一种 T-2 烯霉素的注射制剂 【技术领域】
本发明涉及一种抗肿瘤药物组合物， 特别涉及一种含 T-2 烯霉素的注射制剂。背景技术
T-2 烯霉素是由多种真菌产生的单端孢霉烯类物质。其结构式见下图 ：近年来国内外对 T-2 烯霉素开展了广泛的研究， 对 T-2 烯霉素的毒理学作用有了更加 全面的了解。
T-2 烯霉素具有较强的毒性作用， 可直接刺激皮肤和黏膜， 穿透上皮组织。该 毒素几乎可以影响所有亚细胞水平的活动。 据报道， T-2 烯霉素具有多重毒性作用机制， 如， 在机体内可诱导产生自由基， 从而引起细胞核谷胱甘肽硫转移酶活性降低 ； 能抑制小鼠的 胸腺、 骨髓和肝脏细胞 DNA 和蛋白的合成 ； 能与胞浆膜上的脂质分子和蛋白质结合， 进而影 响膜功能 ； 能抑制白细胞介素 -2 mRNA 合成酶， 从而使得该 mRNA 生成量减少 ； 能引起大鼠肝 脏 NADPH 细胞色素 c 和 NADH 细胞色素 b5 还原酶活性降低， 并伴随着脂肪过氧化能力和谷 胱甘肽脱氢酶系活性升高 ； 并能干扰大鼠肝脏细胞线粒体呼吸链的电子传递过程。
进一步的研究表明， T-2 烯霉素主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官， 如胸腺、 骨 髓、 肝、 脾、 淋巴结、 生殖腺及胃肠粘膜等， 抑制这些器官细胞蛋白质和 DNA 合成， 并可引起 淋巴细胞中 DNA 单链的断裂。对家猪、 家禽、 牛等动物的毒性相对较强， 对成年人的毒性作 用低于幼儿。经呼吸道吸入中毒报道很少， 主要是经口摄入后导致中毒。人类长期经口摄 入 T-2 烯霉素会出现流涎、 呕吐、 腹痛、 头痛、 头晕等症状。
最近研究表明， T-2 烯霉素虽然具有一定的毒性作用， 但也具有显著的广谱抗肿 瘤活性， 体外对癌症细胞具有极强的杀灭作用 , 纳克级的 T-2 烯霉素即可显著抑制白血病 K562 细胞株、 肺癌 NCI-460 细胞株、 肝癌 SMMC-7721 细胞株、 肺癌 A549 细胞株、 人脑胶质瘤 U251 细胞株、 结肠腺癌 LS174-T 及 LOVO 株等肿瘤细胞株的生长。 且对白细胞具有天然的靶 向性。裸小鼠体内实验表明， 将白血病 K562 细胞株接种至裸鼠皮下， 制成实体瘤模型后， 瘤 内注射给予 T-2 烯霉素 5mg/kg， 每日一次， 连续给药 5 天， 可使实体瘤组织细胞坏死分解。 化疗效果强于消化道一线化疗药物 5-FU。 T-2 烯霉素对消化道肿瘤有明确的化疗作用，
国内发明专利 CN200910019618.1（发明人厉保秋， 申请人山东大学， 公开公告日 2009 年 07 月 22 日， 公开公告号 CN101485653A） 、 CN200910019619.6 （发明人厉保秋， 申请人山东大学， 授权公告日 2011 年 2 月 2 日， 授权公告号 CN101513399B） 、 CN200910014633.7 （发 明人厉保秋， 申请人山东大学 , 授权公告日 2011 年 3 月 30 日， 授权公告号 CN101491518B） 、 CN200910019620.9（发明人厉保秋， 申请人山东大学， 授权公告日 2010 年 12 月 8 日， 授权 公告号 CN101485654B） 、 CN200910014627.1（发明人厉保秋， 申请人山东大学， 申请日 2009 年 3 月 3 日， 公开公告号 CN101491517A） 、 CN201010258665.4 （发明人厉保秋， 申请人山东大 学， 申请日 2009 年 3 月 3 日， 公开公告号 CN101940565A） 、 CN201010258681.3（发明人厉保 秋， 申请人山东大学， 申请日 2009 年 3 月 3 日， 公开公告号 CN101984963A） 、 201010258664. X （发明人厉保秋， 申请人山东大学， 申请日 2009 年 3 月 3 日， 公开公告号 CN101984962A） 和 CN201010258682.8（发明人厉保秋， 申请人山东大学， 申请日 2009 年 3 月 3 日， 公开公告号 CN101984964A） 已经分别公开了 T-2 烯霉素在治疗白血病、 骨癌及骨髓增生异常、 实体瘤、 前列腺癌、 胰腺癌、 脑肿瘤及肾细胞癌等癌症中的意图， 其中发明专利 CN200910014633.7 公开了一种 T-2 烯霉素的植入制剂， 用于治疗实体瘤， 具有理想的效果， 且可以避免 T-2 烯 霉素的毒性作用。
