一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用 技术领域 本发明涉及一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用， 特别涉及到利用分子 生物学技术中的 SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术， 制备一组与糜蛋白酶具有高特异 性和高亲和力的核酸适配子及其应用， 属于生物技术领域。
背景技术 糜蛋白酶是一种胰腺分泌的蛋白水解酶， 能迅速分解变性蛋白质， 其作用、 用途与 胰蛋白酶相似， 但比胰蛋白酶分解能力强、 毒性低、 不良反应小。糜蛋白酶具有酶切位点专 一性强的特点， 它能优先水解酪氨酸和苯丙氨酸的羧基所形成的肽键。酶作用最优 pH 值为 8.0 ～ 9.0。糜蛋白酶是特异性较强的蛋白酶， 已经成为一种测定蛋白质氨基酸序列不可或 缺的工具。 基于以上糜蛋白酶的特性， 在蛋白质组学的研究中， 糜蛋白酶受到越来越多的重 视， 并已经得到广泛的应用。
SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术， 是上世纪 90 年代由 Tuerk 和 Ellington 等 人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术， 构建人工合成的随机寡核苷酸 文库， 其中随机序列长度一般在 20 ～ 40nt 左右， 两端引物序列一般在 20nt 左右， 文库容量 14 15 大约在 10 ～ 10 范围内。由于单链寡核苷酸随机序列， 尤其是 RNA 序列容易形成凸环、 发 卡、 假节、 G- 四聚体等二级结构， 故能与蛋白质、 肽段、 药物、 氨基酸、 有机化学物， 甚至是金 属离子相结合， 形成具有很强结合力的复合体。
SELEX 技术具有经济、 简便、 快速等特点。 与其他组合化学库如随机肽库、 抗体库和 噬菌体表面展示文库相比， 从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配子具有很多优势 ： (1) 寡核苷酸本身分子量较小， 易于合成， 便于后续试验 ； (2) 某些核酸适配子具有强于抗体的 亲和性和特异性， 无免疫原性 ； (3) 核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性 ； (4) 稳定性好， 易于保存和运输， 对高温和剧烈环境不敏感。因此， 寡核苷酸适配子在生物感应 器的制备、 目标物质的分析检测， 以及临床诊断和疾病治疗中都具有良好的应用前景。
目前， 尚无有关与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法 和应用的研究报道。
发明内容 本发明的目的是克服上述现有技术中的不足， 提供一组糜蛋白酶核酸适配子， 所 述核酸适配子与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力。
本发明的第二个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 所述方法利用 分子生物学技术中的 SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术为手段， 结合表面修饰的顺磁 性磁珠的使用， 对糜蛋白酶的核酸适配子进行筛选、 扩增和测序， 最终获得与糜蛋白酶具有 高特异性和高亲和力的一组核酸适配子。
本发明的第三个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的应用， 所述核酸适配子与 糜蛋白酶相结合， 与相结合的糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力， 可用于对糜蛋白酶进行
检测、 分离、 纯化以及固定化， 应用于生物感应器的制备、 目标物质的分析检测， 以及制备用 于临床诊断的试剂和疾病治疗的药物。
本发明的第四个目的是提供一种糜蛋白酶反应器及其制备方法， 所述糜蛋白酶反 应器是以所述的一组糜蛋白酶核酸适配子之一为基础制备得到的。
本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子在蛋白质组学新技术新方法关键技术的 研究及应用中具有很强的适用性、 经济性。
本发明的技术方案如下 ：
一组糜蛋白酶核酸适配子， 所述糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列选自核苷酸序 列表中数字标识符 <210> 所表示的序列标识符 1 ～ 27 所述的核苷酸序列， 即核苷酸序列表 中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27。
所述 SEQ ID No.1 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.2 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.3 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.4 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.5 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.6 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.7 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.8 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.9 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.10 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.11 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.12 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.13 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：所述 SEQ ID No.14 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.15 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.16 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.17 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：所述 SEQ ID No.18 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.19 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.20 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.21 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：所述 SEQ ID No.22 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.23 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.24 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.25 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.26 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列结构是以 SEQ ID No.1 ～ SEQID No.27 所述的核苷酸序列为基础， 通过 Internet-tool Mfold 在线软件生成， 所述软件 网址为： http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-forml. cgi。
