一种杀虫真菌及其应用 【技术领域】
本发明涉及生物防治领域， 具体地涉及一种杀虫真菌及其应用。背景技术 蚜虫具有个体小、 发育快、 繁殖率高、 抗药性强的特点， 对环境适应力强， 广泛 分布于世界各种农林植物。它不仅直接取食危害植物， 还间接传播植物病毒， 给蔬菜、 粮油、 果树、 园林等生产造成严重经济损失。在蔬菜上的蚜虫种类主要有桃赤蚜 Myzus persicae(Sulzer)、 萝卜蚜 Lipaphis erysimi(Kaltenbach)、 甘蓝蚜 ( 菜蚜 )Brevicoryne brassicae(Linn.)。桃蚜为全国性分布， 广食性， 可危害 50 科 400 余种植物， 主要包括十字 花科、 茄科蔬菜 ( 如甘蓝、 大白菜、 青菜、 萝卜和茄子、 马铃薯、 番茄等 ) 及蔷薇科果树 ( 桃、 李、 杏、 梅、 樱桃等 )。萝卜蚜多分布于华南， 喜食白菜、 萝卜、 油菜。甘蓝蚜为北方优势种在 浙、 江、 闽等也有记载， 而且为害加重， 尤嗜甘蓝、 花椰菜。 蚜虫以刺吸式口器取食植物汁液， 使植株严重失水、 营养不良、 生长减缓， 出现叶斑、 卷叶、 枯萎以致死亡。蚜虫还是多种植物 病毒载体， 成为植株间病毒传播的媒介， 时常对植物病害期推波助澜的作用。 同时其分泌的 蜜露盖于植物表面， 有利于真菌的传播和诱发煤污病而造成植物的损害。
蚜虫的防治主要有园艺清除、 物理诱捕、 化学杀灭和生物制约等方法， 尽管前两种 方法能够显著降低蚜虫虫口数量， 但由于蚜虫繁殖速度快， 在适宜温湿度和食物条件下， 1 个月内即可增殖 100 倍以上， 因此种植过程中还必须及时施用化学农药， 如内吸性有机磷 类、 拟除虫菊酯类、 氨基甲酯酯类等加以控制。研究证实， 长期反复使用农药已使蚜虫对多 种农药的抗药性剧增， 例如山东聊城、 寿光的瓜 ( 棉 ) 蚜对氰戊菊酯的抗性水平竟然达到 12 万和 27 万倍， 拟除虫菊酯类杀虫剂在当地防蚜已基本无效。一些原本高效的杀蚜剂如抗蚜 威、 吡虫啉等经过几年使用， 抗性也增加几十倍。 过度使用农药造成农产品中药残超标和农 田环境污染。
为保障农作物稳产高产， 同时保证农产品质量安全， 近年无公害植保技术逐渐成 为研究热点， 对蚜虫的生物制约方法越来越受到青睐。目前较成功的方法主要是保护与释 放烟蚜茧蜂、 菜蚜茧蜂、 食蚜瘿蚊 Aphidoletes aphidimyza( 例 ： 1978 年芬兰于保护地试验 成功， 我国 1986 年从加拿大引入释放， 数量益害比为 1 ∶ 20， 7-9 天防效达 90％ ) 等蚜虫 天敌， 提高寄生或捕食作用控制田间害虫的种群密度 ； 再者是施用蚜霉菌 Entomophthora aphidis、 轮枝菌 Verticillium lecanii( 英国商品注册 Vertalec) 等昆虫病原真菌， 通过 病原感染作用使害虫罹病死亡。昆虫病原真菌对脊椎动物高度安全， 与环境友好兼容。其 对寄主昆虫的作用机制是孢子附着于昆虫表皮， 通过分泌专性的昆虫表皮降解酶而穿过体 进入昆虫体腔后增殖， 消耗其营养， 释放毒素， 干扰正常生理功能， 侵染组织器官， 最后 壁， 使寄主罹病而死。由于无需经过消化道， 因此对防止刺吸式口器蚜虫有明显优势。本研究 小组多年从事昆虫病原真菌研究与应用， 发现白僵菌 (Beauveria bassiana) 对蚜虫有寄生 和致死作用， 不同菌株的作用效力相差很大， 需要通过人工筛选才能获得高毒力的菌株。 相 关领域中， 以往研究者也有通过室内生物测定筛选获得对麦蚜等多种蚜虫成蚜的毒力较高
球孢白僵菌菌株。 经研究发现， 白僵菌象其它昆虫病原真菌一样， 存在对寄主起效较慢的弱 点， 生物测定中通常要 3-5 天才能达到致死高峰， 相对地滞后于蚜虫的繁殖速度和植株对 蚜虫危害的耐受程度， 因而常常不能及时控制虫害， 达不到人们期待的理想防效。 为了提高 白僵菌防效， 需要寻求提高白僵菌杀虫速度的方法。 发明内容 为了解决上述问题， 本发明的发明人提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种对蚜虫高效侵染的真菌球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16。
本发明的再一目的是提供球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16 对蚜虫的杀虫作用。
本发明的再一目的是提供一种蚜虫的高效复合杀虫剂， 其包括上述球孢白僵菌菌 株 BBNS-J9-16 的孢子粉。
本发明的再一目的是提供上述高效复合杀虫剂对蚜虫的杀虫作用。
本发明提供了一种高效菌株球孢白僵菌 BBNS-J9-16。本发明人分别从内蒙古、 安 徽、 江西、 贵州等地的天然林区、 草地或农田采集到土壤和感染白僵菌病症的虫尸， 在实验 室内进行微生物分离、 纯化， 保存纯化的球孢白僵菌菌种在 PDAY 试管培养基中， 共得到 68 个菌株。将纯化的菌株接种在 PDAY 平板培养基上， 于 25±1℃培养箱中培养 12-14 天， 收 集分生孢子粉， 进行生物测定， 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 初步筛选得到 4 个具有较高 毒力作用的菌株。将这 4 个初选菌株再次接种蚜虫虫体并从病虫上再分离纯化及生物学测 定选择， 最终得到高效菌株球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana)。该菌株于 2011 年 9 月 23 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5288。
所述菌株的 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 区域的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示 ：
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagttatc caactcccaa cccctgtgaa 60
ttataccttt aattgttgct tcggcgggac ttcgcgcccg ccggggaccc aaaccttctg 120
aattttttaa taagtatctt ctgagtggtt aaaaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg 180
atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 240
agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgtcagta ttctggcggg 300
