IL-1Ra 的新用途及其肿瘤治疗药物组合药盒 【技术领域】
本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 IL-1Ra 的新用途及其肿瘤治疗药物组合药盒。 背景技术 近年来， 随着医学的进步， 现代人类的平均寿命增长至 80 岁， 肿瘤的发病率明显 增高。肿瘤与心脑血管病成为人类健康的两大杀手， 肿瘤的高发病率和高致死率成为威胁 人类健康的重要因素。
随着对肿瘤发病机制的研究， 人们对肿瘤有了进一步的认识。 研究表明， 肿瘤细胞 为生长失控的异常细胞， 会由肿瘤原发部位迁移至其它部位， 如果不能够控制肿瘤的这种 扩散作用， 肿瘤将侵犯人体的重要器官， 引起器官衰竭， 最终导致死亡。目前临床上治疗肿 瘤的常用方法有外科手术切除肿瘤、 放射治疗、 化学治疗和中医治疗等。 鉴于肿瘤是一种全 身性的疾病， 单纯依靠切除肿瘤的治疗效果往往不够理想。 据有关资料表明， 肿瘤病人确诊 时， 仅有三分之一左右的病人适宜通过手术而治愈。绝大多数病人确诊时已处于癌症中晚
期， 需要辅以放射治疗和 ( 或 ) 化学药物治疗， 因此放化疗是当前恶性肿瘤治疗和预防复发 的重要手段。但是放化疗 “敌我不分” ， 对细胞缺乏选择性， 在杀死肿瘤细胞的同时， 同样杀 伤正常细胞， 因而放化疗虽然是肿瘤治疗的重要方法， 但仍具有严重的毒副作用 [4]。
放射治疗和 ( 或 ) 化学药物治疗的主要副作用是免疫功能抑制和骨髓造 血 抑 制， 大 部 分 化 疗 药 物， 如 环 磷 酰 胺、 5- 氟 尿 嘧 啶、 5- 氮 杂 胞 苷 (5-azacytidine or5-azacitidine， 5-Aza) 等化疗药物会引起胸腺免疫器官的急性损伤以及外周免疫功能 的下降， 这直接限制了化疗的应用， 并且化疗后病人处于免疫功能缺失的状态下， 导致感染 几率增加。 若病人在化疗后无法恢复正常水平的免疫功能， 那么病人罹患各种免疫性疾病、 病毒与细菌的感染、 以及癌症复发的几率会大大增加。
胸腺为机体的重要免疫器官， 是 T 细胞发育的场所。胸腺 T 祖细胞来源于骨髓， 其表面标志为 CD3 CD4 CD8 (triple negative， TN)， 具有分化为 T 细胞、 树突状细胞或自然 杀伤细胞的能力， 它在胸腺中经历了从皮质到髓质的复杂分化过程。TN 细胞在胸腺中与 微环境复杂的细胞组分相作用， 获取 CD3 分子， 成为 CD4-CD8- 双阴性 (double-negative， DN) 细胞。TN 细胞与 DN 细胞都属于早期的 pre-T 细胞。随后， DN 细胞在依次经过 DN + + + + I(CD44 CD25 )、 DN II(CD44 CD25 )、 DN III(CD44 CD25 )、 DN IV(CD44-CD25-) 四个阶段发育 为 CD4、 CD8 双阳性细胞 (CD4+CD8+double-positive， DP)。皮质中的 DP 细胞经过 T 细胞受 体 (T-cell antigen receptor) 基因重排， 完成阳性选择 (positive selection， PS) 和阴 性选择 (negative selection， NS)， 发育为 CD4 单阳性或 CD8 单阳性 (single-positive， SP)naive T 细胞， 被输送到外周， 作为辅助 T 细胞或杀伤性 T 细胞发挥免疫功能。
“白细胞介素 -1 受体拮抗剂” (interleukin-1 receptor antagonist， IL-1Ra)， 与 IL-1α、 IL-1β 三者共同属于 IL-1 家族成员。IL-1Ra 是 IL-1α、 IL-1β 共同的拮抗剂， 它 可竞争性的抑制 IL-1 与其受体 IL-1RI 结合， 阻滞在多个组织和器官中表达 IL-1 的生物活性。IL-1Ra 临床上用于类风湿性关节炎、 败血症等疾病。人和小鼠的 IL-1Ra 有 77％的同 源性， IL-1Ra 的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的 IL-1Ra 分子量的差异主要 由糖基化程度不同所致。已证实， 糖基化对 IL-1Ra 生物学活性无影响 (R Daig， G Rogler， E Aschenbrenner， et al.Gut2000(46) ： 350-358)。 发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决肿瘤放射治疗和 / 或化学治疗过程中免疫 功能抑制副作用问题。
为此， 本发明公开了一种如下 (a) 或 (b) 的蛋白在制备用于治疗或保护放疗和 ( 或 ) 化疗药物导致的胸腺急性损伤、 胸腺淋巴细胞损伤和 ( 或 ) 外周 T 淋巴细胞减少的药 物中的用途 ：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所述的蛋白 ；
(b) 至少与 (a) 中的氨基酸序列 70％同源性且具有放疗和 ( 或 ) 化疗药物导致的 胸腺急性损伤、 胸腺淋巴细胞损伤和 ( 或 ) 外周 T 淋巴细胞减少活性的蛋白。
在一些实施例中， 所述胸腺淋巴细胞为胸腺 T 细胞， 胸腺 T 细胞可为 DN T 细胞、 DP T 细胞、 CD4 SP T 细胞或 CD8 SP T 细胞。所述外周 T 淋巴细胞为 CD4+CD45RA+T 细胞和 CD8+CD45RA+T 细胞。
在一实施例中， 所述 (b) 的蛋白为氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所述的蛋白。
在一些实施方式中， 所述化疗药物可选自烷化剂类药物、 抗代谢类药物、 抗生素类 药物、 植物类药物、 激素类药物、 金属络合物、 或蛋白药物， 其中优选为抗代谢类药物。
另一方面， 本发明公开了一种药物组合物， 其含有作为活性成分的上述蛋白和药 学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方式中， 所述药物组合物的制剂为肠外给药制剂， 所述肠外给药制剂 可为注射剂或注射用无菌粉末。
另一方面， 本发明公开了一种肿瘤治疗药物组合药盒， 其包括肿瘤化疗药物制剂 和本发明所述药物组合物的制剂。
另一方面， 本发明公开了上述蛋白作为活性成分可治疗或预防放疗或 / 和化疗药 物导致的胸腺急性损伤和 / 或免疫功能抑制副作用的方法， 该方法包括给予个体有效剂量 的上述蛋白。
另一方面， 本发明还公开了一种治疗肿瘤的方法， 该方法包括在放疗或 / 和化疗 药物前， 给予个体有效剂量的上述蛋白。
本发明所述蛋白的新用途可有效地降低治疗或预防放疗或 / 和化疗药物导致的 胸腺急性损伤和 / 或免疫功能抑制副作用， 将可能为今后临床肿瘤的治疗提供新的选择。 附图说明
图1： 胸腺中 T 细胞的发育过程示意图 ；
图2： 重组人白细胞介素 -1 受体拮抗剂 (recombinant human interleukin-1 receptorantagonist， rHuIL-1Ra) 对 5-Aza 化疗导致的胸腺损伤的保护作用 ；
图3： 5-Aza 化疗后不同时间小鼠胸腺的 H&E 染色图 ( 低倍镜 ) ；图4： 5-Aza 化疗后第 7 天小鼠胸腺切片 H&E 染色图 ( 高倍镜 ) ； 图5： rHuIL-1Ra 对 5-Aza 化疗导致的胸腺指数损伤的保护作用 ； 图6： rHuIL-1Ra 对 5-Aza 化疗导致的胸腺细胞总数损伤的保护作用 ； 图7： 胸腺细胞增殖的检测 ；具体实施方式
在 本 文， 术语所述 “白 细 胞 介 素 -1 受 体 拮 抗 剂” (interleukin-1 receptor antagonist， IL-1Ra)， 与 IL-1α、 IL-1β 三者共同属于 IL-1 家族成员。IL-1Ra 是 IL-1α、 IL-1β 共同的拮抗剂， 能拮抗 IL-1 与其受体 interleukin-1 receptor I(IL-1RI) 的结合， 并抑制 IL-1 的生物学活性。人成熟形式的 IL-1Ra(hIL-1Ra) 的氨基酸序列如 SEQ IDNO.1 所述， 人和小鼠的 IL-1Ra 有 77％的同源性， IL-1Ra 的生物学作用没有种属特异性。不同细 胞产生的 IL-1Ra 分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实， 糖基化对 IL-1Ra 生 物学活性无影响 (R Daig， G Rogler， E Aschenbrenner， et al.Gut 2000(46) ： 350-358)。
本发明的所述蛋白质优选该物质是 hIL-1Ra 蛋白质及其突变体 ； 其功能性活性片 段或其类似物 ； 具有高度同源性的同系物以及编码包含 SEQ ID NO.1 描述的氨基酸序列的 蛋白质的载体例如 DNA 载体 ( 质粒或病毒 )。功能性活性片段或类似物可通过添加、 插入、 修饰、 取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。 术语 “类似物” 也包括嵌合蛋白质、 融合蛋白、 抗独特型抗体、 上述化合物的前体和 其它功能等效物或模拟物。也包括模拟 IL-1Ra 结合蛋白活性的合成体。
术语 “突变体” 是指氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所述 hIL-1Ra 的突变体。相比于 天然的 IL-1Ra 蛋白， 该突变体与它们野生型相比， 具有增强的活性和 / 或改变了的立体专 一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、 或通过体外合成所需多肽来制备。 这些突变体包括， 例如缺失、 插入或替换该氨基酸序列中 的残基。可以通过缺失、 插入和替换的组合以得到最终的构建体， 提供最终的蛋白产品。
蛋白的同源性百分比由 GAP(Needleman 和 Wunsh， 1970) 分析 (GCG 程序 ) 确定， 其 中参数 gap creation penalty ＝ 5， gap extension penalty ＝ 0.3。被分析的序列长度 至少为 15 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 15 个氨基酸的区域进 行测试。更优选地， 被分析的序列长度至少为 50 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两 个序列的至少为 50 个氨基酸的区域进行测试。更优选地， 被分析的序列长度至少为 100 个 氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 100 个氨基酸的区域进行测试。更 优选地， 被分析的序列长度至少为 250 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至 少为 250 个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地， 被分析的序列长度至少为 500 个氨基 酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 500 个氨基酸的区域进行测试。
