4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的制备与应用 【技术领域】
本发明涉及一种缩氨基硫脲类化合物，尤其是涉及一种4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的制备与应用。
背景技术
缩氨基硫脲类化合物是由氨基硫脲与相应的醛或酮缩合形成的希夫碱类化合物，其具有广泛的生物活性，在医药学与化学领域备受关注。李锦州([1]李锦州，张光林，沙靖全，等.呋喃甲酰基吡唑啉酮缩氨基硫脲配合物的合成、光谱表征及生物活性[J].光谱学与光谱分析，2005，25(2)：216-219)研究发现呋喃甲酰基吡唑啉酮缩氨基硫脲对金黄葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白菜软腐病菌和菜豆荤疫菌等均具有良好的抑菌效应；Richardson([2]RichardsonD R.Therapeutic potential of iron chelators in cancer therapy[J].Adv.Exp.Med.Biol.，2002，509：231-249)指出缩氨基硫脲类化合物是极好的核苷二磷酸还原酶(RR)抑制剂，通过对RR的抑制，影响DNA的合成与修复，从而具有抗肿瘤活性；Jiang Z G等([3]Jiang Z G，LebowitzM S，Ghanbari H A.Neuroprotective activity of 3-aminopyridine-2-carboxaldehydethiosemicarbazone(PAN-811)，a cancer therapeutic agent[J].CNS Drug Rev.，2006，12：77-90)的研究表明：3-氨基-2-吡啶醛缩氨基硫脲(3-AP，PAN-811)不仅具有抗肿瘤作用，而且在脑缺血症的治疗中起神经保护作用，其作用机理为减少钙离子与活性氧簇的积聚。同时，作为金属螯合剂，缩氨基硫脲可螯合不同的金属形成金属配合物，应用于分析化学领域([4]陆勤，王国雄，尹湛峰，等.N-氧化吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲钴配合物的研究[J].无机化学学报，1991.7(1)：65-68)。近期，Zhu Yu-jing[等([5]ZhuYJ，Song K K，Li Z C，et al.Antityrosinaseand antimicrobial activities of trans-cinnamaldehyde thiosemicarbazone[J].J Agri.Food Chem.2009，57：5518-5523)首先研究了肉桂醛缩氨基硫脲对蘑菇酪氨酸酶的抑制机理以及其抗菌活性，解先业等([6]解先业，姜林，薛超彬，等.取代苯甲醛缩氨基硫脲的合成及对昆虫酚氧化酶的抑制活性[J].化学试剂，2007.29(1)：34-36)设计合成了部分取代苯甲醛缩氨基硫脲，并研究了其对昆虫酚氧化酶的抑制活性，实验结果表明，缩氨基硫脲类化合物对酚氧化酶有着良好的抑制活性。
酚氧化酶(phenoloxidase，EC.1.14.18.1，简称PO)是存在于昆虫体内的一种含铜的金属酶，是生物体内合成黑色素的关键酶，对昆虫的生长、发育起着重要作用的关键酶类。酚氧化酶催化L-酪氨酸羟化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后，形成保护性黑色素。同时，该酶也与昆虫蜕皮过程中的鞣化作用有关，是昆虫赖于生存的一种重要的酶([7]Ashida M，Yamazaki H，Biochemistry of the phenoloxidase system in insect：withspecial reference to its activation.Ohnishi E，Ishizaki H.(eds)[M]Molting and Metamorphosis.1990，Tokyo：Japan Science Society Press.239-261)。张宗炳([8]张宗炳，冷欣夫.杀虫药剂毒力及应用[M].北京：化学出版社，1993，：331-337)指出：探索新杀虫药剂的一条最有希望的途径是生物合理途径，其中“原酪氨酸酶抑制剂”和“鞣化过程抑制剂”被列在第一、二位.已有研究([9]薛超彬，王勤，罗万春，等.铜铁试剂对菜青虫多酚氧化酶的抑制作用[J].昆虫学报，2005，48(1)：290-294)结果表明，酚氧化酶抑制剂可以通过抑制酶活力来阻碍昆虫在蜕皮时的鞣化作用，从而达到其杀虫作用。以多酚氧化酶作为生物农药的靶点开发新型高效杀虫剂，可以大大减少生物农药的使用量，既能使农药的残留减至最低，又能获得很高的经济效益。因此，研究设计高效的酚氧化酶抑制剂，不仅具有重要的理论意义，同时可以作为“环境友好”的新型农药而具有重要的实践意义和应用前景([7]shida M，Yamazaki H，Biochemistry of the phenoloxidase system in insect：with special reference to its activation.OhnishiE，Ishizaki H.(eds)[M]Molting and Metamorphosis.1990，Tokyo：Japan Science SocietyPress.239-261)。
Heilbron，I.M.，Hudson，H.E.，Huish，Doris M et al.([10]Heilbron，I.M.；Hudson，H.E.；Huish，Doris M.The reversed phototropy of cinnamaldehyde semicarbazone and its methoxyderivatives[J].J.Chem.Soc.，Trans.，123，2273-2279.)于1923年首次合成了4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲，并研究了其抗光色互变作用。Bernstein，J.，Yale，Harry L.与Toldy，L.；Nogradi，T.；Vargha，L.等分别于1951年([11]Bernstein，J.，Yale，Harry L.，Losee，K.et al.The chemotherapyof experimental tuberculosis.III.The synthesis of thiosemicarbazones and related compounds[J].J.Amer.Chem.Soc.73，906-912.)与1954年([12]Toldy，L.，Nogradi，T.，Vargha，L.et al.Antituberculous agents.I.Thiosemicarbazones and hydrazides[J].Acta.Chim.Hung.，4.302-313)报道了该化合物的抗结核效应。然而对于该化合物作为新型杀虫剂靶标蛋白——酚氧化酶的抑制剂的应用尚未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种化合物——4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲及其制备方法。
