710/N；06010987；0028  BL10868/31-07  0650/80；06030324；0003  BL1230/43-22  0701/154；06030903；0001  BL10883/35-12  0704/251；06031385；0001  BL10868/13-28
表5.用于单倍体和双单倍体候选成员的纯合性筛选的微卫星标记




表7.在BLRS用于在双单倍体候选成员的亲本中筛选杂合性的标记


表8.在纯合性筛选中使用的双单倍体候选棕榈和其各自的母本棕榈的列表
  双单倍体候选成员  母本  1  0619/142；05069109；0002  A1124/39-15  2  0640/68；05121236；0004  BL10882/34-18  3  0642/235；05059119；0003  BL701/13-09  4  0644/47；06011226；0001  BL1231/06-11  5  0644/219；05049082；0003  BL013/12-06  6  0622/193；04129038；0001  BL1129/09-11  7  0626/N；04129038；0032  BL1129/09-11  8  0626/N；04129038；0005  BL1129/09-11  9  0626/N；04129038；0025  BL1129/09-11  10  0626/N；04129038；0039  BL1129/09-11  11  0626/N；04129038；0009  BL1129/09-11  12  0626/N；04129038；0016  BL1129/09-11  13  0626/N；04069109；0015  A1124/39-15  14  0706/397；06039153；0002  BL1232/47-05  15  0706/367；06029106；0001  BL1223/03-23  16  0706/368；06029106；0002  BL1223/03-23  17  0622/216；04069109；0006  A1124/39-15  18  0626/N；04069109；0024  A1124/39-15  19  0626/N；04069109；0026  A1124/39-15  20  B67；0409034MC；15  287/10626/07-21
  21  B65；0409034MC；35  287/10626/07-21  22  64-0409021MC-34  287/10625/09-15  23  64-0410040MC-1  286/10622/09-06  24  64-0410040MC-20  286/10622/09-06  25  64-0410040MC-16  286/10622/09-06  26  65-0409021MC-2  287/10625/09-15
表9.在母本中鉴定为杂合且在双单倍体候选成员5ID-0644/219；05049082；0003中鉴定为纯合的微卫星标记
  1  m0195  19  VS1  2  m0425  20  m3737  3  m0788  21  m0779  4  m0825  22  m0878  5  m0894  23  m3739  6  m0905  24  mEgUWA44  7  m0801  25  mEgUWA50  8  m2577  26  mEgUWA07  9  m2628  27  m2518  10  m3160  28  m3826  11  m3360  29  m3535  12  m3543  30  m3310  13  m0146  31  m3693  14  m0588  32  m3705  15  m1773  33  m0059  16  m3311  34  OPSSR30  17  m3544  35  OPSSR32  18  m3557
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<141>2007-03-19
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<170>PatentIn version 3.3
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<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>78
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<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>79
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>87
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>93
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>97
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<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>98
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<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>100
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>101
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>105
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>106
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>107
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<210>108
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>108
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<210>109
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>109
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>110
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<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>112
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>112
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>113
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<210>114
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>114
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>115
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<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>116
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<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>118
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>118
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>120
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>120
ccttgcattc cactatt                                             17
<210>121
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>121
cctcctttgg aattatg                                             17
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>122
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>123
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<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>124
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>126
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<210>127
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>127
gcaggcctga aatcccaaat                                          20
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>128
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<210>129
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>129
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>130
accccggtcc aaataaaatc                                                20
<210>131
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>131
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>134
tccctgcagt gtccctcttt                                          20
<210>135
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>135
tcctgagctg gggtggtc                                            18
<210>136
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>136
cttgggggct tcgctatc                                            18
<210>137
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>137
caatccatta gcgtgccctt ct                                          22
<210>138
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>138
cgaaatgccc ttcctttaca cta                                         23
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>139
ttcttggggt ctcgctacgg                                             20
<210>140
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>140
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<210>141
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>141
ctgacagtgc agaaaatgtt atagt                                       25
<210>142
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>142
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<210>143
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>143
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<210>144
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>144
gttttgtttg gtatgcttgt                                               20
<210>145
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>145
atgagcctaa caaagcacat tctaa                                         25
<210>146
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>146
tattgatagc atttgggatt ag                                            22
<210>147
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>147
aaatggggaa ggcaatagtg                                          20
<210>148
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>148
tttgggagca agcattatca                                          20
<210>149
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>149