catgcctgtt cgagcgtcat tacgcccctc aagtcccctg tggacttggt gttggggatc 360
ggcgaggctg gttttccagc acagccgtcc cttaaattaa ttggcggtct cgccgtggcc 420
ctcctctgcg cagtagtaaa acactcgcaa caggagcccg gcgcggtcca ctgccgtaaa 480
accccccaac tttttatagt tgacctcgaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca 540
tatcaataag cggagga 557
本发明还提供了上述球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16 用于杀蚜虫的应用， 优选该白 僵菌菌株用于杀蔬菜蚜虫和花卉蚜虫的应用。
本 发 明 还 提 供 了 一 种 高 效 复 合 杀 虫 剂， 其 中， 包含上述球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16 的菌体和 / 或其孢子粉。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 其中， 包含化学杀虫剂。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 优选每克所述高效复合杀虫剂含有 0.4 ～ 2×109 孢子和 1/300-1/600 克的吡虫啉， 杀虫使用浓度为稀释 1000 倍。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 优选每克所述高效复合杀虫剂含有 0.4 ～ 2×109 孢子和 1/220-1/260 克的高效氯氰菊酯， 杀虫使用浓度为稀释 1000 倍。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 优选每克所述高效复合杀虫剂含有 0.4 ～ 2×109 孢子和 1/25-1/37.5 克的乐果， 杀虫使用浓度为稀释 1000 倍。
本发明还提供了上述高效复合杀虫剂用于杀蚜虫的应用， 优选用于杀萝卜蚜 (Lipaphis erysimi) 的应用。
本发明筛选得到了一种对蚜虫高效侵染的球孢白僵菌菌株， 同时还筛选到几种能 够与球孢白僵菌兼容的低毒性农药。这些农药在远低于常规用量的条件下， 能够有效促进 球孢白僵菌对蚜虫侵染效力， 大幅减少农药的施用量。 由此形成的高效复合杀虫剂， 利用与 环境友好兼容的昆虫真菌感染寄主从而控制害虫， 实现保护农作物同时， 减少化学农药的 使用， 对保障农产品安全和农业环境安全起积极作用。 附图说明
图 1 菌株 BBNS-J9-16 的显微形态特征。
图 2CTAB 法提取球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的 DNA 的凝胶图。
图 3 扩增的球孢白僵菌 BBNS-J9-16 核糖体 ITS 片段的凝胶图。
图 4 显示了球孢白僵菌 BBNS-J9-16 对蚜虫的作用， a 为健康蚜， b、 c 为感病蚜。
球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana) 于 2011 年 9 月 23 日保存于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科 学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5288。 具体实施方式
结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例 1 球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana) 菌株的分离、 纯化
分别从内蒙古、 安徽、 江西、 贵州等地的天然林区、 草地或农田采集到土壤和感染 白僵菌病症的虫尸， 在实验室内进行微生物分离、 纯化。
分离及纯化步骤为 ： 1) 从土壤分离目标微生物 ： 用无菌水稀释土壤 20 倍、 100 倍、 500 倍， 分别接种到选择性培养基上， 25℃温度下培养 4-7 天， 挑出菌落转移得到新的选择 性培养基平皿上， 单菌落培养 7-10 天， 通过菌落表观和显微形态检查鉴定， 确定球孢白僵 菌， 转移到菌种培养基试管中， 在 25℃温度下培养 14 天后， 于 4℃冰箱冷藏保存。 2) 从罹病 僵虫分离目标微生物 ： 用接种针小心挑取虫尸上的菌体， 接种到选择性培养基上， 在 25℃ 温度下培养 7 天， 分辨菌落并转移到新的选择性培养基平皿上， 单菌落培养 7-10 天， 通过菌 落表观和显微形态检查鉴定， 确定球孢白僵菌， 转移到菌种培养基试管中， 在 25℃温度下培 养 14 天后， 于 4℃冰箱冷藏保存。
保存纯化的球孢白僵菌菌种在 PDAY 试管培养基中， 共得到 68 个菌株。将接种 在 PDAY 平板培养基上， 于 25±1 ℃培养箱中培养 12-14 天， 收集分生孢子粉， 进行生物测 定。 测定方法为 ： 1) 在实验室饲养蚜虫 ； 2) 将孢子粉配制成定量一定浓度的孢子悬浮液， 用 Potter 喷雾塔将 1ml 菌液均匀喷雾到蚜虫体上， 每菌株处理 100 只蚜虫， 3 次重复 ； 3) 将蚜 虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫死亡数量， 4) 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫 ； 5) 根据蚜虫最终死亡率和僵虫 率， 初步筛选得到 4 个具有较高毒力作用的菌株 ； 6) 对这 4 初选菌株按照 1)-5) 的步骤， 再 做进一步测定， 得到高效菌株球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana)。将该菌株于 2011 年 9 月 23 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区 北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5288。
实施例 2 菌株的生物形态学特征
配制 PDAY 培养基， 其组分和配制方法为将新鲜土豆 200g 加水约 1000mL 煮开 15min， 用纱布过滤后留用液体， 加葡萄糖 20g、 酵母浸出粉 5g、 琼脂 15g， 加热使琼脂完全融 化， 定量至 1000mL， 分装到三角瓶中， 置于高压蒸气灭菌器中 121 ℃保持 20min， 待凉至约 60℃时倒入培养皿中， 制成平板待用。