本发明涉及的方面还包括 IL-1Ra 蛋白类似物， 在它们合成期间或合成后进行了 不同的修饰， 例如， 通过生物素化、 苄基化、 糖基化、 乙酰化、 磷酸化、 由已知保护 / 封闭基团 的衍生作用、 蛋白水解的切割作用、 连接到抗体分子或其它细胞配体上等。 这些修饰可以用 来增加本发明 IL-1RA 蛋白的稳定性和 / 或生物活性。
药物组合物
用于本发明或者含有本发明所述蛋白的药物组合物。通常， 当本发明药物组合物
用于上述用途时， 所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给 药途径的药物剂型， 如片剂、 胶囊、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液剂、 口服液、 醑剂、 酊剂、 气雾 剂、 粉雾剂、 注射剂、 注射用无菌粉末、 栓剂等。
“药学上可接受的” 成分是适用于人和 / 或动物而无过度不良副反应 ( 如毒性、 刺 激和变态反应 ) 即有合理的效益 / 风险比的物质。 “药学上可接受的载体” 是用于将本发明 的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、 悬浮剂或赋形剂。载体可 以是液体或固体。
本发明的蛋白可经过口服、 静脉内、 肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为 ： 片剂、 胶囊、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液剂、 醑 剂。固态载体包括 ： 淀粉、 乳糖、 磷酸氢钙、 微晶纤维素、 蔗糖、 白陶土、 微粉硅胶、 滑石粉、 低 取代羟丙基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括 ： 无菌水、 乙醇、 聚乙 二醇、 非离子型表面活性剂和食用油 ( 如玉米油、 花生油和芝麻油 )。在制备药物组合物 的过程中通常使用的佐剂包括 ： 调味剂、 着色剂、 防腐剂 ( 如羟苯烷基丁酯、 苯甲酸钠、 山梨 酸 ) 和抗氧化剂 ( 如维生素 E、 维生素 C、 焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯 )。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括 ： 注射剂、 注射用无菌粉末， 它们是将 药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括 ： 无菌 水、 乙醇、 甘油、 丙二醇、 聚乙二醇。此外， 还需加入抑菌剂 ( 如苯甲醇、 羟苯丁酯、 硫柳汞 )、 等渗调节剂 ( 如氯化钠、 葡萄糖 )、 助悬剂 ( 如羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素 )、 增溶剂 ( 吐 温 -80、 卵磷酯 )、 抗氧化剂 ( 如维生素 E、 维生素 C、 焦亚硫酸钠 ) 和填充剂 ( 如乳糖、 甘露 醇 )。
从易于制备和给药的立场看， 优选的药物组合物是固态组合物， 尤其是冻干粉针剂。 本发明的药物组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。 药物组合 物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体， 并适宜为单位剂量形式。本发明的 药物组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质， 该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本 发明物的活性形式。
本发明公开了一种肿瘤治疗药物组合药盒， 其包括肿瘤化疗药物制剂和本发明所 述药物组合物的制剂。
用途
公开了所述蛋白作为活性成分可以治疗或预防放疗或 / 和化疗药物导致的胸腺 急性损伤和 / 或免疫功能抑制副作用的方法， 该方法包括给予患者有效剂量的上述 (a) 或 (b) 所述的蛋白。
在一些实施方式中， 所述方法可通过化疗药物给药前给药方式、 放疗给药方式， 给 予患者有效剂量的上述 (a) 或 (b) 所述的蛋白。
“有效剂量” 或 “治疗量” 均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通 常， 有效量足以缓和、 改善、 稳定、 减慢或延迟疾病的进一步发展。
所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。 对大 部分大型哺乳动物而言， 每天施以有效成分的总剂量约为 0.01-1000mg。通常， 成人临床给 药量的范围为 0.01-200mg/ 日， 优选为 0.05-100mg/ 日。
在一些实施方式中， 所述化疗药物可选自烷化剂类药物、 抗代谢类药物、 抗生素类 药物、 植物类药物、 激素类药物、 金属络合物、 或蛋白药物， 其中优选为抗代谢类药物。抗代 谢类药物选自脱氧氟尿苷、 5- 脱氧氟尿苷、 氟脲苷、 丙硫氧嘧啶、 丁基氟尿嘧啶、 双喃氟啶、 5- 氟嘧啶醇、 磺巯嘌呤钠、 巯咪嘌呤、 6- 巯基嘌呤、 6- 氨基嘌呤盐酸盐、 甘氨硫嘌呤、 硫乌嘌 呤、 溶癌呤、 硫酸肼、 卫康醇、 亚丝醌、 芬可洛宁、 异优散酮、 抑素、 氯屈磷酸、 氯屈磷酸二钠、 环亮氨酸、 地查枸林、 甲黄酸地查枸林、 白瑞夸尔、 奥昔嘌醇、 澳马利特、 溴巴酸 ( 钠 )、 百利 德定、 溴脲苷、 氟脲己胺、 10- 乙基去氮氨蝶呤、 氟甲氨蝶呤、 二氧甲氨蝶呤、 5， 10- 双去氮四 氢叶酸、 甲满蝶呤、 丁巯嘌呤、 丁克他酰胺、 胱氮杂乌苷、 卡莫氟、 尿嘧啶替加氟、 戊稀吲哚、 硫若星、 优福定、 甲氧檗因、 甲酰溶肉瘤素、 氨 ( 基 ) 蝶呤、 氨蝶呤钠、 8- 氮鸟嘌呤、 二甲胺 腺苷、 ( 硝基 ) 咪唑硫嘌呤、 尿嘧啶、 巯甲脲嘧啶、 重氮丝氨酸、 雷替曲塞、 雷替曲占、 盐酸洛 拉曲克、 槐定碱、 甲酰四氢叶酸、 甲基四氢高叶酸、 唑来磷酸、 替莫唑胺、 比卡鲁胺、 门冬酰 胺酶、 左亚叶酸钙、 亚叶酸钙、 坤来斯巴、 三嗪苯酰胺、 曲麦克特、 曲马多、 氯巴比酸、 5- 重氮 脲嘧啶、 吡拉西坦、 托泊替康、 盐酸拓扑替康、 阿糖胞苷、 环胞苷、 羟基胍、 5- 氟尿嘧啶核苷、 5- 氟尿嘧啶脱氧核苷、 氟脲嘧啶脱氧核苷、 甘油柑碱、 阿垒可散、 异恶唑醋酸、 氨格鲁米特、 氨萘非特、 氯胞苷、 阿他美坦、 氮杂胞苷、 抗瘤氨酸、 脱氧氮杂胞苷、 右雷佐生、 克雷斯托、 克 尼斯他酸、 克拉利平、 克拉利宾、 加洛他滨、 吉西他滨、 伊巴他滨、 依诺他滨、 安西他滨、 地西 他滨、 氟西他滨、 卡培他滨、 依诺他滨、 咪唑他滨、 克兰非鲁、 卡拉酰胺、 卡唑酰胺、 卡巴萘醌、 偶氮苯溴丙胺、 姜黄素、 姜黄素二酮、 酮曲沙、 三甲曲沙、 斯泼古宁、 去氧斯泼古宁、 萘脲磷酸 胺、 氯化地特卡里、 磷酸氟达那苷、 氟苄噻酮、 藤黄酸、 戈舍瑞林、 氮枸岭、 海尼白瑞宁、 肌苷 二醛、 氯苯氨啶、 二溴甘露醇、 二溴卫矛醇、 柯替波斯地、 益若蓝精、 多潘、 美洛格瑞、 丙米腙、 迷托醌、 米托坦、 法扎拉滨、 氟达拉滨、 克拉屈滨、 戊糖苷、 苯来宁、 苯来美特、 磷嘧阿泽胺、 匹 毛尼唑、 聚烯瑞尼酸、 蝶酰天冬氨酸、 蝶酰三谷氨酸、 嘌米舌泊、 利波腺苷、 双曲秦、 裂裥多 糖、 溴茴丙烯酸钠、 氨偶氮苄、 曲丁磺酯、 三乙密胺、 三亚胺醌、 曲西瑞宾、 磷酸曲西瑞宾、 雷 藤素甲、 曲普瑞林、 九布洛唑、 优福定、 维他命 B-17、 威麦宁、 z- 氮杂腺苷、 扎西胞苷、 依匹 哌啶、 阿莫诺期、 阿多来新、 阿克罗宁、 阿拉诺新、 阿美蒽醌、 阿那曲唑、 阿那西戎、 阿那昔酮、 阿斯吲醒、 阿西维辛、 阿替韦啶、 艾多昔芬、 癌可萘、 昂究吉宁、 个鲁达卜辛、 抗瘤酮、 抗瘤酮 A-10、 阿沙芳、 芦笋精、 芥吲酸、 白瑞夸尔 ( 钠 )、 ( 盐酸 ) 必桑郡、 格拉司琼、 托烷司琼、 氮烯 咪胺、 恩丹西酮、 胸腺素、 曲马多、 甲磺酸伊马替尼、 双氯芬酸、 沙利度胺、 托氟杀星、 托瑞米 芬、 安溴索、 高乌甲素、 耐普等因、 胸腺肽、 氟他胺、 乙亚胺、 胺苯、 氧化新喹、 N- 甲基甲酰胺、 牢可达唑、 蒽甲硫脲、 奥昔舒仑、 氧化石蒜碱、 泊芬撒尔、 泊泽尼普定、 戊必罗尔、 螺氯丙醇、 原白头翁素、 佳代胞、 雷替尼卜定、 生索拉德、 素道霉素、 茄软酯碱、 亚胺醌、 斯替苯嘧啶、 泰 莫佐罗、 台多西隆、 硫奥里发新、 硝氨丫啶或安丫啶中的一种或多种， 其中最优选为 5- 氮杂 胞苷。
化疗药物给药剂量按照公知有效剂量给药， 如 5- 氮杂胞苷临床一般为静脉注射， 每次 1-2mg/kg， 1 次 / 日。
另一方面， 本发明还公开了一种治疗肿瘤的方法， 该方法包括在放疗或 / 和化疗 药物前， 给予个体有效剂量的上述蛋白。本发明的药物组合物还可与其它肿瘤疗法联合应 用， 如同时、 序贯或分别应用。本发明的药物组合物可包含有其它活性作用物。
以下结合具体实施例， 进一步阐明本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中， “rHuIL-1Ra” 、 “IL-1Ra” 为同一物质， 均为上文所指 “hIL-1Ra” 。
材料与方法
主要试剂
5- 氮杂胞苷 (5-Aza， Sigma 公司 )、 福尔马林溶液 (4％多聚甲醛 )、 细胞膜通透剂 (0.1％ Triton x-100/0.1％柠檬酸钠 /PBS pH 值 7.2 ～ 7.4)、 BrdU(Sigma 公司 )
实验动物
SPF 级 BALB/c 小鼠， 4 周， 雄性， 上海斯菜克实验动物中心。
实验方法
1、 5- 氮杂胞苷 (5-Aza) 腹腔注射 ：
1) 小鼠腹腔注射使用无菌一次性 1mL 注射器。
2) 腹腔注射时右手持注射器， 左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴， 另外三个手 指抓住小鼠的颈部， 使小鼠的头部向下。进针时从腹部一侧进针， 向腹中线方向进针约 1cm 后注射完药物， 缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头， 防止漏液。
3)5-Aza 注射剂量为 10mg/kg、 30mg/kg、 100mg/kg， 给药容积为 0.1-0.2mL。
2、 小鼠胸腺的获取与称重 ：
1) 胸腺位于胸腔前纵隔， 紧靠心脏， 呈灰白色， 分左、 右两叶。
2) 断颈处死小鼠， 投入盛有 100mL 的 75％酒精中浸透， 拎出后将小鼠仰面翻铺于 超净台上一个消毒医用托盘内的消毒纱布上引颈处死小鼠。
3) 用眼科镊小心捏起小鼠胸腔部的皮肤， 用眼科剪小心剪开皮肤， 并分离皮肤与 肌肉组织。在小鼠胸腔隔膜下向上剪断胸骨， 打开胸腔。
4) 轻轻拨开心脏， 注意不要刺破心脏或血管， 露出胸腺， 将胸腺及周围的组织剪 下， 置于干净的玻璃培养皿中。
5) 用无菌 PBS 轻轻冲洗胸腺组织， 在卫生纸上轻轻吸去胸腺表面的血液及其他液 体， 尽量吸净。
6) 用眼科剪小心去除胸腺表面的结缔组织与淋巴组织， 尽量去除干净后， 用精密 分析天平称重。
3、 胸腺指数 ：
胸腺指数＝胸腺重 (mg)/ 体重 (g)
4、 胸腺细胞总数 ：
1) 将胸腺置于干净的 200 目筛网上。筛网下置一干净的培养皿。
2) 加入 1-2mL 10％ FBS/RPMI 1640 培养基至筛网上