然而， T-2 烯霉素用于非实体瘤时， 无法采用瘤内埋植给药， 而口服或静脉注射给 药， 需要克服 T-2 烯霉素难溶于水、 生物利用度低、 口服或静脉注射给药存在副作用等问 题， 避免 T-2 烯霉素注射给药过程中对血管组织的刺激。 目前对于难溶于水、 生物利用度低、 给药后毒副作用较强的抗肿瘤药物， 多采用复 合溶剂系统提高药物生物利用度， 但助溶效果较好的溶剂如聚氧乙烯蓖麻油、 吐温 -80 等 均存在显著的刺激性。 因此目前倾向于将难溶于水、 生物利用度低、 给药后毒副作用较强的 抗肿瘤药物制备成环糊精包合物、 微球制剂等特殊制剂， 以此提高药物的生物利用度和靶 向性， 降低药物对给药局部或血管系统的刺激性， 但是糊精包合物、 微球制剂等特殊制剂制 备的药物， 价格显著高于普通制剂， 使得患者医疗费用负担加重。
因此， 制剂技术已经成为阻碍 T-2 烯霉素临床应用的关键技术。
发明内容 针对上述现有技术， 本发明提供了一种用于治疗肿瘤的 T-2 烯霉素注射制剂。具 体地说是一种 T-2 烯霉素注射液。
本发明的一方面提供了一种 T-2 烯霉素注射制剂， 所述 T-2 烯霉素注射制剂由 T-2 烯霉素和乙醇组成 ； 所述乙醇的用量为每 0.5mg~2mg T-2 烯霉素使用 1ml 乙醇 ； 所述乙醇的 纯度大于 99.4%。
本发明的另一方面提供了一种 T-2 烯霉素注射制剂， 所述 T-2 烯霉素注射制 剂由 T-2 烯霉素、 乙醇和增溶剂组成， 所述乙醇的纯度大于 98.0% ； 所述乙醇的用量为每 0.5mg~1mg T-2 烯霉素使用 1ml 乙醇 ； 所述增溶剂的用量为每 0.5mg~1.0mgT-2 烯霉素使用 0.5mg 增溶剂。
所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮、 柠檬酸、 聚乙二醇 400 中的一种或两种。
所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸。
所述 T-2 烯霉素注射制剂中所用聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸的重量比为 1:1。
本发明人在处方研究中， 惊奇的发现， 采用纯度大于 99.4% 的乙醇或采用纯度大 于 98.0% 的乙醇与某些助溶剂组成的复合溶剂作为 T-2 烯霉素注射制剂的溶媒和辅料， 制
成的 T-2 烯霉素注射液， 经静脉滴注或推注达到治疗剂量后， 其血管刺激性及对非肿瘤组 织的毒副作用显著降低。
组织分布研究进一步表明， 纯度大于 99.4% 的乙醇或采用纯度大于 98.0% 的乙醇 与某些助溶剂组成的复合溶剂作为 T-2 烯霉素注射液的溶媒和辅料， 静脉注射后， T-2 烯霉 素由血液系统向分裂旺盛的肿瘤组织分布的速度显著加快， 有利于提高 T-2 烯霉素的生物 利用度， 减轻其毒副作用， 且本制剂制备工艺简单， 利于工业化生产， 具备突出的实质性特 点和显著的进步。 附图说明 图 1 T-2 烯霉素阳性对照组器官病理图片。
图 2 T-2 烯霉素注射液静脉给药后在肿瘤及血液中含量比值变化图 在大鼠体内的组织分布。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明 ： 实施例 1 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 40mg 乙醇 （纯度 99.7%） 40ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 2 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 40mg 乙醇 （纯度 99.5%） 50ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 3 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 12mg 乙醇 （纯度 99.8%） 20ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 4 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 30mg 乙醇 （纯度 99.5%） 20ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。