海岛棉脂质转运蛋白及其在纤维改良上的应用 技术领域 本发明涉及一种具有脂质转运功能的蛋白， 在棉花纤维中特异表达编码该蛋白的 基因能够提高棉花品种的纤维长度。
背景技术 利用基因工程手段提高棉花的纤维品质包括棉花的纤维长度是当前棉花分子育 种的重要方向。
植物脂质转运蛋白 (LTP) 是一类小分子碱性蛋白， 占植物可溶性总蛋白的 4％左 右。LTP 是一种多功能的蛋白家族， LTP 蛋白家族的成员不仅参与了磷脂在生物膜之间的运 输， 而且还在生物膜、 角质和脂质的形成、 植物的生殖发育以及信号的转导等生物过程中发 挥了重要的作用。近期的研究表明， LTP 蛋白具有信号肽， 可以从细胞内分泌到细胞外并定 位于细胞壁上。 LTP 蛋白的细胞壁定位功能对于植物的抗病反应、 抗逆境反应 ( 高温、 高盐、 干旱协迫 )、 以及生物膜和脂质的形成具有重要作用。
在棉花的纤维发育过程中， 脂类代谢在棉纤维快速伸长中发挥了重要的作用。在 棉花胚培养基中添加碳链长度在 20 以上的脂类化合物能够促进纤维的伸长发育。烟草中 脂类运输蛋白基因的研究表明， 脂类运输蛋白具有疏松细胞壁的功能。 但是到目前为止， 哪 种蛋白参与运输 C20 以上的脂类化合物并不清楚， 利用基因工程手段提高棉花的纤维长度 也没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的脂质转运蛋白基因以及其片段、 类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途， 尤 其是在提高棉花脂质转运蛋白在胚细胞中的表达水平从而促进棉花纤维伸长方面的用途。
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次采用分子克隆方法从海岛棉胚特异表达的 cDNA 中分离获得了新的 ltp 基因， 并且通过实验证实了它具有促进纤维伸长功能， ltp 基因 转入植物后可导致棉花纤维伸长。在此基础上完成了本发明。
本发明包括以下内容 ：
1、 提供了一种新的分离出的脂质转运蛋白 ( 以下简称为 “LTP” 蛋白质 )， 包含 ：
具有 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其 活性衍生物。较佳地， 该多肽选自下组 ： (a) 具有 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列的多肽 ； (b) 将 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列经过一个或多个 ( 较佳地 1-20 个 ) 氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且具有促进棉花纤维伸长功能的 LTP 蛋白质活性的由 (a) 衍生的多肽。
2、 提供了编码上述多肽的多核苷酸， 选自 ：
(a) 编码上述 LTP 蛋白质多肽的多核苷酸 ； 和 (b) 与多核苷酸 (a) 互补的多核苷 酸。较佳地， 该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO ： 2 所示氨基酸序列的多肽。更佳地， 该多核苷酸的序列是选自下组的一种 ： (a) 具有 SEQ ID NO ： 1 中 1-363 位的序列 ； (b) 具有 SEQ ID NO ： 1 中 1-400 位的序列。
3、 提供了含有上述多核苷酸的载体， 以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被 上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
4、 提供了制备上述 LTP 蛋白质多肽的方法， 该方法包含 ： (a) 在适合表达的条件 下， 培养上述被转化或转导的宿主细胞 ； (b) 从培养物中分离出具有活性的多肽。
5、 提供了上述多核苷酸和 LTP 蛋白质多肽的用途， 即， 在培育提高棉花纤维长度 的棉花品种方面的应用。
6、 提供了一种改变植物脂质转运蛋白， 以提高棉花纤维品质的方法， 它包括步 骤：
(1) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述的表达载体含有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 多核苷酸， 所述的 LTP 选自下组 ：
(a) 具有 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列的多肽 ；
(b) 将 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 而形成的， 且具有促进棉花纤维伸长的由 (a) 衍生的多肽 ； (2) 将植物细胞或组织或器官与步骤 (1) 中的农杆菌接触， 从而使 lpt 基因编码序 列转入植物细胞， 并且整合到植物细胞的染色体上 ；
(3) 选择出转入 lpt 基因的 DNA 编码序列的植物细胞或组织或器官 ；
(4) 将步骤 (3) 中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
在本发明中， 术语 “LTP 蛋白质” 、 “LTP 多肽” 或 “脂质转运蛋白” 可互换使用， 都指 具有 LTP 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2) 的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的 LTP 蛋白质。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， “分离的 LTP 蛋白或多肽” 是指 LTP 多肽基本上不含天然与其相关的 其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化 LTP 蛋白质。
本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。本发明的多 肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原核或真核宿主 ( 例 如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞 ) 中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起 始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括 LTP 蛋白质的片段、 衍生物和类似物。如本文所用， 术语 “片段” 、 “衍生物” 和 “类似物” 是指基本上保持本发明的天然 LTP 蛋白质相同的生物学功能或活性 的多肽。本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i) 有一个或多个保守或非保守性氨 基酸残基 ( 优选保守性氨基酸残基 ) 被取代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也 可以不是由遗传密码编码的， 或 (ii) 在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或
(iii) 成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽， 或 (iv) 附加的氨基酸序列融合到此多 肽序列而形成的多肽 ( 如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列 )。 根据本文所述， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中， 术语 “LTP 多肽” 指具有脂质转运活性的 SEQ ID NO.2 序列的多肽。 该术语还包括具有与 LTP 蛋白质相同功能的、 SEQ ID NO.2 序列的变异形式。这些变异形 式包括 ( 但并不限于 ) ： 若干个 ( 通常为 1-50 个， 较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20 个， 最佳地 1-10 个 ) 氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个 ( 通 常为 20 个以内， 较佳地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内 ) 氨基酸。例如， 在本领域中， 用性 能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 LTP 蛋白的活 性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括 ： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导 突变体、 在高或低的严谨程度条件下能与 ltp DNA 杂交的 DNA 所编码的蛋白。本发明还提 供了其他多肽， 如包含 LTP 多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外， 本发明还包 括了 LTP 多肽的可溶性片段。通常， 该片段具有 LTP 多肽序列的至少约 10 个连续氨基酸， 通常至少约 30 个连续氨基酸， 较佳地至少约 50 个连续氨基酸， 更佳地至少约 80 个连续氨 基酸， 最佳地至少约 100 个连续氨基酸。
发明还提供 LTP 蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然 LTP 多肽的差别可以 是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。 这些多 肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。
在本发明中， “LTP 蛋白质保守性变异多肽” 指与 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列相比， 有至多 10 个， 较佳地至多 8 个， 更佳地至多 5 个， 最佳地至多 3 个氨基酸被性质相似或相近 的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表 1 进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 Ala(A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gln(Q) Glu(E) 代表性的取代 Val ； Leu ； Ile Lys ； Gln ； Asn Gln ； His ； Lys ； Arg Glu Ser Asn Asp 优选的取代 Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp5102321163 A CN 102321168 Gly(G) His(H) Ile(I) Leu(L) Lys(K) Met(M) Phe(F) Pro(P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V)