3) 用玻璃注射器的针栓在筛网上轻轻研磨胸腺， 直至无可见的块状胸腺组织。
4) 用 3-5mL 含 10％ FBS/RPMI 1640 培养基冲洗筛网， 尽量冲洗干净， 避免筛网上 有残留的胸腺细胞。10％ FBS/RPMI 1640 培养基流入筛网下方的培养皿中。
5) 收集培养皿中的胸腺细胞研磨液， 加入 15mL 无菌离心管中。
6)1600rpm 离心 5 分钟。
7) 用预冷的 0.5％ FBS/PBS 洗涤一次。8) 将细胞重悬于 2mL 5mM EDTA/PBS 中， 如有块状悬浮物， 尽量用枪头吹打均匀， 如若不能， 则弃去。
9) 取 10μL 胸腺细胞重悬液， 加入事先准备好的血细胞计数仪稀释液中， 上下颠 倒混匀。用血细胞计数仪进行检测。
5、 胸腺组织固定 ：
用预冷的 PBS 冲洗胸腺 ； 将冲洗后的胸腺放入新鲜配制的 4％多聚甲醛固定液中， 其中固定液体积应大于 10 倍的胸腺体积 ； 常温固定， 至少固定 24 小时 ； 每 1-2 星期更换固 定液， 可常温长时间保存。
6、 胸腺 T 细胞亚群增殖检验方法
如上 4 制备胸腺细胞重悬液， 加入 PE-CD4 和 PE-Cy5-CD8 抗体进行表面抗原标记 后， 用 2％多聚甲醛固定细胞， 0.1％ Triton X-100/0.1％柠檬酸钠透化细胞膜， 适宜浓度 DNase I 解开 DNA 双链 ；
胸腺细胞 FITC-BrdU 抗体染色后先经过前向角 (FSC) 和测向角散射光 (SSC) 分 析， 去除细胞粘连和细胞碎片， 分析选中的细胞群。FITC-BrdU 抗体染色可见细胞未增殖细 胞 (BrdU 阴性， BrdU ) 和增殖细胞 (BrdU 阳性， BrdU+) 区分明显， 选择 BrdU+/SSC 设门划定 增殖细胞， 通过同时分析 FL2-H 和 FL3-H 双通道， 检测胸腺细胞 CD4 和 CD8 表面抗原的分布。 下列实施例中， 对照组 (NS 或 control) 为腹腔注射生理盐水的小鼠组， 给药组 (rHuIL-1Ra 或 IL-1Ra) 为腹腔注射 rHuIL-1Ra 的小鼠组。
实施例 1.5-Aza 化疗对胸腺的损伤以及 rHuIL-1Ra 预防性给药对胸腺的保护
在化疗前 5 天连续注射 3mg/kg/ 天 rHuIL-1Ra， 在最后一次蛋白给药 24 小时内腹 腔注射 100mg/kg 5-Aza( 记为第 0 天 )， 在第 0 天 ( 注射 5-Aza 前 )、 1.5 天、 3 天、 7 天、 11 天、 14 天分别取对照组与给药组小鼠胸腺， 观察胸腺指数与胸腺病理切片 H&E 染色的变化。
实验结果表明， 5-Aza 对小鼠胸腺的毒副作用明显， 并引起化疗导致的胸腺损伤及 修复的过程。化疗后第 1.5 天、 3 天、 7 天， 对照组 (NS) 小鼠与给药组 (rHuIL-1Ra) 小鼠胸 腺指数急剧下降。 在第 3 天对照组小鼠胸腺指数为化疗前水平的 13.20％； 给药组为化疗前 水平的 22.86％， 比对照组胸腺指数高 82.22％， 显著高于对照组， 具有统计学意义 ( 双尾 T 检验， n ＝ 4-6)。在第 7 天， 对照组与给药组小鼠胸腺指数降低至最低点， 表明第 7 天为化 疗导致最严重的毒副作用时间点， 对照组小鼠胸腺指数为化疗前水平的 8.94％， 给药组为 20.09％， 比对照组高 136.1％， 显著高于对照组 ( 双尾 T 检验， n ＝ 4-6)。在第 7 天后小鼠 胸腺开始迅速恢复。 在第 14 天， 对照组小鼠胸腺指数上升至化疗前水平的 70.43％， 给药组 恢复至化疗前水平的 64.93％， 给药组与对照组间胸腺指数无显著差异 ( 图 2)。
对化疗后第 0 天、 1.5 天、 7 天、 11 天和 14 天的胸腺 HE 染色切片进行分析，
结果表明
(1) 在化疗前， 胸腺组织皮质、 髓质完整， 皮质厚且与髓质有清晰的分界线。 对照组 与给药组无显著差异 ( 图 3)。
(2) 在化疗第 1.5 天及第 7 天， 胸腺体积， 皮质、 髓质面积减小， 对照组 (NS) 胸腺 皮质髓质界限模糊， 给药组 (rHuIL-1Ra) 胸腺皮质髓质界限清晰。这表明胸腺皮质髓质在 5-Aza 注射后受损， 且 rHuIL-1Ra 对化疗中的胸腺起到了保护作用 ( 图 3， 图 4)。
(3) 在化疗后第 11 天和第 14 天， 通过切片观察胸腺组织皮髓质完整， 面积与厚度
逐渐恢复至化疗前水平， 且胸腺皮髓质界限清晰， 表明胸腺逐渐恢复 ( 图 3)。
通过 5-Aza 注射后小鼠胸腺指数与胸腺切片 H&E 染色图， 可知 5-Aza 化疗后的 0 至 7 天为小鼠胸腺的急性损伤期， 在损伤期胸腺重量急剧减小， 胸腺指数下降， 其中第 7 天 为胸腺损伤最为严重的时间点。 rHuIL-1Ra 预防性给药能够在小鼠胸腺的损伤期第 3 天、 第 7 天减少化疗对小鼠胸腺指数的减少， 并且在第 7 天能够减轻小鼠胸腺组织病理学的损伤， 表明 rHuIL-1Ra 能够减轻 5-Aza 化疗导致的小鼠胸腺损伤。
实施例 2.rHuIL-1Ra 预防性给药保护了胸腺损伤并促进其修复
实验动物为 4 周龄 BALB/c 雄性小鼠， 实验设生理盐水对照组与 rHuIL-1Ra 蛋白给 药组。rHuIL-1Ra 的给药剂量为 3mg/kg， 在化疗前 5 天每 12 小时注射一次， 注射方式为皮 下注射， 并以注射同体积无热源生理盐水 (NS) 的小鼠为对照组。在最后一次注射蛋白 24h 内， 腹腔一次性注射 5-Aza 100mg/kg。在第 0 天 ( 注射 5-Aza 前 )、 第 7 天、 第 11 天分别处 死一批小鼠， 检测小鼠胸腺指数、 胸腺细胞总数、 胸腺细胞亚群比例、 胸腺细胞增殖、 以及外 周血初始 T 细胞的变化。
2.1 rHuIL-1Ra 对胸腺指数与胸腺细胞总数的作用
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天 分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 处死后分离胸腺， 制备胸腺细胞悬液， rHuIL-1Ra 对胸 腺指数与胸腺细胞总数的保护作用与实施例 1 的实验结果相符合 ： (1) 化疗后第 7 天， 给药 组小鼠胸腺指数显著高于对照组 ( 图 5) ； (2) 化疗后第 7 天， rHuIL-1Ra 给药组小鼠胸腺细 胞总数显著高于对照组， 比对照组高 131.11％。第 11 天胸腺恢复期， rHuIL-1Ra 给药组胸 腺细胞总数显著高于对照组， 比对照组高 28.03％ ( 图 6)。 2.2 rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群的作用
试验方法 ：
1) 实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 处死后分离胸腺， 制备胸腺细胞悬液， 计数细胞浓 度。按照下表准备细胞 ：
表 .1 胸腺 T 细胞亚群表面抗原 CD4、 CD8 比例检测样品
2)2400rmp 离心 5min， 收集细胞。 3) 吸弃上清， 加入 50μL PBS/0.5％ FBS， 充分混匀使细胞重悬。 4) 根据样品分组， 分别加入相应抗体 ； 4℃避光孵育 30min。6) 加入 200μL PBS/0.5％ FBS 洗涤。
7)2400rmp 离心 5min， 收集细胞。
8) 弃上清， 加入 500μLPBS/0.5％ FBS 重悬细胞， 移入流式管中 4℃避光保存， 24h 内上机检测。
9) 统计学分析
A) 流式细胞仪检测 FITC 和 PE-Cy5 染色结果， 用 Cell Quest 软件分析， 计算胸腺 细胞 DN、 DP、 CD8 SP、 CD4SP 细胞比例。
B) 结果进行双尾 T 检验及方差分析， 以 p ＜ 0.05 为具有统计学差异， ** 代表 p ＜ 0.01， 为差异极显著。
试验结果 ：
以 细 胞 膜 表 面 抗 体 CD4、 CD8 将 胸 腺 细 胞 分 为 DN(CD4-CD8-)、 DP(CD4+CD8+)、 CD4SP(CD4+CD8-) 和 CD8SP(CD4-CD8+) 四个亚群。 CellQuest 软件分析流式细胞仪检测数据， 结果如表 2 所示。N 代表检测的小鼠只数。
表 2.5-Aza 化疗中 rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群分布的作用
结果表明 ：
根据以上实验结果， rHuIL-1Ra 蛋白预防性给药能够在化疗前以及化疗后改变小 鼠胸腺 T 细胞亚群的比例。
(1)rHuIL-1Ra 蛋白预防性给药在化疗前显著减少了小鼠胸腺 DN 细胞的比例 (p ＜ 0.05)。由于 DN 细胞在 T 细胞的发育中属于早期的 pre-T 细胞， 具有进一步分化为 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞的能力。此结果说明 rHuIL-1Ra 抑制了 DN 细胞的增殖从而减少了 DN 亚群细胞的数量。被抑制的 DN 细胞对化疗的敏感性降低， 因而在化疗后被保护的 DN 细 胞便能够继续分化为 CD4SP 和 CD8SP 亚群细胞， 并对免疫功能的恢复发挥重要的作用。
(2) 在化疗后第 7 天， rHuIL-1Ra 蛋白组小鼠 DN 亚群细胞的比例与对照组相比无 显著差异， 而 DP 亚群细胞比例显著高于对照组， 表明 DN 细胞分化为 DP 细胞增多或 DP 细胞 自身的增殖增多。同时， 给药组胸腺中的 CD4SP 和 CD8SP 亚群细胞显著低于对照组。胸腺 中 T 细胞发育分化为 CD4SP 和 CD8SP 亚群细胞后， 作为成熟的 T 细胞输送并定居至外周， 胸 腺中 CD4SP 和 CD8SP 细胞的减少， 存在两种可能， 其一为 CD4SP 和 CD8SP 细胞自身生成的减 少， 其二为 CD4SP 和 CD8SP 的生成并未减少， 而是进入了外周免疫系统， 究竟是哪种原因导 致了给药组 CD4SP 和 CD8SP 细胞的减少， 这需要对外周血初始 T 细胞数量的检测来验证。
(3) 在化疗后胸腺受损后恢复的第 11 天， 对照组与蛋白给药组小鼠的 DN、 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞均无显著性差异。
2.3 rHuIL-1Ra 对胸腺细胞增殖的作用
试验方法 ：
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天 分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只。小鼠腹腔注射 100mg/kg BrdU 溶液 (10mg/mL)， 分两 次注射， 每次间隔 1.5h ； 第一次注射 BrdU 3 小时后引颈处死小鼠， 取胸腺检测。 以流式细胞 术分析小鼠胸腺中增殖的细胞比例。细胞分析过程及 BrdU 检测示意图见图 7( 胸腺细胞增 殖的检测。(A) 胸腺细胞前向角 (FSC) 与侧向角 (SSC) 分析， 圈门 R1 去除细胞碎片与粘连。 (B)FL-1H 与 SSC 分析， 圈门 R2 分析 BrdU+ 细胞比例。(C)BrdU+ 细胞比例分析柱状图 )。
试验结果 ：
rHuIL-1Ra 对胸腺细胞增殖的作用如表 3 所示。 以双尾 T 检验比较统计学差异， 表 中结果以平均数 (Mean)± 标准误 (SEM) 表示。*p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01。N 代表检测的小 鼠只数。