实施例 5 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 24mg 乙醇 （纯度 99.8%） 20ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 6 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 34mg 乙醇 （纯度 99.7%） 20ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 7 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 38mg 乙醇 （纯度 99.8%） 20ml 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素加到乙醇中， 搅拌使其充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。 实施例 8 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 20mg 乙醇 （纯度 98.6%） 22ml 聚乙二醇 400 19mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 聚乙二醇 400 混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分溶解后， 灭 菌、 分装、 保存即可。
实施例 9 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 10mg 乙醇 （纯度 99.1%） 19ml 聚乙二醇 400 4mg 柠檬酸 2mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 聚乙二醇 400 和柠檬酸混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分溶 解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 10 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 16mg 乙醇 （纯度 99.7%） 24ml
聚乙烯吡咯烷酮 6mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇和聚乙烯吡咯烷酮混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 11 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 30mg 乙醇 （纯度 99.7%） 36ml 聚乙烯吡咯烷酮 10mg 聚乙二醇 400 5mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 聚乙二醇 400 和聚乙烯吡咯烷酮混合， 搅拌使 T-2 烯霉 素充分溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 12 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 30mg 乙醇 （纯度 99.7%） 54ml 聚乙烯吡咯烷酮 8mg 柠檬酸 8mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分 溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。 实施例 13 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 30mg 乙醇 （纯度 99.7%） 34ml 聚乙烯吡咯烷酮 10mg 柠檬酸 10mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分 溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 14 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 30mg 乙醇 （纯度 99.7%） 42ml 聚乙烯吡咯烷酮 14mg 柠檬酸 14mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分
溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 15 T-2 烯霉素注射液的配制 组方 ： T-2 烯霉素 30mg 乙醇 （纯度 99.7%） 39ml 聚乙烯吡咯烷酮 9.5mg 柠檬酸 9.5mg 制备 ： 将处方量的 T-2 烯霉素、 乙醇、 柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合， 搅拌使 T-2 烯霉素充分 溶解后， 灭菌、 分装、 保存即可。
