吡唑并嘧啶酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途.pdf

本发明公开了式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于医药领域。经药理实验证明式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物对人肝癌细胞HepG2和人前列腺癌细胞PC-3等肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用，而这种增殖抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡而实现。吡唑[3，4-d]嘧啶-4-酮衍生物作为主要活性成分制备得到新的抗肿瘤药物，为肿瘤的治疗提供了新的选择。

1.  式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途：

其中，R₁为氢、C1-C4烷基、溴、氯、氟或甲氧基；R₂为氢、C1-C4烷基、溴、氯、氟或甲氧基。

2.  根据权利要求1所述的用途，其特征在于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁为氢、C1-C4烷基或甲氧基；R₂为氢、C1-C4烷基或甲氧基。

3.  根据权利要求2所述的用途，其特征在于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁为氢或C1-C4烷基；R₂为氢或C1-C4烷基。

4.  根据权利要求3所述的用途，其特征在于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁与R₂均为氢。

5.  一种抗肿瘤药物，其特征在于是由式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。

6.  根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁为氢、C1-C4烷基或甲氧基；R₂为氢、C1-C4烷基或甲氧基。

7.  根据权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的中的R₁为氢或C1-C4烷基；R₂为氢或C1-C4烷基。

8.  根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的中的R₁与R₂均为氢。

吡唑并嘧啶酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及吡唑并嘧啶酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤已成为危害人类健康和生存的重要杀手，特别是近年来，随着环境的恶化，恶性肿瘤的发病率已出现明显的上升趋势。尽管随着新一代化疗药物如紫杉醇、吉西他宾、格力卫等的应用，患者的生存获得一定益处，但大多数癌症患者的预后仍较差，死亡率高，典型的如肝癌和前列腺癌等。因此，研发新型，特别是具有崭新母体结构的抗肿瘤药物或从已报道的化合物中筛选出新的抗肿瘤药物已成为当务之急。
具有下式结构的化合物是一类吡唑并嘧啶酮衍生物，

其中，具有代表性的是2-((4-oxo-1-phenyl-4，5-dihydro-1H-pyrazolo[3，4-d]pyrimidin-6-yl)methylthio)quinazolin-4(3H)-one，其相对分子质量为402.44，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。目前为止，还未见关于式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物在医药方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供式I所示结构的吡唑并嘧啶酮衍生物(吡唑[3，4-d]嘧啶-4-酮衍生物)在医药领域的新用途，尤其是在制备抗肿瘤药物中的用途。

其中，R₁为氢、C1-C4烷基、溴、氯、氟或甲氧基；R₂为氢、C1-C4烷基、溴、氯、氟或甲氧基。
进一步的，式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁为氢、C1-C4烷基或甲氧基；R₂为氢、C1-C4烷基或甲氧基。
优选的，式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁与R₂均为氢。
本发明的另一个方面是提供了一种抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物是由式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物作为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。
进一步的，上述式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁为氢、C1-C4烷基或甲氧基；R₂为氢、C1-C4烷基或甲氧基。
优选的，式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物中的R₁与R₂均为氢。
本发明的有益效果在于，创造性地发现式I所示的吡唑并嘧啶酮衍生物具有好的抗肿瘤作用，能用于制备抗肿瘤药物组合物，并通过实验表明其很可能是通过导致肿瘤细胞凋亡起到抗肿瘤作用。为抗肿瘤药物制备领域提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。
附图说明
图一为本发明中吡唑并嘧啶酮衍生物对人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制实验结果。
图二为本发明中吡唑并嘧啶酮衍生物对人前列腺癌细胞株PC-3的增殖抑制实验结果。
以下结合附图通过对具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
具体实施方式
实施例一吡唑并嘧啶酮衍生物抑制肿瘤的实验
一、吡唑并嘧啶酮衍生物的来源及理化性质
本发明具体实施方式中使用的一种吡唑并嘧啶酮衍生物结构式如式II所示，购买自荷兰Specs公司(Specs，荷兰)，相对分子质量为402.44，