Pro ； Ala说明书Ala Arg Leu Ile Arg Leu Leu Ala Thr Ser Tyr Phe Leu4/12 页Asn ； Gln ； Lys ； Arg Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe Ile ； Val ； Met ； Ala ； Phe Arg ； Gln ； Asn Leu ； Phe ； Ile Leu ； Val ； Ile ； Ala ； Tyr Ala Thr Ser Tyr ； Phe Trp ； Phe ； Thr ； Ser Ile ； Leu ； Met ； Phe ； Ala本发明的多核苷酸可以是 DNA 形式或 RNA 形式。DNA 形式包括 cDNA、 基因组 DNA 或人工合成的 DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA 可以是编码链或非编码链。编码成 熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO ： 1 所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。 如 本文所用， “简并的变异体” 在本发明中是指编码具有 SEQ ID NO ： 2 的蛋白质， 但与 SEQ ID NO ： 1 所示的编码区序列有差别的核酸序列。 编码 SEQ ID NO ： 2 的成熟多肽的多核苷酸包括 ： 只编码成熟多肽的编码序列 ； 成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列 ； 成熟多肽的编码序列 ( 和任选的附加编码序列 ) 以及非编码序列。
术语 “编码多肽的多核苷酸” 可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也可以是还包括 附加编码和 / 或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、 类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。 如本 领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50 ％， 较佳地至少 70％， 更佳地至少 80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多 核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中， “严格条件” 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温
度下的杂交和洗脱， 如 0.2×SSC， 0.1％ SDS， 60℃； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50％ (v/v) 甲酰胺， 0.1％小牛血清 /0.1％ Ficoll， 42℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 90％以上， 更好是 95％以上时才发生杂交。并且， 可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO ： 2 所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用， “核酸片段” 的长度至 少含 15 个核苷酸， 较好是至少 30 个核苷酸， 更好是至少 50 个核苷酸， 最好是至少 100 个核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术 ( 如 PCR) 以确定和 / 或分离编码 LTP 蛋白质 的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供， 更佳地被纯化至均质。
本发明的 LTP 核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、 PCR 扩增法、 或重组 法的方法获得。例如首先根据 SEQ ID NO ： 1 的序列进行全序列合成。
对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开放阅读框序 列来设计引物， 并用人工合成的 LTP 核苷酸全长序列或其片段作为模板， 扩增而得有关序 列。
一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。通常， 通 过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白 ( 或其片段和衍生物 ) 的 DNA 序列。然后可将该 DNA 序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA 分子 ( 或如载体 ) 和细胞中。此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 ltp 基因编 码序列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组 DNA 技术 (Science， 1984 ； 224 ： 1431)， 可利用本发明的多聚核苷 酸序列可用来表达或生产重组的 LTP1 多肽。一般来说有以下步骤 ：
(1). 用本发明的编码 LTP 多肽的多核苷酸 ( 或变异体 )， 或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞 ；
(2). 在合适的培养基中培养的宿主细胞 ；
(3). 从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中， LTP 蛋白质多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语 “重组表达载 体” 指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒或其他 载体。总之， 只要能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个 重要特征是通常含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 ltp 基因编码 DNA 序列和合适的转录 / 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA 合成技术、 体内重组技 术等。所述的 DNA 序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA 合成。表达 载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以及绿色荧光蛋
白 (GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当 DNA 序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于转化适 当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞 ； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞 ； 或是高 等真核细胞， 如植物细胞。代表性例子有 ： 大肠杆菌， 链霉菌属、 农杆菌 ； 真菌细胞如酵母 ； 植物细胞 ； 昆虫细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强子序列时将 会使转录得到增强。增强子是 DNA 的顺式作用因子， 通常大约有 10 到 300 个碱基对， 作用 于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细胞。
用重组 DNA 转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl2 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要， 转化也可用电穿孔 的方法进行。当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA 转染方法 ： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械 方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方 法， 例如叶盘法。对于转化的植物细胞、 组织或器官可以用常规方法再生成植株， 从而获得 脂质转运蛋白抗性提高的植物。 获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法 ( 如温度转换或化学诱导 ) 诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞外。 如 果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这 些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于 ： 常规的复性处理、 用 蛋白沉淀剂处理 ( 盐析方法 )、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离心、 分子筛层析 ( 凝胶过滤 )、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层析 (HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