ccacgtctac gaaatgataa                                          20
<210>150
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>150
cctaccacaa ccccagtctc                                          20
<210>151
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>151
attgcgtctc tttccattga                                            20
<210>152
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>152
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<210>153
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>153
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<210>154
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>154
ttcaggtcca ctttcattta                                            20
<210>155
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>155
acagatcatg cttgctcaca                                            20
<210>156
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>156
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<210>157
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>157
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<210>158
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>158
ggctgacatg caacactaac                                         20
<210>159
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>159
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>162
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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cggtgtccct caggatgta                                              19
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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ggcaccaaac acagtaa                                             17
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>204
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agaaccaccg gagt tac                                          17
<210>205
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actcatttca atctcagtgt c                                      21
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>209
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<210>210
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>210
catcccattt ccctctt                                            17
<210>211
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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cacatcctag catcattg                                           18
<210>212
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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tcattttcta attccaaaca ag                                      22
<210>213
<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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ttttctccat agtccgttac                                          20
<210>214
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
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cacctttcct ttttgtc                                             17
<210>215
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>215
gacttactat cttggctcac                                          20
<210>216
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>216
agttctcaag cctcaca                                             17
<210>217
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
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<210>218
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>218
ttctcttcct tctcacttgt                                          20
<210>219
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>219
gtgcgataaa gaggagagt                                           19
<210>220
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>220
acaatattta gaccttccat gag                                      23
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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cctttagaat tgccgtatc                                           19
<210>222
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>222
atacatcccc tcccctctct                                          20
<210>223
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>223
gaacttggcg tgtaact                                             17
<210>224
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成寡核苷酸引物
<400>224
tggtaggtct atttgagagt                                          20
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.适用于产生种子、繁殖和改良作物的单倍体或双单倍体油棕或海枣植物的选择方法，所述方法包括：
(a)提供棕榈植物群；
(b)从所述群中选择非典型表型的个体植物的子集；
(c)评估所述子集中植物的DNA含量；
(d)根据步骤(c)的结果将所述子集中剩余的植物归类为单倍体或二倍体。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
(e)评估所述子集中二倍体植物的杂合性；
(f)舍弃所述子集中发现的杂合二倍体植物；
(g)将剩余的二倍体植物归类为双单倍体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(c)在步骤(e)之前进行。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，利用多个分子标记进一步评估在步骤(e)中被归类为二倍体的植物的杂合性，将发现的杂合植物舍弃并将剩余的植物归类为双单倍体。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述杂合性筛选步骤(c)使用分子标记或生化标记。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述杂合性筛选步骤(c)使用多个共显性分子标记，例如2-40个微卫星标记或序列特异性多态区域(SCAR)标记或单核苷酸多态性(SNP)标记。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述非典型表型为非典型生长形态或生长模式。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述非典型生长形态为胚根生长缩短，胚根与胚芽的长度比改变，胚根与胚芽的角度改变，胚根或胚芽的颜色改变，种子形状、大小或密度改变，以及胚芽宽度与长度的比例改变中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述棕榈植物群包括温室种植的棕榈或田间种植的棕榈，其中所述非典型生长形态或生长模式是营养生长变缓、小叶宽度与长度的比例减小、复叶节间距离缩短、复叶与植物轴的角度、叶子颜色和早熟开花中的一种或多种。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述非典型表型为从单个种子萌发两个或更多个胚。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述用于选择植物的非典型表型选自于在之前的试验中显示与单倍体或二倍体性状相关的非典型表型。
12.根据权利要求4所述的方法，其中，利用多个DNA标记对杂合性的进一步评估包括使用50-200个，例如70-120个微卫星标记。
13.根据权利要求1-8和10-12中任一项所述的方法，其中所述植物为萌发的种子或秧苗。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，使用多个分子标记进一步评估所选植物杂合性的步骤使用了汇集样品。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，如果对于所使用的每个分子标记在每个基因座仅显示一个等位基因，则将所选植物归类为缺乏杂合性。
16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述植物群包含至少1,000,000株植物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述植物群包含5,000,000-20,000,000株个体。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述棕榈为油棕。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中一株或多株被归类为单倍体或双单倍体的植物随后被用于育种、繁殖或产生种子。
20.子代植物，其来自根据权利要求1-19中任一项所述的方法选出的植物的体细胞或生殖细胞。
21.来自植物的克隆、花粉或胚珠，其中所述植物是通过权利要求1-19中任一项所述的方法选出的植物或为权利要求20所述的植物。
22.产生纯合双单倍体油棕或海枣植物的方法，所述方法包括：
(a)利用权利要求1或5-18中的任一项方法选择单倍体植物；
(b)通过自发染色体加倍；或通过对所述单倍体植物施加外部刺激使染色体的数量加倍；或通过对从所述单倍体植物分离的一个或多个细胞施加外部刺激，然后利用组织培养再生植物；或通过所述单倍体植物的自交或克隆或授粉；从而获得双单倍体植物。
23.根据权利要求19所述的方法，其包括使可从权利要求3或权利要求20的方法获得的两株不同的双单倍体或该双单倍体的子代杂交。
24.在母本的子代群中鉴定双单倍体植物的方法，其包括：
(a)使用共显性分子标记，例如微卫星或基于SNP的标记，在母本中鉴定出至少20个杂合的非连锁基因座；
(b)利用1-5个经鉴定的标记进行初筛，舍弃杂合体，将剩余的作为候选双单倍体保留；
(c)对保留的候选成员使用流式细胞术或其它方法以测定DNA，舍弃单倍体，保留作为潜在双单倍体的二倍体；
(d)对所述保留的候选成员使用另外的至少15个剩余标记，并将二倍体且对所使的所有标记都纯合的个体归类为双单倍体。
25.子代植物，其来自经权利要求24的方法鉴定的双单倍体植物的体细胞或生殖细胞。
26.单倍体油棕植物。
27.双单倍体油棕植物。
28.F1杂交油棕植物。
29.从权利要求27或28所述的植物收获和提取的产物，其包括油和籽仁。
30.获得棕榈油的方法，其包括提取来自双单倍体亲本的F1杂交油棕的种子。