本发明的另一目的是4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲在杀虫剂靶标蛋白酚氧化酶中的应用。
本发明所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的分子式为C11H13N3OS，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的结构式为：
在常温下，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲易溶于DMSO，微溶于甲醇、乙醇等；红外光谱的结果显示，1680cm-1附近C＝O的吸收峰消失，而在1602cm-1出现C＝N的吸收峰；4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的分子量为m/z 235.1(M+H+，CH3OH)；核磁共振氢谱的结果如下：
1H NMR(DMSO-d6，TMS，400MHz)：δ(ppm)11.35(HN，s)，7.90(CH，s)，7.48～6.91(C6H4，4H，d)，8.21，7.62(NH2，s)，3.76(CH3O，s)，6.70，6.75(CH＝CH，d)。
本发明所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的制备方法包括以下步骤：
1)称取氨基硫脲溶于溶剂中，加入与氨基硫脲等量的4-甲氧基肉桂醛，磁力搅拌下，加入适量冰醋酸，加热回流反应后将反应体系冷却至室温，静置结晶，抽滤，获得粗产物；
2)将粗产物重结晶，得到产物4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲。
所述加热回流反应的温度最好为60～70℃，加热回流反应的时间最好为3～5h。
本发明所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲可用在杀虫剂靶标蛋白酚氧化酶中。
在常温下，所得产物4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲易溶于DMSO，微溶于甲醇、乙醇等。
反应产物采用红外光谱、质谱和核磁共振谱对其结构进行鉴定(红外光谱如图1所示，质谱图如图2所示，核磁共振谱如图3所示)。红外光谱的结果显示，1680cm-1附近C＝O的吸收峰消失，而在1602cm-1出现C＝N的吸收峰；ESI-MS的结果表明，该化合物的分子量为m/z 258.0(M+Na+，CH3OH)；核磁共振氢谱地结果如下：
1H NMR(DMSO-d6，TMS，400MHz)：δ(ppm)11.35(HN，s)，7.90(CH，s)，7.48～6.91(C6H4，4H，d)，8.21，7.62(NH2，s)，3.76(CH3O，s)，6.70，6.75(CH＝CH，d)。
结合红外光谱、质谱与核磁共振氢谱数据，确定合成化合物为4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲。
与Bernstein等的方法相比，本发明所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的制备方法将氨基硫脲与4-甲氧基肉桂醛用相同的溶剂溶解，有利于反应体系的均一化；另外，本发明在重结晶后产率较高，达77.1％(Bernstein方法为70％)。
以菜青虫酚氧化酶研究对象，测定了4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制效应、抑制机理与抑制类型和抑制参数。实验结果表明：4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶有强烈的抑制作用，其导致酚氧化酶活力丧失50％的浓度(半抑制率，IC50)为1.62μmol/L，抑制机理以反应初速度对酶量作图，得到一组相交于原点的直线，说明4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制表现为可逆抑制；抑制类型的判定采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，得到一组相交于Y轴的直线，从而判定其抑制类型为竞争性抑制，二次作图，求得抑制常数KI＝0.94μmol/L。与已见报道的酚氧化酶抑制剂如4-羟基苯甲酸(IC50＝11.3mmol/L)、铜铁试剂(IC50＝0.652mmol/L)和曲酸(IC50＝0.468mmol/L)等相比，其抑制效果分别提高了69800、400和290倍，该结果表明，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲可作为以酚氧化酶为靶标的新型杀虫剂投入应用。
【附图说明】
图1为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的红外光谱图。在图1中，横坐标为红外辐射的波数(cm-1)，纵坐标为透光率(％)；其主要波峰信息如下：
波峰1波数3400.97cm-1强度12.09％为NH2伸缩振动吸收峰；
波峰2波数3264.36cm-1强度12.40％为NH伸缩振动吸收峰；
波峰3波数3165.59cm-1强度12.40％为苯环上C-H伸缩振动吸收峰；
波峰1波数1602.11cm-1强度8.32％为C＝N伸缩振动吸收峰；
波峰5，6波数1578.90cm-1，1511.93cm-1强度为11.86％，5.40％为C＝C伸缩振动吸收峰；
波峰7波数1258.73cm-1强度10.05％为C＝S伸缩振动吸收峰；
波峰8波数1246.79cm-1强度11.31％为C-O伸缩振动吸收峰。
图2为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的ESI-MS质谱图。在图2中，横坐标为化合物分子的荷质比(m/z)，纵坐标为离子信号强度(×104)；对应碎片离子的荷质比从左至右为102.4，145.2，186.5，236.1，258.0，291.1，359.2，其中258.0对应峰为分子离子碎片(M+Na+)。