另一方面， 本发明还包括对 ltp 基因的 DNA 或是其片段编码的多肽具有特异性的 多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。较佳地， 指那些能与 LTP 蛋白质基因产物或 片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明中抗体包括那些能够结合 并抑制 LTP 蛋白质的分子， 也包括那些并不影响 LTP 蛋白质功能的抗体。本发明还包括那 些能与修饰或未经修饰形式的 LTP 蛋白质基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体， 而且还包括具有免疫活性的抗体片 段、 或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化 的 LTP 蛋白质基因产物或者其具有抗原性的片段， 可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产 生。与之相似的， 表达 LTP 蛋白质或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗 体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用 LTP 蛋白质 基因产物的片段或功能区， 通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法
制备或利用多肽合成仪合成。与 LTP 蛋白质基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核 细胞 ( 例如 E.Coli) 中生产的基因产物来免疫动物而产生 ； 与翻译后修饰形式结合的抗体 ( 如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽 )， 可以用真核细胞 ( 例如酵母或昆虫细胞 ) 中产生的基 因产物来免疫动物而获得。抗 LTP 蛋白质的抗体可用于检测样品中的 LTP 蛋白质。
多克隆抗体的生产可用 LTP 蛋白质或多肽免疫动物， 如家兔、 小鼠、 大鼠等。多种 佐剂可用于增强免疫反应， 包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还涉及定量和定位检测 LTP 蛋白质水平的测试方法。这些试验是本领域所 熟知的， 且包括 FISH 测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在 LTP 蛋白质的方法是利用 LTP 蛋白质的特异性抗体 进行检测， 它包括 ： 将样品与 LTP 蛋白质特异性抗体接触 ； 观察是否形成抗体复合物， 形成 了抗体复合物就表示样品中存在 LTP 蛋白质。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列 (microarray) 或 DNA 芯片 ( 又称为 “基因芯片” ) 上， 用于基因的表达分析。用 LTP 蛋白质特异的引物进行 RNA- 聚合酶链反应 (RT-PCR) 体外扩增也可检测 LTP 蛋白质的转录产物。
本发明的研究发现， 棉花胚特异表达的脂质转运蛋白 LTP 在棉花纤维快速伸长优 势表达， 并在胚表皮和植物的表皮毛细胞中特异表达， LTP 参与运输 C20 以上的脂类化合 物， 在棉花胚中增强表达 ltp 基因能够提高棉花纤维长度。
在本发明的一个实例中， 提供了一种分离的多核苷酸， 它编码具有 SEQ ID NO ： 2所 示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用原位杂交技术从构建的海岛棉 cDNA 文 库库中分离的。其序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 它包含的多核苷酸序列全长为 400 个碱基， 其 开放读框位于 1-363 位， 编码全长为 120 个氨基酸的 LTP 蛋白质 (SEQ ID NO ： 2)。
本发明的 LTP 蛋白质具有如下特性 ： A)LTP 蛋白在棉花伸长纤维中特异表达， 能够 转运长碳链的脂肪酸 ( ≥ C20) ； B) 脂质转运蛋白纤维改良功能明确， 在棉花纤维中超量表 达该基因能够显著促进纤维伸长。
经实验证实， 转 ltp 基因的棉花植株与对照相比， 转基因植株的棉花纤维质量得 到了明显改进， 纤维长度增加 2.7-3.5mm ； 纤维强度与对照相比增加 0.3-3.3CN/tex。
LTP 蛋白质为促进植物纤维伸长提供了新的途径， 因而具有巨大的应用前景。 通过 将 ltp 基因导入农作物品种 ( 例如棉花 )， 改变现有棉花品种的纤维长度， 可获得脂质转运 蛋白的棉花农作物品种， 解决农业生产中存在的实际问题。 附图说明 图 1 是 lpt 基因遗传转化载体的构建示意图。图中， LB、 RB 分别为 T-DNA 的左右 边界序列。CaMV35S 为烟草花叶病毒 35S 启动子。NOS 为终止子。NPTII 为卡那霉素抗性基 因。fbp 为矮牵牛胚特异表达启动子 ( 见实施例 3)。
图 2 是转 lpt 基因棉花幼苗 (T0) 叶片 PCR 检测图。M 为 DL2000 分子量标记。标 记的分子量分别为 2000、 1000、 750、 500、 250 和 100bp ； P 为阳性对照 (lpt 质粒 ) ； 1-7 为经 过转化 lpt 基因的转基因棉花幼苗 ( 见实施例 4)。
图 3 是转 lpt 基因的棉花植株的 Southern 杂交分析情况。(P ： lpt 基因质粒 DNA ； 1-6 ： 转基因植株 ( 见实施例 5)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的技术的公开， 对本领域的技术 人员而言是显而易见的。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述 的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例 1 脂质转运蛋白的 CDNA 片段克隆
(1) 海岛棉胚组织特异 cDNA 的合成
海岛棉胚组织特异表达 cDNA 合成采用 Clontech 公司的 cDNA 文库构建试剂盒的 方法实施， 该方法的具体步骤如下。
选取海岛棉品种 Pima-90 开花后 2 天的胚组织用于抽提棉花的总 RNA。称取 0.5g 海岛棉胚， 用液氮研磨成细粉， 分装于两个 1.5ml 的 eppendorf 管中。 每管加入 1ml TRIZOL 用力摇动使混合均匀， 室温下放置 5min。然后在 4℃， 12,000g 的条件下离心 10min， 将上 清液吸入干净的 1.5ml 的 eppendorf 管中。每管加 0.2ml 氯仿， 用力振荡 15s， 室温放置 2 ～ 3min。然后在 4 ℃、 12,000g 的条件下离心 15min。将上清液转移到干净的 1.5ml 的 eppendorf 管中， 加入等体积异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min。在 4℃， 12,000g 的条件下 离心 10min。弃上清， 加入 1ml 75％乙醇洗涤， 在 4℃， 7,500g 离心 5min。弃上清， 室温干燥 15-20min 后溶于适量 RNA-free water 中 (55 ～ 60℃水浴 10min 使 RNA 充分溶解 )。所获 得的 RNA 用于 cDNA 合成反应。 按照 QIAGEN 公司的 mRNA 纯化试剂盒的方法将总 RNA 纯化为 mRNA， 然后立刻按照 ClonTECHTM 试剂盒中所提供的方法进行单链 cDNA 合成和双链 cDNA 合成。
(2) 采用 PCR 方法分离脂质转运蛋白基因
设计 PCR 扩增引物 2 条， 分别为 P1 和 P2， 利用在 2 条引物以步骤 (1) 所获得的 cDNA 为模板扩增 ltp 全长基因。PCR 的反应体系为 ： 10×PCR buffer， 3μL ； dNTPs(dATP， dTTP， dGTP)2μL ； MgCl2， 2μL ； 引物 P1 和 P2 各 2μL ； Taq 酶， 2 个单位 ； 棉纤维组织 cDNA， 100ng， 加入无菌水补足 30μL 体系， 迅速混匀后离心。
PCR 扩增条件按照以下程序完成 ：
94℃， 3min， 1cycle ；
94℃， 1min ； 50℃， 1min， 72℃， 1min， 36cycles ；
72℃， 3min， 1cycle。
反应结束后， PCR 产物在 1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。按照 Invitrogen 公 司的 PCR 产物回收试剂和回收 PCR 片段。
(3) 脂质转运蛋白基因的 cDNA 片段的测序验证
PCR 片段与 Takara 公司 PGEM-18T 载体相连接。 连接产物转化大肠杆菌 DH5α。 按 照步骤 (2) 的 PCR 方法鉴定阳性克隆。抽提阳性的大肠杆菌质粒并进行序列测定。
实施例 2 脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因的人工合成
根据已完成的含 400bp 编码区的核苷酸序列， 首先分 8 个区段分别根据正链和副
链序列， 分别合成出长度约 150-200bp、 具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链 各一一对应的 8 个互补的单链寡核苷酸片段分别退火， 形成 8 个带有粘性末端的双链寡核 苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段， 经 T4DNA 连接酶催化组装成一个完整的 ltp 基因。该 合成的 DNA 片段含有 SEQ ID NO ： 1 中 1-363 位的核苷酸序列， 并且合成基因的两端含 XbaI 和 SacI 位点。
将上述人工合成的 5’ 和 3’ 端酶切位点为 XbaI 和 SacI 位点 ltp 基因， 用于下面 脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因植物表达载体的构建。
实施例 3 脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因植物表达载体的构建
脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因植物表达载体构建的具体方法如下 ：
A.pBI121 和 pCAMBIA2301 用 HindIII 和 EcoRI 双 酶 切， 将 pBI121 带 有 p35S-GUS-Nos-ter 的片段连入 pCAMBIA2301， 形成中间载体 p35S-2301-GUS ；