所述核酸适配子是与核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷 酸序列之一序列一致性为 60％以上， 并且具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是能够与核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的 核苷酸序列之一杂交， 并且具有相同功能的寡核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一转录的 RNA 序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一的不少于一个位置的 A 或 T 或 C 或 G 被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄 嘌呤置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生 物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰所得到的具有相同 功能的核苷酸序列。
一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 包括以下步骤 ：
(1) 用作筛选的 ssDNA( 单链 DNA) 的制备 ： 使用上游引物和生物素修饰的下游引 物对原始随机寡核苷酸库进行 PCR 扩增， 扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收， 得 到回收的产物， 将回收的产物与表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠反应， 再利用碱变 性， 磁力分离去除磁珠， 得到 ssDNA 溶液， 将所述 ssDNA 溶液用酸中和后， 得到作为筛选的 ssDNA 随机文库 ；
(2)PCR 扩增与糜蛋白酶特异结合的 ssDNA， 之后进入下一轮筛选 ；
(3) 进行不少于 10 轮循环的筛选， 获得目的核酸适配子扩增后高拷贝数的 PCR 产 物； 其中， 每隔 3 轮循环的筛选， 进行 1 次反筛选， 即利用未结合糜蛋白酶的固载基质为目 标， 进行 ssDNA 的孵育筛选， 并去除反筛选后的固载基质， 这样， 与固载基质特异性结合的 非目的 ssDNA 便被排除掉 ；
(4) 将最后一轮筛选获得的 ssDNA 经 PCR 扩增的产物克隆至菌株中， 在合适的条 件下培养， 得到菌落后挑菌、 测序， 得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序 列。
一组糜蛋白酶核酸适配子的应用， 所述核酸适配子可用于对糜蛋白酶进行检测、 分离、 纯化以及固定化， 应用于生物感应器的制备、 目标物质的分析检测， 以及制备用于临 床诊断的试剂和疾病治疗的药物 ； 特别是应用于酶反应器制备过程中糜蛋白酶的固定化， 以及固定化后的糜蛋白酶反应器的研究与应用。
一种糜蛋白酶反应器， 所述糜蛋白酶反应器是以核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子为基础制备得到。
一种糜蛋白酶反应器的制备方法， 其特征在于 ： 所述制备方法包括以下步骤 ：(1) 表面氨基修饰的硅胶颗粒与戊二醛进行反应， 而后加入 5’ 端氨基修饰的核苷 酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子， 持 续磁力搅拌， 最终得到表面接枝有所述 5’ 端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒 ；
(2) 使用动态混匀器将所述硅胶颗粒装填至聚醚醚酮色谱微柱中 ；
(3) 填充结实后， 用 Tris-HCl 缓冲液平衡所述聚醚醚酮色谱微柱系统， 然后将糜 蛋白酶溶解到 Tris-HCl 缓冲液中， 以流动相方式进样， 使糜蛋白酶流经所述聚醚醚酮色谱 微柱并进行动态固定化， 得到糜蛋白酶反应器 ；
(4) 制备好的糜蛋白酶反应器， 作为蛋白质类样品的在线酶解反应器进行蛋白质 类样品的酶解反应， 用于蛋白质和蛋白质组学的研究 ；
(5) 所述酶解反应结束后， 使用乙腈水溶液作为流动相冲洗， 可将固载到核苷酸序 列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子上的糜蛋 白酶洗脱， 洗脱后的糜蛋白酶溶液置于≤ -20℃条件下保存， 再次使用前将其解冻， 重复所 述步骤 (3) 将其重新固载， 糜蛋白酶反应器即可恢复功能， 达到循环使用、 可再生的目的。
其中， 步骤 (5) 所述的乙腈水溶液优选为 60％的乙腈水溶液 ； 所述洗脱后的糜蛋 白酶溶液的保存条件优选为 -20℃。 有益效果
1. 本发明采用的技术可以高通量地筛选与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的 核酸适配子 ；
2. 核酸适配子具有抗体不具备的一些优势， 如体外筛选、 合成、 易于修饰和稳定性 高等特点 ；
3. 筛选出的与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子， 可以特异性的结 合糜蛋白酶， 成为糜蛋白酶固定化的固载辅助材料。
附图说明 图 1 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 1 ～ 9 轮 SELEX 筛选后得到的 ssDNA 通过 PCR 得到的产物经 3％琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图。
图 2 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 10 轮 SELEX 筛 选后得到的 ssDNA 通过 PCR 扩增后得到的产物经 3％琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图。
图 3 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 1 ～ 10 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 与糜蛋白酶结合力测定的变化图。
图 4 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 10 轮 SELEX 筛 选的 PCR 产物经 pEASY-T1 克隆试剂盒克隆到 Tran1-T1 载体后， 于含有卡那霉素的 LB 固体 培养基上培养 12 小时后的菌斑生长情况。
具体实施方式
为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式， 下面给出实施例。 实施例 1
一组糜蛋白酶核酸适配子， 其特征是具有核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列之一。
核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 所述的核苷酸序列 ： cccaagcttg ggtatgagag gagaggtcgt gtcaccgcgg gcaaggttta ctgcttagca gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag aagttatcgc ggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag 80 No.2 所述的核苷酸序列 ： caaaccatac gttgcaccga gcggggttgg ttgaaggtcg No.3 所述的核苷酸序列 ： ctgcagattg cttaactgtt atggctaact gtaggtttta No.4 所述的核苷酸序列 ： ggatcctcag ccacgctgaa cgtgggcagc gcatcaaggt No.5 所述的核苷酸序列 ： gtgacttcgt aaggggatag tggaaagcgt cgtaaccccg No.6 所述的核苷酸序列 ： tgtacagccc atattacctg catagaggta aagctgcgcc No.7 所述的核苷酸序列 ： gaactggacc gatcagtggt gaatgagagt cggctcaccc No.8 所述的核苷酸序列 ： gcgtggtaga ggttcgcatc taagttggac gtgacatgac No.9 所述的核苷酸序列 ： gcagcaagca ttcagatgtc ggagggtcat gatctggtcg No.10 所述的核苷酸序列 ： gggatgtgcg taactaagga agcatgcgag cgaggggcag No.11 所述的核苷酸序列 ： ggaggtccag cactaagagg aagctctcaa gggatgcacg No.12 所述的核苷酸序列 ： tatgatcgat tgcgttgggt agcaattggg taatagttag No.13 所述的核苷酸序列 ： gataagtatc tacggcaata ctgaatgggc actactctta3960
