蜂胶黄酮的提取、纯化技术及其抗癌机理.pdf

本发明公开了一种蜂胶黄酮的提取方法及纯化技术。将蜂胶药材冷冻后粉碎，加入水、乙醇、乙酸乙酯，冷浸过夜后抽滤，滤渣加入乙醇、乙酸乙酯微波提取，减压回收溶剂，浓缩物用乙酸乙酯萃取，洗涤萃取液，用无水硫酸钠干燥，得到蜂胶黄酮的浓缩液。用吸附层析法——梯度洗脱工艺提纯蜂胶总黄酮。收集的洗脱液旋转蒸发浓缩，形成过饱和溶液析出结晶，得到结晶物。结晶物用高效液相色谱(HPLC)分析，成分相近者且黄酮含量高者合并，即为制备的蜂胶总黄酮。本发明工艺简单，用混合溶剂法结合微波法能更好的提炼出蜂胶黄酮有效成分，再

1.  一种蜂胶黄酮的提取方法及纯化技术，其特征在于包括以下步骤：
取蜂胶药材，-10℃～-4℃冷冻8-12h后变硬变脆，用万能粉碎机将蜂胶粉碎成粗粉，准确称取蜂胶样品于三角瓶中，按照每克加入水∶乙醇(80％)∶乙酸乙酯＝10∶8∶2.5室温下冷浸过夜后，抽滤，滤渣再按照每克加入乙醇(80％)∶乙酸乙酯＝5∶1进行微波提取，微波照射时间为30s，合并两次得到的滤液，减压回收溶剂，提取物被浓缩。再将浓缩物用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用蒸馏水洗涤蜂胶乙酸乙酯液，用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩，得到蜂胶黄酮的浓缩提取液。
采用常见的芦丁标准曲线法测定浓缩提取液中蜂胶黄酮的含量。
采用吸附层析法(Adsorption Chromato～aphy)——梯度洗脱工艺从蜂胶浓缩液中提纯蜂胶总黄酮。选用薄层层析用硅胶G作为层析吸附剂，石油醚-乙酸乙酯为梯度洗脱剂，收集洗脱液备用。前段洗脱液颜色与溶剂颜色接近，真空负压旋转蒸发浓缩洗脱液，回收溶剂得到少量乳白色腊脂样物质弃去。此后每次收集洗脱液500ml，真空负压(负压为0.03～0.05mPa，水温45℃)旋转蒸发浓缩洗脱液，回收溶剂，余下物用少量加热的乙酸乙酯超声溶解，形成过饱和溶液，室温下析出结晶，分别收集不同时段得到结晶物。取少量结晶物质采用高效液相色谱(HPLC)分析，成分相近者且黄酮含量高者合并，即为制备的蜂胶总黄酮。精密称取10mg蜂胶总黄酮，置25ml容量瓶中，加80％乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀，作为蜂胶总黄酮样品液，按照上述标准曲线法测定此时蜂胶总黄酮的含量。

2.  以活性蜂胶黄酮提取物为主要成分用于预防和治疗对糖尿病、高血脂、高血压、肿瘤、多种炎症、病菌引起的疾病等药物及药物组合物。

3.  根据权利要求1中所述的对蜂胶原料的冷冻条件，其特征在于-10℃～-4℃之间，冷冻8-12h，直到药材变硬、变脆而易于粉碎即可。

4.  根据权利要求1中所述有机提取溶剂水∶乙醇(80％)∶乙酸乙酯＝10∶8∶2.5，其特征在于该溶剂也可为水∶乙醇(95％)∶乙酸＝10∶9∶1或水∶乙醇(80％)∶乙酸乙酯＝10∶7∶5。