B. 用 XbaI 和 SacI 双切 p35S-2301-GUS 和上述人工合成的 ltp 基因， 用 ltp 置换 p35S-2301-GUS 相应酶切位点的 GUS， 从而获得脂质转运蛋白的 ltp 基因植物表达载体 ( 图 1)。再将其转入农杆菌系 LBA4404 中， 用于转化棉花。
实施例 4 利用农杆菌介导转化构建获得脂质转运蛋白基因的转基因棉花 把含有目的基因的农杆菌在合适抗性的 LB 培养基上划线， 28℃下培养 2 天， 挑取 单菌落接种于 50ml( 浓度为 50mg/L 卡那霉素 ) 的 LB 液体培养基中。培养基在 200rpm， 28 度条件下摇床上培养 42-48 小时。当 OD600 达到 0.3-0.8 之间时， 3000g 离心收集菌体。利 用 1/2MS 液体培养基将收集的菌体稀释至 OD600 ＝ 0.2-0.4 之间。
(1) 外植体与农杆菌的共培养 ： 取上述 5-6 天苗龄的下胚轴， 切成长约 0.5-0.8cm 长的小段， 于 1/2MS 液体培养基稀释的农杆菌菌液中浸泡 15 分钟， 取出， 用滤纸吸干下胚轴 表面的菌液后， 转入不加任何抗生素的固体 CB2.1 培养基中， 每皿 30-40 块下胚轴， 于 25℃ 下共培养 50-60 小时。
(2) 愈伤组织 (callus) 的诱导 ： 用含有 cef 250mg/l 的无菌水洗共培养的下胚 轴 3-4 次， 把下胚轴用无菌滤纸吸干下胚轴表面的水后， 把下胚轴转入 CB3.1 培养基上 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗循环光照培养 ) 培养 3-4 周。小的愈伤组织大约在 3 周时可以被 看到， 然后， 每隔一个月继代培养， 直到愈伤组织达到合适的数量。
(3) 胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导 ： 将一定数量的愈伤组织转入到 CB4 培养基 中， 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗循环光照培养 ) 培养， 每隔一个月继代培养， 直到体细胞胚出 现。
(4) 体细胞胚的萌发 ： 把体细胞胚转到 CB5 培养基中， 让它们萌发并长成小苗。
(5) 转基因植株的获得 ： 转移幼苗 (2-4cm 长， 具有叶子的嫩枝 ) 转到 CB6 培养基中 ( 需要更大的容器 )， 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗循环光照培养 ) 生长 4 个月。将具有较好根 系的转基因植株直接转到含有湿土的小盆中， 并在培养室中 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗， 循 环光照培养 ) 培养 2 周， 然后， 转移这些小盆到温室中。每天对转基因植株进行浇水， 对之 进行施肥等直到棉铃成熟。然后， 收集种子， 4℃保存种子。
(7) 转基因的 PCR 鉴定 ：
用小量抽提植物总 DNA 的方法得到植物总 DNA， 以 1.5μl 总 DNA 为模板以引物 (P1/P2) 进行 PCR 扩增， 共检测了 36 棵无菌棉花苗， 其中有 17 棵被检测到有特异性条带的
阳性植株 (T0)， 部分植株 PCR 产物电泳结果如图 2 所示。
实施例 5 利用 Southern 杂交方法鉴定棉花脂质转运蛋白基因的转基因植株 ；
利用 Southern blot 分析目标基因在海岛棉基因组中整合情况，
(1) 对照和转基因植株基因 DNA 组的酶切和电泳
对照和转基因植株基因 DNA 组按照表 2 的酶切体系于 37℃、 BamHI 酶切 24-48h 后， 取 5μL 产物电泳， 于 UV 灯下检测是否酶切完全， 酶切完全的在泳道上为均匀弥散状条带， 然后将酶切产物在冷冻干燥离心机上浓缩至 50μL， 加 6μL Loading buffer 后， 在 1％琼 脂糖凝胶电泳。先用 120V 电泳 20min， 当 DNA 全部跑出点样孔后， 将电压调为 2V/cm， 电泳 5h。
表 2 棉花 DNA 限制性内切酶体系。
成分 棉花基因组 DNA 10× 限制性内切酶 Buffer 限制性内切酶 (15U/μL) ddH2O
体积 60μg 20μL 5μL 总体积至 200μL(2) 转膜
电泳结束后取出凝胶， 切去多余的胶块， 测量长和宽， 切去右上角作为标记， 然后 放入脱嘌呤液 10-15min 进行脱嘌呤处理， 此时溴酚蓝的颜色变黄。
将胶块转移至一新托盘内， 用去离子水漂洗 2 次， 然后将样品转移到变性液中至 少 50min 做 DNA 变性处理。
变性结束后， 将胶块转移至另一新托盘内， 用去离子水漂洗 2 次， 然后将样品转移 到中和液中 30min。
玻璃平板置于陶瓷方盘上， 并铺上两张 Whatman 3MM 滤纸作为虹吸桥， 盘中加入 足量的转移缓冲液 10×SSC， 用玻璃棒赶出虹吸桥和玻璃板中的气泡。 将一长和宽和凝胶大 小一致的硝酸纤维素滤膜， 切去一角， 在 10×SSC 溶液浸润 3-5min。
将凝胶正面朝下， 放置于虹吸桥中央， 用玻璃棒赶出滤纸和胶块之间的气泡。 将硝 酸纤维膜覆盖于凝胶上， 并使切角对齐。用 Parafilm 封凝胶的四边， 以防短路。在膜上放 三层 3MM 滤纸， 并用玻璃棒赶出气泡。将多层吸水纸覆盖于滤纸上， 顶部放一合适大小的玻 璃板， 并在玻璃板上方放置 500g 重物， 转膜 3-5d， 期间应不断更换吸水纸。转膜完成后， 取 下胶体， 用 EB 染色 10min， 并进行紫外检测， 检查转膜效果。 用 3MM 滤纸夹住尼龙膜， 置于室 温 30min 晾干， 然后置于 80℃固定 2-3h 后， 将尼龙膜包裹于锡泊纸中， 于 4℃保存备用。
(3) 探针制备
根据促进纤维伸长基因 3’ 端相对非保守区域设计特异引物， 扩增 400bp 长度的片 段 (2800-3200) 作为 Southern blot 检测的探针。
探针标记步骤如下 ： 取 20μL Cross-linker 用 80μL 水 ( 试剂盒内提供 ) 稀释成 工作浓度。工作液在 2-8℃可保存一个星期。用试剂盒内提供的水将用于标记的 DNA 稀释 到 10ng/μL。核酸中的盐浓度必须尽可能低， 不超过 50mmol/L。取 10μL 稀释过的 DNA 样 品于微量 Eppendorf 离心管中， 在沸水浴中变性 5min。立即将样品置于冰上冷却 5min， 在 微量离心机上轻轻离心， 将混合物收集到管底。向冷却的 DNA 样品中加入 10μL Reaction buffer， 轻轻地混匀， 置于冰上。
加入 2μL Labeling reagent， 轻轻地混匀。 加入 10μL Cross-linker 工作液， 彻 底混匀， 在微量离心机上轻轻离心， 将混合物收集到管底。反应混合物于 37℃温育 30min。 标记后的探针可以立即使用， 或置于冰上保存 2h。长时间保存需要加入 50％甘油 (v/v)。
(4) 杂交 ：
取所需体积的杂交缓冲液， 预热至 55℃。Buffer 用量一般为 0.25mL/cm2 杂交膜。 对于大的杂交膜， Buffer 用量可以减少到 0.125mL/cm2 ； 将膜置于 Hybridization buffer 中， 在杂交炉中预杂交至少 15min ； 在预杂交 Buffer 中加入标记好的探针， 一般每毫升 Buffer 中加入 5-10ng 探针 ； 在 55℃杂交炉中杂交过夜。可通过改变杂交温度 (50-75℃ ) 调控严谨度。
(5) 洗膜 ：
将 Primary wash buffer 预热至 55℃， 其用量为 2-5mL/cm2 ； 小心地将纤维膜转移 到 Primary wash buffer 中， 55℃漂洗 10min ； 用 Primary wash buffer 在 55℃漂洗 10min ； 将纤维膜转移至一干净容器， 加入过量 Secondary wash buffer， 在室温下漂洗 5min ； 用 Secondary wash buffer 再一次漂洗 5min。
(6) 检测 ：
去除膜上多余的 Secondary wash buffer， 并将膜置于一层平整的 SanranWrap 上 面， 使样品面朝上 ； 将检测试剂滴于膜上 (30-40μL/cm2)， 放置 2-5min， 除去多余检测试 剂；
在 X 光片夹中铺一层干净滤纸， 滤纸下面放上增感屏前屏 ； 将膜用保鲜膜包好， 正 面向上放在滤纸上， 用胶带固定 ； 暗室中取一张 X 光片放在杂交膜上。再放上增感屏后屏， 合上光片夹， 封上胶带， 曝光 2h 左右 ； 在暗室中将显影液倒入大方盘中， 取出 X 光片， 置显影 液中， 轻轻晃动液体， 显影 3-5min 至黑色曝光条带显现， 立即将 X 光片转移至定影液中， 定 影 20min 左右， 取出 X 光片置流水中冲洗过夜 ；
转 lpt 基因棉花植株的 Southern 杂交分析情况见图 3。图 3 中 1-6 为转 lpt 基因 植株， P 为阳性质粒对照。图 3 的实验结果说明 lpt 基因已经整合到棉花的基因组中， 拷贝 数为 1-2 个， 转基因植株可用于基因的功能分析鉴定。
实施例 6 转 ltp 基因植株的纤维品质鉴定
为了进一步了解 ltp 基因在提高棉花纤维品质中的具体应用， 我们对所获得的 6 个不同转基因棉花株系进行田间试验， 比较转基因棉花植株与对照植株 ( 非转基因植株 柯 -312) 之间纤维品质差异。
2010 年 5 月 25 日将所获得 6 个不同的转基因棉花株系播种于上海交通大学试验 场， 试验采取完全随机设计， 小区面积为 10m×2m， 行株距为 90cm×20cm， 4 次重复。田间管 理均按高产栽培要求进行。从 9 月 15 日开始起收获发育正常的中部棉铃 5 个进行棉花的纤维品质分析。
按照 GB/T 19617-2004 棉花长度试验方法手扯尺量法 ) 进行测量棉花纤维的长度 鉴定。
按照 (GB/T13783-1992 棉纤维断裂比强度的测定 / 平束法 ) 进行棉花纤维强度鉴 定。纤维强度的测定是将纤维样品混匀后用棉花纤维引伸器制成棉条， 用国产 Y162A 型束 纤维强力机测定 3.2mm 隔距比强度， 测 6 次重复平均值作为试样代表值， 并用中国纤维检验 局的标准棉样修正。
所获得 6 个不同的转基因棉花株系与对照的纤维长度、 纤维强度进行测量， 结果 见表 3， 表中株系 1 ～株系 6 是转 ltp 基因棉花， 来自上述实施例 4， 对照株系是柯 -312。
表 3 转基因植株纤维品质和对照植株的对比
从表 3 中可以看到， 转 ltp 基因的棉花植株与对照相比， 转基因植株的棉花纤维质 量得到了明显改进， 纤维长度增加 2.7-3.5mm ； 纤维强度也有所增加， 纤维强度与对照相比 增加 0.3-3.3CN/tex。上述结果说明表达 ltp 基因具有提高棉花纤维长度和部分增加纤维 强度的功能。
