低分子量葡聚糖、其制备方法及用途.pdf

本发明公开一种低分子量葡聚糖，其特征在于，其是从黄芪中分离得到的。本发明也公开上述低分子量葡聚糖的分离纯化方法。本发明还公开所述低分子量葡聚糖在制备免疫增强及肿瘤辅助治疗药物或保健食品中的应用。

1、  低分子量葡聚糖，其特征在于，其是从黄芪中分离得到的。

2、  根据权利要求1所述的低分子量葡聚糖，其特征在于，其重均分子量为2300。

3、  根据权利要求1或2所述的低分子量葡聚糖，其特征在于，其具有如下通式(1)所示的重复单元：


4、  根据权利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖的制备方法，其特征在于，该方法采用柱层析分离纯化制得所述低分子量葡聚糖。

5、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
a.取黄芪多糖，溶解、离心，上清液透析并浓缩，得到浓缩物；
b.取浓缩物，溶解、离心，上清液用阴离子交换树脂或离子交换凝胶柱层析进行初步分离，将所得流份分别浓缩、透析并干燥，得到若干组分；
c.继续用凝胶柱反复层析上述组分，得到纯化的低分子量葡聚糖。

6、  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，b步骤中所述的阴离子交换树脂选自DEAE-Cellulose DE52、DEAE-Cellulose DE32、CM-Cellulose CM52或CM-Cellulose CM32，单独或混合使用。

7、  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，b步骤中所述的阴离子交换树脂选自DEAE-Cellulose DE52。

8、  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，b步骤中所述的离子交换凝胶柱选自DEAE Sepharose F.F.、CM Sepharose F.F.、DEAESepharose CL-6B或CM Sepharose CL-6B，单独或混合使用。

9、  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，c步骤中所述的凝胶柱选自Sephadex G25、Sephadex G50、Sephadex G75、Sephadex G100、Sephacryl S-100HR、Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-300HR、SephacrylS-400HR、Toyopeal HW-40、Toyopeal HW-50、Toyopeal HW-55、Superdex30、Superdex 75、Superdex 200、Superdex 6或Superdex 12，单独或混合使用。

10、  根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，c步骤中所述的凝胶柱选自Sephadex G25、Sephadex G50、Sephadex G75或SephadexG100。

11、  根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，c步骤中所述的凝胶柱是Sephadex G50。

12、  权利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖在制备免疫增强及肿瘤辅助治疗药物或保健食品中的应用。

13、  一种组合物，其由权利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖和药学上可接受的赋形剂组成。

低分子量葡聚糖、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种低分子量葡聚糖、所述低分子量葡聚糖的制备方法及其用途。
背景技术
黄芪(Radix Astragalus)是豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，味甘、性温，归肺、脾经，是重要的益气中药。黄芪多糖是其主要有效成分之一，现代药理研究证明，黄芪多糖具有提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射损伤、调节血糖、抗衰老等作用(张小梅.黄芪多糖的免疫调节作用及抗肿瘤作用研究进展.大连大学学报，2003，24(6)：101-104；包文奇，吕美，王志祥.黄芪多糖的药理研究进展.河南农业科学，2005，(4)：78-80)。
目前对黄芪多糖的研究主要集中在分子量较大的多糖上(李鹏飞，杜海燕，赵孟春.黄芪多糖的化学和免疫学研究.上海畜牧兽医通讯，2005，(5)：4-6；单俊杰，王顺春，刘涤，胡之璧.黄芪多糖的化学和药理研究进展.上海中医药大学学报，2000，14(3)：61-65)，而对低分子量多糖的研究几乎处于空白。
发明内容
为解决上述的黄芪中低分子量多糖的研究处于空白的技术问题，本发明从黄芪中分离纯化获得一种低分子量葡聚糖，经化学分析和光谱分析相结合的方法确定出其化学结构，并通过药理实验证明该类结构的葡聚糖具有明显的免疫增强活性，可应用于药品或保健食品中。
因此，本发明的第一个目的是提供一种低分子量葡聚糖，其特征在于，其是从黄芪中分离得到的。
所述低分子量葡聚糖的重均分子量为2300，其仅由葡萄糖组成，不含蛋白质和核酸。
发明人将该葡聚糖命名为MAPS-1-W2-2G。
MAPS-1-W2-2G具有如下通式(1)所示的重复单元：