在 PDAY 平板培养基上接种分生孢子， 25℃培养 2d， 肉眼观察可见菌落， 菌落菌丝 呈白色绒毛状， 继续培养 3-4d， 可见菌落扩大生长， 表面有乳白色孢子产生， 孢子成熟后， 菌 落表面富集白色粉状孢子。
在凹型载玻片的小室内滴一滴灭菌的 PDAY 培养基， 接种分生孢子， 25 ℃培养 3-4d， 于显微镜下观察， 可见分生孢子梗着生于营养菌丝上， 单生 ； 产孢细胞簇生， 呈瓶状， 颈部产孢轴呈 “Z” 型着生排列 ； 孢子易脱落分散 ； 分生孢子球形， 2-3μm。如图 1 所示。 实施例 3 菌株的核糖体 ITS 区核苷酸序列特征
配制 LM 培养基， 其组分和配制方法为称取葡萄糖 40g、 蛋白胨 5g， 加水至 1000mL， 分装至三角瓶， 置于高压蒸气灭菌器中 121℃保持 20min， 放凉至室温备用。 5
接种分生孢子至上述培养基中， 接种量为 1×10 孢子 /mL， 于 25±1℃、 200rpm 摇 床上培养 48h， 用滤纸过滤后留菌丝， 挤干水分备用。
用 CTAB 法提取基因组 DNA。按常规 DNA 提取操作进行， 得到基因组 DNA， 如图 2 所 示。
以 ITS1-5.8S-ITS2rDNA 区 域 引 物 15’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 引 物 25’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC 进行 PCR 扩增， 得到扩增的 DNA 片段， 如图 3 所示， 将片段进行 核苷酸序列检测， 得到菌株核糖体 ITS 核苷酸序列， 如 SEQ ID No.1 所示。
实施例 4 菌株对蔬菜蚜虫的作用效果
在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi ； 用 0.05％的吐温 80 水溶液 将菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成系列浓度梯度为 50、 10、 2、 0.4、 0.08×106 孢子 /mL 的 孢子悬浮液， 取 1mL 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体上， 每菌株处理 100 只蚜虫， 3 次重 复； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫死亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁 净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫 ； 根据蚜虫最终死亡率和僵 虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。结果见表 1 和图 4， 证明菌株能有效导致蚜虫患病死亡。
表 1 球孢白僵菌 BBNS-J9-16 对菜蚜的毒力作用
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。
实施例 5 菌株对花卉蚜虫的作用效果
5 月， 从月季叶片上采集到蚜虫 ； 用 0.05％的吐温 80 水溶液配制成系列浓度梯度 7 为 1×10 孢子 /mL 的孢子悬浮液， 取 1mL 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体上， 每次处理 2-3 张叶片， 约 100-130 只蚜虫， 5 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记 录蚜虫死亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌 而成为僵虫 ； 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。结果见表 2， 证明菌 株能有效导致蚜虫患病死亡。
表 2 球孢白僵菌 BBNS-J9-16 对月季蚜虫的毒力作用实施例 6 球孢白僵菌与吡虫啉复合杀虫剂对蚜虫的毒杀作用
试验用球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉， 含量为 1×1011 孢子 /g。吡虫啉为江苏 镇江建苏化工有限公司生产的 10％可湿性粉剂， 厂商推荐田间使用浓度为稀释 2000-3000 倍。4 种复合杀虫剂均为球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉与吡虫啉的混合物， 其中复合剂 9 9 A1 中每克含 2×10 孢子和 1/300 克的吡虫啉， 复合剂 A2 中每克含 0.4×10 孢子和 1/300 9 克的吡虫啉， 复合剂 A3 中每克含 2×10 孢子和 1/600 克的吡虫啉， 复合剂 A4 中每克含 9 0.4×10 孢子和 1/600 克的吡虫啉。
试验方法 ： 在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi ； 分别配制以下各 处理的溶液或悬浮液 ： 1) 分别称取 1g 复合杀虫剂 A1、 复合杀虫剂 A2、 复合杀虫剂 A3 和复合 杀虫剂 A4， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 9 稀释， 得到它们的稀释 1000 倍的悬浮液 ； 2) 用 0.05％的 6 吐温 80 水溶液将菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成浓度为 0.4×10 孢子 /mL 和 2×106 孢 子 /mL 的孢子悬浮液， 即分别等同于复合杀虫剂 A1 和 A2 的 1000 倍的悬浮液中的白僵菌孢 子含量 ； 3) 称取 1g 10％的吡虫啉可湿性粉， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 2、 1 ∶ 9、 1 ∶ 9 依次稀释， 得到 30000 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 A1 和 A2 的 1000 倍的悬浮液中吡虫啉的含量 ；
再按 1 ∶ 1 稀释 1 次， 即得到 60000 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 A3 和 A4 的 1000 倍的 悬浮液中吡虫啉的含量。分别取配制好的处理液 1mL， 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体 上， 每次处理 100 只蚜虫， 3 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养 7 天， 每天观察记录蚜虫死 亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵 虫； 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。