表 3.rHuIL-1Ra 对胸腺细胞增殖的作用
结果表明 ：
以上结果说明， 注射 rHuIL-1Ra 后， 第 0 天对照组胸腺细胞增殖比例为 14.58％， 给 药组胸腺细胞增殖比例为 10.54％， 为对照组的 73.0％， 且统计差异极显著。给药组小鼠胸 + 腺 BrdU 阳性细胞 (BrdU ) 数低于正常小鼠， 表明 rHuIL-1Ra 抑制了正常小鼠胸腺细胞的增 殖， 该结果与 rHuIL-1Ra 对正常小鼠胸腺细胞周期的结果一致。
在化疗导致胸腺损伤最为严重的第 7 天， 对照组胸腺细增殖比例为 12.73 ％， 而 给药组胸腺细胞增殖比例为 15.59％， 比对照组高 22.5％， 具有统计学意义。在第 11 天， 对照组胸腺细胞增殖比例为 12.74 ％， 给药组胸腺细胞增殖比例为 17.86 ％， 比对照组高 + 40.2％， 且统计差异极显著。第 7 天与第 11 天， 给药组小鼠胸腺 BrdU 细胞数高于对照组， 表明在 5-Aza 化疗过程中， rHuIL-1Ra 的预防性给药可以促进胸腺损伤期与恢复期的细胞 增殖， 促进胸腺化疗后的恢复。
2.4 rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群增殖的作用
试验方法 ：
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天 分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 小鼠腹腔注射 100mg/kg BrdU 溶液 (10mg/mL)， 分两次 注射， 每次间隔 1.5 小时 ； 第一次注射 BrdU 3 小时后引颈处死小鼠， 取胸腺检测。流式细胞 术分析小鼠胸腺中胸腺 DN、 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞的增殖细胞比例。分析时胸腺细胞 经过前向角 (FSC) 和测向角散射光 (SSC) 分析去除细胞碎片， 并分析 FL2-H 和 FL3-H 双通 道， 将胸腺细胞根据 CD4 和 CD8 表面抗原的分布划分为 CD4SP、 CD8SP、 DP 和 DN 亚群。对每 一亚群分析 FL1-H 通道， 其中 FL1-H 通道高表达的细胞即为 BrdU+ 细胞 ( 增殖细胞 )。
试验结果 ：
rHuIL-1Ra 对胸腺 DN、 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞增殖的作用如表 4 所示。表中 结果以平均数 (Mean)± 标准误 (SEM) 表示。双尾 T 检验比较统计学差异， *p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01。N 代表检测的小鼠只数。
表 4.rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群增殖的作用
72.0％。从上述结果可知 rHuIL-1Ra 对正常小鼠胸腺细胞的增殖具有抑制作用。
(2) 化疗后第 7 天， 与对照组胸腺细胞增殖比例的结果相一致， 不同 T 亚群增殖比 例相比化疗前均显著下降。而给药组相比化疗前变化不大。rHuIL-1Ra 给药组 DN 亚群细胞 BrdU+ 细胞比例显著高于对照组， 为对照组的 189.4％； CD8SP 亚群细胞 BrdU+ 细胞比例显著 高于对照组， 为对照组的 219.0％。此结果说明 IL-1Ra 有效保护了胸腺细胞的增殖。
(3) 化疗后第 11 天， rHuIL-1Ra 给药组各 T 细胞亚群 BrdU+ 细胞比例均高于对 照组， 统计差异极显著。其中 DN 亚群细胞为对照组的 166.7 ％， DP 亚群细胞为对照组的 147.6％， 统计差异极显著 ； CD4SP 亚群细胞为对照组的 156.1％， 统计差异显著 ； CD8SP 亚群 细胞对照组的 179.5％， 统计差异极显著。此结果说明 IL-1Ra 有效促进了胸腺细胞在化疗 后恢复阶段的增殖。
根据上述结果， 在化疗前预防性给药 rHuIL-1Ra， 能够保护化疗导致的小鼠胸腺损 伤， 并在胸腺恢复期促进小鼠胸腺细胞的增殖。本部分实验结果表明， 具体到胸腺 T 细胞各 亚群当中， rHuIL-1Ra 能够抑制正常小鼠 DN、 DPT 细胞亚群的增殖， 即 rHuIL-1Ra 主要对分 化早期的 T 细胞的增殖有抑制作用， 这种抑制减少 5-Aza 化疗对胸腺 DN、 DP 亚群细胞的损
伤。在胸腺损伤最严重的第 7 天， rHuIL-1Ra 给药组小鼠胸腺细胞增殖比例显著高于对照 组， 表明 rHuIL-1Ra 在很大程度上促进了胸腺损伤期胸腺细胞的增殖， 对胸腺分化 T 细胞能 力具有保护作用。在胸腺恢复期的第 11 天， rHuIL-1Ra 给药组各 T 细胞亚群增殖比例均显 著高于对照组， 说明 rHuIL-1Ra 对胸腺功能及外周免疫系统的恢复具有促进作用。
2.5 rHuIL-1Ra 预防性给药对外周血初始 T 细胞的作用
试验方法 ：
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 用弯头眼科镊摘眼球取血 ； 迅速将小鼠血滴入事先 加好柠檬酸钠抗凝剂的 EP 管中， 反复摇晃使小鼠外周血与抗凝剂混合均匀 ； 取 10μL 3％ 冰醋酸裂红后用血球计数板计数细胞数。计数后即可将细胞调整至合适浓度进行外周血 T 细胞检测实验 ； 按 1 ∶ 9 比例加入预冷的氯化铵溶液裂解红细胞， 混匀， 冰上 10 分钟， 离心 后以 1mL PBS 重悬混匀。将细胞调整至相应浓度 ； 4℃避光孵育 10min ； 取出离心管， 按照 1 ∶ 2(NH4Cl ∶ PBS/0.5％ FBS) 的比例加入 PBS/0.5％ FBS 充分混匀 ； 离心， 室温， 1600rpm， 5min ； 倾倒上清， 在吸水纸吸除残液， 加入 1mL PBS/0.5％ FBS 液， 充分混匀 ； 吸取 95μL 细 胞悬液， 加入 5μL 3％冰醋酸 (19 ∶ 1) 混匀计数细胞浓度 ； 细胞悬液室温离心， 2400rpm， 5min ； 弃上清， 用 1.2mL PBS/0.5％ FBS 液重悬。按照下表准备样品管。
表 5 外周血 CD4+CD45RA+， CD8+CD45RA+T 细胞比例检测样品根据样品分组， 分别加入相应抗体 ； 4℃避光孵育 30min ； 以 200μlPBS/0.5％ FBS 洗涤一次 ； 加 500μl PBS/0.5％ FBS 重悬细胞， 移入流式管中 4℃避光保存， 24h 内上机检 测。
统计学分析 ：
A) 流式细胞仪检测 FITC、 PE-Cy5、 PE 染色结果， 用 Cell Quest 软件分析， 计算外 + + + + 周血细胞 CD4 CD45RA 、 CD8 CD45RA T 细胞比例。
B) 结果进行双尾 T 检验及方差分析
试验结果 ：
CD45RA 是区别初始 T 细胞与记忆 T 细胞的重要细胞表面标志， CD45RA+ 细胞为胸
腺生成、 未接触过抗原的 T 细胞， 因此外周血中 CD4+CD45RA+ 与 CD8+CD45RA+( 即初始 T 细胞 ) 细胞比例的变化是评价胸腺 T 细胞输出功能的重要指标。
rHuIL-1Ra 对外周血初始 T 细胞的作用结果如表 6 所示。表中结果以平均数 (Mean)± 标准误 (SEM) 表示。双尾 T 检验比较统计学差异， *p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01。N 代 表检测的小鼠只数。
表 6.rHuIL-1Ra 对 CD4+CD45RA+ 与 CD8+CD45RA+T 细胞的作用
结果表明 ：
(1) 注射 rHuIL-1Ra 的给药组在第 0 天， CD4+CD45RA+T 细胞低于对照组， 为对照组 + + 的 49.30％。CD8 CD45RA T 细胞低于对照组， 为对照组的 38.80％ ； 经双尾 T 检验具有统计 学意义。
(2) 在化疗后第 7 天， 给药组小鼠 CD4+CD45RA+T 细胞和 CD8+CD45RA+T 显著高于对 照组， 分别为对照组的 202.9％和 228.0％， 经双尾 T 检验具有统计学意义。 + +
(3) 在化疗后第 11 天， CD4 CD45RA T 细胞显著高于对照组， 为对照组的 340.0％， 双 + + 尾 T 检验具有统计学意义。CD8 CD45RA T 细胞平均值也高于对照组， 为对照组的 304.5％。
上 述 结 果 结 果 说 明， rHuIL-1Ra 能 够 减 少 正 常 小 鼠 外 周 血 中 CD4+CD45RA+ 与 CD8+CD45RA+ 初始 T 细胞的数量。然而， 由于在胸腺 T 淋巴细胞增殖的检测中并未发现 rHuIL-1Ra 能够显著的抑制 CD4SP T 细胞的增殖， 因此外周血中 CD4 初始 T 细胞的减少可能 因为 rHuIL-1Ra 影响了胸腺中 CD4SP T 细胞的迁移与定居。
第 7 天的数据表明， 化疗后外周血中 CD4 与 CD8 初始 T 细胞的比例急剧增加， 这可 能是由于化疗后外周血总数急剧降低导致的初始 T 细胞的表观增加。这也反映了动物机体 在化疗时， 由于化疗药物的作用导致外周血等二级免疫系统的免疫细胞急剧减少， 外周免 疫系统几乎处于 “瘫痪” 的状态。 此时， 针对外周免疫系统的损伤， 机体的应激反应会促使一 级免疫器官增加 T 细胞的输出， 从而平衡外周免疫系统中 T 细胞的缺失。在对照组与给药 组间， 给药组 CD4、 CD8 初始 T 细胞的增加均显著高于对照组。这说明 rHuIL-1Ra 对胸腺的 保护作用分为两个方面， 其一， rHuIL-1Ra 保护并促进了化疗后胸腺中 DN、 DP 细胞的增殖，
其二， rHuIL-1Ra 保护并增加了胸腺中 CD4SP、 CD8SP 亚型细胞向外周的迁移。
第 11 天的结果中， 给药组 CD4、 CD8 初始 T 细胞数高于对照组， 分别为对照组的 3.4 倍和 3 倍， 结合对胸腺中 CD4SP、 CD8SP 细胞增殖的检测， rHuIL-1Ra 既增加了胸腺中 CD4SP、 CD8SP 细胞的增殖， 也增加了外周血中 CD4、 CD8 初始 T 细胞的数量。对化疗后处于恢复期 的胸腺和外周免疫系统起到了促进免疫恢复的作用。
讨论 ： rHuIL-1Ra 能够在 5-Aza 化疗中对胸腺起到保护作用。rHuIL-1Ra 的预防性 用药能够抑制胸腺早期 T 细胞的增殖， 降低其对化疗药物的敏感性， 并且在胸腺恢复期促 进胸腺各 T 细胞亚群的增殖。外周血初始 T 细胞的检测表明 rHuIL-1Ra 能够通过促进 T 细 胞增殖和迁移， 促进外周免疫系统的恢复。
本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 IL-1Ra 的新用途及其肿瘤治疗药物组合药盒。 背景技术 近年来， 随着医学的进步， 现代人类的平均寿命增长至 80 岁， 肿瘤的发病率明显 增高。肿瘤与心脑血管病成为人类健康的两大杀手， 肿瘤的高发病率和高致死率成为威胁 人类健康的重要因素。