本发明的第二个目的是提供该低分子量葡聚糖的制备方法，为采用柱层析的分离纯化方法制备。
所述方法可包括如下步骤：
a.取黄芪多糖，溶解、离心，上清液透析并浓缩，得到浓缩物；
b.取浓缩物，溶解、离心，上清液用阴离子交换树脂或离子交换凝胶柱层析进行初步分离，将所得流分分别浓缩、透析并干燥，得到若干组分；
c.继续用凝胶柱反复层析上述组分，得到纯化的低分子量葡聚糖。
其中，b步骤中所述的阴离子交换树脂可以选自DEAE-CelluloseDE52、DEAE-Cellulose DE32、CM-Cellulose CM52或CM-Cellulose CM32，优选DEAE-Cellulose DE52；所述的离子交换凝胶柱可以选自DEAESepharose F.F.、CM Sepharose F.F.、DEAE Sepharose CL-6B或CMSepharose CL-6B；而c步骤中所述的凝胶柱可以选自Sephadex G25、Sephadex G50、Sephadex G75、Sephadex G100、Sephacryl S-100 HR、Sephacryl S-200 HR、Sephacryl S-300 HR、Sephacryl S-400 HR、ToyopealHW-40、Toyopeal HW-50、Toyopeal HW-55、Superdex 30、Superdex 75、Superdex 200、Superdex 6或Superdex 12，优选自Sephadex G25、SephadexG50、Sephadex G75或Sephadex G100，最优选Sephadex G50。
由于通过药理实验证明本发明从黄芪中分离得到的低分子量葡聚糖具有明显的免疫增强活性，因此，本发明的第三个目的是提供所述的低分子量葡聚糖在制备免疫增强及肿瘤辅助治疗药物或保健食品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种药物组合物或保健食品组合物，其由所述的低分子量葡聚糖和药学上或食品学上可接受的赋形剂组成。
附图说明
图1为低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G在高效凝胶色谱柱上的色谱图；
图2为低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G的单糖组成分析结果；
图3为低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G的紫外扫描图谱；
图4为低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G的¹³C-NMR谱图；
图5为低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G的IR谱图；
图6为低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G的甲基化分析结果。
具体实施方式
实施例1：黄芪多糖分离纯化
(1)黄芪多糖(MAPS)按专利【杨义芳，许海燕，黄春跃.一种精制黄芪多糖的方法.中国发明专利：200610024178.5】所述方法分离提取，得率为8.37％，纯度为85.74％。
(2)取(1)中得到的MAPS 50g，溶于适量的蒸馏水，5000rpm离心20min，上清液对水透析(截留分子量3500)，透析袋内溶液浓缩得到MAPS-1(12.6g)。
(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加10ml蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE-Cellulose DE52柱(OH-型，40×4.0cm，填料高30cm)层析进行初步分离。首先以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.01mol/L和0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，自动部分收集仪分别收集各流分，示差仪和苯酚-硫酸法平行跟踪检测，并且根据检测的结果合并相同流分，经浓缩，蒸馏水透析及冷冻干燥得到5个组分：MAPS-1-W1(808.8mg)，MAPS-1-W2(383.2mg)，MAPS-1-W3(341.8mg)，MAPS-1-0.01M(1477.4mg)，MAPS-1-0.1M(227.9mg)。
(4)组分MAPS-1-0.1M多糖含量较低，弃去。MAPS-1-W1，MAPS-1-W2，MAPS-1-W3部分分别继续用Sephadex G-50凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，MAPS-1-0.01M继续用SephacrylS-400 HR凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，分别用蒸馏水洗脱，示差仪和苯酚-硫酸法平行跟踪检测，合并流分，冷冻干燥。MAPS-1-W1部分纯化得到一个纯葡聚糖MAPS-1-W1-1G(1)；MAPS-1-W2部分纯化得到两个纯多糖MAPS-1-W2-1G(2)和MAPS-1-W2-2G(3)；MAPS-1-W3部分纯化得到两个纯多糖MAPS-1-W2-2G(3)和MAPS-1-W3-1G(4)；MAPS-1-0.01M部分纯化得到一个纯多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。
实施例2：黄芪多糖分离纯化
(1)黄芪多糖(MAPS)按专利【杨义芳，许海燕，黄春跃.一种精制黄芪多糖的方法.中国发明专利：200610024178.5】所述方法分离提取，得率为8.37％，纯度为85.74％。
(2)取(1)中得到的MAPS 50g，溶于适量的蒸馏水，5000rpm离心20min，上清液对水透析(截留分子量3500)，透析袋内溶液浓缩得到MAPS-1(12.6g)。