60 79 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag aagttatcgc ggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag aagttatcgc ggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag80 No.14 所述的核苷酸序列 ： ggcacggaaa gatatccaga agtatggacg cgcattagcg No.15 所述的核苷酸序列 ： gggccaaagc gtaaaagatg taatgttata tgacttgatc No.16 所述的核苷酸序列 ： gtcacgcgcg ttaaacggag aggctattaa agctttgtgg No.17 所述的核苷酸序列 ： cactgagaga agattgggtc taacataagg tcttagcagg No.18 所述的核苷酸序列 ： cccagggggg aaactcatct ggttcagtag gagccctgcg No.19 所述的核苷酸序列 ： gacaagcttg tcccaggcgg aacgggccgc attagtgttc No.20 所述的核苷酸序列 ： atttcctagg ctgggccaga ggggcacagc cactcccatt No.21 所述的核苷酸序列 ： cttaggtcac accagtcggg gggggcgttg gtaaaacatg No.22 所述的核苷酸序列 ： gttgataggt gtaaccgcgc gtttgtaagg gaatgcaaac No.23 所述的核苷酸序列 ： cagccgagtt actgttgatg gatagatcgt ccacgagccg No.24 所述的核苷酸序列 ： gacaagcttg tcccaggcgg aacgggccgc attagtgttc No.25 所述的核苷酸序列 ： atttcctagg ctgggccaga ggggcacagc cactcccatt No.26 所述的核苷酸序列 ： actgatagaa atccggaact atcccaactt agtcttcctg4060 79 60 80 60 79 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 aagttatcgc ggatccgcg 79
核苷酸序列表中 SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列 ：
cccaagcttg ggtatgagag tgtctgctgg agcactcaga ctgtggaggc gacaagaaag 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
实施例 2
一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 包括以下步骤 ：
(1) 首先对原始随机寡核苷酸库进行全库扩增， 以增加其拷贝数， 便于筛选的进 行。以上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行 PCR 扩增， 使用购于 Promega 公司 PCR 试剂盒。反应体系如下 ：
上游引物 100pmol(5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ )
下游引物 100pmol(5’ -biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ )
模板 DNA 5μg(5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG-40N
GAAGTTATCGCGGATCCGCG 3’ )
其中， 所述下游引物是生物素修饰的下游引物。
PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 5 分钟， 热循环共 20 次， 热循环条件为 94℃变性 1 分 钟， 55℃复性 50 秒， 72℃延伸 50 秒， 最后 72℃延伸 10 分钟。
得到 PCR 扩增的产物， 将所述产物进行 3％琼脂糖凝胶电泳， 对目标条带进行胶回 收， 以去除聚合酶和未反应的引物。使用 EppendorfBioPhotometer Plus 对回收的 DNA 进 行定量， 并根据 DNA 的量决定表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠加入量， 所述 DNA 与磁 珠的摩尔比为 1 ∶ 3。将 DNA 与磁珠孵育 30 分钟后， 用 PBS-T 缓冲液清洗磁珠 2 遍， 然后 用 200μL100mM 的 NaOH 使 dsDNA( 双链 DNA) 变性， 磁力分离， 去除磁珠， 得到 ssDNA 溶液， 将所述 ssDNA 溶液用酸中和后， 得到用作筛选的 ssDNA 随机文库。
(2) 甲苯磺酰基修饰的磁珠购于北京思尔成公司， 按磁珠的使用说明书将糜蛋白 酶以共价结合形式固定在所述甲苯磺酰基修饰的磁珠上， 得到共价结合糜蛋白酶的甲苯磺 酰基修饰的磁珠， 以所述共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠为靶目标进行糜蛋白 酶核酸适配子的第 1 轮 SELEX 筛选 ： 将所述共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠与 步骤 (1) 中所述用作筛选的 ssDNA 随机文库在 37℃下孵育 2 小时， 之后进行磁力分离， 并用 PBS 缓冲液清洗磁珠 2 遍， 加入 100μL PBS 缓冲液， 在 94℃水浴锅中静置 10 分钟， 之后行 磁力分离磁珠， 获得 100μL 含有 ssDNA 的 PBS 溶液， 将所述含有 ssDNA 的 PBS 溶液为模板， 以上游引物 (5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ ) 和生物素修饰的下游引物 (5’ -biotin-C6-C GCGGATCCGCGATAACTTC 3’ ) 进行 PCR， 并进行电泳检测， 得到 80bp 的目标条带后切胶回收， 再次进行 ssDNA 的制备， 所述 ssDNA 的制备方法同步骤 (1) 中对目标条带进行胶回收之后 的操作方法， 得到第 1 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 文库 ； 以所述第 1 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 文库为模板进行第 2 轮 SELEX 筛选。
(3) 之后每一轮 SELEX 筛选均按照所述步骤 (2) 中第 1 轮 SELEX 筛选的方法进行， 不同的是随着筛选的进行， PCR 中引物的用量和热循环次数逐渐减少， 具体的为 ： 第 1 轮～ 第 3 轮引物用量 100pmol， 热循环 25 次 ； 第 4 轮～第 7 轮引物用量 80pmol， 热循环 20 次 ； 第 8 轮～第 10 轮引物用量 60pmol， 热循环 15 次。其中， 每隔 3 轮 SELEX 筛选， 要进行 1 次反筛 选， 即使用未固定糜蛋白酶的甲苯磺酰基磁珠为靶目标， 与前一轮 SELEX 筛选得到的 ssDNA文库进行孵育， 2 小时后磁力分离去除磁珠， 这样便可将与磁珠特异性结合的 ssDNA 除去， 避免磁珠对筛选的影响。如图 1 所示， ladder( 分子量阶梯 ) 为 10bp， 左侧的是阴性对照， ladder 右侧从左到右的依次是第 1 轮到第 9 轮的 PCR 产物， 所有 PCR 产物的条带都显示在 80bp 处， 阴性对照条带集中在 20bp 处， 是引物的指示带。
经过 10 轮的 SELEX 的筛选， 将每 1 轮制备出的 ssDNA 与等摩尔质量的糜蛋白酶 进行酶联免疫吸附实验， 对各轮 ssDNA 对糜蛋白酶的结合量和结合能力进行表征。如图 3 所示， 图 3 中左侧纵坐标表示吸光度 (absorbency)， 横坐标 1 ～ 10 分别表示第 1 ～ 10 轮 SELEX 的筛选制备出的 ssDNA 与等摩尔质量的糜蛋白酶进行酶联免疫吸附实验后的样品， 横坐标 11 和 12 为空白对照样品。可以看到， 通过 10 轮的筛选， 糜蛋白酶与 ssDNA 的结合 力不再升高， 达到饱和状态， 所以在第 10 轮筛选之后， 终止 SELEX 筛选。
