亚洲带绦虫 microRNA 及其应用 技术领域 本发明属于生物学领域， 涉及一种亚洲带绦虫， 具体是一种亚洲带绦虫 micoRNA 及其应用。
背景技术 亚洲带绦虫 (Taenia asiatica ) 广泛分布于东南亚， 包括我国西南地区及台湾， 韩 国、 泰国、 印尼和菲律宾等地。人们通过食生或半生含有亚洲带绦虫囊尾蚴的猪、 或野猪的 内脏， 特别是肝脏而感染， 对人类健康和畜产品质量影响极大。 亚洲带绦虫成虫形态与牛带 绦虫成虫相似， 但其幼虫却与猪带绦虫的囊尾蚴相似。亚洲带绦虫成虫与牛带绦虫成虫的 形态极为相似， 人们长期以来把亚洲带绦虫误认为是牛带绦虫。上世纪 80 年代以来人们对 其形态学、 流行分布、 中间宿主及实验动物感染、 遗传学进行了研究， 但大部分工作仍局限 在细胞水平。
MicroRNAs （microRNAs） 是一类大小长约 20 ～ 25 个核苷酸， 内源性的具有调控功 能的非编码 RNA， 在许多真核生物中都曾经被发现。 这类 RNA 的功能主要是参与机体或细胞 的调节途径， 包括发育、 细胞增殖和凋亡、 脂肪代谢等过程。 在寄生虫研究领域， 已有研究表 明寄生线虫存在独特的 microRNA 转录后调控机制， 它们可以通过 microRNA 实现对宿主和 自身基因表达模式的精确调控， 从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视。通过选 择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育， 从而减少和阻断寄生线虫的传播途径。亚 洲带绦虫特异表达的 microRNA 有可能成为其免疫预防和化学防治的新分子靶标， 为核酸 疫苗的制备奠定基础 ； 也为猪带绦虫、 牛带绦虫和亚洲带绦虫的分类提供新的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亚洲带绦虫 micoRNA 及其应用， 所述的这种亚洲带绦 虫 micoRNA 及其应用要解决现有技术中的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性、 以及动物产品 和环境中含有药物残留的技术问题。
本发明一种亚洲带绦虫 microRNA， 其核苷酸序列为 ： 如 SEQ ID NO:n 所示， n 选自 1 － 170 的正整数 ； 或者与 SEQ ID NO:n 中的任何一条序列互补的序列。
进一步的， 所述的互补序列为 DNA 或 RNA。
进一步的， 所述互补序列为经过修饰的 DNA 或 RNA。
进一步的， 所述互补序列为经过硫代修饰或甲氧基修饰的 DNA 或 RNA。
本发明还提供了上述的任一亚洲带绦虫 microRNA 在制备亚洲带绦虫疫苗中的应 用。
本发明还提供了一种抑制亚洲带绦虫成虫生长发育的组合物， 含有有效量的至少 一个寡核苷酸， 所述的寡核苷酸特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互补的序列。
本发明还提供了一种基因芯片， 包括一个固相载体， 其特征在于 ： 在所述的固相载体上固定有至少一个寡核苷酸探针， 所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互 补的序列。
本发明所提供的亚洲带绦虫特异表达的 microRNA 均分别克隆亚洲带绦虫的成 虫， 成熟的 microRNA 序列长度为 18 ～ 25 nt。对其 microRNA 进行深度测序， 获得亚洲带绦 虫成虫的 microRNA 表达谱， 通过比对发现， SEQ ID NO ： 1 ～ 170 所示的 microRNA 只在亚洲 带绦虫成虫中表达， 而在参照基因组日本血吸虫中不表达。 因此， 在亚洲带绦虫体内过量表 达 SEQ ID NO ： 1 ～ 170 分子或采用 microRNA 反向互补序列抑制 SEQ ID NO ： 1 ～ 170 的表 达将影响亚洲带绦虫生理功能及器官分化相关的功能。此外， 鉴于亚洲带绦虫与牛带绦虫 和猪带绦虫的物种相似性， 本发明所提供的亚洲带绦虫成虫特异性 microRNA 及其反向互 补序列亦可应该用于影响牛带绦虫以及猪带绦虫的生理功能及分化相关的功能。因此， 本 发明亚洲带绦虫成虫特异性表达的 microRNA 可用于制备带绦虫疫苗， 特别是亚洲带绦虫 疫苗。