试验结果见表 3， 证明球孢白僵菌与吡虫啉复合杀虫剂能有效提高对蚜虫的毒杀 死亡率和死亡速率。
表 3 杀虫主剂与单独球孢白僵菌或吡虫啉对蚜虫的毒力比较
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。 “--” 表示不处 理或不存在。
实施例 7 球孢白僵菌与高效氯氰菊酯复合杀虫剂对蚜虫的毒杀作用
试验用球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉， 含量为 1×1011 孢子 /g。高效氯氰菊 酯为中国农科院植保所廊坊农药中试厂生产的 4.5％乳油， 厂商推荐田间使用浓度为稀释 1500-2000 倍。4 种复合杀虫剂均为球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉与高效氯氰菊酯的混 合物， 其中复合剂 B1 中每克含 2×109 孢子和 1/220 克的高效氯氰菊酯， 复合剂 B2 中每克含 9 9 0.4×10 孢子和 1/220 克的高效氯氰菊酯， 复合剂 B3 中每克含 2×10 孢子和 1/260 克的高 9 效氯氰菊酯， 复合剂 B4 中每克含 0.4×10 孢子和 1/260 克的高效氯氰菊酯。
在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi ； 分别配制以下各处理的溶液 或悬浮液 ： 1) 分别称取 1g 复合杀虫剂 B1、 复合杀虫剂 B2、 复合杀虫剂 B3 和复合杀虫剂 B4， 加 水 99mL， 再按 1 ∶ 9 稀释， 得到它们的 1000 倍的稀释液 ； 2) 用 0.05％的吐温 80 水溶液将 6 菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成浓度梯度为 0.4×10 孢子 /mL 和 2×106 孢子 /mL 的孢子 悬浮液， 即分别等同于复合杀虫剂 B1 和 B2 的 1000 倍稀释液中的白僵菌孢子含量 ； 3) 量取 1mL 4.5％的高效氯氰菊酯乳油， 加水 98mL， 再按 1 ∶ 9、 1 ∶ 9 依次稀释， 得到 9900 倍的稀 释液， 即等同于复合杀虫剂 B1 和 B2 的 1000 倍稀释液中高效氯氰菊酯的含量 ； 再按 11 ∶ 2 加水稀释 1 次， 即得到 11700 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 B3 和 B4 的 1000 倍的悬浮液 中高效氯氰菊酯的含量。分别取配制好的处理液 1mL， 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体 上， 每次处理 100 只蚜虫， 3 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫 死亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为
僵虫 ； 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。
结果见表 4， 证明球孢白僵菌与高效氯氰菊酯复合剂能有效提高对蚜虫的毒杀死 亡率和死亡速率。
表 4 杀虫主剂与单独球孢白僵菌或高效氯氰菊酯对蚜虫的毒力比较
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。 “--” 表示不处 理或不存在
实施例 8 球孢白僵菌与乐果复合杀虫剂对蚜虫的毒杀作用
试验用球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉， 含量为 1×1011 孢子 /g。农药乐果为江 苏腾龙生物药业有限公司生产的 40％乳油， 厂商推荐田间使用浓度为稀释 800-2000 倍。4 种复合杀虫剂均为球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉与乐果的混合物， 其中复合剂 C1 中每 9 9 克含 2×10 孢子和 1/25 克的乐果， 复合剂 C2 中每克含 0.4×10 孢子和 1/25 克的乐果， 9 复合剂 C3 中每克含 2×10 孢子和 1/37.5 克的乐果， 复合剂 C4 中每克含 0.4×109 孢子和 1/37.5 克的乐果。
在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi。 分别配制以下各处理的溶液 或悬浮液 ： 1) 分别称取 1g 复合杀虫剂 C1、 复合杀虫剂 C2、 复合杀虫剂 C3 和复合杀虫剂 C4， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 9 稀释， 得到它们的稀释 1000 倍的稀释液 ； 2) 用 0.05％的吐温 80 水 6 溶液将菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成浓度梯度为 0.4×10 孢子 /mL 和 2×106 孢子 /mL 的孢子悬浮液， 即分别等同于复合杀虫剂 C1 和 C2 的 1000 倍的悬浮液中的白僵菌孢子含量 ； 3) 量取 1mL 40％的乐果乳油， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 9、 1 ∶ 9 依次稀释， 得到 10000 倍的稀 释液， 即等同于复合杀虫剂 C1 和 C2 的 1000 倍稀释液中乐果的含量 ； 再按 2 ∶ 1 加水稀释 1 次， 即得到 15000 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 C3 和 C4 的 1000 倍的悬浮液中乐果的含 量。 分别取配制好的处理液 1mL， 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体上， 每次处理 100 只蚜 虫， 3 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫死亡数量， 将死亡蚜虫 转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫 ； 根据蚜虫最终死 亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。