(4) 在得到第 10 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 之后， 对所述第 10 轮 SELEX 筛选出 的 ssDNA 进 行 PCR 扩 增， 使 用 的 引 物 是 无 修 饰 的 上 游 引 物 (5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ )50pmol 和无修饰的下游引物 (5’ CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ )50pmol， 热循环次数为 15 次， 扩增结束后电泳检测， 结果如图 2 所示， 10bp 的 ladder 两侧均为第 10 轮 PCR 扩增的产 物， 所有产物的条带都显示在 80bp 处， 产物条带明亮清晰。使用 pEASY-T1 克隆试剂盒将第 10 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 经 PCR 扩增的产物克隆至 Tran1-T1 感受态细胞中， 经过热激、 孵育后， 均匀的将其涂布于含有卡那霉素的 LB 固体培养基上， 37℃培养 12 小时， 菌株生长 出， 如图 4 所示， 菌株菌落呈白色圆斑状， 清晰明显， 挑选其中的单个菌落， 置于 LB 液体培养 基中， 37℃培育 4 小时， 然后进行测序， 最终得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的 核苷酸序列， 所述核苷酸序列为核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸 序列之一， 所述核酸适配子与糜蛋白具有高特异性和高亲和力。
本实施例中用于 SELEX 筛选的原始随机寡核苷酸库由 TaKaRa 公司合成， 引物序列 由 Invitrogen 公司合成， 其中原始随机核苷酸文库中有 40 个碱基为随机产生， 序列为 5’ 15 CCCAAGCTTGGGTATGAGAG-40N-GAAGTTATCGCGGATCCGCG 3’ ， 库容量为 10 ， 上游引物序列为 ： 5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ ， 下游引物序列为 ： 5’ CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ ， 生物素修饰 的下游引物序列为 ： 5’ -biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ ， 甲苯磺酰基修饰的磁珠和 链霉亲和素修饰的磁珠购于北京思尔成公司， PCR 试剂盒购于 Promega 公司， Tran1-T1 载体 和 pEASY-T1 克隆试剂盒购于北京全式金公司， 糜蛋白酶购于 Sigma 公司。
实施例 3
以核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白 酶核酸适配子为基础的糜蛋白酶反应器的制备与应用。
将实施例 2 中获得的糜蛋白酶核酸适配子 ( 核苷酸序列表中 SEQ ID No.1)、 表面 氨基修饰的硅胶颗粒、 戊二醛和聚醚醚酮 (PEEKsil) 色谱微柱等作为实验材料， 对糜蛋白 酶进行动态固定化， 步骤如下 ：
(1) 称取 40mg 表面氨基修饰的硅胶颗粒， 室温下与戊二醛持续磁力搅拌反应 2 小 时， 反应后用 NaCO3/NaHCO3(20mM， pH ＝ 9.2) 缓冲液清洗 3 次， 再用三蒸水清洗 3 次， 之后加 入 5’ 端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子 ( 核苷酸序列表中 SEQ ID No.1)， 持续磁力搅拌反 应 3 小时后， 用 NaCO3/NaHCO3 缓冲液清洗 3 次、 三蒸水清洗 3 次， 最终得到表面接枝有所述 5’ 端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒 ；(2) 将所述硅胶颗粒装入到动态混匀器的磁力搅拌腔中， 将聚醚醚酮色谱微柱的 一端安装柱前过滤器， 前过滤器筛板孔径为 2μm， 以防止填充颗粒的流失， 将聚醚醚酮色谱 微柱的另一端接到动态混匀器的四通阀上， 将动态混匀器中的磁力搅拌器与微流泵相连， 准备填充 ；
(3) 首先用 0.1mL min-1 流速的色谱级纯乙腈填充动态混匀器的磁力搅拌腔 5 分 钟。之后将所述乙腈的流速调整至 0.01mL min-1， 直到聚醚醚酮色谱微柱末端有乙腈流出， 打开磁力搅拌器的开关开始装填聚醚醚酮色谱微柱， 关泵， 压力降为零后将聚醚醚酮色谱 微柱卸下， 并在聚醚醚酮色谱微柱的另一端安装柱前过滤器， 得到制备好的聚醚醚酮色谱 微柱 ； 将制备好的聚醚醚酮色谱微柱接到微流液相系统中， 用 0.1mL min-1 流速的三蒸水冲 洗平衡 ；
(4) 平衡后， 用 10mM Tris-HCl(pH ＝ 8.0) 缓冲液平衡聚醚醚酮色谱微柱系统 30 分钟， 流速设定为 5μL min-1， 然后将糜蛋白酶溶解到所述 Tris-HCl 缓冲液中， 以流动相方 式进样， 让所述含有糜蛋白酶的 Tris-HCl 缓冲液流经聚醚醚酮色谱微柱并在聚醚醚酮色 谱微柱内部进行动态固定化， 在 273nm 波长处检测糜蛋白吸收峰， 30 分钟后固定化过程结 束， 继续用色谱级的纯乙腈冲洗聚醚醚酮色谱微柱， 平衡 30 分钟， 得到糜蛋白酶聚醚醚酮 反应器， 即固定化后的糜蛋白酶反应器 ； (5) 将所述制备好的糜蛋白酶反应器， 以 5μL min-1 的流速分别酶解 100μL 1mg mL-1 的牛血清白蛋白、 肌红蛋白、 细胞色素 C 3 种蛋白， 以及所述 3 种蛋白的混合物， 1小 时后收集酶解后的样品， 冷冻干燥， 用色谱流动相 ( 含 0.1 ％甲酸的水溶液 ) 溶解后进 HPLC-ESI-Trap 系统， 检测 ；
(6) 经过酶解后的 3 种蛋白以及 3 种蛋白的混合物， 通过质谱检测， 分别酶解的 3 种蛋白的肽段覆盖率分别为 ： 牛血清白蛋白 23％、 肌红蛋白 43％、 细胞色素 C 58％， 3种 蛋白的混合物酶解后肽段覆盖率分别为 ： 牛血清白蛋白 22％、 肌红蛋白 41％、 细胞色素 C 53％， 连续三天进行平行实验， 结果相差不明显， 说明聚醚醚酮色谱微柱中的糜蛋白酶活力 保持较好 ；
(7) 实验结束后， 使用 60％的乙腈水溶液作为流动相冲洗， 可将固载到所述核酸 适配子上的糜蛋白酶洗脱， 洗脱后的糜蛋白酶溶液置于 -20℃保存， 再次使用前将其解冻， 利用动态固定化方法， 即步骤 (4) 将其重新固载， 所述糜蛋白酶反应器即可恢复功能 ；
(8) 用所述恢复功能后的糜蛋白酶反应器对细胞色素 C 进行了 3 次重复酶解， 肽段 覆盖率分别为 52％、 50％、 51％， 这样， 利用所述糜蛋白酶核酸适配子为基础的糜蛋白酶反 应器， 达到了酶解的高效率， 并实现了糜蛋白酶的回收和再生， 节约了实验成本。
本发明所述具有核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸序 列的一组共 27 条糜蛋白酶核酸适配子是在 SELEX 筛选 10 轮后得到的混合物， 经过转染、 克隆、 测序得到的， SELEX 技术本身指的就是指数富集进化， 在最后一轮即第 10 轮得到的产 物， 无论是 27 条还是 270 条甚至更多， 其对配体 ( 糜蛋白酶 ) 的结合能力和专一性是一致 的， 因为结合能力弱和专一性差的序列在之前的筛选过程中已经被淘汰掉， 指数富集的意 义就在于新一轮筛选产物的亲和力和专一性都要比上一轮产物的亲和力和专一性得到了 指数级别的提升， 随着一轮一轮筛选的进行， 在亲和力不再提升的第 10 轮产物中， 所述 27 条糜蛋白酶核酸适配子每一条表现出的亲和力和特异性是一致的， 至少处于同一个数量级
上， 所以， 实施例 2 中得到的核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的 27 条糜 蛋白酶核酸适配子中任何一条都具有代表性。实施例 3 的数据虽然只是应用核苷酸序列表 中 SEQ ID No.1 所述的糜蛋白酶核酸适配子得到的， 但具有科学的代表性， 可以证明 SEQ ID No.2 ～ SEQ ID No.27 所述的糜蛋白酶核酸适配子均具有同样的功能。
背景技术 糜蛋白酶是一种胰腺分泌的蛋白水解酶， 能迅速分解变性蛋白质， 其作用、 用途与 胰蛋白酶相似， 但比胰蛋白酶分解能力强、 毒性低、 不良反应小。糜蛋白酶具有酶切位点专 一性强的特点， 它能优先水解酪氨酸和苯丙氨酸的羧基所形成的肽键。酶作用最优 pH 值为 8.0 ～ 9.0。糜蛋白酶是特异性较强的蛋白酶， 已经成为一种测定蛋白质氨基酸序列不可或 缺的工具。 基于以上糜蛋白酶的特性， 在蛋白质组学的研究中， 糜蛋白酶受到越来越多的重 视， 并已经得到广泛的应用。
SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术， 是上世纪 90 年代由 Tuerk 和 Ellington 等 人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术， 构建人工合成的随机寡核苷酸 文库， 其中随机序列长度一般在 20 ～ 40nt 左右， 两端引物序列一般在 20nt 左右， 文库容量 14 15 大约在 10 ～ 10 范围内。由于单链寡核苷酸随机序列， 尤其是 RNA 序列容易形成凸环、 发 卡、 假节、 G- 四聚体等二级结构， 故能与蛋白质、 肽段、 药物、 氨基酸、 有机化学物， 甚至是金 属离子相结合， 形成具有很强结合力的复合体。