5.  蜂胶黄酮提取物用于预防和治疗对糖尿病、高血脂、高血压、肿瘤、多种炎症、病菌引起的疾病等。

蜂胶黄酮的提取、纯化技术及其抗癌机理
技术领域
本发明是关于蜂胶黄酮的提取、纯化的新方法，属于中药或天然药物领域。
背景技术
蜂胶是今近年来蜂产品研究与开发的热点。它广泛的生物学活性在现代医学中得到了越来越多的应用。2003年4月日本东京世界蜂胶年会肯定了蜂胶具有增强免疫力、抗病原微生物、调节人体内分泌、降低血糖、血脂、血压，降低血液黏滞度，改善微循环、净化血液，清除自由基，促进组织修复，抗癌，保肝护肝等多种功效。
蜂胶，是蜜蜂从长寿胶源植物的树芽树皮等部位采集树脂，再混以蜜蜂舌腺、蜡腺等腺体分泌物，经蜜蜂反复代谢合成的一种胶状物质。
对蜂胶化学成分的研究始于德国。1910年Kustenmacher从蜂胶中鉴定出肉桂醇和肉桂酸。现代科学分析从蜂胶中鉴定出305种化合物，其中黄酮类71个，芳香酸与芳香酸酯类59个，氨基酸25个，醛和酮类19个，甾体类6个，糖类9个，羟类25个，醇、酚类和其他化合物24个。新采集的蜂胶中约含有55％树脂和香膏，30％蜂蜡，10％芳香挥发油，5％的花粉等杂物。蜂胶中丰富的黄酮类和萜烯类物质具有独特的生物学作用。
从蜂胶中提取黄酮类化合物的传统方法主要是根据相似相溶原理进行溶液或溶剂提取，常用有热水提取法、碱液提取法、丙酮提取法、醇提取法、酶解法等方法。为了获得蜂胶黄酮含量较高的原料，必须对蜂胶浸膏进行进一步提纯。常用的黄酮类化合物的分离纯化方法较多，如柱层析、薄层层析、铅盐沉淀、硼酸络合、pH梯度萃取、溶剂萃取、超声波及微波法以及近年来应用的高效液相色谱、制备色谱气相层析、微乳薄层色谱等，目前仅限于在实验室使用，用于工业化生产受到限制。大孔树脂吸附法利用有机高分子聚合物为吸附剂，其物化稳定性高、吸附选择性好、不受无机物存在的影响，节省费用，广泛应用于物质的分离纯化，但近年来发现大孔树脂分离物质中有树脂残留，且较难去除，严重限制了其应用。超临界二氧化碳萃取法在诸多物质的分离中取得成功，但其用于提取分离蜂胶黄酮存在明显不足。
关于蜂胶黄酮的组合溶剂冷浸加微波辅助法提取及吸附层析——梯度洗脱法纯化蜂胶黄酮的技术在本发明完成之前没有报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种适合于产业化生产蜂胶黄酮提取物的新工艺。
本发明的目的之二是为蜂胶黄酮类为主要药用成分的保健品或药物制剂提供了高纯度原料。
本发明的目的之三是通过介绍蜂胶黄酮的抗癌机理作用，为蜂胶黄酮的进一步研究打下基础。
本发明的技术解决方案如下：
取蜂胶药材，-10℃～-4℃冷冻8-12h后变硬变脆，用万能粉碎机将蜂胶粉碎成粗粉，准确称取蜂胶样品于三角瓶中，按照每克加入水∶乙醇(80％)∶乙酸乙酯＝10∶8∶2.5室温下冷浸过夜后，抽滤，滤渣再按照每克加入乙醇(80％)∶乙酸乙酯＝5∶1进行微波提取，微波照射时间为30s，合并两次得到的滤液，减压回收溶剂，提取物被浓缩。再将浓缩物用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用蒸馏水洗涤蜂胶乙酸乙酯液，用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩，得到蜂胶黄酮的浓缩提取液。
本发明的方法制备的蜂胶黄酮提取液为黄棕色至棕色的，有特异的香气，味涩。用该种混合溶剂提取得到的黄酮有效成分完全，能够减少活性成分的破坏，而且减少了乙醇的使用量，另外再将滤渣用微波法提取，时间短，操作简单，能将滤渣中的有效成分更好的提取出来。.
建立以芦丁为标准对照品的紫外分光光度方法测定蜂胶黄酮的含量。
蜂胶总黄酮定性试验盐酸——镁粉还原反应试验混合液呈红色，NaNO₂——AI(NO₃)₃试验溶液呈红橙色，为黄酮类化合物阳性反应，证明待测样品溶液中含有黄酮类物质。蜂胶总黄酮甲醇溶液紫外光扫描曲线在200～600nm波长之间进行扫描，在270nm附近处有最大吸收峰。
采用吸附层析法(Adsorption Chromato～aphy)——梯度洗脱工艺从蜂胶浓缩液中提纯蜂胶总黄酮。选用薄层层析用硅胶G作为层析吸附剂，石油醚-乙酸乙酯为梯度洗脱剂，收集洗脱液备用。前1500ml洗脱液颜色与溶剂颜色接近，真空负压旋转蒸发浓缩洗脱液，回收溶剂得到少量乳白色腊脂样物质弃去。此后每次收集洗脱液500ml，真空负压(负压为0.03～0.05mPa，水温45℃)旋转蒸发浓缩洗脱液，回收溶剂，余下物用少量加热的乙酸乙酯超声溶解，形成过饱和溶液，室温下析出结晶，分别收集不同时间段得到结晶物。取少量结晶物质采用高效液相色谱(HPLC)分析，成分相近者且黄酮含量高者合并，即为制备的蜂胶总黄酮。精密称取10mg蜂胶总黄酮，置25ml容量瓶中，加80％乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀，作为蜂胶总黄酮样品液，按照上述标准曲线法测定此时蜂胶总黄酮的含量。