结果见表 5， 证明球孢白僵菌与乐果复合剂能有效提高对蚜虫的毒杀死亡率和死 表 5 杀虫主剂与单独球孢白僵菌或乐果对蚜虫的毒力比较亡速率。
本发明涉及生物防治领域， 具体地涉及一种杀虫真菌及其应用。背景技术 蚜虫具有个体小、 发育快、 繁殖率高、 抗药性强的特点， 对环境适应力强， 广泛 分布于世界各种农林植物。它不仅直接取食危害植物， 还间接传播植物病毒， 给蔬菜、 粮油、 果树、 园林等生产造成严重经济损失。在蔬菜上的蚜虫种类主要有桃赤蚜 Myzus persicae(Sulzer)、 萝卜蚜 Lipaphis erysimi(Kaltenbach)、 甘蓝蚜 ( 菜蚜 )Brevicoryne brassicae(Linn.)。桃蚜为全国性分布， 广食性， 可危害 50 科 400 余种植物， 主要包括十字 花科、 茄科蔬菜 ( 如甘蓝、 大白菜、 青菜、 萝卜和茄子、 马铃薯、 番茄等 ) 及蔷薇科果树 ( 桃、 李、 杏、 梅、 樱桃等 )。萝卜蚜多分布于华南， 喜食白菜、 萝卜、 油菜。甘蓝蚜为北方优势种在 浙、 江、 闽等也有记载， 而且为害加重， 尤嗜甘蓝、 花椰菜。 蚜虫以刺吸式口器取食植物汁液， 使植株严重失水、 营养不良、 生长减缓， 出现叶斑、 卷叶、 枯萎以致死亡。蚜虫还是多种植物 病毒载体， 成为植株间病毒传播的媒介， 时常对植物病害期推波助澜的作用。 同时其分泌的 蜜露盖于植物表面， 有利于真菌的传播和诱发煤污病而造成植物的损害。
蚜虫的防治主要有园艺清除、 物理诱捕、 化学杀灭和生物制约等方法， 尽管前两种 方法能够显著降低蚜虫虫口数量， 但由于蚜虫繁殖速度快， 在适宜温湿度和食物条件下， 1 个月内即可增殖 100 倍以上， 因此种植过程中还必须及时施用化学农药， 如内吸性有机磷 类、 拟除虫菊酯类、 氨基甲酯酯类等加以控制。研究证实， 长期反复使用农药已使蚜虫对多 种农药的抗药性剧增， 例如山东聊城、 寿光的瓜 ( 棉 ) 蚜对氰戊菊酯的抗性水平竟然达到 12 万和 27 万倍， 拟除虫菊酯类杀虫剂在当地防蚜已基本无效。一些原本高效的杀蚜剂如抗蚜 威、 吡虫啉等经过几年使用， 抗性也增加几十倍。 过度使用农药造成农产品中药残超标和农 田环境污染。
为保障农作物稳产高产， 同时保证农产品质量安全， 近年无公害植保技术逐渐成 为研究热点， 对蚜虫的生物制约方法越来越受到青睐。目前较成功的方法主要是保护与释 放烟蚜茧蜂、 菜蚜茧蜂、 食蚜瘿蚊 Aphidoletes aphidimyza( 例 ： 1978 年芬兰于保护地试验 成功， 我国 1986 年从加拿大引入释放， 数量益害比为 1 ∶ 20， 7-9 天防效达 90％ ) 等蚜虫 天敌， 提高寄生或捕食作用控制田间害虫的种群密度 ； 再者是施用蚜霉菌 Entomophthora aphidis、 轮枝菌 Verticillium lecanii( 英国商品注册 Vertalec) 等昆虫病原真菌， 通过 病原感染作用使害虫罹病死亡。昆虫病原真菌对脊椎动物高度安全， 与环境友好兼容。其 对寄主昆虫的作用机制是孢子附着于昆虫表皮， 通过分泌专性的昆虫表皮降解酶而穿过体 进入昆虫体腔后增殖， 消耗其营养， 释放毒素， 干扰正常生理功能， 侵染组织器官， 最后 壁， 使寄主罹病而死。由于无需经过消化道， 因此对防止刺吸式口器蚜虫有明显优势。本研究 小组多年从事昆虫病原真菌研究与应用， 发现白僵菌 (Beauveria bassiana) 对蚜虫有寄生 和致死作用， 不同菌株的作用效力相差很大， 需要通过人工筛选才能获得高毒力的菌株。 相 关领域中， 以往研究者也有通过室内生物测定筛选获得对麦蚜等多种蚜虫成蚜的毒力较高
球孢白僵菌菌株。 经研究发现， 白僵菌象其它昆虫病原真菌一样， 存在对寄主起效较慢的弱 点， 生物测定中通常要 3-5 天才能达到致死高峰， 相对地滞后于蚜虫的繁殖速度和植株对 蚜虫危害的耐受程度， 因而常常不能及时控制虫害， 达不到人们期待的理想防效。 为了提高 白僵菌防效， 需要寻求提高白僵菌杀虫速度的方法。 发明内容 为了解决上述问题， 本发明的发明人提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种对蚜虫高效侵染的真菌球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16。
本发明的再一目的是提供球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16 对蚜虫的杀虫作用。
本发明的再一目的是提供一种蚜虫的高效复合杀虫剂， 其包括上述球孢白僵菌菌 株 BBNS-J9-16 的孢子粉。
本发明的再一目的是提供上述高效复合杀虫剂对蚜虫的杀虫作用。
本发明提供了一种高效菌株球孢白僵菌 BBNS-J9-16。本发明人分别从内蒙古、 安 徽、 江西、 贵州等地的天然林区、 草地或农田采集到土壤和感染白僵菌病症的虫尸， 在实验 室内进行微生物分离、 纯化， 保存纯化的球孢白僵菌菌种在 PDAY 试管培养基中， 共得到 68 个菌株。将纯化的菌株接种在 PDAY 平板培养基上， 于 25±1℃培养箱中培养 12-14 天， 收 集分生孢子粉， 进行生物测定， 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 初步筛选得到 4 个具有较高 毒力作用的菌株。将这 4 个初选菌株再次接种蚜虫虫体并从病虫上再分离纯化及生物学测 定选择， 最终得到高效菌株球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana)。该菌株于 2011 年 9 月 23 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5288。
所述菌株的 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 区域的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示 ：
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagttatc caactcccaa cccctgtgaa 60
ttataccttt aattgttgct tcggcgggac ttcgcgcccg ccggggaccc aaaccttctg 120
aattttttaa taagtatctt ctgagtggtt aaaaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg 180
atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 240
agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgtcagta ttctggcggg 300