SELEX 技术具有经济、 简便、 快速等特点。 与其他组合化学库如随机肽库、 抗体库和 噬菌体表面展示文库相比， 从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配子具有很多优势 ： (1) 寡核苷酸本身分子量较小， 易于合成， 便于后续试验 ； (2) 某些核酸适配子具有强于抗体的 亲和性和特异性， 无免疫原性 ； (3) 核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性 ； (4) 稳定性好， 易于保存和运输， 对高温和剧烈环境不敏感。因此， 寡核苷酸适配子在生物感应 器的制备、 目标物质的分析检测， 以及临床诊断和疾病治疗中都具有良好的应用前景。
目前， 尚无有关与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法 和应用的研究报道。
SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术， 是上世纪 90 年代由 Tuerk 和 Ellington 等 人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术， 构建人工合成的随机寡核苷酸 文库， 其中随机序列长度一般在 20 ～ 40nt 左右， 两端引物序列一般在 20nt 左右， 文库容量 14 15 大约在 10 ～ 10 范围内。由于单链寡核苷酸随机序列， 尤其是 RNA 序列容易形成凸环、 发 卡、 假节、 G- 四聚体等二级结构， 故能与蛋白质、 肽段、 药物、 氨基酸、 有机化学物， 甚至是金 属离子相结合， 形成具有很强结合力的复合体。
SELEX 技术具有经济、 简便、 快速等特点。 与其他组合化学库如随机肽库、 抗体库和 噬菌体表面展示文库相比， 从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配子具有很多优势 ： (1) 寡核苷酸本身分子量较小， 易于合成， 便于后续试验 ； (2) 某些核酸适配子具有强于抗体的 亲和性和特异性， 无免疫原性 ； (3) 核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性 ； (4) 稳定性好， 易于保存和运输， 对高温和剧烈环境不敏感。因此， 寡核苷酸适配子在生物感应 器的制备、 目标物质的分析检测， 以及临床诊断和疾病治疗中都具有良好的应用前景。
目前， 尚无有关与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法 和应用的研究报道。
发明内容 本发明的目的是克服上述现有技术中的不足， 提供一组糜蛋白酶核酸适配子， 所 述核酸适配子与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力。
本发明的第二个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 所述方法利用 分子生物学技术中的 SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术为手段， 结合表面修饰的顺磁 性磁珠的使用， 对糜蛋白酶的核酸适配子进行筛选、 扩增和测序， 最终获得与糜蛋白酶具有 高特异性和高亲和力的一组核酸适配子。
本发明的第三个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的应用， 所述核酸适配子与 糜蛋白酶相结合， 与相结合的糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力， 可用于对糜蛋白酶进行
本发明的第二个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 所述方法利用 分子生物学技术中的 SELEX 技术， 即系统进化指数富集技术为手段， 结合表面修饰的顺磁 性磁珠的使用， 对糜蛋白酶的核酸适配子进行筛选、 扩增和测序， 最终获得与糜蛋白酶具有 高特异性和高亲和力的一组核酸适配子。
本发明的第三个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的应用， 所述核酸适配子与 糜蛋白酶相结合， 与相结合的糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力， 可用于对糜蛋白酶进行
检测、 分离、 纯化以及固定化， 应用于生物感应器的制备、 目标物质的分析检测， 以及制备用 于临床诊断的试剂和疾病治疗的药物。
本发明的第四个目的是提供一种糜蛋白酶反应器及其制备方法， 所述糜蛋白酶反 应器是以所述的一组糜蛋白酶核酸适配子之一为基础制备得到的。
本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子在蛋白质组学新技术新方法关键技术的 研究及应用中具有很强的适用性、 经济性。
本发明的技术方案如下 ：
一组糜蛋白酶核酸适配子， 所述糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列选自核苷酸序 列表中数字标识符 <210> 所表示的序列标识符 1 ～ 27 所述的核苷酸序列， 即核苷酸序列表 中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27。
所述 SEQ ID No.1 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.2 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.3 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.4 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.5 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.6 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.7 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.8 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.9 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.10 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.11 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.12 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.13 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：所述 SEQ ID No.14 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.15 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.16 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.17 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：所述 SEQ ID No.18 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.19 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.20 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.21 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：所述 SEQ ID No.22 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.23 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.24 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.25 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.26 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列具有下述结构 ：