随着对肿瘤发病机制的研究， 人们对肿瘤有了进一步的认识。 研究表明， 肿瘤细胞 为生长失控的异常细胞， 会由肿瘤原发部位迁移至其它部位， 如果不能够控制肿瘤的这种 扩散作用， 肿瘤将侵犯人体的重要器官， 引起器官衰竭， 最终导致死亡。目前临床上治疗肿 瘤的常用方法有外科手术切除肿瘤、 放射治疗、 化学治疗和中医治疗等。 鉴于肿瘤是一种全 身性的疾病， 单纯依靠切除肿瘤的治疗效果往往不够理想。 据有关资料表明， 肿瘤病人确诊 时， 仅有三分之一左右的病人适宜通过手术而治愈。绝大多数病人确诊时已处于癌症中晚
随着对肿瘤发病机制的研究， 人们对肿瘤有了进一步的认识。 研究表明， 肿瘤细胞 为生长失控的异常细胞， 会由肿瘤原发部位迁移至其它部位， 如果不能够控制肿瘤的这种 扩散作用， 肿瘤将侵犯人体的重要器官， 引起器官衰竭， 最终导致死亡。目前临床上治疗肿 瘤的常用方法有外科手术切除肿瘤、 放射治疗、 化学治疗和中医治疗等。 鉴于肿瘤是一种全 身性的疾病， 单纯依靠切除肿瘤的治疗效果往往不够理想。 据有关资料表明， 肿瘤病人确诊 时， 仅有三分之一左右的病人适宜通过手术而治愈。绝大多数病人确诊时已处于癌症中晚
期， 需要辅以放射治疗和 ( 或 ) 化学药物治疗， 因此放化疗是当前恶性肿瘤治疗和预防复发 的重要手段。但是放化疗 “敌我不分” ， 对细胞缺乏选择性， 在杀死肿瘤细胞的同时， 同样杀 伤正常细胞， 因而放化疗虽然是肿瘤治疗的重要方法， 但仍具有严重的毒副作用 [4]。
放射治疗和 ( 或 ) 化学药物治疗的主要副作用是免疫功能抑制和骨髓造 血 抑 制， 大 部 分 化 疗 药 物， 如 环 磷 酰 胺、 5- 氟 尿 嘧 啶、 5- 氮 杂 胞 苷 (5-azacytidine or5-azacitidine， 5-Aza) 等化疗药物会引起胸腺免疫器官的急性损伤以及外周免疫功能 的下降， 这直接限制了化疗的应用， 并且化疗后病人处于免疫功能缺失的状态下， 导致感染 几率增加。 若病人在化疗后无法恢复正常水平的免疫功能， 那么病人罹患各种免疫性疾病、 病毒与细菌的感染、 以及癌症复发的几率会大大增加。
胸腺为机体的重要免疫器官， 是 T 细胞发育的场所。胸腺 T 祖细胞来源于骨髓， 其表面标志为 CD3 CD4 CD8 (triple negative， TN)， 具有分化为 T 细胞、 树突状细胞或自然 杀伤细胞的能力， 它在胸腺中经历了从皮质到髓质的复杂分化过程。TN 细胞在胸腺中与 微环境复杂的细胞组分相作用， 获取 CD3 分子， 成为 CD4-CD8- 双阴性 (double-negative， DN) 细胞。TN 细胞与 DN 细胞都属于早期的 pre-T 细胞。随后， DN 细胞在依次经过 DN + + + + I(CD44 CD25 )、 DN II(CD44 CD25 )、 DN III(CD44 CD25 )、 DN IV(CD44-CD25-) 四个阶段发育 为 CD4、 CD8 双阳性细胞 (CD4+CD8+double-positive， DP)。皮质中的 DP 细胞经过 T 细胞受 体 (T-cell antigen receptor) 基因重排， 完成阳性选择 (positive selection， PS) 和阴 性选择 (negative selection， NS)， 发育为 CD4 单阳性或 CD8 单阳性 (single-positive， SP)naive T 细胞， 被输送到外周， 作为辅助 T 细胞或杀伤性 T 细胞发挥免疫功能。
“白细胞介素 -1 受体拮抗剂” (interleukin-1 receptor antagonist， IL-1Ra)， 与 IL-1α、 IL-1β 三者共同属于 IL-1 家族成员。IL-1Ra 是 IL-1α、 IL-1β 共同的拮抗剂， 它 可竞争性的抑制 IL-1 与其受体 IL-1RI 结合， 阻滞在多个组织和器官中表达 IL-1 的生物活性。IL-1Ra 临床上用于类风湿性关节炎、 败血症等疾病。人和小鼠的 IL-1Ra 有 77％的同 源性， IL-1Ra 的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的 IL-1Ra 分子量的差异主要 由糖基化程度不同所致。已证实， 糖基化对 IL-1Ra 生物学活性无影响 (R Daig， G Rogler， E Aschenbrenner， et al.Gut2000(46) ： 350-358)。 发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决肿瘤放射治疗和 / 或化学治疗过程中免疫 功能抑制副作用问题。
为此， 本发明公开了一种如下 (a) 或 (b) 的蛋白在制备用于治疗或保护放疗和 ( 或 ) 化疗药物导致的胸腺急性损伤、 胸腺淋巴细胞损伤和 ( 或 ) 外周 T 淋巴细胞减少的药 物中的用途 ：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所述的蛋白 ；
(b) 至少与 (a) 中的氨基酸序列 70％同源性且具有放疗和 ( 或 ) 化疗药物导致的 胸腺急性损伤、 胸腺淋巴细胞损伤和 ( 或 ) 外周 T 淋巴细胞减少活性的蛋白。
在一些实施例中， 所述胸腺淋巴细胞为胸腺 T 细胞， 胸腺 T 细胞可为 DN T 细胞、 DP T 细胞、 CD4 SP T 细胞或 CD8 SP T 细胞。所述外周 T 淋巴细胞为 CD4+CD45RA+T 细胞和 CD8+CD45RA+T 细胞。
在一实施例中， 所述 (b) 的蛋白为氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所述的蛋白。
在一些实施方式中， 所述化疗药物可选自烷化剂类药物、 抗代谢类药物、 抗生素类 药物、 植物类药物、 激素类药物、 金属络合物、 或蛋白药物， 其中优选为抗代谢类药物。
另一方面， 本发明公开了一种药物组合物， 其含有作为活性成分的上述蛋白和药 学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方式中， 所述药物组合物的制剂为肠外给药制剂， 所述肠外给药制剂 可为注射剂或注射用无菌粉末。
另一方面， 本发明公开了一种肿瘤治疗药物组合药盒， 其包括肿瘤化疗药物制剂 和本发明所述药物组合物的制剂。
另一方面， 本发明公开了上述蛋白作为活性成分可治疗或预防放疗或 / 和化疗药 物导致的胸腺急性损伤和 / 或免疫功能抑制副作用的方法， 该方法包括给予个体有效剂量 的上述蛋白。
另一方面， 本发明还公开了一种治疗肿瘤的方法， 该方法包括在放疗或 / 和化疗 药物前， 给予个体有效剂量的上述蛋白。
本发明所述蛋白的新用途可有效地降低治疗或预防放疗或 / 和化疗药物导致的 胸腺急性损伤和 / 或免疫功能抑制副作用， 将可能为今后临床肿瘤的治疗提供新的选择。 附图说明
图1： 胸腺中 T 细胞的发育过程示意图 ；
图2： 重组人白细胞介素 -1 受体拮抗剂 (recombinant human interleukin-1 receptorantagonist， rHuIL-1Ra) 对 5-Aza 化疗导致的胸腺损伤的保护作用 ；
图3： 5-Aza 化疗后不同时间小鼠胸腺的 H&E 染色图 ( 低倍镜 ) ；图4： 5-Aza 化疗后第 7 天小鼠胸腺切片 H&E 染色图 ( 高倍镜 ) ； 图5： rHuIL-1Ra 对 5-Aza 化疗导致的胸腺指数损伤的保护作用 ； 图6： rHuIL-1Ra 对 5-Aza 化疗导致的胸腺细胞总数损伤的保护作用 ； 图7： 胸腺细胞增殖的检测 ；具体实施方式
在 本 文， 术语所述 “白 细 胞 介 素 -1 受 体 拮 抗 剂” (interleukin-1 receptor antagonist， IL-1Ra)， 与 IL-1α、 IL-1β 三者共同属于 IL-1 家族成员。IL-1Ra 是 IL-1α、 IL-1β 共同的拮抗剂， 能拮抗 IL-1 与其受体 interleukin-1 receptor I(IL-1RI) 的结合， 并抑制 IL-1 的生物学活性。人成熟形式的 IL-1Ra(hIL-1Ra) 的氨基酸序列如 SEQ IDNO.1 所述， 人和小鼠的 IL-1Ra 有 77％的同源性， IL-1Ra 的生物学作用没有种属特异性。不同细 胞产生的 IL-1Ra 分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实， 糖基化对 IL-1Ra 生 物学活性无影响 (R Daig， G Rogler， E Aschenbrenner， et al.Gut 2000(46) ： 350-358)。
本发明的所述蛋白质优选该物质是 hIL-1Ra 蛋白质及其突变体 ； 其功能性活性片 段或其类似物 ； 具有高度同源性的同系物以及编码包含 SEQ ID NO.1 描述的氨基酸序列的 蛋白质的载体例如 DNA 载体 ( 质粒或病毒 )。功能性活性片段或类似物可通过添加、 插入、 修饰、 取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。 术语 “类似物” 也包括嵌合蛋白质、 融合蛋白、 抗独特型抗体、 上述化合物的前体和 其它功能等效物或模拟物。也包括模拟 IL-1Ra 结合蛋白活性的合成体。
术语 “突变体” 是指氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所述 hIL-1Ra 的突变体。相比于 天然的 IL-1Ra 蛋白， 该突变体与它们野生型相比， 具有增强的活性和 / 或改变了的立体专 一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、 或通过体外合成所需多肽来制备。 这些突变体包括， 例如缺失、 插入或替换该氨基酸序列中 的残基。可以通过缺失、 插入和替换的组合以得到最终的构建体， 提供最终的蛋白产品。
蛋白的同源性百分比由 GAP(Needleman 和 Wunsh， 1970) 分析 (GCG 程序 ) 确定， 其 中参数 gap creation penalty ＝ 5， gap extension penalty ＝ 0.3。被分析的序列长度 至少为 15 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 15 个氨基酸的区域进 行测试。更优选地， 被分析的序列长度至少为 50 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两 个序列的至少为 50 个氨基酸的区域进行测试。更优选地， 被分析的序列长度至少为 100 个 氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 100 个氨基酸的区域进行测试。更 优选地， 被分析的序列长度至少为 250 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至 少为 250 个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地， 被分析的序列长度至少为 500 个氨基 酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 500 个氨基酸的区域进行测试。
本发明涉及的方面还包括 IL-1Ra 蛋白类似物， 在它们合成期间或合成后进行了 不同的修饰， 例如， 通过生物素化、 苄基化、 糖基化、 乙酰化、 磷酸化、 由已知保护 / 封闭基团 的衍生作用、 蛋白水解的切割作用、 连接到抗体分子或其它细胞配体上等。 这些修饰可以用 来增加本发明 IL-1RA 蛋白的稳定性和 / 或生物活性。