本发明和已有技术相比， 其技术效果是显而易见的。本发明的亚洲带绦虫成虫特 异表达的 microRNA 可以选择性的抑制或阻断某一特定发育期虫体的发育， 从而减少或阻 断寄生虫， 尤其是亚洲带绦虫的传播。本发明 microRNA 制备成为亚洲带绦虫疫苗时， 作为 核酸疫苗， 避免了传统抗蠕虫药物造成的全球性分布的寄生虫抗药性问题， 也不会导致动 物产品或环境种内药物的残留。 具体实施方式 实施例 1 microRNA 的获得 1. 总 RNA 抽提 1） 将样本 （亚洲带绦虫成虫孕节一片） 放入研体中， 加入少量液氮， 迅速研磨， 待组织变 软， 再加少量液氮， 再研磨， 如此三次， 按 50–100mg 组织 /ml Trizol 加入 Trizol， 转移入离 心管 ； 2） 加入 250μL 氯仿， 剧烈振荡 10s， 使液体充分混匀呈乳白状 （无分相现象） 后， 再室温 静置 5min ； 3） 在 4℃条件下， 以 12000r/min 离心 15min ； 4） 将上层水相转移到一个新的离心管中， 加入等体积的异丙醇， 上下颠倒混匀， 然后在 4℃条件下静置 10–15min ； 5） 在 4℃条件下， 以 12000r/min 离心 15min， 小心并尽可能去掉上清 ； 6） 用 1mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀和管壁， 在 4℃条件下， 以 12000r/min 离心 8min， 然后 小心弃去乙醇 ； 7） 将 RNA 沉淀进行干燥 （不能完全干燥） 处理后， 用 10μL RNase–free 水将 RNA 溶解， 直接用于反转录。
2. 总 RNA 纯度和完整性检测 1）纯度检测 ： 取 1 μL RNA 样品 50 倍稀释， 在 BioPhotometer plus 核酸蛋白测定仪 上测定 OD 值， OD 260/OD 280 的比值大于 1.8。
2） 总 RNA 完整性 ： 取 RNA 样品 1 μL， 1% 琼脂糖凝胶电泳 80 V×20 min， 用凝胶成 像系统观察总 RNA 5S rRNA， 18S rRNA 和 28S rRNA 条带， 三条带条带完整。
3.small RNA 序列的获得和筛选 用 15% PAGE 胶回收 20-30 nt 的 small RNA， 加上 5’ 和 3’ 端接头 （购自 Illumina 公 司） 后实施 RT-PCR（反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司） 。产物经 6 %TBE PAGE 胶纯化后 进行 Solexa 测序。然后屏蔽掉可能为接头序列的部分、 测序质量差的序列 （例如测序信号 很低等） 及长度小于 18 nt 的序列获得 clean reads。
4.microRNA 的鉴定 用 BLAST 程 序 （NCBI， www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）将 clean reads 与 GenBank 和 Rfam database（version 9.0） （http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA） 进行比对分析， 去除非编码 RNA 序列， 包括 rRNA， tRNA， snRNA， snoRNA， 和 other ncRNA ； 通过 Repeatmasker（http://www.repeatmasker.org） 去除转座子等重复序列 ； 然后搜索 Sanger miRBase（version 13.0） 数据库， 寻找序列相似性 microRNA。将亚洲带绦虫所表 达的 microRNA 与已报道的日本血吸虫进行比较， 分别屏蔽掉两两共有相关的序列， 获得亚 洲带绦虫未注释的 microRNA（例举 170 条） 。
此外， 为了提高反向互补序列的作用和细胞内稳定性， 上述亚洲带绦虫特异性 microRNA 的反向互补序列可以是 DNA 或 RNA， 还可以对反向互补序列进行硫代、 甲氧基等修 饰。