所述 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列结构是以 SEQ ID No.1 ～ SEQID No.27 所述的核苷酸序列为基础， 通过 Internet-tool Mfold 在线软件生成， 所述软件 网址为： http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-forml. cgi。
所述核酸适配子是与核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷 酸序列之一序列一致性为 60％以上， 并且具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是能够与核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的 核苷酸序列之一杂交， 并且具有相同功能的寡核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一转录的 RNA 序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一的不少于一个位置的 A 或 T 或 C 或 G 被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄 嘌呤置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸 序列之一的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生 物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰所得到的具有相同 功能的核苷酸序列。
一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 包括以下步骤 ：
(1) 用作筛选的 ssDNA( 单链 DNA) 的制备 ： 使用上游引物和生物素修饰的下游引 物对原始随机寡核苷酸库进行 PCR 扩增， 扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收， 得 到回收的产物， 将回收的产物与表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠反应， 再利用碱变 性， 磁力分离去除磁珠， 得到 ssDNA 溶液， 将所述 ssDNA 溶液用酸中和后， 得到作为筛选的 ssDNA 随机文库 ；
(2)PCR 扩增与糜蛋白酶特异结合的 ssDNA， 之后进入下一轮筛选 ；
(3) 进行不少于 10 轮循环的筛选， 获得目的核酸适配子扩增后高拷贝数的 PCR 产 物； 其中， 每隔 3 轮循环的筛选， 进行 1 次反筛选， 即利用未结合糜蛋白酶的固载基质为目 标， 进行 ssDNA 的孵育筛选， 并去除反筛选后的固载基质， 这样， 与固载基质特异性结合的 非目的 ssDNA 便被排除掉 ；
(4) 将最后一轮筛选获得的 ssDNA 经 PCR 扩增的产物克隆至菌株中， 在合适的条 件下培养， 得到菌落后挑菌、 测序， 得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序 列。
一组糜蛋白酶核酸适配子的应用， 所述核酸适配子可用于对糜蛋白酶进行检测、 分离、 纯化以及固定化， 应用于生物感应器的制备、 目标物质的分析检测， 以及制备用于临 床诊断的试剂和疾病治疗的药物 ； 特别是应用于酶反应器制备过程中糜蛋白酶的固定化， 以及固定化后的糜蛋白酶反应器的研究与应用。
一种糜蛋白酶反应器， 所述糜蛋白酶反应器是以核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子为基础制备得到。
一种糜蛋白酶反应器的制备方法， 其特征在于 ： 所述制备方法包括以下步骤 ：(1) 表面氨基修饰的硅胶颗粒与戊二醛进行反应， 而后加入 5’ 端氨基修饰的核苷 酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子， 持 续磁力搅拌， 最终得到表面接枝有所述 5’ 端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒 ；
(2) 使用动态混匀器将所述硅胶颗粒装填至聚醚醚酮色谱微柱中 ；
(3) 填充结实后， 用 Tris-HCl 缓冲液平衡所述聚醚醚酮色谱微柱系统， 然后将糜 蛋白酶溶解到 Tris-HCl 缓冲液中， 以流动相方式进样， 使糜蛋白酶流经所述聚醚醚酮色谱 微柱并进行动态固定化， 得到糜蛋白酶反应器 ；
(4) 制备好的糜蛋白酶反应器， 作为蛋白质类样品的在线酶解反应器进行蛋白质 类样品的酶解反应， 用于蛋白质和蛋白质组学的研究 ；
(5) 所述酶解反应结束后， 使用乙腈水溶液作为流动相冲洗， 可将固载到核苷酸序 列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子上的糜蛋 白酶洗脱， 洗脱后的糜蛋白酶溶液置于≤ -20℃条件下保存， 再次使用前将其解冻， 重复所 述步骤 (3) 将其重新固载， 糜蛋白酶反应器即可恢复功能， 达到循环使用、 可再生的目的。
其中， 步骤 (5) 所述的乙腈水溶液优选为 60％的乙腈水溶液 ； 所述洗脱后的糜蛋 白酶溶液的保存条件优选为 -20℃。 有益效果
1. 本发明采用的技术可以高通量地筛选与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的 核酸适配子 ；
2. 核酸适配子具有抗体不具备的一些优势， 如体外筛选、 合成、 易于修饰和稳定性 高等特点 ；
3. 筛选出的与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子， 可以特异性的结 合糜蛋白酶， 成为糜蛋白酶固定化的固载辅助材料。
附图说明 图 1 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 1 ～ 9 轮 SELEX 筛选后得到的 ssDNA 通过 PCR 得到的产物经 3％琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图。
图 2 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 10 轮 SELEX 筛 选后得到的 ssDNA 通过 PCR 扩增后得到的产物经 3％琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图。
图 3 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 1 ～ 10 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 与糜蛋白酶结合力测定的变化图。
图 4 为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中， 第 10 轮 SELEX 筛 选的 PCR 产物经 pEASY-T1 克隆试剂盒克隆到 Tran1-T1 载体后， 于含有卡那霉素的 LB 固体 培养基上培养 12 小时后的菌斑生长情况。
具体实施方式
为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式， 下面给出实施例。 实施例 1
一组糜蛋白酶核酸适配子， 其特征是具有核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列之一。
核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 所述的核苷酸序列 ： cccaagcttg ggtatgagag gagaggtcgt gtcaccgcgg gcaaggttta ctgcttagca gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag aagttatcgc ggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag 80 No.2 所述的核苷酸序列 ： caaaccatac gttgcaccga gcggggttgg ttgaaggtcg No.3 所述的核苷酸序列 ： ctgcagattg cttaactgtt atggctaact gtaggtttta No.4 所述的核苷酸序列 ： ggatcctcag ccacgctgaa cgtgggcagc gcatcaaggt No.5 所述的核苷酸序列 ： gtgacttcgt aaggggatag tggaaagcgt cgtaaccccg No.6 所述的核苷酸序列 ： tgtacagccc atattacctg catagaggta aagctgcgcc No.7 所述的核苷酸序列 ： gaactggacc gatcagtggt gaatgagagt cggctcaccc No.8 所述的核苷酸序列 ： gcgtggtaga ggttcgcatc taagttggac gtgacatgac No.9 所述的核苷酸序列 ： gcagcaagca ttcagatgtc ggagggtcat gatctggtcg No.10 所述的核苷酸序列 ： gggatgtgcg taactaagga agcatgcgag cgaggggcag No.11 所述的核苷酸序列 ： ggaggtccag cactaagagg aagctctcaa gggatgcacg No.12 所述的核苷酸序列 ： tatgatcgat tgcgttgggt agcaattggg taatagttag No.13 所述的核苷酸序列 ： gataagtatc tacggcaata ctgaatgggc actactctta3960