药物组合物
用于本发明或者含有本发明所述蛋白的药物组合物。通常， 当本发明药物组合物
用于上述用途时， 所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给 药途径的药物剂型， 如片剂、 胶囊、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液剂、 口服液、 醑剂、 酊剂、 气雾 剂、 粉雾剂、 注射剂、 注射用无菌粉末、 栓剂等。
“药学上可接受的” 成分是适用于人和 / 或动物而无过度不良副反应 ( 如毒性、 刺 激和变态反应 ) 即有合理的效益 / 风险比的物质。 “药学上可接受的载体” 是用于将本发明 的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、 悬浮剂或赋形剂。载体可 以是液体或固体。
本发明的蛋白可经过口服、 静脉内、 肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为 ： 片剂、 胶囊、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液剂、 醑 剂。固态载体包括 ： 淀粉、 乳糖、 磷酸氢钙、 微晶纤维素、 蔗糖、 白陶土、 微粉硅胶、 滑石粉、 低 取代羟丙基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括 ： 无菌水、 乙醇、 聚乙 二醇、 非离子型表面活性剂和食用油 ( 如玉米油、 花生油和芝麻油 )。在制备药物组合物 的过程中通常使用的佐剂包括 ： 调味剂、 着色剂、 防腐剂 ( 如羟苯烷基丁酯、 苯甲酸钠、 山梨 酸 ) 和抗氧化剂 ( 如维生素 E、 维生素 C、 焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯 )。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括 ： 注射剂、 注射用无菌粉末， 它们是将 药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括 ： 无菌 水、 乙醇、 甘油、 丙二醇、 聚乙二醇。此外， 还需加入抑菌剂 ( 如苯甲醇、 羟苯丁酯、 硫柳汞 )、 等渗调节剂 ( 如氯化钠、 葡萄糖 )、 助悬剂 ( 如羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素 )、 增溶剂 ( 吐 温 -80、 卵磷酯 )、 抗氧化剂 ( 如维生素 E、 维生素 C、 焦亚硫酸钠 ) 和填充剂 ( 如乳糖、 甘露 醇 )。
从易于制备和给药的立场看， 优选的药物组合物是固态组合物， 尤其是冻干粉针剂。 本发明的药物组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。 药物组合 物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体， 并适宜为单位剂量形式。本发明的 药物组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质， 该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本 发明物的活性形式。
本发明公开了一种肿瘤治疗药物组合药盒， 其包括肿瘤化疗药物制剂和本发明所 述药物组合物的制剂。
用途
公开了所述蛋白作为活性成分可以治疗或预防放疗或 / 和化疗药物导致的胸腺 急性损伤和 / 或免疫功能抑制副作用的方法， 该方法包括给予患者有效剂量的上述 (a) 或 (b) 所述的蛋白。
在一些实施方式中， 所述方法可通过化疗药物给药前给药方式、 放疗给药方式， 给 予患者有效剂量的上述 (a) 或 (b) 所述的蛋白。
“有效剂量” 或 “治疗量” 均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通 常， 有效量足以缓和、 改善、 稳定、 减慢或延迟疾病的进一步发展。
所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。 对大 部分大型哺乳动物而言， 每天施以有效成分的总剂量约为 0.01-1000mg。通常， 成人临床给 药量的范围为 0.01-200mg/ 日， 优选为 0.05-100mg/ 日。
在一些实施方式中， 所述化疗药物可选自烷化剂类药物、 抗代谢类药物、 抗生素类 药物、 植物类药物、 激素类药物、 金属络合物、 或蛋白药物， 其中优选为抗代谢类药物。抗代 谢类药物选自脱氧氟尿苷、 5- 脱氧氟尿苷、 氟脲苷、 丙硫氧嘧啶、 丁基氟尿嘧啶、 双喃氟啶、 5- 氟嘧啶醇、 磺巯嘌呤钠、 巯咪嘌呤、 6- 巯基嘌呤、 6- 氨基嘌呤盐酸盐、 甘氨硫嘌呤、 硫乌嘌 呤、 溶癌呤、 硫酸肼、 卫康醇、 亚丝醌、 芬可洛宁、 异优散酮、 抑素、 氯屈磷酸、 氯屈磷酸二钠、 环亮氨酸、 地查枸林、 甲黄酸地查枸林、 白瑞夸尔、 奥昔嘌醇、 澳马利特、 溴巴酸 ( 钠 )、 百利 德定、 溴脲苷、 氟脲己胺、 10- 乙基去氮氨蝶呤、 氟甲氨蝶呤、 二氧甲氨蝶呤、 5， 10- 双去氮四 氢叶酸、 甲满蝶呤、 丁巯嘌呤、 丁克他酰胺、 胱氮杂乌苷、 卡莫氟、 尿嘧啶替加氟、 戊稀吲哚、 硫若星、 优福定、 甲氧檗因、 甲酰溶肉瘤素、 氨 ( 基 ) 蝶呤、 氨蝶呤钠、 8- 氮鸟嘌呤、 二甲胺 腺苷、 ( 硝基 ) 咪唑硫嘌呤、 尿嘧啶、 巯甲脲嘧啶、 重氮丝氨酸、 雷替曲塞、 雷替曲占、 盐酸洛 拉曲克、 槐定碱、 甲酰四氢叶酸、 甲基四氢高叶酸、 唑来磷酸、 替莫唑胺、 比卡鲁胺、 门冬酰 胺酶、 左亚叶酸钙、 亚叶酸钙、 坤来斯巴、 三嗪苯酰胺、 曲麦克特、 曲马多、 氯巴比酸、 5- 重氮 脲嘧啶、 吡拉西坦、 托泊替康、 盐酸拓扑替康、 阿糖胞苷、 环胞苷、 羟基胍、 5- 氟尿嘧啶核苷、 5- 氟尿嘧啶脱氧核苷、 氟脲嘧啶脱氧核苷、 甘油柑碱、 阿垒可散、 异恶唑醋酸、 氨格鲁米特、 氨萘非特、 氯胞苷、 阿他美坦、 氮杂胞苷、 抗瘤氨酸、 脱氧氮杂胞苷、 右雷佐生、 克雷斯托、 克 尼斯他酸、 克拉利平、 克拉利宾、 加洛他滨、 吉西他滨、 伊巴他滨、 依诺他滨、 安西他滨、 地西 他滨、 氟西他滨、 卡培他滨、 依诺他滨、 咪唑他滨、 克兰非鲁、 卡拉酰胺、 卡唑酰胺、 卡巴萘醌、 偶氮苯溴丙胺、 姜黄素、 姜黄素二酮、 酮曲沙、 三甲曲沙、 斯泼古宁、 去氧斯泼古宁、 萘脲磷酸 胺、 氯化地特卡里、 磷酸氟达那苷、 氟苄噻酮、 藤黄酸、 戈舍瑞林、 氮枸岭、 海尼白瑞宁、 肌苷 二醛、 氯苯氨啶、 二溴甘露醇、 二溴卫矛醇、 柯替波斯地、 益若蓝精、 多潘、 美洛格瑞、 丙米腙、 迷托醌、 米托坦、 法扎拉滨、 氟达拉滨、 克拉屈滨、 戊糖苷、 苯来宁、 苯来美特、 磷嘧阿泽胺、 匹 毛尼唑、 聚烯瑞尼酸、 蝶酰天冬氨酸、 蝶酰三谷氨酸、 嘌米舌泊、 利波腺苷、 双曲秦、 裂裥多 糖、 溴茴丙烯酸钠、 氨偶氮苄、 曲丁磺酯、 三乙密胺、 三亚胺醌、 曲西瑞宾、 磷酸曲西瑞宾、 雷 藤素甲、 曲普瑞林、 九布洛唑、 优福定、 维他命 B-17、 威麦宁、 z- 氮杂腺苷、 扎西胞苷、 依匹 哌啶、 阿莫诺期、 阿多来新、 阿克罗宁、 阿拉诺新、 阿美蒽醌、 阿那曲唑、 阿那西戎、 阿那昔酮、 阿斯吲醒、 阿西维辛、 阿替韦啶、 艾多昔芬、 癌可萘、 昂究吉宁、 个鲁达卜辛、 抗瘤酮、 抗瘤酮 A-10、 阿沙芳、 芦笋精、 芥吲酸、 白瑞夸尔 ( 钠 )、 ( 盐酸 ) 必桑郡、 格拉司琼、 托烷司琼、 氮烯 咪胺、 恩丹西酮、 胸腺素、 曲马多、 甲磺酸伊马替尼、 双氯芬酸、 沙利度胺、 托氟杀星、 托瑞米 芬、 安溴索、 高乌甲素、 耐普等因、 胸腺肽、 氟他胺、 乙亚胺、 胺苯、 氧化新喹、 N- 甲基甲酰胺、 牢可达唑、 蒽甲硫脲、 奥昔舒仑、 氧化石蒜碱、 泊芬撒尔、 泊泽尼普定、 戊必罗尔、 螺氯丙醇、 原白头翁素、 佳代胞、 雷替尼卜定、 生索拉德、 素道霉素、 茄软酯碱、 亚胺醌、 斯替苯嘧啶、 泰 莫佐罗、 台多西隆、 硫奥里发新、 硝氨丫啶或安丫啶中的一种或多种， 其中最优选为 5- 氮杂 胞苷。
化疗药物给药剂量按照公知有效剂量给药， 如 5- 氮杂胞苷临床一般为静脉注射， 每次 1-2mg/kg， 1 次 / 日。
另一方面， 本发明还公开了一种治疗肿瘤的方法， 该方法包括在放疗或 / 和化疗 药物前， 给予个体有效剂量的上述蛋白。本发明的药物组合物还可与其它肿瘤疗法联合应 用， 如同时、 序贯或分别应用。本发明的药物组合物可包含有其它活性作用物。
以下结合具体实施例， 进一步阐明本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中， “rHuIL-1Ra” 、 “IL-1Ra” 为同一物质， 均为上文所指 “hIL-1Ra” 。
材料与方法
主要试剂
5- 氮杂胞苷 (5-Aza， Sigma 公司 )、 福尔马林溶液 (4％多聚甲醛 )、 细胞膜通透剂 (0.1％ Triton x-100/0.1％柠檬酸钠 /PBS pH 值 7.2 ～ 7.4)、 BrdU(Sigma 公司 )
实验动物
SPF 级 BALB/c 小鼠， 4 周， 雄性， 上海斯菜克实验动物中心。
实验方法
1、 5- 氮杂胞苷 (5-Aza) 腹腔注射 ：
1) 小鼠腹腔注射使用无菌一次性 1mL 注射器。
2) 腹腔注射时右手持注射器， 左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴， 另外三个手 指抓住小鼠的颈部， 使小鼠的头部向下。进针时从腹部一侧进针， 向腹中线方向进针约 1cm 后注射完药物， 缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头， 防止漏液。
3)5-Aza 注射剂量为 10mg/kg、 30mg/kg、 100mg/kg， 给药容积为 0.1-0.2mL。
2、 小鼠胸腺的获取与称重 ：
1) 胸腺位于胸腔前纵隔， 紧靠心脏， 呈灰白色， 分左、 右两叶。
2) 断颈处死小鼠， 投入盛有 100mL 的 75％酒精中浸透， 拎出后将小鼠仰面翻铺于 超净台上一个消毒医用托盘内的消毒纱布上引颈处死小鼠。
3) 用眼科镊小心捏起小鼠胸腔部的皮肤， 用眼科剪小心剪开皮肤， 并分离皮肤与 肌肉组织。在小鼠胸腔隔膜下向上剪断胸骨， 打开胸腔。
4) 轻轻拨开心脏， 注意不要刺破心脏或血管， 露出胸腺， 将胸腺及周围的组织剪 下， 置于干净的玻璃培养皿中。
5) 用无菌 PBS 轻轻冲洗胸腺组织， 在卫生纸上轻轻吸去胸腺表面的血液及其他液 体， 尽量吸净。
6) 用眼科剪小心去除胸腺表面的结缔组织与淋巴组织， 尽量去除干净后， 用精密 分析天平称重。
3、 胸腺指数 ：
胸腺指数＝胸腺重 (mg)/ 体重 (g)
4、 胸腺细胞总数 ：
1) 将胸腺置于干净的 200 目筛网上。筛网下置一干净的培养皿。
2) 加入 1-2mL 10％ FBS/RPMI 1640 培养基至筛网上
3) 用玻璃注射器的针栓在筛网上轻轻研磨胸腺， 直至无可见的块状胸腺组织。