实施例 2 本发明一种基因芯片， 包括一个固相载体， 在所述的固相载体上固定有至少一个寡核 苷酸探针， 所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互补的序列。
背景技术 亚洲带绦虫 (Taenia asiatica ) 广泛分布于东南亚， 包括我国西南地区及台湾， 韩 国、 泰国、 印尼和菲律宾等地。人们通过食生或半生含有亚洲带绦虫囊尾蚴的猪、 或野猪的 内脏， 特别是肝脏而感染， 对人类健康和畜产品质量影响极大。 亚洲带绦虫成虫形态与牛带 绦虫成虫相似， 但其幼虫却与猪带绦虫的囊尾蚴相似。亚洲带绦虫成虫与牛带绦虫成虫的 形态极为相似， 人们长期以来把亚洲带绦虫误认为是牛带绦虫。上世纪 80 年代以来人们对 其形态学、 流行分布、 中间宿主及实验动物感染、 遗传学进行了研究， 但大部分工作仍局限 在细胞水平。
MicroRNAs （microRNAs） 是一类大小长约 20 ～ 25 个核苷酸， 内源性的具有调控功 能的非编码 RNA， 在许多真核生物中都曾经被发现。 这类 RNA 的功能主要是参与机体或细胞 的调节途径， 包括发育、 细胞增殖和凋亡、 脂肪代谢等过程。 在寄生虫研究领域， 已有研究表 明寄生线虫存在独特的 microRNA 转录后调控机制， 它们可以通过 microRNA 实现对宿主和 自身基因表达模式的精确调控， 从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视。通过选 择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育， 从而减少和阻断寄生线虫的传播途径。亚 洲带绦虫特异表达的 microRNA 有可能成为其免疫预防和化学防治的新分子靶标， 为核酸 疫苗的制备奠定基础 ； 也为猪带绦虫、 牛带绦虫和亚洲带绦虫的分类提供新的依据。
MicroRNAs （microRNAs） 是一类大小长约 20 ～ 25 个核苷酸， 内源性的具有调控功 能的非编码 RNA， 在许多真核生物中都曾经被发现。 这类 RNA 的功能主要是参与机体或细胞 的调节途径， 包括发育、 细胞增殖和凋亡、 脂肪代谢等过程。 在寄生虫研究领域， 已有研究表 明寄生线虫存在独特的 microRNA 转录后调控机制， 它们可以通过 microRNA 实现对宿主和 自身基因表达模式的精确调控， 从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视。通过选 择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育， 从而减少和阻断寄生线虫的传播途径。亚 洲带绦虫特异表达的 microRNA 有可能成为其免疫预防和化学防治的新分子靶标， 为核酸 疫苗的制备奠定基础 ； 也为猪带绦虫、 牛带绦虫和亚洲带绦虫的分类提供新的依据。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种亚洲带绦虫 micoRNA 及其应用， 所述的这种亚洲带绦 虫 micoRNA 及其应用要解决现有技术中的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性、 以及动物产品 和环境中含有药物残留的技术问题。
本发明一种亚洲带绦虫 microRNA， 其核苷酸序列为 ： 如 SEQ ID NO:n 所示， n 选自 1 － 170 的正整数 ； 或者与 SEQ ID NO:n 中的任何一条序列互补的序列。
进一步的， 所述的互补序列为 DNA 或 RNA。
进一步的， 所述互补序列为经过修饰的 DNA 或 RNA。
进一步的， 所述互补序列为经过硫代修饰或甲氧基修饰的 DNA 或 RNA。
本发明还提供了上述的任一亚洲带绦虫 microRNA 在制备亚洲带绦虫疫苗中的应 用。
本发明还提供了一种抑制亚洲带绦虫成虫生长发育的组合物， 含有有效量的至少 一个寡核苷酸， 所述的寡核苷酸特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互补的序列。
本发明还提供了一种基因芯片， 包括一个固相载体， 其特征在于 ： 在所述的固相载体上固定有至少一个寡核苷酸探针， 所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互 补的序列。