60 79 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag aagttatcgc ggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag aagttatcgc ggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag gaagttatcg cggatccgcg 核苷酸序列表中 SEQ ID cccaagcttg ggtatgagag80 No.14 所述的核苷酸序列 ： ggcacggaaa gatatccaga agtatggacg cgcattagcg No.15 所述的核苷酸序列 ： gggccaaagc gtaaaagatg taatgttata tgacttgatc No.16 所述的核苷酸序列 ： gtcacgcgcg ttaaacggag aggctattaa agctttgtgg No.17 所述的核苷酸序列 ： cactgagaga agattgggtc taacataagg tcttagcagg No.18 所述的核苷酸序列 ： cccagggggg aaactcatct ggttcagtag gagccctgcg No.19 所述的核苷酸序列 ： gacaagcttg tcccaggcgg aacgggccgc attagtgttc No.20 所述的核苷酸序列 ： atttcctagg ctgggccaga ggggcacagc cactcccatt No.21 所述的核苷酸序列 ： cttaggtcac accagtcggg gggggcgttg gtaaaacatg No.22 所述的核苷酸序列 ： gttgataggt gtaaccgcgc gtttgtaagg gaatgcaaac No.23 所述的核苷酸序列 ： cagccgagtt actgttgatg gatagatcgt ccacgagccg No.24 所述的核苷酸序列 ： gacaagcttg tcccaggcgg aacgggccgc attagtgttc No.25 所述的核苷酸序列 ： atttcctagg ctgggccaga ggggcacagc cactcccatt No.26 所述的核苷酸序列 ： actgatagaa atccggaact atcccaactt agtcttcctg4060 79 60 80 60 79 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 60 80 aagttatcgc ggatccgcg 79
核苷酸序列表中 SEQ ID No.27 所述的核苷酸序列 ：
cccaagcttg ggtatgagag tgtctgctgg agcactcaga ctgtggaggc gacaagaaag 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
实施例 2
一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法， 包括以下步骤 ：
(1) 首先对原始随机寡核苷酸库进行全库扩增， 以增加其拷贝数， 便于筛选的进 行。以上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行 PCR 扩增， 使用购于 Promega 公司 PCR 试剂盒。反应体系如下 ：
上游引物 100pmol(5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ )
下游引物 100pmol(5’ -biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ )
模板 DNA 5μg(5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG-40N
GAAGTTATCGCGGATCCGCG 3’ )
其中， 所述下游引物是生物素修饰的下游引物。
PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 5 分钟， 热循环共 20 次， 热循环条件为 94℃变性 1 分 钟， 55℃复性 50 秒， 72℃延伸 50 秒， 最后 72℃延伸 10 分钟。
得到 PCR 扩增的产物， 将所述产物进行 3％琼脂糖凝胶电泳， 对目标条带进行胶回 收， 以去除聚合酶和未反应的引物。使用 EppendorfBioPhotometer Plus 对回收的 DNA 进 行定量， 并根据 DNA 的量决定表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠加入量， 所述 DNA 与磁 珠的摩尔比为 1 ∶ 3。将 DNA 与磁珠孵育 30 分钟后， 用 PBS-T 缓冲液清洗磁珠 2 遍， 然后 用 200μL100mM 的 NaOH 使 dsDNA( 双链 DNA) 变性， 磁力分离， 去除磁珠， 得到 ssDNA 溶液， 将所述 ssDNA 溶液用酸中和后， 得到用作筛选的 ssDNA 随机文库。
(2) 甲苯磺酰基修饰的磁珠购于北京思尔成公司， 按磁珠的使用说明书将糜蛋白 酶以共价结合形式固定在所述甲苯磺酰基修饰的磁珠上， 得到共价结合糜蛋白酶的甲苯磺 酰基修饰的磁珠， 以所述共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠为靶目标进行糜蛋白 酶核酸适配子的第 1 轮 SELEX 筛选 ： 将所述共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠与 步骤 (1) 中所述用作筛选的 ssDNA 随机文库在 37℃下孵育 2 小时， 之后进行磁力分离， 并用 PBS 缓冲液清洗磁珠 2 遍， 加入 100μL PBS 缓冲液， 在 94℃水浴锅中静置 10 分钟， 之后行 磁力分离磁珠， 获得 100μL 含有 ssDNA 的 PBS 溶液， 将所述含有 ssDNA 的 PBS 溶液为模板， 以上游引物 (5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ ) 和生物素修饰的下游引物 (5’ -biotin-C6-C GCGGATCCGCGATAACTTC 3’ ) 进行 PCR， 并进行电泳检测， 得到 80bp 的目标条带后切胶回收， 再次进行 ssDNA 的制备， 所述 ssDNA 的制备方法同步骤 (1) 中对目标条带进行胶回收之后 的操作方法， 得到第 1 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 文库 ； 以所述第 1 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 文库为模板进行第 2 轮 SELEX 筛选。
(3) 之后每一轮 SELEX 筛选均按照所述步骤 (2) 中第 1 轮 SELEX 筛选的方法进行， 不同的是随着筛选的进行， PCR 中引物的用量和热循环次数逐渐减少， 具体的为 ： 第 1 轮～ 第 3 轮引物用量 100pmol， 热循环 25 次 ； 第 4 轮～第 7 轮引物用量 80pmol， 热循环 20 次 ； 第 8 轮～第 10 轮引物用量 60pmol， 热循环 15 次。其中， 每隔 3 轮 SELEX 筛选， 要进行 1 次反筛 选， 即使用未固定糜蛋白酶的甲苯磺酰基磁珠为靶目标， 与前一轮 SELEX 筛选得到的 ssDNA文库进行孵育， 2 小时后磁力分离去除磁珠， 这样便可将与磁珠特异性结合的 ssDNA 除去， 避免磁珠对筛选的影响。如图 1 所示， ladder( 分子量阶梯 ) 为 10bp， 左侧的是阴性对照， ladder 右侧从左到右的依次是第 1 轮到第 9 轮的 PCR 产物， 所有 PCR 产物的条带都显示在 80bp 处， 阴性对照条带集中在 20bp 处， 是引物的指示带。