参照棉花纤维品质的分级方法国家标准 《GB 1103-2007 棉花细绒棉》 ， 转基因的棉 花的纤维品质已经达到国家优质棉标准。
背景技术 利用基因工程手段提高棉花的纤维品质包括棉花的纤维长度是当前棉花分子育 种的重要方向。
植物脂质转运蛋白 (LTP) 是一类小分子碱性蛋白， 占植物可溶性总蛋白的 4％左 右。LTP 是一种多功能的蛋白家族， LTP 蛋白家族的成员不仅参与了磷脂在生物膜之间的运 输， 而且还在生物膜、 角质和脂质的形成、 植物的生殖发育以及信号的转导等生物过程中发 挥了重要的作用。近期的研究表明， LTP 蛋白具有信号肽， 可以从细胞内分泌到细胞外并定 位于细胞壁上。 LTP 蛋白的细胞壁定位功能对于植物的抗病反应、 抗逆境反应 ( 高温、 高盐、 干旱协迫 )、 以及生物膜和脂质的形成具有重要作用。
在棉花的纤维发育过程中， 脂类代谢在棉纤维快速伸长中发挥了重要的作用。在 棉花胚培养基中添加碳链长度在 20 以上的脂类化合物能够促进纤维的伸长发育。烟草中 脂类运输蛋白基因的研究表明， 脂类运输蛋白具有疏松细胞壁的功能。 但是到目前为止， 哪 种蛋白参与运输 C20 以上的脂类化合物并不清楚， 利用基因工程手段提高棉花的纤维长度 也没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的脂质转运蛋白基因以及其片段、 类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途， 尤 其是在提高棉花脂质转运蛋白在胚细胞中的表达水平从而促进棉花纤维伸长方面的用途。
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次采用分子克隆方法从海岛棉胚特异表达的 cDNA 中分离获得了新的 ltp 基因， 并且通过实验证实了它具有促进纤维伸长功能， ltp 基因 转入植物后可导致棉花纤维伸长。在此基础上完成了本发明。
本发明包括以下内容 ：
1、 提供了一种新的分离出的脂质转运蛋白 ( 以下简称为 “LTP” 蛋白质 )， 包含 ：
具有 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其 活性衍生物。较佳地， 该多肽选自下组 ： (a) 具有 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列的多肽 ； (b) 将 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列经过一个或多个 ( 较佳地 1-20 个 ) 氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且具有促进棉花纤维伸长功能的 LTP 蛋白质活性的由 (a) 衍生的多肽。
2、 提供了编码上述多肽的多核苷酸， 选自 ：
(a) 编码上述 LTP 蛋白质多肽的多核苷酸 ； 和 (b) 与多核苷酸 (a) 互补的多核苷 酸。较佳地， 该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO ： 2 所示氨基酸序列的多肽。更佳地， 该多核苷酸的序列是选自下组的一种 ： (a) 具有 SEQ ID NO ： 1 中 1-363 位的序列 ； (b) 具有 SEQ ID NO ： 1 中 1-400 位的序列。
3、 提供了含有上述多核苷酸的载体， 以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被 上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
4、 提供了制备上述 LTP 蛋白质多肽的方法， 该方法包含 ： (a) 在适合表达的条件 下， 培养上述被转化或转导的宿主细胞 ； (b) 从培养物中分离出具有活性的多肽。
5、 提供了上述多核苷酸和 LTP 蛋白质多肽的用途， 即， 在培育提高棉花纤维长度 的棉花品种方面的应用。
6、 提供了一种改变植物脂质转运蛋白， 以提高棉花纤维品质的方法， 它包括步 骤：
(1) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述的表达载体含有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 多核苷酸， 所述的 LTP 选自下组 ：
(a) 具有 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列的多肽 ；
(b) 将 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 而形成的， 且具有促进棉花纤维伸长的由 (a) 衍生的多肽 ； (2) 将植物细胞或组织或器官与步骤 (1) 中的农杆菌接触， 从而使 lpt 基因编码序 列转入植物细胞， 并且整合到植物细胞的染色体上 ；
(3) 选择出转入 lpt 基因的 DNA 编码序列的植物细胞或组织或器官 ；
(4) 将步骤 (3) 中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
在本发明中， 术语 “LTP 蛋白质” 、 “LTP 多肽” 或 “脂质转运蛋白” 可互换使用， 都指 具有 LTP 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2) 的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的 LTP 蛋白质。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， “分离的 LTP 蛋白或多肽” 是指 LTP 多肽基本上不含天然与其相关的 其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化 LTP 蛋白质。
本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。本发明的多 肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原核或真核宿主 ( 例 如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞 ) 中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起 始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括 LTP 蛋白质的片段、 衍生物和类似物。如本文所用， 术语 “片段” 、 “衍生物” 和 “类似物” 是指基本上保持本发明的天然 LTP 蛋白质相同的生物学功能或活性 的多肽。本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i) 有一个或多个保守或非保守性氨 基酸残基 ( 优选保守性氨基酸残基 ) 被取代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也 可以不是由遗传密码编码的， 或 (ii) 在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或
(iii) 成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽， 或 (iv) 附加的氨基酸序列融合到此多 肽序列而形成的多肽 ( 如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列 )。 根据本文所述， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中， 术语 “LTP 多肽” 指具有脂质转运活性的 SEQ ID NO.2 序列的多肽。 该术语还包括具有与 LTP 蛋白质相同功能的、 SEQ ID NO.2 序列的变异形式。这些变异形 式包括 ( 但并不限于 ) ： 若干个 ( 通常为 1-50 个， 较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20 个， 最佳地 1-10 个 ) 氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个 ( 通 常为 20 个以内， 较佳地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内 ) 氨基酸。例如， 在本领域中， 用性 能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 LTP 蛋白的活 性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括 ： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导 突变体、 在高或低的严谨程度条件下能与 ltp DNA 杂交的 DNA 所编码的蛋白。本发明还提 供了其他多肽， 如包含 LTP 多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外， 本发明还包 括了 LTP 多肽的可溶性片段。通常， 该片段具有 LTP 多肽序列的至少约 10 个连续氨基酸， 通常至少约 30 个连续氨基酸， 较佳地至少约 50 个连续氨基酸， 更佳地至少约 80 个连续氨 基酸， 最佳地至少约 100 个连续氨基酸。
发明还提供 LTP 蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然 LTP 多肽的差别可以 是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。 这些多 肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。
在本发明中， “LTP 蛋白质保守性变异多肽” 指与 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列相比， 有至多 10 个， 较佳地至多 8 个， 更佳地至多 5 个， 最佳地至多 3 个氨基酸被性质相似或相近 的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表 1 进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 Ala(A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gln(Q) Glu(E) 代表性的取代 Val ； Leu ； Ile Lys ； Gln ； Asn Gln ； His ； Lys ； Arg Glu Ser Asn Asp 优选的取代 Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp5102321163 A CN 102321168 Gly(G) His(H) Ile(I) Leu(L) Lys(K) Met(M) Phe(F) Pro(P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V)