本发明所提供的亚洲带绦虫特异表达的 microRNA 均分别克隆亚洲带绦虫的成 虫， 成熟的 microRNA 序列长度为 18 ～ 25 nt。对其 microRNA 进行深度测序， 获得亚洲带绦 虫成虫的 microRNA 表达谱， 通过比对发现， SEQ ID NO ： 1 ～ 170 所示的 microRNA 只在亚洲 带绦虫成虫中表达， 而在参照基因组日本血吸虫中不表达。 因此， 在亚洲带绦虫体内过量表 达 SEQ ID NO ： 1 ～ 170 分子或采用 microRNA 反向互补序列抑制 SEQ ID NO ： 1 ～ 170 的表 达将影响亚洲带绦虫生理功能及器官分化相关的功能。此外， 鉴于亚洲带绦虫与牛带绦虫 和猪带绦虫的物种相似性， 本发明所提供的亚洲带绦虫成虫特异性 microRNA 及其反向互 补序列亦可应该用于影响牛带绦虫以及猪带绦虫的生理功能及分化相关的功能。因此， 本 发明亚洲带绦虫成虫特异性表达的 microRNA 可用于制备带绦虫疫苗， 特别是亚洲带绦虫 疫苗。
本发明和已有技术相比， 其技术效果是显而易见的。本发明的亚洲带绦虫成虫特 异表达的 microRNA 可以选择性的抑制或阻断某一特定发育期虫体的发育， 从而减少或阻 断寄生虫， 尤其是亚洲带绦虫的传播。本发明 microRNA 制备成为亚洲带绦虫疫苗时， 作为 核酸疫苗， 避免了传统抗蠕虫药物造成的全球性分布的寄生虫抗药性问题， 也不会导致动 物产品或环境种内药物的残留。 具体实施方式 实施例 1 microRNA 的获得 1. 总 RNA 抽提 1） 将样本 （亚洲带绦虫成虫孕节一片） 放入研体中， 加入少量液氮， 迅速研磨， 待组织变 软， 再加少量液氮， 再研磨， 如此三次， 按 50–100mg 组织 /ml Trizol 加入 Trizol， 转移入离 心管 ； 2） 加入 250μL 氯仿， 剧烈振荡 10s， 使液体充分混匀呈乳白状 （无分相现象） 后， 再室温 静置 5min ； 3） 在 4℃条件下， 以 12000r/min 离心 15min ； 4） 将上层水相转移到一个新的离心管中， 加入等体积的异丙醇， 上下颠倒混匀， 然后在 4℃条件下静置 10–15min ； 5） 在 4℃条件下， 以 12000r/min 离心 15min， 小心并尽可能去掉上清 ； 6） 用 1mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀和管壁， 在 4℃条件下， 以 12000r/min 离心 8min， 然后 小心弃去乙醇 ； 7） 将 RNA 沉淀进行干燥 （不能完全干燥） 处理后， 用 10μL RNase–free 水将 RNA 溶解， 直接用于反转录。
2. 总 RNA 纯度和完整性检测 1）纯度检测 ： 取 1 μL RNA 样品 50 倍稀释， 在 BioPhotometer plus 核酸蛋白测定仪 上测定 OD 值， OD 260/OD 280 的比值大于 1.8。
2. 总 RNA 纯度和完整性检测 1）纯度检测 ： 取 1 μL RNA 样品 50 倍稀释， 在 BioPhotometer plus 核酸蛋白测定仪 上测定 OD 值， OD 260/OD 280 的比值大于 1.8。
2） 总 RNA 完整性 ： 取 RNA 样品 1 μL， 1% 琼脂糖凝胶电泳 80 V×20 min， 用凝胶成 像系统观察总 RNA 5S rRNA， 18S rRNA 和 28S rRNA 条带， 三条带条带完整。
3.small RNA 序列的获得和筛选 用 15% PAGE 胶回收 20-30 nt 的 small RNA， 加上 5’ 和 3’ 端接头 （购自 Illumina 公 司） 后实施 RT-PCR（反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司） 。产物经 6 %TBE PAGE 胶纯化后 进行 Solexa 测序。然后屏蔽掉可能为接头序列的部分、 测序质量差的序列 （例如测序信号 很低等） 及长度小于 18 nt 的序列获得 clean reads。