本发明所得到的高纯度的蜂胶黄酮具有很广泛的应用，尤其是在抗癌方面有着很好的前景，可以通过以下的叙述得到证实。
蜂胶的抗癌作用机理
国内外的研究和临床实践表明，蜂胶有抗癌作用。蜂胶的抗癌机理如下：1.抑制癌细胞生长 铃木郁功(1996)研究了蜂胶水溶物及其不同组分对小鼠艾氏腹水癌的抑制作用，对接种艾氏腹水癌细胞的小鼠每天注射400蜂胶水溶物，连注3-4天，癌细胞抑制率高达85％，6只小鼠中有3只小鼠的肿瘤完全消失；每只小鼠每天注射200蜂胶组分1，连注34天，癌细胞抑制率高达93.2％，6只小鼠中有4只小鼠的肿瘤完全消失；给小鼠注射蜂胶组分2，癌细胞抑制率为83％，6只小鼠中有1只小鼠的癌细胞完全消失。2.丰富的抗癌有效成分很多研究表明，蜂胶中有丰富的抗癌有效成分。Kimoto Tetsuo等(1998)发现蜂胶提取液中的3，5-二异戊烯-4-苯丙烯酸(Artepillim C)具有抗菌活性，对人和鼠类的恶性肿瘤细胞起到细胞毒素的作用，可以明显抑制肿瘤细胞生长，最后导致肿瘤细胞凋亡。目前，已知蜂胶中所含抗癌有效成分有：黄酮类化合物的槲皮素、山萘素、高良姜素、芹菜素、木樨草素、蜜桔黄素、福桔黄素、鼠李素、皂草黄素、桑黄素、儿茶精等；萜烯类化合物中的多种倍萜类、二萜类和三萜类化合物；多糖物质中的甙类物质尤其是B1-3葡聚糖；酯类化合物中的咖啡酸苯乙酯、异戊二烯酯等及其他化合物的天然组合，及它们之间相互协调作用，赋予了蜂胶的抗癌作用。3.增强免疫功能癌症发生的根本原因，是人体免疫功能失调，癌变的细胞逃脱了免疫监视，在体内迅速分裂增殖，形成恶性肿瘤。蜂胶为天然免疫增强剂，既能促进机体增加抗体产生，又能增强巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞活性，提高机体的特异性和非特异性免疫功能。Dilnov等(1991)研究报道，蜂胶提取物能增强免疫机能和丙种球蛋白的活性，增加抗体产量，增强巨噬细胞的吞噬能力。他们1992年研究还证明，蜂胶提取物可以激活巨噬细胞，增强机体非特异性免疫功能。4.抑制致癌物产生 目前已知有1000多种化合物对人类有致癌作用，而亚硝胺和黄曲霉是具有高致癌力的主要致癌物。蜂胶中的酚酸类化合物、硒、维生素C及B-胡萝卜素可以阻断体内亚硝胺的合成。蜂胶中的黄酮可以诱发苯芘羧化酶解除黄曲霉等致癌物质的毒性。Pepeljnj.k S等(1982)发现蜂胶提取液对赭曲霉素A有明显的抑制作用。ShanmM等(1998)发现添加50mg/kg的蜂胶可以阻碍使用扑热息痛造成的肝坏死过程，减少肝癌的发病几率。5.抗氧化日本著名医学博士丹羽靳员等用一系列试验证明，体内的活性氧(自由基)是引起细胞癌变的重要元凶。他们对6万多人进行普查发现，体内抗氧化剂的活力与是否得癌症有很大的关系。蜂胶是公认的天然抗氧化剂，它含有丰富的抗氧化作用的黄酮类化合物、不饱和脂肪酸、维生素E、维生素C及微量元素锌、硒等物质，因而具有显著的抗氧化作用。研究证明，蜂胶的质量浓度在0.01％～0.05％时即具有很强的抗氧化能力，并能使超氧化物歧化酶(SOD)活性显著提高。6.抗菌抗病毒生物性致癌在癌症的发病过程中起着不可忽视的作用。目前的研究表明，蜂胶中所含的球松素、双氢黄酮、良姜素、杨芽黄素、乔松素、对香豆苯酸酯、短叶松素-3-乙酸酯、樱花素、高良姜素、柳穿鱼素、鼠李柠檬素、短叶松素、咖啡酸酯、山萘素、白杨素、桉叶油素、蒎烯或萜烯类化合物、柯因、莰菲醇、金合欢素、栎精、木樨草素、藤黄苗素、柚木柯因、松属素、异樱花素、槲皮素等，对许多细菌、真菌、病毒有很强的抑制、杀灭作用，因此对病菌、病毒引起的癌症有一定的抗癌功效。
讨论
用强极性溶剂提取黄酮类物质是最常用和最有效地方法。如果单纯用乙醇做溶剂，当乙醇浓度偏低时总黄酮含量及粗黄酮收率均较低，且提取液存放易腐败变质，使后续的过滤，干燥等操作困难；而乙醇浓度越高，提取物中杂质含量也越高。有研究证明，80％左右的乙醇对黄酮的提取率最高。
微波法提取蜂胶黄酮有其独特的优越之处。同其他的提取方法相比，它最显著的特点是节约了时间，只需要30s且又达到了较高的提取率。如用乙醇浸提法一般在4-12h之间；超声波提取法也需要30min左右。另外，微波法还具有操作简便、副产物少、产率高、产物易提纯等优点
为了获得蜂胶黄酮含量较高的原料，必须对蜂胶浸膏进行进一步提纯。本发明中采用的吸附层析——梯度洗脱法的处理量相对较大，分离效果好，操作简单，适用于蜂胶黄酮的产业化生产。