Pro ； Ala说明书Ala Arg Leu Ile Arg Leu Leu Ala Thr Ser Tyr Phe Leu4/12 页Asn ； Gln ； Lys ； Arg Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe Ile ； Val ； Met ； Ala ； Phe Arg ； Gln ； Asn Leu ； Phe ； Ile Leu ； Val ； Ile ； Ala ； Tyr Ala Thr Ser Tyr ； Phe Trp ； Phe ； Thr ； Ser Ile ； Leu ； Met ； Phe ； Ala本发明的多核苷酸可以是 DNA 形式或 RNA 形式。DNA 形式包括 cDNA、 基因组 DNA 或人工合成的 DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA 可以是编码链或非编码链。编码成 熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO ： 1 所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。 如 本文所用， “简并的变异体” 在本发明中是指编码具有 SEQ ID NO ： 2 的蛋白质， 但与 SEQ ID NO ： 1 所示的编码区序列有差别的核酸序列。 编码 SEQ ID NO ： 2 的成熟多肽的多核苷酸包括 ： 只编码成熟多肽的编码序列 ； 成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列 ； 成熟多肽的编码序列 ( 和任选的附加编码序列 ) 以及非编码序列。
术语 “编码多肽的多核苷酸” 可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也可以是还包括 附加编码和 / 或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、 类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。 如本 领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50 ％， 较佳地至少 70％， 更佳地至少 80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多 核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中， “严格条件” 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温
度下的杂交和洗脱， 如 0.2×SSC， 0.1％ SDS， 60℃； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50％ (v/v) 甲酰胺， 0.1％小牛血清 /0.1％ Ficoll， 42℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 90％以上， 更好是 95％以上时才发生杂交。并且， 可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO ： 2 所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用， “核酸片段” 的长度至 少含 15 个核苷酸， 较好是至少 30 个核苷酸， 更好是至少 50 个核苷酸， 最好是至少 100 个核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术 ( 如 PCR) 以确定和 / 或分离编码 LTP 蛋白质 的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供， 更佳地被纯化至均质。
本发明的 LTP 核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、 PCR 扩增法、 或重组 法的方法获得。例如首先根据 SEQ ID NO ： 1 的序列进行全序列合成。
对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开放阅读框序 列来设计引物， 并用人工合成的 LTP 核苷酸全长序列或其片段作为模板， 扩增而得有关序 列。
一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。通常， 通 过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白 ( 或其片段和衍生物 ) 的 DNA 序列。然后可将该 DNA 序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA 分子 ( 或如载体 ) 和细胞中。此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 ltp 基因编 码序列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组 DNA 技术 (Science， 1984 ； 224 ： 1431)， 可利用本发明的多聚核苷 酸序列可用来表达或生产重组的 LTP1 多肽。一般来说有以下步骤 ：
(1). 用本发明的编码 LTP 多肽的多核苷酸 ( 或变异体 )， 或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞 ；
(2). 在合适的培养基中培养的宿主细胞 ；
(3). 从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中， LTP 蛋白质多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语 “重组表达载 体” 指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒或其他 载体。总之， 只要能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个 重要特征是通常含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 ltp 基因编码 DNA 序列和合适的转录 / 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA 合成技术、 体内重组技 术等。所述的 DNA 序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA 合成。表达 载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以及绿色荧光蛋
白 (GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当 DNA 序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于转化适 当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞 ； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞 ； 或是高 等真核细胞， 如植物细胞。代表性例子有 ： 大肠杆菌， 链霉菌属、 农杆菌 ； 真菌细胞如酵母 ； 植物细胞 ； 昆虫细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强子序列时将 会使转录得到增强。增强子是 DNA 的顺式作用因子， 通常大约有 10 到 300 个碱基对， 作用 于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细胞。
用重组 DNA 转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl2 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要， 转化也可用电穿孔 的方法进行。当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA 转染方法 ： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械 方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方 法， 例如叶盘法。对于转化的植物细胞、 组织或器官可以用常规方法再生成植株， 从而获得 脂质转运蛋白抗性提高的植物。 获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法 ( 如温度转换或化学诱导 ) 诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞外。 如 果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这 些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于 ： 常规的复性处理、 用 蛋白沉淀剂处理 ( 盐析方法 )、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离心、 分子筛层析 ( 凝胶过滤 )、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层析 (HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