catgcctgtt cgagcgtcat tacgcccctc aagtcccctg tggacttggt gttggggatc 360
ggcgaggctg gttttccagc acagccgtcc cttaaattaa ttggcggtct cgccgtggcc 420
ctcctctgcg cagtagtaaa acactcgcaa caggagcccg gcgcggtcca ctgccgtaaa 480
accccccaac tttttatagt tgacctcgaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca 540
tatcaataag cggagga 557
本发明还提供了上述球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16 用于杀蚜虫的应用， 优选该白 僵菌菌株用于杀蔬菜蚜虫和花卉蚜虫的应用。
本 发 明 还 提 供 了 一 种 高 效 复 合 杀 虫 剂， 其 中， 包含上述球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16 的菌体和 / 或其孢子粉。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 其中， 包含化学杀虫剂。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 优选每克所述高效复合杀虫剂含有 0.4 ～ 2×109 孢子和 1/300-1/600 克的吡虫啉， 杀虫使用浓度为稀释 1000 倍。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 优选每克所述高效复合杀虫剂含有 0.4 ～ 2×109 孢子和 1/220-1/260 克的高效氯氰菊酯， 杀虫使用浓度为稀释 1000 倍。
根据本发明的高效复合杀虫剂， 优选每克所述高效复合杀虫剂含有 0.4 ～ 2×109 孢子和 1/25-1/37.5 克的乐果， 杀虫使用浓度为稀释 1000 倍。
本发明还提供了上述高效复合杀虫剂用于杀蚜虫的应用， 优选用于杀萝卜蚜 (Lipaphis erysimi) 的应用。
本发明筛选得到了一种对蚜虫高效侵染的球孢白僵菌菌株， 同时还筛选到几种能 够与球孢白僵菌兼容的低毒性农药。这些农药在远低于常规用量的条件下， 能够有效促进 球孢白僵菌对蚜虫侵染效力， 大幅减少农药的施用量。 由此形成的高效复合杀虫剂， 利用与 环境友好兼容的昆虫真菌感染寄主从而控制害虫， 实现保护农作物同时， 减少化学农药的 使用， 对保障农产品安全和农业环境安全起积极作用。 附图说明
图 1 菌株 BBNS-J9-16 的显微形态特征。
图 2CTAB 法提取球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的 DNA 的凝胶图。
图 3 扩增的球孢白僵菌 BBNS-J9-16 核糖体 ITS 片段的凝胶图。
图 4 显示了球孢白僵菌 BBNS-J9-16 对蚜虫的作用， a 为健康蚜， b、 c 为感病蚜。
球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana) 于 2011 年 9 月 23 日保存于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科 学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5288。 具体实施方式
结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例 1 球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana) 菌株的分离、 纯化
分别从内蒙古、 安徽、 江西、 贵州等地的天然林区、 草地或农田采集到土壤和感染 白僵菌病症的虫尸， 在实验室内进行微生物分离、 纯化。
分离及纯化步骤为 ： 1) 从土壤分离目标微生物 ： 用无菌水稀释土壤 20 倍、 100 倍、 500 倍， 分别接种到选择性培养基上， 25℃温度下培养 4-7 天， 挑出菌落转移得到新的选择 性培养基平皿上， 单菌落培养 7-10 天， 通过菌落表观和显微形态检查鉴定， 确定球孢白僵 菌， 转移到菌种培养基试管中， 在 25℃温度下培养 14 天后， 于 4℃冰箱冷藏保存。 2) 从罹病 僵虫分离目标微生物 ： 用接种针小心挑取虫尸上的菌体， 接种到选择性培养基上， 在 25℃ 温度下培养 7 天， 分辨菌落并转移到新的选择性培养基平皿上， 单菌落培养 7-10 天， 通过菌 落表观和显微形态检查鉴定， 确定球孢白僵菌， 转移到菌种培养基试管中， 在 25℃温度下培 养 14 天后， 于 4℃冰箱冷藏保存。
保存纯化的球孢白僵菌菌种在 PDAY 试管培养基中， 共得到 68 个菌株。将接种 在 PDAY 平板培养基上， 于 25±1 ℃培养箱中培养 12-14 天， 收集分生孢子粉， 进行生物测 定。 测定方法为 ： 1) 在实验室饲养蚜虫 ； 2) 将孢子粉配制成定量一定浓度的孢子悬浮液， 用 Potter 喷雾塔将 1ml 菌液均匀喷雾到蚜虫体上， 每菌株处理 100 只蚜虫， 3 次重复 ； 3) 将蚜 虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫死亡数量， 4) 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫 ； 5) 根据蚜虫最终死亡率和僵虫 率， 初步筛选得到 4 个具有较高毒力作用的菌株 ； 6) 对这 4 初选菌株按照 1)-5) 的步骤， 再 做进一步测定， 得到高效菌株球孢白僵菌 BBNS-J9-16(Beauveria bassiana)。将该菌株于 2011 年 9 月 23 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区 北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5288。
实施例 2 菌株的生物形态学特征
配制 PDAY 培养基， 其组分和配制方法为将新鲜土豆 200g 加水约 1000mL 煮开 15min， 用纱布过滤后留用液体， 加葡萄糖 20g、 酵母浸出粉 5g、 琼脂 15g， 加热使琼脂完全融 化， 定量至 1000mL， 分装到三角瓶中， 置于高压蒸气灭菌器中 121 ℃保持 20min， 待凉至约 60℃时倒入培养皿中， 制成平板待用。