4) 用 3-5mL 含 10％ FBS/RPMI 1640 培养基冲洗筛网， 尽量冲洗干净， 避免筛网上 有残留的胸腺细胞。10％ FBS/RPMI 1640 培养基流入筛网下方的培养皿中。
5) 收集培养皿中的胸腺细胞研磨液， 加入 15mL 无菌离心管中。
6)1600rpm 离心 5 分钟。
7) 用预冷的 0.5％ FBS/PBS 洗涤一次。8) 将细胞重悬于 2mL 5mM EDTA/PBS 中， 如有块状悬浮物， 尽量用枪头吹打均匀， 如若不能， 则弃去。
9) 取 10μL 胸腺细胞重悬液， 加入事先准备好的血细胞计数仪稀释液中， 上下颠 倒混匀。用血细胞计数仪进行检测。
5、 胸腺组织固定 ：
用预冷的 PBS 冲洗胸腺 ； 将冲洗后的胸腺放入新鲜配制的 4％多聚甲醛固定液中， 其中固定液体积应大于 10 倍的胸腺体积 ； 常温固定， 至少固定 24 小时 ； 每 1-2 星期更换固 定液， 可常温长时间保存。
6、 胸腺 T 细胞亚群增殖检验方法
如上 4 制备胸腺细胞重悬液， 加入 PE-CD4 和 PE-Cy5-CD8 抗体进行表面抗原标记 后， 用 2％多聚甲醛固定细胞， 0.1％ Triton X-100/0.1％柠檬酸钠透化细胞膜， 适宜浓度 DNase I 解开 DNA 双链 ；
胸腺细胞 FITC-BrdU 抗体染色后先经过前向角 (FSC) 和测向角散射光 (SSC) 分 析， 去除细胞粘连和细胞碎片， 分析选中的细胞群。FITC-BrdU 抗体染色可见细胞未增殖细 胞 (BrdU 阴性， BrdU ) 和增殖细胞 (BrdU 阳性， BrdU+) 区分明显， 选择 BrdU+/SSC 设门划定 增殖细胞， 通过同时分析 FL2-H 和 FL3-H 双通道， 检测胸腺细胞 CD4 和 CD8 表面抗原的分布。 下列实施例中， 对照组 (NS 或 control) 为腹腔注射生理盐水的小鼠组， 给药组 (rHuIL-1Ra 或 IL-1Ra) 为腹腔注射 rHuIL-1Ra 的小鼠组。
实施例 1.5-Aza 化疗对胸腺的损伤以及 rHuIL-1Ra 预防性给药对胸腺的保护
在化疗前 5 天连续注射 3mg/kg/ 天 rHuIL-1Ra， 在最后一次蛋白给药 24 小时内腹 腔注射 100mg/kg 5-Aza( 记为第 0 天 )， 在第 0 天 ( 注射 5-Aza 前 )、 1.5 天、 3 天、 7 天、 11 天、 14 天分别取对照组与给药组小鼠胸腺， 观察胸腺指数与胸腺病理切片 H&E 染色的变化。
实验结果表明， 5-Aza 对小鼠胸腺的毒副作用明显， 并引起化疗导致的胸腺损伤及 修复的过程。化疗后第 1.5 天、 3 天、 7 天， 对照组 (NS) 小鼠与给药组 (rHuIL-1Ra) 小鼠胸 腺指数急剧下降。 在第 3 天对照组小鼠胸腺指数为化疗前水平的 13.20％； 给药组为化疗前 水平的 22.86％， 比对照组胸腺指数高 82.22％， 显著高于对照组， 具有统计学意义 ( 双尾 T 检验， n ＝ 4-6)。在第 7 天， 对照组与给药组小鼠胸腺指数降低至最低点， 表明第 7 天为化 疗导致最严重的毒副作用时间点， 对照组小鼠胸腺指数为化疗前水平的 8.94％， 给药组为 20.09％， 比对照组高 136.1％， 显著高于对照组 ( 双尾 T 检验， n ＝ 4-6)。在第 7 天后小鼠 胸腺开始迅速恢复。 在第 14 天， 对照组小鼠胸腺指数上升至化疗前水平的 70.43％， 给药组 恢复至化疗前水平的 64.93％， 给药组与对照组间胸腺指数无显著差异 ( 图 2)。
对化疗后第 0 天、 1.5 天、 7 天、 11 天和 14 天的胸腺 HE 染色切片进行分析，
结果表明
(1) 在化疗前， 胸腺组织皮质、 髓质完整， 皮质厚且与髓质有清晰的分界线。 对照组 与给药组无显著差异 ( 图 3)。
(2) 在化疗第 1.5 天及第 7 天， 胸腺体积， 皮质、 髓质面积减小， 对照组 (NS) 胸腺 皮质髓质界限模糊， 给药组 (rHuIL-1Ra) 胸腺皮质髓质界限清晰。这表明胸腺皮质髓质在 5-Aza 注射后受损， 且 rHuIL-1Ra 对化疗中的胸腺起到了保护作用 ( 图 3， 图 4)。
(3) 在化疗后第 11 天和第 14 天， 通过切片观察胸腺组织皮髓质完整， 面积与厚度
逐渐恢复至化疗前水平， 且胸腺皮髓质界限清晰， 表明胸腺逐渐恢复 ( 图 3)。
通过 5-Aza 注射后小鼠胸腺指数与胸腺切片 H&E 染色图， 可知 5-Aza 化疗后的 0 至 7 天为小鼠胸腺的急性损伤期， 在损伤期胸腺重量急剧减小， 胸腺指数下降， 其中第 7 天 为胸腺损伤最为严重的时间点。 rHuIL-1Ra 预防性给药能够在小鼠胸腺的损伤期第 3 天、 第 7 天减少化疗对小鼠胸腺指数的减少， 并且在第 7 天能够减轻小鼠胸腺组织病理学的损伤， 表明 rHuIL-1Ra 能够减轻 5-Aza 化疗导致的小鼠胸腺损伤。
实施例 2.rHuIL-1Ra 预防性给药保护了胸腺损伤并促进其修复
实验动物为 4 周龄 BALB/c 雄性小鼠， 实验设生理盐水对照组与 rHuIL-1Ra 蛋白给 药组。rHuIL-1Ra 的给药剂量为 3mg/kg， 在化疗前 5 天每 12 小时注射一次， 注射方式为皮 下注射， 并以注射同体积无热源生理盐水 (NS) 的小鼠为对照组。在最后一次注射蛋白 24h 内， 腹腔一次性注射 5-Aza 100mg/kg。在第 0 天 ( 注射 5-Aza 前 )、 第 7 天、 第 11 天分别处 死一批小鼠， 检测小鼠胸腺指数、 胸腺细胞总数、 胸腺细胞亚群比例、 胸腺细胞增殖、 以及外 周血初始 T 细胞的变化。
2.1 rHuIL-1Ra 对胸腺指数与胸腺细胞总数的作用
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天 分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 处死后分离胸腺， 制备胸腺细胞悬液， rHuIL-1Ra 对胸 腺指数与胸腺细胞总数的保护作用与实施例 1 的实验结果相符合 ： (1) 化疗后第 7 天， 给药 组小鼠胸腺指数显著高于对照组 ( 图 5) ； (2) 化疗后第 7 天， rHuIL-1Ra 给药组小鼠胸腺细 胞总数显著高于对照组， 比对照组高 131.11％。第 11 天胸腺恢复期， rHuIL-1Ra 给药组胸 腺细胞总数显著高于对照组， 比对照组高 28.03％ ( 图 6)。 2.2 rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群的作用
试验方法 ：
1) 实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 处死后分离胸腺， 制备胸腺细胞悬液， 计数细胞浓 度。按照下表准备细胞 ：
表 .1 胸腺 T 细胞亚群表面抗原 CD4、 CD8 比例检测样品
2)2400rmp 离心 5min， 收集细胞。 3) 吸弃上清， 加入 50μL PBS/0.5％ FBS， 充分混匀使细胞重悬。 4) 根据样品分组， 分别加入相应抗体 ； 4℃避光孵育 30min。6) 加入 200μL PBS/0.5％ FBS 洗涤。
7)2400rmp 离心 5min， 收集细胞。
8) 弃上清， 加入 500μLPBS/0.5％ FBS 重悬细胞， 移入流式管中 4℃避光保存， 24h 内上机检测。
9) 统计学分析
A) 流式细胞仪检测 FITC 和 PE-Cy5 染色结果， 用 Cell Quest 软件分析， 计算胸腺 细胞 DN、 DP、 CD8 SP、 CD4SP 细胞比例。
B) 结果进行双尾 T 检验及方差分析， 以 p ＜ 0.05 为具有统计学差异， ** 代表 p ＜ 0.01， 为差异极显著。
试验结果 ：
以 细 胞 膜 表 面 抗 体 CD4、 CD8 将 胸 腺 细 胞 分 为 DN(CD4-CD8-)、 DP(CD4+CD8+)、 CD4SP(CD4+CD8-) 和 CD8SP(CD4-CD8+) 四个亚群。 CellQuest 软件分析流式细胞仪检测数据， 结果如表 2 所示。N 代表检测的小鼠只数。
表 2.5-Aza 化疗中 rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群分布的作用
结果表明 ：
根据以上实验结果， rHuIL-1Ra 蛋白预防性给药能够在化疗前以及化疗后改变小 鼠胸腺 T 细胞亚群的比例。
(1)rHuIL-1Ra 蛋白预防性给药在化疗前显著减少了小鼠胸腺 DN 细胞的比例 (p ＜ 0.05)。由于 DN 细胞在 T 细胞的发育中属于早期的 pre-T 细胞， 具有进一步分化为 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞的能力。此结果说明 rHuIL-1Ra 抑制了 DN 细胞的增殖从而减少了 DN 亚群细胞的数量。被抑制的 DN 细胞对化疗的敏感性降低， 因而在化疗后被保护的 DN 细 胞便能够继续分化为 CD4SP 和 CD8SP 亚群细胞， 并对免疫功能的恢复发挥重要的作用。
(2) 在化疗后第 7 天， rHuIL-1Ra 蛋白组小鼠 DN 亚群细胞的比例与对照组相比无 显著差异， 而 DP 亚群细胞比例显著高于对照组， 表明 DN 细胞分化为 DP 细胞增多或 DP 细胞 自身的增殖增多。同时， 给药组胸腺中的 CD4SP 和 CD8SP 亚群细胞显著低于对照组。胸腺 中 T 细胞发育分化为 CD4SP 和 CD8SP 亚群细胞后， 作为成熟的 T 细胞输送并定居至外周， 胸 腺中 CD4SP 和 CD8SP 细胞的减少， 存在两种可能， 其一为 CD4SP 和 CD8SP 细胞自身生成的减 少， 其二为 CD4SP 和 CD8SP 的生成并未减少， 而是进入了外周免疫系统， 究竟是哪种原因导 致了给药组 CD4SP 和 CD8SP 细胞的减少， 这需要对外周血初始 T 细胞数量的检测来验证。
(3) 在化疗后胸腺受损后恢复的第 11 天， 对照组与蛋白给药组小鼠的 DN、 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞均无显著性差异。
2.3 rHuIL-1Ra 对胸腺细胞增殖的作用
试验方法 ：
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天 分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只。小鼠腹腔注射 100mg/kg BrdU 溶液 (10mg/mL)， 分两 次注射， 每次间隔 1.5h ； 第一次注射 BrdU 3 小时后引颈处死小鼠， 取胸腺检测。 以流式细胞 术分析小鼠胸腺中增殖的细胞比例。细胞分析过程及 BrdU 检测示意图见图 7( 胸腺细胞增 殖的检测。(A) 胸腺细胞前向角 (FSC) 与侧向角 (SSC) 分析， 圈门 R1 去除细胞碎片与粘连。 (B)FL-1H 与 SSC 分析， 圈门 R2 分析 BrdU+ 细胞比例。(C)BrdU+ 细胞比例分析柱状图 )。
试验结果 ：
rHuIL-1Ra 对胸腺细胞增殖的作用如表 3 所示。 以双尾 T 检验比较统计学差异， 表 中结果以平均数 (Mean)± 标准误 (SEM) 表示。*p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01。N 代表检测的小 鼠只数。
表 3.rHuIL-1Ra 对胸腺细胞增殖的作用