图3为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的核磁共振氢谱。在图3中，横坐标为化学位移值(ppm)；化学位移从左至右分别为11.340，8.136，7.893，7.869，7.604，7.583，7.499，7.477，6.955，6.944，6.921，6.916，6.754，6.731，6.714，6.691，3.758ppm。
图4为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的核磁共振氢谱化学位移6.5～8.5部分的放大图。在图4中，横坐标为化学位移值(ppm)；化学位移从左至右分别为8.136，7.893，7.869，7.604，7.583，7.499，7.477，6.955，6.944，6.921，6.916，6.754，6.731，6.714，6.691ppm。
图5为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制效应。在图5中，横坐标为[I](4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的浓度，单位为μmol/L)，纵坐标为Relative Activity(相对酶活力，单位为％)。
图6为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制机理的判定。在图6中，横坐标为[E](反应体系中的酶浓度，单位为mg/L)，纵坐标为v(酶催化反应速率，单位为μmol·L·min-1)；线1，2，3，4，5对应的4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲浓度分别为0，0.4，0.8，1.2和1.6μmol/L。
图7为本发明实施例所述4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制类型与抑制参数的确定。在图7中，横坐标为[S]-1(反应体系中底物L-DOPA的浓度的倒数，单位为μmol-1·L)，纵坐标为v-1(酶催化反应速率的倒数，单位为μmol-1·L-1·min)；线1，2，3，4，5对应的抑制剂浓度分别为0，0.4，0.8，1.2和1.6μmol/L。
图8为二次作图。在图8中，横坐标为[I](4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲浓度，μmol/L)，纵坐标为Slope(图7中5条线的斜率)。
【具体实施方式】
1.4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的合成步骤
称取氨基硫脲0.455g(5mmol)，溶于10mL 95％乙醇溶液中，加入含有0.81g 4-甲氧基肉桂醛的95％乙醇溶液，磁力搅拌下，加入2mL冰醋酸，加热回流，薄层层析监测反应进程，加热回流3h后，将反应体系冷却至室温，于4℃静置结晶，抽滤，获得粗产物。
采用50％乙醇重结晶，得到产物，烘箱干燥，称重，计算产率为77.1％。采用质谱、红外光谱和核磁共振谱鉴定所得产物的结构，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的红外光谱图参见图1，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的ESI-MS质谱图参见图2，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的核磁共振氢谱参见图3，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的核磁共振氢谱化学位移6.5～8.5部分的放大图参见图4。
2.4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对菜青虫酚氧化酶的抑制作用
菜青虫酚氧化酶的提取参考文献[9]，本实验使用的酚氧化酶未经纯化。在2mL反应体系中，在1.8mL含有1mmol/L底物L-DOPA的0.1mmoL/L的磷酸缓冲液(PBS，pH＝6.8)中，加入200μL粗酶液，使用Beckman DU650分光光度计，37℃恒温下测定475nm的光密度值随时间的增长直线，从直线的斜率求得酶活力，消光系数按(ε＝3700M-1·cm-1)计算.DMSO终浓度都为3.33％，并在对照中排除其对酶的影响.酶活力单位(U)定义为在该条件下，每分钟产生1μmol/L产物的酶量。4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制效应参见图5。
3.4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对菜青虫酚氧化酶的抑制机理的判断
在上述酶活力测定体系中，固定底物L-DOPA的浓度为1mmol/L，改变加入粗酶液的体积，使用Beckman DU650分光光度计，37℃恒温下测定不同浓度的4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲作用下酶的活力，消光系数按(ε＝3700M-1·cm-1)，计算酶催化反应速率。4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制机理的判定参见图6。以酶量对酶催化反应速率作图，得到一组相交于原点的直线，说明4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制表现为可逆抑制。
4.4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对菜青虫酚氧化酶的抑制类型和抑制常数的测定
在上述酶活力测定体系中，固定酶量不变，改变加入底物L-DOPA的浓度，使用BeckmanDU650分光光度计，37℃恒温下测定不同浓度的4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲作用下酶的活力，消光系数按(ε＝3700M-1·cm-1)，计算酶催化反应速率.以底物浓度的倒数对酶催化反应速率的倒数作图，得到一组相交于Y轴的直线，从而判定其抑制类型为竞争性抑制，4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲对酚氧化酶的抑制类型与抑制参数的确定参见图7。以所得直线的斜率对4-甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲的浓度二次作图(参见图8)，求得抑制常数KI＝0.94μmol/L。