4.microRNA 的鉴定 用 BLAST 程 序 （NCBI， www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）将 clean reads 与 GenBank 和 Rfam database（version 9.0） （http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA） 进行比对分析， 去除非编码 RNA 序列， 包括 rRNA， tRNA， snRNA， snoRNA， 和 other ncRNA ； 通过 Repeatmasker（http://www.repeatmasker.org） 去除转座子等重复序列 ； 然后搜索 Sanger miRBase（version 13.0） 数据库， 寻找序列相似性 microRNA。将亚洲带绦虫所表 达的 microRNA 与已报道的日本血吸虫进行比较， 分别屏蔽掉两两共有相关的序列， 获得亚 洲带绦虫未注释的 microRNA（例举 170 条） 。
此外， 为了提高反向互补序列的作用和细胞内稳定性， 上述亚洲带绦虫特异性 microRNA 的反向互补序列可以是 DNA 或 RNA， 还可以对反向互补序列进行硫代、 甲氧基等修 饰。
实施例 2 本发明一种基因芯片， 包括一个固相载体， 在所述的固相载体上固定有至少一个寡核 苷酸探针， 所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互补的序列。
由于芯片的制造技术属于本领域的常规技术， 在此不再赘述。5102329797 A CN 102329807
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3.small RNA 序列的获得和筛选 用 15% PAGE 胶回收 20-30 nt 的 small RNA， 加上 5’ 和 3’ 端接头 （购自 Illumina 公 司） 后实施 RT-PCR（反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司） 。产物经 6 %TBE PAGE 胶纯化后 进行 Solexa 测序。然后屏蔽掉可能为接头序列的部分、 测序质量差的序列 （例如测序信号 很低等） 及长度小于 18 nt 的序列获得 clean reads。
4.microRNA 的鉴定 用 BLAST 程 序 （NCBI， www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）将 clean reads 与 GenBank 和 Rfam database（version 9.0） （http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA） 进行比对分析， 去除非编码 RNA 序列， 包括 rRNA， tRNA， snRNA， snoRNA， 和 other ncRNA ； 通过 Repeatmasker（http://www.repeatmasker.org） 去除转座子等重复序列 ； 然后搜索 Sanger miRBase（version 13.0） 数据库， 寻找序列相似性 microRNA。将亚洲带绦虫所表 达的 microRNA 与已报道的日本血吸虫进行比较， 分别屏蔽掉两两共有相关的序列， 获得亚 洲带绦虫未注释的 microRNA（例举 170 条） 。
此外， 为了提高反向互补序列的作用和细胞内稳定性， 上述亚洲带绦虫特异性 microRNA 的反向互补序列可以是 DNA 或 RNA， 还可以对反向互补序列进行硫代、 甲氧基等修 饰。
实施例 2 本发明一种基因芯片， 包括一个固相载体， 在所述的固相载体上固定有至少一个寡核 苷酸探针， 所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如 SEQ ID NO:1 ～ 170 中任一所示的 microRNA 序列或者与 SEQ ID NO:1 ～ 170 中的任何一条序列互补的序列。
由于芯片的制造技术属于本领域的常规技术， 在此不再赘述。5102329797 A CN 102329807
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