(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE-Cellulose DE52柱(OH-型，40×4.0cm，填料高30cm)层析进行初步分离。首先以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.01mol/L和0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，自动部分收集仪分别收集各流分，示差仪和苯酚-硫酸法平行跟踪检测，并且根据检测的结果合并相同流分，经浓缩，蒸馏水透析及冷冻干燥得到5个组分：MAPS-1-W1(808.8mg)，MAPS-1-W2(383.2mg)，MAPS-1-W3(341.8mg)，MAPS-1-0.01M(1477.4mg)，MAPS-1-0.1M(227.9mg)。
(4)组分MAPS-1-0.1M多糖含量较低，弃去。MAPS-1-W1，MAPS-1-W2，MAPS-1-W3部分分别继续用Toyopeal HW-40F凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，MAPS-1-0.01M继续用ToyopealHW-50F凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，分别用蒸馏水洗脱，示差仪和苯酚-硫酸法平行跟踪检测，合并流分，冷冻干燥。MAPS-1-W1部分纯化得到一个纯葡聚糖MAPS-1-W1-1G(1)；MAPS-1-W2部分纯化得到两个纯多糖MAPS-1-W2-1G(2)和MAPS-1-W2-2G(3)；MAPS-1-W3部分纯化得到两个纯多糖MAPS-1-W2-2G(3)和MAPS-1-W3-1G(4)；MAPS-1-0.01M部分纯化得到一个纯多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。
实施例3：黄芪多糖分离纯化
(1)黄芪多糖(MAPS)按专利【杨义芳，许海燕，黄春跃.一种精制黄芪多糖的方法.中国发明专利：200610024178.5】所述方法分离提取，得率为8.37％，纯度为85.74％。
(2)取(1)中得到的MAPS 50g，溶于适量的蒸馏水，5000rpm离心20min，上清液对水透析(截留分子量3500)，透析袋内溶液浓缩得到MAPS-1(12.6g)。
(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE Sepharose F.F.柱(40×4.0cm，填料高30cm)层析进行初步分离。首先以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脱，自动部分收集仪分别收集各流分，示差仪和苯酚-硫酸法平行跟踪检测，并且根据检测的结果合并相同流分，经浓缩，蒸馏水透析及冷冻干燥得到5个组分。将水洗脱得到的四个组分继续分别用Sephacryl S-100 HR凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，得到四个纯多糖MAPS-1-W1-1G(1)、MAPS-1-W2-1G(2)、MAPS-1-W2-2G(3)和MAPS-1-W3-1G(4)；将0.01mol/L NaCl溶液洗脱得到的组分继续用Sephadex G-100凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，得到一个纯多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。
实施例4：黄芪多糖分离纯化
(1)黄芪多糖(MAPS)按专利【杨义芳，许海燕，黄春跃.一种精制黄芪多糖的方法.中国发明专利：200610024178.5】所述方法分离提取，得率为8.37％，纯度为85.74％。
(2)取(1)中得到的MAPS 50g，溶于适量的蒸馏水，5000rpm离心20min，上清液对水透析(截留分子量3500)，透析袋内溶液浓缩得到MAPS-1(12.6g)。
(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE Sepharose CL-6B柱(40×4.0cm，填料高30cm)层析进行初步分离。首先以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脱，自动部分收集仪分别收集各流分，示差仪和苯酚-硫酸法平行跟踪检测，并且根据检测的结果合并相同流分，经浓缩，蒸馏水透析及冷冻干燥得到5个组分。将水洗脱得到的四个组分继续分别用Superdex 30凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，得到四个纯多糖MAPS-1-W1-1G(1)、MAPS-1-W2-1G(2)、MAPS-1-W2-2G(3)和MAPS-1-W3-1G(4)；将0.01mol/L NaCl溶液洗脱得到的组分继续用Superdex6凝胶柱(100×2.6cm，填料高90cm)反复层析，得到一个纯多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。
实施例5：低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G的化学结构的鉴定
葡聚糖MAPS-1-W2-2G，经高效凝胶色谱柱色谱(PolySep-GFC-P200，300×7.8mm)，谱图出现单一对称峰(图1)，表明纯度已达到对其进行结构、药理研究的要求，同时测定其重均分子量为2300，经气相色谱图分析(图3)，MAPS-1-W2-2G仅由葡萄糖组成，为一葡聚糖。经紫外扫描图谱(图3)，MAPS-1-W2-2G在260nm和280nm附近均无蛋白质和氨基酸的特征吸收峰，同时茚三酮反应、考马斯亮蓝反应均呈阴性，表明其不含蛋白质和核酸。MAPS-1-W2-2G的¹³C-NMR谱图中(图4)，端基碳的化学位移均在103ppm以下，其中94-103ppm信号峰为C-1信号，表明其构型为α构型，这与IR谱图(图5)分析结果是一致的。根据NMR谱峰的归属、甲基化分析(图6)以及高碘酸氧化和Smith降解结果，证明多糖MAPS-1-W2-2G的一级结构是具有分支的(1→4)-α-葡聚糖，主链上平均约每7个糖残基中有1个糖残基的C-6位被葡萄糖取代，其重复单元可表示如下：