经过 10 轮的 SELEX 的筛选， 将每 1 轮制备出的 ssDNA 与等摩尔质量的糜蛋白酶 进行酶联免疫吸附实验， 对各轮 ssDNA 对糜蛋白酶的结合量和结合能力进行表征。如图 3 所示， 图 3 中左侧纵坐标表示吸光度 (absorbency)， 横坐标 1 ～ 10 分别表示第 1 ～ 10 轮 SELEX 的筛选制备出的 ssDNA 与等摩尔质量的糜蛋白酶进行酶联免疫吸附实验后的样品， 横坐标 11 和 12 为空白对照样品。可以看到， 通过 10 轮的筛选， 糜蛋白酶与 ssDNA 的结合 力不再升高， 达到饱和状态， 所以在第 10 轮筛选之后， 终止 SELEX 筛选。
(4) 在得到第 10 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 之后， 对所述第 10 轮 SELEX 筛选出 的 ssDNA 进 行 PCR 扩 增， 使 用 的 引 物 是 无 修 饰 的 上 游 引 物 (5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ )50pmol 和无修饰的下游引物 (5’ CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ )50pmol， 热循环次数为 15 次， 扩增结束后电泳检测， 结果如图 2 所示， 10bp 的 ladder 两侧均为第 10 轮 PCR 扩增的产 物， 所有产物的条带都显示在 80bp 处， 产物条带明亮清晰。使用 pEASY-T1 克隆试剂盒将第 10 轮 SELEX 筛选出的 ssDNA 经 PCR 扩增的产物克隆至 Tran1-T1 感受态细胞中， 经过热激、 孵育后， 均匀的将其涂布于含有卡那霉素的 LB 固体培养基上， 37℃培养 12 小时， 菌株生长 出， 如图 4 所示， 菌株菌落呈白色圆斑状， 清晰明显， 挑选其中的单个菌落， 置于 LB 液体培养 基中， 37℃培育 4 小时， 然后进行测序， 最终得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的 核苷酸序列， 所述核苷酸序列为核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸 序列之一， 所述核酸适配子与糜蛋白具有高特异性和高亲和力。
本实施例中用于 SELEX 筛选的原始随机寡核苷酸库由 TaKaRa 公司合成， 引物序列 由 Invitrogen 公司合成， 其中原始随机核苷酸文库中有 40 个碱基为随机产生， 序列为 5’ 15 CCCAAGCTTGGGTATGAGAG-40N-GAAGTTATCGCGGATCCGCG 3’ ， 库容量为 10 ， 上游引物序列为 ： 5’ CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’ ， 下游引物序列为 ： 5’ CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ ， 生物素修饰 的下游引物序列为 ： 5’ -biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’ ， 甲苯磺酰基修饰的磁珠和 链霉亲和素修饰的磁珠购于北京思尔成公司， PCR 试剂盒购于 Promega 公司， Tran1-T1 载体 和 pEASY-T1 克隆试剂盒购于北京全式金公司， 糜蛋白酶购于 Sigma 公司。
实施例 3
以核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述核苷酸序列之一的糜蛋白 酶核酸适配子为基础的糜蛋白酶反应器的制备与应用。
将实施例 2 中获得的糜蛋白酶核酸适配子 ( 核苷酸序列表中 SEQ ID No.1)、 表面 氨基修饰的硅胶颗粒、 戊二醛和聚醚醚酮 (PEEKsil) 色谱微柱等作为实验材料， 对糜蛋白 酶进行动态固定化， 步骤如下 ：
(1) 称取 40mg 表面氨基修饰的硅胶颗粒， 室温下与戊二醛持续磁力搅拌反应 2 小 时， 反应后用 NaCO3/NaHCO3(20mM， pH ＝ 9.2) 缓冲液清洗 3 次， 再用三蒸水清洗 3 次， 之后加 入 5’ 端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子 ( 核苷酸序列表中 SEQ ID No.1)， 持续磁力搅拌反 应 3 小时后， 用 NaCO3/NaHCO3 缓冲液清洗 3 次、 三蒸水清洗 3 次， 最终得到表面接枝有所述 5’ 端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒 ；(2) 将所述硅胶颗粒装入到动态混匀器的磁力搅拌腔中， 将聚醚醚酮色谱微柱的 一端安装柱前过滤器， 前过滤器筛板孔径为 2μm， 以防止填充颗粒的流失， 将聚醚醚酮色谱 微柱的另一端接到动态混匀器的四通阀上， 将动态混匀器中的磁力搅拌器与微流泵相连， 准备填充 ；
(3) 首先用 0.1mL min-1 流速的色谱级纯乙腈填充动态混匀器的磁力搅拌腔 5 分 钟。之后将所述乙腈的流速调整至 0.01mL min-1， 直到聚醚醚酮色谱微柱末端有乙腈流出， 打开磁力搅拌器的开关开始装填聚醚醚酮色谱微柱， 关泵， 压力降为零后将聚醚醚酮色谱 微柱卸下， 并在聚醚醚酮色谱微柱的另一端安装柱前过滤器， 得到制备好的聚醚醚酮色谱 微柱 ； 将制备好的聚醚醚酮色谱微柱接到微流液相系统中， 用 0.1mL min-1 流速的三蒸水冲 洗平衡 ；
(4) 平衡后， 用 10mM Tris-HCl(pH ＝ 8.0) 缓冲液平衡聚醚醚酮色谱微柱系统 30 分钟， 流速设定为 5μL min-1， 然后将糜蛋白酶溶解到所述 Tris-HCl 缓冲液中， 以流动相方 式进样， 让所述含有糜蛋白酶的 Tris-HCl 缓冲液流经聚醚醚酮色谱微柱并在聚醚醚酮色 谱微柱内部进行动态固定化， 在 273nm 波长处检测糜蛋白吸收峰， 30 分钟后固定化过程结 束， 继续用色谱级的纯乙腈冲洗聚醚醚酮色谱微柱， 平衡 30 分钟， 得到糜蛋白酶聚醚醚酮 反应器， 即固定化后的糜蛋白酶反应器 ； (5) 将所述制备好的糜蛋白酶反应器， 以 5μL min-1 的流速分别酶解 100μL 1mg mL-1 的牛血清白蛋白、 肌红蛋白、 细胞色素 C 3 种蛋白， 以及所述 3 种蛋白的混合物， 1小 时后收集酶解后的样品， 冷冻干燥， 用色谱流动相 ( 含 0.1 ％甲酸的水溶液 ) 溶解后进 HPLC-ESI-Trap 系统， 检测 ；
(6) 经过酶解后的 3 种蛋白以及 3 种蛋白的混合物， 通过质谱检测， 分别酶解的 3 种蛋白的肽段覆盖率分别为 ： 牛血清白蛋白 23％、 肌红蛋白 43％、 细胞色素 C 58％， 3种 蛋白的混合物酶解后肽段覆盖率分别为 ： 牛血清白蛋白 22％、 肌红蛋白 41％、 细胞色素 C 53％， 连续三天进行平行实验， 结果相差不明显， 说明聚醚醚酮色谱微柱中的糜蛋白酶活力 保持较好 ；
(7) 实验结束后， 使用 60％的乙腈水溶液作为流动相冲洗， 可将固载到所述核酸 适配子上的糜蛋白酶洗脱， 洗脱后的糜蛋白酶溶液置于 -20℃保存， 再次使用前将其解冻， 利用动态固定化方法， 即步骤 (4) 将其重新固载， 所述糜蛋白酶反应器即可恢复功能 ；
(8) 用所述恢复功能后的糜蛋白酶反应器对细胞色素 C 进行了 3 次重复酶解， 肽段 覆盖率分别为 52％、 50％、 51％， 这样， 利用所述糜蛋白酶核酸适配子为基础的糜蛋白酶反 应器， 达到了酶解的高效率， 并实现了糜蛋白酶的回收和再生， 节约了实验成本。
本发明所述具有核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的核苷酸序 列的一组共 27 条糜蛋白酶核酸适配子是在 SELEX 筛选 10 轮后得到的混合物， 经过转染、 克隆、 测序得到的， SELEX 技术本身指的就是指数富集进化， 在最后一轮即第 10 轮得到的产 物， 无论是 27 条还是 270 条甚至更多， 其对配体 ( 糜蛋白酶 ) 的结合能力和专一性是一致 的， 因为结合能力弱和专一性差的序列在之前的筛选过程中已经被淘汰掉， 指数富集的意 义就在于新一轮筛选产物的亲和力和专一性都要比上一轮产物的亲和力和专一性得到了 指数级别的提升， 随着一轮一轮筛选的进行， 在亲和力不再提升的第 10 轮产物中， 所述 27 条糜蛋白酶核酸适配子每一条表现出的亲和力和特异性是一致的， 至少处于同一个数量级
上， 所以， 实施例 2 中得到的核苷酸序列表中 SEQ ID No.1 ～ SEQ ID No.27 所述的 27 条糜 蛋白酶核酸适配子中任何一条都具有代表性。实施例 3 的数据虽然只是应用核苷酸序列表 中 SEQ ID No.1 所述的糜蛋白酶核酸适配子得到的， 但具有科学的代表性， 可以证明 SEQ ID No.2 ～ SEQ ID No.27 所述的糜蛋白酶核酸适配子均具有同样的功能。
本发明包括但不限于以上实施例， 凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等 同替换或局部改进， 都将视为在本发明的保护范围之内。44102373212 A CN 102373215
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