该吡唑并嘧啶酮衍生物为浅黄色粉末，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。
其化学名为：
2-((4-oxo-1-phenyl-4，5-dihydro-1H-pyrazolo[3，4-d]pyrimidin-6-yl)methylthio)quinazolin-4(3H)-one。
中文名：
2-(4-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶基-6)甲硫基-4(3H)-喹唑啉酮。
二实验材料
1、主要试剂
RPMI-1640、DMEM、胎牛血清、胰酶等购自Gibco BRL公司(Invitrogen Corporation，USA)，溴化噻唑蓝四唑(MTT)、碘化丙啶(PI)、二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司(USA)产品。式II所示的吡唑并嘧啶酮衍生物购自荷兰Specs公司，为化学标准品，体外实验时用DMSO配制成10mg/ml储存液，置4℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。
2、细胞系及培养
本实验所用的人肺癌细胞株(A549)，人肝癌细胞株(HepG2)，人前列腺癌细胞株(PC-3)，人乳腺癌细胞株(MCF-7和MDA-MB-231)，小鼠结肠癌细胞株(CT26)，小鼠Lewis肺癌细胞株(LL2)，小鼠乳腺癌细胞株(4T1)和小鼠肝癌细胞株(HEPA1-6)购于美国ATCC公司，常规保存。HepG2细胞及LL2细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基、5％CO₂、37℃培养。PC-3细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、CT26细胞、4T1细胞、HEPA1-6细胞及A549细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基、5％CO₂、37℃培养。
三实验方法和结果
1统计学方法
实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS 13.0统计软件处理。计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2细胞增殖抑制实验
2.1实验方法(MTT法)
用完全培养液调整细胞浓度为2×10⁴/mL，接种于96孔板，每孔200μL，培养过夜，次日分别用不同剂量的吡唑并嘧啶酮衍生物(终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.16μg/ml)处理细胞，同时等体积的溶剂对照组，DMSO浓度为0.1％(0.1％的DMSO对细胞增殖没有影响)。每个设5个复孔，37℃，5％ CO₂培养。分别于培养48小时后，取1个培养板，每孔加入5mg/mL MTT试剂20μL，继续培养2～4h，弃上清，再加DMSO150μL，振荡混匀15min，用酶标仪(λ＝570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值。相对细胞增殖抑制率(％)＝(对照组A₅₇₀-实验组A₅₇₀)/对照组A₅₇₀×100％。实验至少重复3次(因溶剂对照组无细胞增殖抑制作用，故这里的对照组是指溶剂对照组)。为了观察吡唑并嘧啶酮衍生物细胞增殖抑制作用是否有时间依赖性，进一步进行吡唑并嘧啶酮衍生物作用HepG2细胞和PC-3细胞72小时细胞增殖抑制试验，试验处理方法同上。
2.2吡唑并嘧啶酮衍生物对细胞增殖抑制实验结果
不同浓度吡唑并嘧啶酮衍生物作用不同细胞后，随药物浓度增大，细胞增殖抑制越明显，各剂量组与对照组相比，细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)  (结果见表1)。吡唑并嘧啶酮衍生物处理A549、HepG2、MCF-7、MDA-MB-231细胞及PC-3细胞48h的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.90μg/ml、5.62μg/ml、17.02μg/ml、5.79μg/ml、10.7μg/ml及35.42μg/ml。吡唑并嘧啶酮衍生物处理LL2细胞、CT26细胞、4T1细胞及HEPA1-6细胞48h的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为1.51μg/ml、0.79μg/ml、2.25μg/ml及2.01μg/ml。
不同浓度吡唑并嘧啶酮衍生物作用HepG2及PC-3细胞不同时间，细胞抑制率随作用时间逐渐升高(结果见图1和图2)。各剂量组与对照组相比，相对细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)。吡唑并嘧啶酮衍生物处理HepG2及PC-3细胞48h和72h的半数抑制浓度(IC₅₀)分别约为2.14μg/ml、5.62μg/ml及10.7μg/ml、1.02μg/ml。细胞增殖抑制试验结果显示吡唑并嘧啶酮衍生物能显著性抑制各种不同组织来源的肿瘤细胞的增殖。

3流式细胞仪分析检测细胞凋亡
3.1实验方法
取对数生长期的HepG2细胞和PC-3细胞，按每孔1×10⁵个细胞接种于6孔板中，培养24小时后，加入吡唑并嘧啶酮衍生物，使其终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625μg/ml，每个剂量组设3个复孔，37℃，5％CO₂培养。培养72小时后，收集不同处理组和对照组的细胞，用4℃预冷的PBS洗涤3次，加入70％冷乙醇固定细胞。离心之后加入含RNase的PI染料，半小时后上流式细胞仪检测。
3.2实验结果
HepG2和PC-3细胞经吡唑并嘧啶酮衍生物作用后经流式细胞仪检测时发现，在G0/G1期峰前出现一亚二倍体，使用凋亡程序软件去除细胞碎屑后分析确认其为凋亡峰，此峰随药物浓度增大而升高呈现出较明显的剂量依赖性。处理组和对照组相比有显著性差异(P＜0.05)(结果见表2)，提示吡唑并嘧啶酮衍生物对HepG2和PC-3细胞的增殖抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡而实现。
表2吡唑并嘧啶酮衍生物对不同细胞株的诱导凋亡比例(％)