在 PDAY 平板培养基上接种分生孢子， 25℃培养 2d， 肉眼观察可见菌落， 菌落菌丝 呈白色绒毛状， 继续培养 3-4d， 可见菌落扩大生长， 表面有乳白色孢子产生， 孢子成熟后， 菌 落表面富集白色粉状孢子。
在凹型载玻片的小室内滴一滴灭菌的 PDAY 培养基， 接种分生孢子， 25 ℃培养 3-4d， 于显微镜下观察， 可见分生孢子梗着生于营养菌丝上， 单生 ； 产孢细胞簇生， 呈瓶状， 颈部产孢轴呈 “Z” 型着生排列 ； 孢子易脱落分散 ； 分生孢子球形， 2-3μm。如图 1 所示。 实施例 3 菌株的核糖体 ITS 区核苷酸序列特征
配制 LM 培养基， 其组分和配制方法为称取葡萄糖 40g、 蛋白胨 5g， 加水至 1000mL， 分装至三角瓶， 置于高压蒸气灭菌器中 121℃保持 20min， 放凉至室温备用。 5
接种分生孢子至上述培养基中， 接种量为 1×10 孢子 /mL， 于 25±1℃、 200rpm 摇 床上培养 48h， 用滤纸过滤后留菌丝， 挤干水分备用。
用 CTAB 法提取基因组 DNA。按常规 DNA 提取操作进行， 得到基因组 DNA， 如图 2 所 示。
以 ITS1-5.8S-ITS2rDNA 区 域 引 物 15’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 引 物 25’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC 进行 PCR 扩增， 得到扩增的 DNA 片段， 如图 3 所示， 将片段进行 核苷酸序列检测， 得到菌株核糖体 ITS 核苷酸序列， 如 SEQ ID No.1 所示。
实施例 4 菌株对蔬菜蚜虫的作用效果
在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi ； 用 0.05％的吐温 80 水溶液 将菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成系列浓度梯度为 50、 10、 2、 0.4、 0.08×106 孢子 /mL 的 孢子悬浮液， 取 1mL 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体上， 每菌株处理 100 只蚜虫， 3 次重 复； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫死亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁 净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫 ； 根据蚜虫最终死亡率和僵 虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。结果见表 1 和图 4， 证明菌株能有效导致蚜虫患病死亡。
表 1 球孢白僵菌 BBNS-J9-16 对菜蚜的毒力作用
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。
实施例 5 菌株对花卉蚜虫的作用效果
5 月， 从月季叶片上采集到蚜虫 ； 用 0.05％的吐温 80 水溶液配制成系列浓度梯度 7 为 1×10 孢子 /mL 的孢子悬浮液， 取 1mL 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体上， 每次处理 2-3 张叶片， 约 100-130 只蚜虫， 5 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记 录蚜虫死亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌 而成为僵虫 ； 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。结果见表 2， 证明菌 株能有效导致蚜虫患病死亡。
表 2 球孢白僵菌 BBNS-J9-16 对月季蚜虫的毒力作用实施例 6 球孢白僵菌与吡虫啉复合杀虫剂对蚜虫的毒杀作用
试验用球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉， 含量为 1×1011 孢子 /g。吡虫啉为江苏 镇江建苏化工有限公司生产的 10％可湿性粉剂， 厂商推荐田间使用浓度为稀释 2000-3000 倍。4 种复合杀虫剂均为球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉与吡虫啉的混合物， 其中复合剂 9 9 A1 中每克含 2×10 孢子和 1/300 克的吡虫啉， 复合剂 A2 中每克含 0.4×10 孢子和 1/300 9 克的吡虫啉， 复合剂 A3 中每克含 2×10 孢子和 1/600 克的吡虫啉， 复合剂 A4 中每克含 9 0.4×10 孢子和 1/600 克的吡虫啉。
试验方法 ： 在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi ； 分别配制以下各 处理的溶液或悬浮液 ： 1) 分别称取 1g 复合杀虫剂 A1、 复合杀虫剂 A2、 复合杀虫剂 A3 和复合 杀虫剂 A4， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 9 稀释， 得到它们的稀释 1000 倍的悬浮液 ； 2) 用 0.05％的 6 吐温 80 水溶液将菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成浓度为 0.4×10 孢子 /mL 和 2×106 孢 子 /mL 的孢子悬浮液， 即分别等同于复合杀虫剂 A1 和 A2 的 1000 倍的悬浮液中的白僵菌孢 子含量 ； 3) 称取 1g 10％的吡虫啉可湿性粉， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 2、 1 ∶ 9、 1 ∶ 9 依次稀释， 得到 30000 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 A1 和 A2 的 1000 倍的悬浮液中吡虫啉的含量 ；
再按 1 ∶ 1 稀释 1 次， 即得到 60000 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 A3 和 A4 的 1000 倍的 悬浮液中吡虫啉的含量。分别取配制好的处理液 1mL， 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体 上， 每次处理 100 只蚜虫， 3 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养 7 天， 每天观察记录蚜虫死 亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵 虫； 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。