结果表明 ：
以上结果说明， 注射 rHuIL-1Ra 后， 第 0 天对照组胸腺细胞增殖比例为 14.58％， 给 药组胸腺细胞增殖比例为 10.54％， 为对照组的 73.0％， 且统计差异极显著。给药组小鼠胸 + 腺 BrdU 阳性细胞 (BrdU ) 数低于正常小鼠， 表明 rHuIL-1Ra 抑制了正常小鼠胸腺细胞的增 殖， 该结果与 rHuIL-1Ra 对正常小鼠胸腺细胞周期的结果一致。
在化疗导致胸腺损伤最为严重的第 7 天， 对照组胸腺细增殖比例为 12.73 ％， 而 给药组胸腺细胞增殖比例为 15.59％， 比对照组高 22.5％， 具有统计学意义。在第 11 天， 对照组胸腺细胞增殖比例为 12.74 ％， 给药组胸腺细胞增殖比例为 17.86 ％， 比对照组高 + 40.2％， 且统计差异极显著。第 7 天与第 11 天， 给药组小鼠胸腺 BrdU 细胞数高于对照组， 表明在 5-Aza 化疗过程中， rHuIL-1Ra 的预防性给药可以促进胸腺损伤期与恢复期的细胞 增殖， 促进胸腺化疗后的恢复。
2.4 rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群增殖的作用
试验方法 ：
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天 分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 小鼠腹腔注射 100mg/kg BrdU 溶液 (10mg/mL)， 分两次 注射， 每次间隔 1.5 小时 ； 第一次注射 BrdU 3 小时后引颈处死小鼠， 取胸腺检测。流式细胞 术分析小鼠胸腺中胸腺 DN、 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞的增殖细胞比例。分析时胸腺细胞 经过前向角 (FSC) 和测向角散射光 (SSC) 分析去除细胞碎片， 并分析 FL2-H 和 FL3-H 双通 道， 将胸腺细胞根据 CD4 和 CD8 表面抗原的分布划分为 CD4SP、 CD8SP、 DP 和 DN 亚群。对每 一亚群分析 FL1-H 通道， 其中 FL1-H 通道高表达的细胞即为 BrdU+ 细胞 ( 增殖细胞 )。
试验结果 ：
rHuIL-1Ra 对胸腺 DN、 DP、 CD4SP、 CD8SP 亚群细胞增殖的作用如表 4 所示。表中 结果以平均数 (Mean)± 标准误 (SEM) 表示。双尾 T 检验比较统计学差异， *p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01。N 代表检测的小鼠只数。
表 4.rHuIL-1Ra 对胸腺 T 细胞亚群增殖的作用
72.0％。从上述结果可知 rHuIL-1Ra 对正常小鼠胸腺细胞的增殖具有抑制作用。
(2) 化疗后第 7 天， 与对照组胸腺细胞增殖比例的结果相一致， 不同 T 亚群增殖比 例相比化疗前均显著下降。而给药组相比化疗前变化不大。rHuIL-1Ra 给药组 DN 亚群细胞 BrdU+ 细胞比例显著高于对照组， 为对照组的 189.4％； CD8SP 亚群细胞 BrdU+ 细胞比例显著 高于对照组， 为对照组的 219.0％。此结果说明 IL-1Ra 有效保护了胸腺细胞的增殖。
(3) 化疗后第 11 天， rHuIL-1Ra 给药组各 T 细胞亚群 BrdU+ 细胞比例均高于对 照组， 统计差异极显著。其中 DN 亚群细胞为对照组的 166.7 ％， DP 亚群细胞为对照组的 147.6％， 统计差异极显著 ； CD4SP 亚群细胞为对照组的 156.1％， 统计差异显著 ； CD8SP 亚群 细胞对照组的 179.5％， 统计差异极显著。此结果说明 IL-1Ra 有效促进了胸腺细胞在化疗 后恢复阶段的增殖。
根据上述结果， 在化疗前预防性给药 rHuIL-1Ra， 能够保护化疗导致的小鼠胸腺损 伤， 并在胸腺恢复期促进小鼠胸腺细胞的增殖。本部分实验结果表明， 具体到胸腺 T 细胞各 亚群当中， rHuIL-1Ra 能够抑制正常小鼠 DN、 DPT 细胞亚群的增殖， 即 rHuIL-1Ra 主要对分 化早期的 T 细胞的增殖有抑制作用， 这种抑制减少 5-Aza 化疗对胸腺 DN、 DP 亚群细胞的损
伤。在胸腺损伤最严重的第 7 天， rHuIL-1Ra 给药组小鼠胸腺细胞增殖比例显著高于对照 组， 表明 rHuIL-1Ra 在很大程度上促进了胸腺损伤期胸腺细胞的增殖， 对胸腺分化 T 细胞能 力具有保护作用。在胸腺恢复期的第 11 天， rHuIL-1Ra 给药组各 T 细胞亚群增殖比例均显 著高于对照组， 说明 rHuIL-1Ra 对胸腺功能及外周免疫系统的恢复具有促进作用。
2.5 rHuIL-1Ra 预防性给药对外周血初始 T 细胞的作用
试验方法 ：
实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例 2 描述。在化疗后的第 0 天、 7 天、 11 天分别取对照组、 给药组小鼠 5 ～ 6 只， 用弯头眼科镊摘眼球取血 ； 迅速将小鼠血滴入事先 加好柠檬酸钠抗凝剂的 EP 管中， 反复摇晃使小鼠外周血与抗凝剂混合均匀 ； 取 10μL 3％ 冰醋酸裂红后用血球计数板计数细胞数。计数后即可将细胞调整至合适浓度进行外周血 T 细胞检测实验 ； 按 1 ∶ 9 比例加入预冷的氯化铵溶液裂解红细胞， 混匀， 冰上 10 分钟， 离心 后以 1mL PBS 重悬混匀。将细胞调整至相应浓度 ； 4℃避光孵育 10min ； 取出离心管， 按照 1 ∶ 2(NH4Cl ∶ PBS/0.5％ FBS) 的比例加入 PBS/0.5％ FBS 充分混匀 ； 离心， 室温， 1600rpm， 5min ； 倾倒上清， 在吸水纸吸除残液， 加入 1mL PBS/0.5％ FBS 液， 充分混匀 ； 吸取 95μL 细 胞悬液， 加入 5μL 3％冰醋酸 (19 ∶ 1) 混匀计数细胞浓度 ； 细胞悬液室温离心， 2400rpm， 5min ； 弃上清， 用 1.2mL PBS/0.5％ FBS 液重悬。按照下表准备样品管。
表 5 外周血 CD4+CD45RA+， CD8+CD45RA+T 细胞比例检测样品根据样品分组， 分别加入相应抗体 ； 4℃避光孵育 30min ； 以 200μlPBS/0.5％ FBS 洗涤一次 ； 加 500μl PBS/0.5％ FBS 重悬细胞， 移入流式管中 4℃避光保存， 24h 内上机检 测。
统计学分析 ：
A) 流式细胞仪检测 FITC、 PE-Cy5、 PE 染色结果， 用 Cell Quest 软件分析， 计算外 + + + + 周血细胞 CD4 CD45RA 、 CD8 CD45RA T 细胞比例。
B) 结果进行双尾 T 检验及方差分析
试验结果 ：
CD45RA 是区别初始 T 细胞与记忆 T 细胞的重要细胞表面标志， CD45RA+ 细胞为胸
腺生成、 未接触过抗原的 T 细胞， 因此外周血中 CD4+CD45RA+ 与 CD8+CD45RA+( 即初始 T 细胞 ) 细胞比例的变化是评价胸腺 T 细胞输出功能的重要指标。
rHuIL-1Ra 对外周血初始 T 细胞的作用结果如表 6 所示。表中结果以平均数 (Mean)± 标准误 (SEM) 表示。双尾 T 检验比较统计学差异， *p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01。N 代 表检测的小鼠只数。
表 6.rHuIL-1Ra 对 CD4+CD45RA+ 与 CD8+CD45RA+T 细胞的作用
结果表明 ：
(1) 注射 rHuIL-1Ra 的给药组在第 0 天， CD4+CD45RA+T 细胞低于对照组， 为对照组 + + 的 49.30％。CD8 CD45RA T 细胞低于对照组， 为对照组的 38.80％ ； 经双尾 T 检验具有统计 学意义。
(2) 在化疗后第 7 天， 给药组小鼠 CD4+CD45RA+T 细胞和 CD8+CD45RA+T 显著高于对 照组， 分别为对照组的 202.9％和 228.0％， 经双尾 T 检验具有统计学意义。 + +
(3) 在化疗后第 11 天， CD4 CD45RA T 细胞显著高于对照组， 为对照组的 340.0％， 双 + + 尾 T 检验具有统计学意义。CD8 CD45RA T 细胞平均值也高于对照组， 为对照组的 304.5％。
上 述 结 果 结 果 说 明， rHuIL-1Ra 能 够 减 少 正 常 小 鼠 外 周 血 中 CD4+CD45RA+ 与 CD8+CD45RA+ 初始 T 细胞的数量。然而， 由于在胸腺 T 淋巴细胞增殖的检测中并未发现 rHuIL-1Ra 能够显著的抑制 CD4SP T 细胞的增殖， 因此外周血中 CD4 初始 T 细胞的减少可能 因为 rHuIL-1Ra 影响了胸腺中 CD4SP T 细胞的迁移与定居。
第 7 天的数据表明， 化疗后外周血中 CD4 与 CD8 初始 T 细胞的比例急剧增加， 这可 能是由于化疗后外周血总数急剧降低导致的初始 T 细胞的表观增加。这也反映了动物机体 在化疗时， 由于化疗药物的作用导致外周血等二级免疫系统的免疫细胞急剧减少， 外周免 疫系统几乎处于 “瘫痪” 的状态。 此时， 针对外周免疫系统的损伤， 机体的应激反应会促使一 级免疫器官增加 T 细胞的输出， 从而平衡外周免疫系统中 T 细胞的缺失。在对照组与给药 组间， 给药组 CD4、 CD8 初始 T 细胞的增加均显著高于对照组。这说明 rHuIL-1Ra 对胸腺的 保护作用分为两个方面， 其一， rHuIL-1Ra 保护并促进了化疗后胸腺中 DN、 DP 细胞的增殖，
其二， rHuIL-1Ra 保护并增加了胸腺中 CD4SP、 CD8SP 亚型细胞向外周的迁移。
第 11 天的结果中， 给药组 CD4、 CD8 初始 T 细胞数高于对照组， 分别为对照组的 3.4 倍和 3 倍， 结合对胸腺中 CD4SP、 CD8SP 细胞增殖的检测， rHuIL-1Ra 既增加了胸腺中 CD4SP、 CD8SP 细胞的增殖， 也增加了外周血中 CD4、 CD8 初始 T 细胞的数量。对化疗后处于恢复期 的胸腺和外周免疫系统起到了促进免疫恢复的作用。
讨论 ： rHuIL-1Ra 能够在 5-Aza 化疗中对胸腺起到保护作用。rHuIL-1Ra 的预防性 用药能够抑制胸腺早期 T 细胞的增殖， 降低其对化疗药物的敏感性， 并且在胸腺恢复期促 进胸腺各 T 细胞亚群的增殖。外周血初始 T 细胞的检测表明 rHuIL-1Ra 能够通过促进 T 细 胞增殖和迁移， 促进外周免疫系统的恢复。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制， 所述实施方案只作为阐明本发明各 个方面的单个例子， 本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上， 除了本文所述的 内容外， 本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所 述改进也落入所附权利要求书的范围之内。 上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为 参考。18102370967 A CN 102370968
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