另一方面， 本发明还包括对 ltp 基因的 DNA 或是其片段编码的多肽具有特异性的 多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。较佳地， 指那些能与 LTP 蛋白质基因产物或 片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明中抗体包括那些能够结合 并抑制 LTP 蛋白质的分子， 也包括那些并不影响 LTP 蛋白质功能的抗体。本发明还包括那 些能与修饰或未经修饰形式的 LTP 蛋白质基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体， 而且还包括具有免疫活性的抗体片 段、 或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化 的 LTP 蛋白质基因产物或者其具有抗原性的片段， 可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产 生。与之相似的， 表达 LTP 蛋白质或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗 体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用 LTP 蛋白质 基因产物的片段或功能区， 通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法
制备或利用多肽合成仪合成。与 LTP 蛋白质基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核 细胞 ( 例如 E.Coli) 中生产的基因产物来免疫动物而产生 ； 与翻译后修饰形式结合的抗体 ( 如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽 )， 可以用真核细胞 ( 例如酵母或昆虫细胞 ) 中产生的基 因产物来免疫动物而获得。抗 LTP 蛋白质的抗体可用于检测样品中的 LTP 蛋白质。
多克隆抗体的生产可用 LTP 蛋白质或多肽免疫动物， 如家兔、 小鼠、 大鼠等。多种 佐剂可用于增强免疫反应， 包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还涉及定量和定位检测 LTP 蛋白质水平的测试方法。这些试验是本领域所 熟知的， 且包括 FISH 测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在 LTP 蛋白质的方法是利用 LTP 蛋白质的特异性抗体 进行检测， 它包括 ： 将样品与 LTP 蛋白质特异性抗体接触 ； 观察是否形成抗体复合物， 形成 了抗体复合物就表示样品中存在 LTP 蛋白质。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列 (microarray) 或 DNA 芯片 ( 又称为 “基因芯片” ) 上， 用于基因的表达分析。用 LTP 蛋白质特异的引物进行 RNA- 聚合酶链反应 (RT-PCR) 体外扩增也可检测 LTP 蛋白质的转录产物。
本发明的研究发现， 棉花胚特异表达的脂质转运蛋白 LTP 在棉花纤维快速伸长优 势表达， 并在胚表皮和植物的表皮毛细胞中特异表达， LTP 参与运输 C20 以上的脂类化合 物， 在棉花胚中增强表达 ltp 基因能够提高棉花纤维长度。
在本发明的一个实例中， 提供了一种分离的多核苷酸， 它编码具有 SEQ ID NO ： 2所 示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用原位杂交技术从构建的海岛棉 cDNA 文 库库中分离的。其序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 它包含的多核苷酸序列全长为 400 个碱基， 其 开放读框位于 1-363 位， 编码全长为 120 个氨基酸的 LTP 蛋白质 (SEQ ID NO ： 2)。
本发明的 LTP 蛋白质具有如下特性 ： A)LTP 蛋白在棉花伸长纤维中特异表达， 能够 转运长碳链的脂肪酸 ( ≥ C20) ； B) 脂质转运蛋白纤维改良功能明确， 在棉花纤维中超量表 达该基因能够显著促进纤维伸长。
经实验证实， 转 ltp 基因的棉花植株与对照相比， 转基因植株的棉花纤维质量得 到了明显改进， 纤维长度增加 2.7-3.5mm ； 纤维强度与对照相比增加 0.3-3.3CN/tex。
LTP 蛋白质为促进植物纤维伸长提供了新的途径， 因而具有巨大的应用前景。 通过 将 ltp 基因导入农作物品种 ( 例如棉花 )， 改变现有棉花品种的纤维长度， 可获得脂质转运 蛋白的棉花农作物品种， 解决农业生产中存在的实际问题。 附图说明 图 1 是 lpt 基因遗传转化载体的构建示意图。图中， LB、 RB 分别为 T-DNA 的左右 边界序列。CaMV35S 为烟草花叶病毒 35S 启动子。NOS 为终止子。NPTII 为卡那霉素抗性基 因。fbp 为矮牵牛胚特异表达启动子 ( 见实施例 3)。
图 2 是转 lpt 基因棉花幼苗 (T0) 叶片 PCR 检测图。M 为 DL2000 分子量标记。标 记的分子量分别为 2000、 1000、 750、 500、 250 和 100bp ； P 为阳性对照 (lpt 质粒 ) ； 1-7 为经 过转化 lpt 基因的转基因棉花幼苗 ( 见实施例 4)。
图 3 是转 lpt 基因的棉花植株的 Southern 杂交分析情况。(P ： lpt 基因质粒 DNA ； 1-6 ： 转基因植株 ( 见实施例 5)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的技术的公开， 对本领域的技术 人员而言是显而易见的。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述 的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例 1 脂质转运蛋白的 CDNA 片段克隆
(1) 海岛棉胚组织特异 cDNA 的合成
海岛棉胚组织特异表达 cDNA 合成采用 Clontech 公司的 cDNA 文库构建试剂盒的 方法实施， 该方法的具体步骤如下。
选取海岛棉品种 Pima-90 开花后 2 天的胚组织用于抽提棉花的总 RNA。称取 0.5g 海岛棉胚， 用液氮研磨成细粉， 分装于两个 1.5ml 的 eppendorf 管中。 每管加入 1ml TRIZOL 用力摇动使混合均匀， 室温下放置 5min。然后在 4℃， 12,000g 的条件下离心 10min， 将上 清液吸入干净的 1.5ml 的 eppendorf 管中。每管加 0.2ml 氯仿， 用力振荡 15s， 室温放置 2 ～ 3min。然后在 4 ℃、 12,000g 的条件下离心 15min。将上清液转移到干净的 1.5ml 的 eppendorf 管中， 加入等体积异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min。在 4℃， 12,000g 的条件下 离心 10min。弃上清， 加入 1ml 75％乙醇洗涤， 在 4℃， 7,500g 离心 5min。弃上清， 室温干燥 15-20min 后溶于适量 RNA-free water 中 (55 ～ 60℃水浴 10min 使 RNA 充分溶解 )。所获 得的 RNA 用于 cDNA 合成反应。 按照 QIAGEN 公司的 mRNA 纯化试剂盒的方法将总 RNA 纯化为 mRNA， 然后立刻按照 ClonTECHTM 试剂盒中所提供的方法进行单链 cDNA 合成和双链 cDNA 合成。
(2) 采用 PCR 方法分离脂质转运蛋白基因
设计 PCR 扩增引物 2 条， 分别为 P1 和 P2， 利用在 2 条引物以步骤 (1) 所获得的 cDNA 为模板扩增 ltp 全长基因。PCR 的反应体系为 ： 10×PCR buffer， 3μL ； dNTPs(dATP， dTTP， dGTP)2μL ； MgCl2， 2μL ； 引物 P1 和 P2 各 2μL ； Taq 酶， 2 个单位 ； 棉纤维组织 cDNA， 100ng， 加入无菌水补足 30μL 体系， 迅速混匀后离心。
PCR 扩增条件按照以下程序完成 ：
94℃， 3min， 1cycle ；
94℃， 1min ； 50℃， 1min， 72℃， 1min， 36cycles ；
72℃， 3min， 1cycle。
反应结束后， PCR 产物在 1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。按照 Invitrogen 公 司的 PCR 产物回收试剂和回收 PCR 片段。
(3) 脂质转运蛋白基因的 cDNA 片段的测序验证
PCR 片段与 Takara 公司 PGEM-18T 载体相连接。 连接产物转化大肠杆菌 DH5α。 按 照步骤 (2) 的 PCR 方法鉴定阳性克隆。抽提阳性的大肠杆菌质粒并进行序列测定。
实施例 2 脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因的人工合成
根据已完成的含 400bp 编码区的核苷酸序列， 首先分 8 个区段分别根据正链和副
链序列， 分别合成出长度约 150-200bp、 具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链 各一一对应的 8 个互补的单链寡核苷酸片段分别退火， 形成 8 个带有粘性末端的双链寡核 苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段， 经 T4DNA 连接酶催化组装成一个完整的 ltp 基因。该 合成的 DNA 片段含有 SEQ ID NO ： 1 中 1-363 位的核苷酸序列， 并且合成基因的两端含 XbaI 和 SacI 位点。
将上述人工合成的 5’ 和 3’ 端酶切位点为 XbaI 和 SacI 位点 ltp 基因， 用于下面 脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因植物表达载体的构建。
实施例 3 脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因植物表达载体的构建
脂质转运蛋白的 LTP 蛋白质基因植物表达载体构建的具体方法如下 ：
A.pBI121 和 pCAMBIA2301 用 HindIII 和 EcoRI 双 酶 切， 将 pBI121 带 有 p35S-GUS-Nos-ter 的片段连入 pCAMBIA2301， 形成中间载体 p35S-2301-GUS ；
B. 用 XbaI 和 SacI 双切 p35S-2301-GUS 和上述人工合成的 ltp 基因， 用 ltp 置换 p35S-2301-GUS 相应酶切位点的 GUS， 从而获得脂质转运蛋白的 ltp 基因植物表达载体 ( 图 1)。再将其转入农杆菌系 LBA4404 中， 用于转化棉花。