试验结果见表 3， 证明球孢白僵菌与吡虫啉复合杀虫剂能有效提高对蚜虫的毒杀 死亡率和死亡速率。
表 3 杀虫主剂与单独球孢白僵菌或吡虫啉对蚜虫的毒力比较
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。 “--” 表示不处 理或不存在。
实施例 7 球孢白僵菌与高效氯氰菊酯复合杀虫剂对蚜虫的毒杀作用
试验用球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉， 含量为 1×1011 孢子 /g。高效氯氰菊 酯为中国农科院植保所廊坊农药中试厂生产的 4.5％乳油， 厂商推荐田间使用浓度为稀释 1500-2000 倍。4 种复合杀虫剂均为球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉与高效氯氰菊酯的混 合物， 其中复合剂 B1 中每克含 2×109 孢子和 1/220 克的高效氯氰菊酯， 复合剂 B2 中每克含 9 9 0.4×10 孢子和 1/220 克的高效氯氰菊酯， 复合剂 B3 中每克含 2×10 孢子和 1/260 克的高 9 效氯氰菊酯， 复合剂 B4 中每克含 0.4×10 孢子和 1/260 克的高效氯氰菊酯。
在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi ； 分别配制以下各处理的溶液 或悬浮液 ： 1) 分别称取 1g 复合杀虫剂 B1、 复合杀虫剂 B2、 复合杀虫剂 B3 和复合杀虫剂 B4， 加 水 99mL， 再按 1 ∶ 9 稀释， 得到它们的 1000 倍的稀释液 ； 2) 用 0.05％的吐温 80 水溶液将 6 菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成浓度梯度为 0.4×10 孢子 /mL 和 2×106 孢子 /mL 的孢子 悬浮液， 即分别等同于复合杀虫剂 B1 和 B2 的 1000 倍稀释液中的白僵菌孢子含量 ； 3) 量取 1mL 4.5％的高效氯氰菊酯乳油， 加水 98mL， 再按 1 ∶ 9、 1 ∶ 9 依次稀释， 得到 9900 倍的稀 释液， 即等同于复合杀虫剂 B1 和 B2 的 1000 倍稀释液中高效氯氰菊酯的含量 ； 再按 11 ∶ 2 加水稀释 1 次， 即得到 11700 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 B3 和 B4 的 1000 倍的悬浮液 中高效氯氰菊酯的含量。分别取配制好的处理液 1mL， 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体 上， 每次处理 100 只蚜虫， 3 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫 死亡数量， 将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为
僵虫 ； 根据蚜虫最终死亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。
结果见表 4， 证明球孢白僵菌与高效氯氰菊酯复合剂能有效提高对蚜虫的毒杀死 亡率和死亡速率。
表 4 杀虫主剂与单独球孢白僵菌或高效氯氰菊酯对蚜虫的毒力比较
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。 “--” 表示不处 理或不存在
实施例 8 球孢白僵菌与乐果复合杀虫剂对蚜虫的毒杀作用
试验用球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉， 含量为 1×1011 孢子 /g。农药乐果为江 苏腾龙生物药业有限公司生产的 40％乳油， 厂商推荐田间使用浓度为稀释 800-2000 倍。4 种复合杀虫剂均为球孢白僵菌 BBNS-J9-16 的孢子粉与乐果的混合物， 其中复合剂 C1 中每 9 9 克含 2×10 孢子和 1/25 克的乐果， 复合剂 C2 中每克含 0.4×10 孢子和 1/25 克的乐果， 9 复合剂 C3 中每克含 2×10 孢子和 1/37.5 克的乐果， 复合剂 C4 中每克含 0.4×109 孢子和 1/37.5 克的乐果。
在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜 Lipaphis erysimi。 分别配制以下各处理的溶液 或悬浮液 ： 1) 分别称取 1g 复合杀虫剂 C1、 复合杀虫剂 C2、 复合杀虫剂 C3 和复合杀虫剂 C4， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 9 稀释， 得到它们的稀释 1000 倍的稀释液 ； 2) 用 0.05％的吐温 80 水 6 溶液将菌株 BBNS-J9-16 的孢子粉配制成浓度梯度为 0.4×10 孢子 /mL 和 2×106 孢子 /mL 的孢子悬浮液， 即分别等同于复合杀虫剂 C1 和 C2 的 1000 倍的悬浮液中的白僵菌孢子含量 ； 3) 量取 1mL 40％的乐果乳油， 加水 99mL， 再按 1 ∶ 9、 1 ∶ 9 依次稀释， 得到 10000 倍的稀 释液， 即等同于复合杀虫剂 C1 和 C2 的 1000 倍稀释液中乐果的含量 ； 再按 2 ∶ 1 加水稀释 1 次， 即得到 15000 倍的稀释液， 即等同于复合杀虫剂 C3 和 C4 的 1000 倍的悬浮液中乐果的含 量。 分别取配制好的处理液 1mL， 用 Potter 喷雾塔均匀喷雾到蚜虫体上， 每次处理 100 只蚜 虫， 3 次重复 ； 将蚜虫置于 25℃温度下饲养养 7 天， 每天观察记录蚜虫死亡数量， 将死亡蚜虫 转移到洁净培养皿中， 保湿 3-5 天， 观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫 ； 根据蚜虫最终死 亡率和僵虫率， 评价菌株对蚜虫的作用。
结果见表 5， 证明球孢白僵菌与乐果复合剂能有效提高对蚜虫的毒杀死亡率和死 表 5 杀虫主剂与单独球孢白僵菌或乐果对蚜虫的毒力比较亡速率。
1 注： 为对照校正值， 以 “平均值 ± 标准差” 表示， 后缀字母表示差异显著性， 以同 2 列比较相同字母表示无显著差异， α ＝ 0.05 ；为死亡虫数中的僵虫比率。 “--” 表示不处理或不存在。10102363750 A CN 102363768
序列表1/1 页