实施例6
无菌条件下取低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G 5g，加入注射用水2000ml中，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得1000支注射液。
实施例7
取低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G 10g，药用淀粉60g，糊精60g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时，制成1000片。
实施例8
取低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-2G 10g，药用淀粉100g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装成1000个胶囊。
实验例1：本发明化合物MAPS-1-W2-2G在体外对刀蛋白(Con A)或脂多糖(LPS)诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响
对照物为黄芪多糖AG-1、AG-2和A2Nb，其中黄芪多糖AG-1和AG-2按文献【黄乔书，吕归宝，李雅臣，等.黄芪多糖的研究[J].药学学报，1982，17(3)：200-206】所述方法分离纯化得到。其中，AG-1为水溶性多糖，结构为α-(1→4)(1→6)-葡聚糖，(1→4)和(1→6)糖苷键的糖基组成比例为5∶2；AG-2为水不溶性多糖，结构为α-(1→4)-葡聚糖；黄芪多糖A2Nb按文献【王莹，赵毅民，张起凤，等.黄芪中一种新葡聚糖的分离纯化与化学结构研究[J].中草药，2001，32(11)：962-964】所述方法分离纯化得到。A2Nb的平均分子量为3.6×10⁵，主要连接方式为α-(1→4)-D-Glc，在每25个葡萄糖中有一个C-6位上的分支。
按照文献(徐叔云.药理实验方法学(第三版)[M].北京：人民卫生出版社，2001，1426-1427；Zhao C，Li M，Luo YF，et al.Isolation andstructural characterization of an immunostimulating polysaccharide from Fuzi.Aconitum carmichaeli[J].Carbohydrate Research，2006，341(4)：485-491)的方法，将小鼠脾细胞悬液点于96孔培养板上，每孔100μL，设一个对照组，再加入50μL的Con A或LPS(终浓度为2.5μg/mL或10μg/mL)，最后加入不同量的多糖样品(终浓度为10，50，100μg/mL)，每孔培养液补足为200μL。将细胞培养板置于含有5％CO₂，37℃培养箱中培养。72h后，加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，置于5％CO₂，37℃培养箱中继续培养4h。取出反应物，离心(2000rpm，5min)，弃上清，每孔加入15μL DMSO，充分振荡，待凝块完全溶解后在酶标测定仪上570nm读出A值。
所得实验数据用mean±S.D.表示，测试样品与对照组的显著性差异与否用t-检验来评价。结果如表1所示。
表1MAPS-1-W2-2G在体外对Con A或LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

注：与空白比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。
从上表可以看出：葡聚糖MAPS-1-W2-2G具有显著的促进T淋巴细胞增殖活性，且活性较未经分离纯化的黄芪多糖MAPS以及多糖AG-1、AG-2和A2Nb活性好；而对于LPS诱导小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应，葡聚糖MAPS-1-W2-2G对细胞增殖没有明显的影响。