实施例 4 利用农杆菌介导转化构建获得脂质转运蛋白基因的转基因棉花 把含有目的基因的农杆菌在合适抗性的 LB 培养基上划线， 28℃下培养 2 天， 挑取 单菌落接种于 50ml( 浓度为 50mg/L 卡那霉素 ) 的 LB 液体培养基中。培养基在 200rpm， 28 度条件下摇床上培养 42-48 小时。当 OD600 达到 0.3-0.8 之间时， 3000g 离心收集菌体。利 用 1/2MS 液体培养基将收集的菌体稀释至 OD600 ＝ 0.2-0.4 之间。
(1) 外植体与农杆菌的共培养 ： 取上述 5-6 天苗龄的下胚轴， 切成长约 0.5-0.8cm 长的小段， 于 1/2MS 液体培养基稀释的农杆菌菌液中浸泡 15 分钟， 取出， 用滤纸吸干下胚轴 表面的菌液后， 转入不加任何抗生素的固体 CB2.1 培养基中， 每皿 30-40 块下胚轴， 于 25℃ 下共培养 50-60 小时。
(2) 愈伤组织 (callus) 的诱导 ： 用含有 cef 250mg/l 的无菌水洗共培养的下胚 轴 3-4 次， 把下胚轴用无菌滤纸吸干下胚轴表面的水后， 把下胚轴转入 CB3.1 培养基上 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗循环光照培养 ) 培养 3-4 周。小的愈伤组织大约在 3 周时可以被 看到， 然后， 每隔一个月继代培养， 直到愈伤组织达到合适的数量。
(3) 胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导 ： 将一定数量的愈伤组织转入到 CB4 培养基 中， 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗循环光照培养 ) 培养， 每隔一个月继代培养， 直到体细胞胚出 现。
(4) 体细胞胚的萌发 ： 把体细胞胚转到 CB5 培养基中， 让它们萌发并长成小苗。
(5) 转基因植株的获得 ： 转移幼苗 (2-4cm 长， 具有叶子的嫩枝 ) 转到 CB6 培养基中 ( 需要更大的容器 )， 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗循环光照培养 ) 生长 4 个月。将具有较好根 系的转基因植株直接转到含有湿土的小盆中， 并在培养室中 28℃ -30℃ (16h 光 /8h 暗， 循 环光照培养 ) 培养 2 周， 然后， 转移这些小盆到温室中。每天对转基因植株进行浇水， 对之 进行施肥等直到棉铃成熟。然后， 收集种子， 4℃保存种子。
(7) 转基因的 PCR 鉴定 ：
用小量抽提植物总 DNA 的方法得到植物总 DNA， 以 1.5μl 总 DNA 为模板以引物 (P1/P2) 进行 PCR 扩增， 共检测了 36 棵无菌棉花苗， 其中有 17 棵被检测到有特异性条带的
阳性植株 (T0)， 部分植株 PCR 产物电泳结果如图 2 所示。
实施例 5 利用 Southern 杂交方法鉴定棉花脂质转运蛋白基因的转基因植株 ；
利用 Southern blot 分析目标基因在海岛棉基因组中整合情况，
(1) 对照和转基因植株基因 DNA 组的酶切和电泳
对照和转基因植株基因 DNA 组按照表 2 的酶切体系于 37℃、 BamHI 酶切 24-48h 后， 取 5μL 产物电泳， 于 UV 灯下检测是否酶切完全， 酶切完全的在泳道上为均匀弥散状条带， 然后将酶切产物在冷冻干燥离心机上浓缩至 50μL， 加 6μL Loading buffer 后， 在 1％琼 脂糖凝胶电泳。先用 120V 电泳 20min， 当 DNA 全部跑出点样孔后， 将电压调为 2V/cm， 电泳 5h。
表 2 棉花 DNA 限制性内切酶体系。
成分 棉花基因组 DNA 10× 限制性内切酶 Buffer 限制性内切酶 (15U/μL) ddH2O
体积 60μg 20μL 5μL 总体积至 200μL(2) 转膜
电泳结束后取出凝胶， 切去多余的胶块， 测量长和宽， 切去右上角作为标记， 然后 放入脱嘌呤液 10-15min 进行脱嘌呤处理， 此时溴酚蓝的颜色变黄。
将胶块转移至一新托盘内， 用去离子水漂洗 2 次， 然后将样品转移到变性液中至 少 50min 做 DNA 变性处理。
变性结束后， 将胶块转移至另一新托盘内， 用去离子水漂洗 2 次， 然后将样品转移 到中和液中 30min。
玻璃平板置于陶瓷方盘上， 并铺上两张 Whatman 3MM 滤纸作为虹吸桥， 盘中加入 足量的转移缓冲液 10×SSC， 用玻璃棒赶出虹吸桥和玻璃板中的气泡。 将一长和宽和凝胶大 小一致的硝酸纤维素滤膜， 切去一角， 在 10×SSC 溶液浸润 3-5min。
将凝胶正面朝下， 放置于虹吸桥中央， 用玻璃棒赶出滤纸和胶块之间的气泡。 将硝 酸纤维膜覆盖于凝胶上， 并使切角对齐。用 Parafilm 封凝胶的四边， 以防短路。在膜上放 三层 3MM 滤纸， 并用玻璃棒赶出气泡。将多层吸水纸覆盖于滤纸上， 顶部放一合适大小的玻 璃板， 并在玻璃板上方放置 500g 重物， 转膜 3-5d， 期间应不断更换吸水纸。转膜完成后， 取 下胶体， 用 EB 染色 10min， 并进行紫外检测， 检查转膜效果。 用 3MM 滤纸夹住尼龙膜， 置于室 温 30min 晾干， 然后置于 80℃固定 2-3h 后， 将尼龙膜包裹于锡泊纸中， 于 4℃保存备用。
(3) 探针制备
根据促进纤维伸长基因 3’ 端相对非保守区域设计特异引物， 扩增 400bp 长度的片 段 (2800-3200) 作为 Southern blot 检测的探针。
探针标记步骤如下 ： 取 20μL Cross-linker 用 80μL 水 ( 试剂盒内提供 ) 稀释成 工作浓度。工作液在 2-8℃可保存一个星期。用试剂盒内提供的水将用于标记的 DNA 稀释 到 10ng/μL。核酸中的盐浓度必须尽可能低， 不超过 50mmol/L。取 10μL 稀释过的 DNA 样 品于微量 Eppendorf 离心管中， 在沸水浴中变性 5min。立即将样品置于冰上冷却 5min， 在 微量离心机上轻轻离心， 将混合物收集到管底。向冷却的 DNA 样品中加入 10μL Reaction buffer， 轻轻地混匀， 置于冰上。
加入 2μL Labeling reagent， 轻轻地混匀。 加入 10μL Cross-linker 工作液， 彻 底混匀， 在微量离心机上轻轻离心， 将混合物收集到管底。反应混合物于 37℃温育 30min。 标记后的探针可以立即使用， 或置于冰上保存 2h。长时间保存需要加入 50％甘油 (v/v)。
(4) 杂交 ：
取所需体积的杂交缓冲液， 预热至 55℃。Buffer 用量一般为 0.25mL/cm2 杂交膜。 对于大的杂交膜， Buffer 用量可以减少到 0.125mL/cm2 ； 将膜置于 Hybridization buffer 中， 在杂交炉中预杂交至少 15min ； 在预杂交 Buffer 中加入标记好的探针， 一般每毫升 Buffer 中加入 5-10ng 探针 ； 在 55℃杂交炉中杂交过夜。可通过改变杂交温度 (50-75℃ ) 调控严谨度。
(5) 洗膜 ：
将 Primary wash buffer 预热至 55℃， 其用量为 2-5mL/cm2 ； 小心地将纤维膜转移 到 Primary wash buffer 中， 55℃漂洗 10min ； 用 Primary wash buffer 在 55℃漂洗 10min ； 将纤维膜转移至一干净容器， 加入过量 Secondary wash buffer， 在室温下漂洗 5min ； 用 Secondary wash buffer 再一次漂洗 5min。
(6) 检测 ：
去除膜上多余的 Secondary wash buffer， 并将膜置于一层平整的 SanranWrap 上 面， 使样品面朝上 ； 将检测试剂滴于膜上 (30-40μL/cm2)， 放置 2-5min， 除去多余检测试 剂；
在 X 光片夹中铺一层干净滤纸， 滤纸下面放上增感屏前屏 ； 将膜用保鲜膜包好， 正 面向上放在滤纸上， 用胶带固定 ； 暗室中取一张 X 光片放在杂交膜上。再放上增感屏后屏， 合上光片夹， 封上胶带， 曝光 2h 左右 ； 在暗室中将显影液倒入大方盘中， 取出 X 光片， 置显影 液中， 轻轻晃动液体， 显影 3-5min 至黑色曝光条带显现， 立即将 X 光片转移至定影液中， 定 影 20min 左右， 取出 X 光片置流水中冲洗过夜 ；
转 lpt 基因棉花植株的 Southern 杂交分析情况见图 3。图 3 中 1-6 为转 lpt 基因 植株， P 为阳性质粒对照。图 3 的实验结果说明 lpt 基因已经整合到棉花的基因组中， 拷贝 数为 1-2 个， 转基因植株可用于基因的功能分析鉴定。
实施例 6 转 ltp 基因植株的纤维品质鉴定
为了进一步了解 ltp 基因在提高棉花纤维品质中的具体应用， 我们对所获得的 6 个不同转基因棉花株系进行田间试验， 比较转基因棉花植株与对照植株 ( 非转基因植株 柯 -312) 之间纤维品质差异。
2010 年 5 月 25 日将所获得 6 个不同的转基因棉花株系播种于上海交通大学试验 场， 试验采取完全随机设计， 小区面积为 10m×2m， 行株距为 90cm×20cm， 4 次重复。田间管 理均按高产栽培要求进行。从 9 月 15 日开始起收获发育正常的中部棉铃 5 个进行棉花的纤维品质分析。
按照 GB/T 19617-2004 棉花长度试验方法手扯尺量法 ) 进行测量棉花纤维的长度 鉴定。
按照 (GB/T13783-1992 棉纤维断裂比强度的测定 / 平束法 ) 进行棉花纤维强度鉴 定。纤维强度的测定是将纤维样品混匀后用棉花纤维引伸器制成棉条， 用国产 Y162A 型束 纤维强力机测定 3.2mm 隔距比强度， 测 6 次重复平均值作为试样代表值， 并用中国纤维检验 局的标准棉样修正。
所获得 6 个不同的转基因棉花株系与对照的纤维长度、 纤维强度进行测量， 结果 见表 3， 表中株系 1 ～株系 6 是转 ltp 基因棉花， 来自上述实施例 4， 对照株系是柯 -312。
表 3 转基因植株纤维品质和对照植株的对比
从表 3 中可以看到， 转 ltp 基因的棉花植株与对照相比， 转基因植株的棉花纤维质 量得到了明显改进， 纤维长度增加 2.7-3.5mm ； 纤维强度也有所增加， 纤维强度与对照相比 增加 0.3-3.3CN/tex。上述结果说明表达 ltp 基因具有提高棉花纤维长度和部分增加纤维 强度的功能。
参照棉花纤维品质的分级方法国家标准 《GB 1103-2007 棉花细绒棉》 ， 转基因的棉 花的纤维品质已经达到国家优质棉标准。
14102321163 A CN 102321168
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