实施例 16 T-2 烯霉素注射液的毒性实验 KM 小鼠， 体重 30 g ～ 40g， 雌雄各半随机分为 7 组每组 20。实验组六组， 分别尾静脉注 射给予实施例 1、 5、 8、 9、 12、 14 所制注射液 （以 T-2 烯霉素 1mg/kg 体重剂量给药） ； 阴性对照 组尾静脉注射给予生理盐水 ； 阳性对照组尾静脉注射给予 T-2 烯霉素乙醇溶液 （乙醇浓度 为 95%， 按体积比计算 ； 以 T-2 烯霉素 0.5mg/kg 体重剂量给药） 。每日给药 1 次， 连续给药 7 天， 给药期间及给药后 1-7 天每日进行进行大体观察、 血液学、 血生化、 尿生化检查， 给药后 第 1、 3、 5、 7 天每天各组每天处死 5 只动物进行病理解剖， 光学显微镜下进行病理检查。 大体观察发现阳性对照组给药后呕吐发生率为 92%， 第 4 次给药后， 小鼠进食量显 著减少 ； 实验组呕吐发生率最高为 3%（实施例 8 所制静脉注射剂） ， 各实验组与对照组二者 相比均存在显著差异 （p<0.05） ， 且实验组呕吐症状相对较轻。提示阳性对照组药物对胃肠 道粘膜系统产生了较强的刺激。
实验过程中观察小鼠皮肤， 阳性对照组小鼠尾部、 腹部皮肤出现显著的出血性瘀 点， 眼睛出现充血症状， 实验组小鼠尾部、 腹部皮肤出血性瘀点显著少于实验组， 提示实施 例 1、 5、 8、 9、 12、 14 所制的 T-2 烯霉素注射液可显著减轻 T-2 烯霉素对血管组织的刺激。
实验结束处死各组小鼠， 取小鼠心脏、 肝脏、 肺脏、 脾脏及肾脏， 大体观察发现阳性 对照组小鼠肝脾肿大出血， 各器官制作病理切片， 显微镜下观察各组动物的病理变化。 结果 表明， 阳性对照组小鼠均存在不同程度的心肌出血及肝、 肺、 肾脏出血现象， 结果见图 1。实 验组未发现明显异常。提示 T-2 烯霉素注射液可减轻 T-2 烯霉素对血管及其它脏器的刺激 作用。
实施例 17 T-2 烯霉素注射液在荷瘤小鼠体内的组织分布实验 C-57 小鼠 4-6 周龄， 体重 15-25g， 雄性， 将 Lewis 肺癌细胞， 接种于实验小鼠右前肢根 7 部腹侧皮下， 每只接种 2.0×10 个肿瘤细胞， 总体积 0.20ml。2 周后肿块长大， 用于实验。
将荷瘤小鼠随机分为 4 组， 实验组单次尾静脉注射给予实施例 1 所制的 T-2 烯霉 素注射液 （以 T-2 烯霉素 0.5mg/kg 体重剂量给药） 。阳性对照组尾静脉注射给予 T-2 烯霉 素乙醇溶液 （乙醇浓度为 95%， 按体积比计算 ； 以 T-2 烯霉素 0.5mg/kg 体重剂量给药） 。各 组动物每日给药 1 次， 连续给药 3 天。给药后第 1、 2、 8、 12、 16、 24 小时每组 5 只小鼠， 采血 后， 处死， 取出肿瘤组织， 测定血浆及肿瘤组织 T-2 烯霉素的相对含量， 计算肿瘤组织中 T-2 烯霉素含量与血浆中 T-2 烯霉素含量的比值 [T=（肿瘤组织中 T-2 烯霉素含量） /（血浆中 T-2 烯霉素含量） ， 结果见图 2。
由图 2 可见， T-2 烯霉素注射液静脉注射给药后可显著提高 T-2 烯霉素在肿瘤组织 的分布， 且能够使肿瘤组织中 T-2 烯霉素维持在高浓度大 40 小时。而 T-2 烯霉素乙醇溶液 静脉注射给药后 T-2 烯霉素在肿瘤组织的分布较低。提示 T-2 烯霉素注射液可以提高 T-2 烯霉素生物利用度， 并可改善 T-2 烯霉素的组织分布。
实施例 18 T-2 烯霉素注射液的稳定性实验 对实施例 1、 3、 7、 11、 14 所得 T-2 烯霉素注射液进行稳定性实验。
(1) 强光照射试验 ： 将 T-2 烯霉素注射液在 4 000 lx 光照下分别放置 5 天 和 10 天后进行观测 , 结果发现 , 与放置前相比 , 注射剂仍保持澄清透明。
(2) 高湿度试验 ： 将 T-2 烯霉素注射液放在密闭器皿中分别于 25 % 、 75% 及 92 .5 % 相对湿度条件下放置， 5 天和 10 天后考察稳定性。与放置前相比 , 静脉注射剂仍保 持澄清透明 , 未见药物析出。
(3) 高温试验 ： 将 T-2 烯霉素注射液放在密闭器皿中并分别置于 40 、 60 、 80 ℃ 条件下， 5 天和 10 天后考察稳定性。与放置前相比 , 仍保持澄清透明 , 未见药物析出。
(4) 加速试验 : 将 T-2 烯霉素注射液 4000rpm 离心 10 min, 仍保持澄清透明 , 未 见药物析出。
(5) 常温留样考察 : 将 T-2 烯霉素注射液在温度 25℃ 、 相对湿度 75 % 条件下分 别放置 1、 2、 3 、 6、 12、 24 月 , 仍保持澄清透明 , 未见药物析出。
因 T-2 烯霉素本身在光照和高温条件下， 能够稳定存在。因此， T-2 烯霉素注射液 的稳定性实验主要是观察 T-2 烯霉素在选定的溶剂系统中， 在强光、 高温、 高湿等条件下， 是否会出现药物析出等制剂问题。由实验结果可见， T-2 烯霉素注射液稳定性较强， 符合制 剂技术要求， 即使在高湿条件下， 仍能稳定存在一定时间。
实施例 19 T-2 烯霉素体外细胞毒及对肿瘤细胞生长的抑制作用 （1） 细胞 正常细胞 ： L929( 小鼠成纤维细胞 )、 CHL（仓鼠肺细胞） 人肿瘤细胞系 ： MCF-7( 乳腺癌 )、 HepG-2（肝癌） 、 K562（白血病） 、 A549（肺癌） 、 U251( 人 脑胶质瘤 )、DU145（前列腺癌） 、 RPMI8226（多发性骨髓瘤） 。
（2） 阳性对照 ： 注射用丝裂霉素 （3） 方法 ： 采用细胞毒类抗肿瘤的 “磺酰罗丹明染色法 （SRB 法） 检测。
供试品配制 ： 取 T-2 烯霉素注射液 1ml， 加入 9ml DMSO， 配制成浓度为 0.5mg/ml 的溶液， 再用 RPMI 1640 完全培养基稀释为 0.025ng/ml、 0.25ng/ml、 2.5ng/ml、 25ng/ml、 250ng/ml、 2500ng/ml、 25000ng/ml 的使用浓度。
细胞培养 ： 将细胞复苏后用细胞所需相应完全培养基置 37℃， 5%CO2 培养箱中培 养、 传代， 培养至对数生长期。
细胞接种 ： 将培养至对数生长期的细胞用 0.25% 胰酶消化， 加完全培养基吹打成 细胞悬液， 取少许细胞悬液加等量 0.4% 台盼蓝染液染色后显微镜下计数， 贴壁细胞调整浓 5 5 度至 2×10 个 /ml， 悬浮细胞调整浓度至 5×10 个 /ml， 以 100µl/ 孔接种于 96 孔板， 置 37℃， 5%CO2 培养箱中培养 24 小时。
受试物处理细胞 ： 实验组每孔加入 100µl 各浓度的供试品液， 阴性对照加入等量 的完全培养基， 空白对照为不加细胞的完全培养基， 每组设 6 个平行， 置 7℃， 5%CO2 培养箱中继续培养 24 小时。
贴壁细胞检测 （SRB 法） ： 细胞培养 24h 后， 取出培养板， 于每孔加入 50µl 预冷的 50% 三氯乙酸 （TCA） ， 终浓度为 10%， 板置 4℃ 1 小时。取出用蒸馏水洗 5 遍， 除去三氯乙酸、 培养液、 低分子量代谢物、 血清蛋白， 空气中干燥。待完全干燥后每孔加入 1% 的醋酸配制的 0.4% 的 SRB100µl， 室温下染色 15 分钟～ 30 分钟。倒掉染液， 用 1% 醋酸洗 5 次， 去除未结 合的染料， 空气中干燥后用 pH 10.5 的 10mmol/L 的非缓冲 Tris 碱液 150µl 溶解。在平板 振荡器上震荡 5min， 于波长 490nm 处， 酶联免疫监测仪测定各孔的光吸收值。 记录数值得出 各浓度细胞的生长抑制率， 运用 SPSS13.0 软件得出 IC50 值。
悬浮细胞检测 （SRB 法） ： 细胞培养 24 小时后， 取出培养板， 于每孔加入 50µl 预冷 的 80% 三氯乙酸 （TCA） ， 终浓度为 16%， 静置 5 分钟， 板置 4℃ 1 小时。取出用蒸馏水洗 5 遍， 除去三氯乙酸、 培养液、 低分子量代谢物、 血清蛋白， 空气中干燥。 待完全干燥后每孔加入 1% 的醋酸配制的 0.4% 的 SRB100µl， 室温下染色 15 分钟～ 30 分钟。倒掉染液， 用 1% 醋酸洗 5 次， 去除未结合的染料， 空气中干燥后用 pH 10.5 的 10mmol/L 的非缓冲 Tris 碱液 150µl 溶 解。在平板振荡器上震荡 5min， 于波长 490nm 处， 酶联免疫监测仪测定各孔的光吸收值。记 录数值得出各浓度细胞的生长抑制率， 运用 SPSS13.0 软件得出 IC50 值。
（4） 结果 T-2 烯霉素对正常细胞抑制作用的抑制率及 IC50 值 ： 表 1 T-2 烯霉素对肿瘤细胞抑制作用的抑制率及 IC50 值肿瘤细胞 A549( 肺癌 ) HepG-2( 肝癌 ) U251( 人脑胶质瘤 ) DU145( 前列腺癌 ) MCF-7( 乳腺癌 ) K562( 白血病 ) RPMI8226（多发性骨髓瘤） IC50 值 （ng/ml） 158.68 210.41 384.02 1551.21 1335.56 11.59 1083.95T-2 体外细胞毒性实验表明， ng 级水平即可明显抑制细胞生长 ； IC50 低于 100ng/ml 细 胞株为白血病 K562 株。而丝裂霉素达到对细胞生长明显抑制作用时需达到 2×105ng/ml。