源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子及其表达载体与应 用 技术领域 本发明属微生物基因工程领域， 具体涉及一种源于红球菌的联苯降解相关基因操 纵子， 特别是涉及所述源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子及其表达载体在降解联苯和 多氯联苯中的应用。
背景技术 多氯联苯 (Polychlorinated biphenyls， PCBs) 是通过联苯直接氯代反应， 形成的 最多带有十个氯元素的复杂化合物， 随着工业的生产和应用， 多氯联苯被持续排放到环境 中 【Furukawa 和 Gen， Appl Microbiol， 2000， 46 ： 283-296】 。由于它们的疏水性， PCBs 非常 容易被土壤、 沉淀物和淤泥中的有机物质所吸收， PCBs 主要被排放到水生环境中。另外， 各 种 PCBs 化合物的辛醇 / 水分离系数很高， 这就导致了他们很容易被脂肪组织所吸收。PCBs 具备典型的持久性有机污染物的特性 ： (1) 难降解性。PCBs 结构稳定， 自然条件下不易降 解。(2) 远距离迁移性。PCBs 物质具有半挥发性， 能够从水体或土壤中以蒸汽形式进入大 气环境或被大气颗粒物吸附， 通过大气环流远距离迁移 【Wiegel 和 Wu， FEMS Microbiology Ecology， 2000， 32， 1-15 ； Jim 和 Reyes， Environmental Pollution， 2008， 155 ： 1-12】 。 因此， PCBs 对自然环境和人类健康都存在着较大的威胁， 降解和修复 PCBs 污染迫在眉睫。PCBs 是一种持久性有机污染物， 对人类和自然环境具有很大的威胁， 降解 PCBs 一直是研究的热 点。在目前的研究方法中生物降解最具潜力。生物降解主要分为微生物降解和、 植物修复 和微生物 - 植物共同修复三个方面。
目 前， 许 多 降 解 PCBs 的 菌 株 被 分 离， 包 括 革 兰 氏 阴 性 菌， 例 如 Pseudomona、 Alcaligenes、 Achromobacte、 Janibacter、 Burkholderia、 Acinetobacter、 Comamonas、 Sphingomonas、 Paenibacillus 和 Ralstonia ；革 兰 氏 阳 性 菌 包 括 Arthrobacter、 Corynebacterium、 Rhodococcus 和 Bacillus【Bedard 等， Microb.Ecol， 1990， 20 ： 87-102 ； Erickson 和 Mondello， J Bact， 1992， 174 ： 2903-2312 ； Kim 等， J Microbiol Biotechnol， 1996， 6： 167-172 ； Shimura 等， FEMS Microbiol Lett， 1999， 178 ： 87-93 ； Sakai 等， Appl Microbiol Biotechnol， 2005， 68 ： 111-116】 。
PCBs 的降解是一系列联苯降解酶控制辅助代谢的过程， 这些酶主要分为四类， 包 括联苯双加氧酶 (BphA)， 二氢二羟基脱氢酶 (BphB)， 2， 3 二羟基双加氧酶 (BphC) 和水解酶 (BphD)【Furukawa 和 Miyazaki， J Bacteriol， 1986， 166 ： 392-398 ； Abramowicz， Cri Rev Biotech， 1990 ； 10 ： 241-251 ； Furukawa， Biodegradation， 1994， 5： 289-300 ； Furukawa 和 Gen， Appl Microbiol， 2000， 46 ： 283-296 ； Furukawa 和 Fujihara， J Biosci Bioeng， 2008， 105 ： 433-449】 。降解 PCBs 主要的酶主要是由 bph 基因簇的 bphA、 bphB、 bphC 和 bphD 四 5： 个基因编码 【Abramowicz， Cri Rev Biotech， 1990 ； Furukawa， Biodegradation， 1994， 289-300 ； Masayuki 等， J Biosci Bioeng， 2002， 421-427 ； Adebusoye 等， Biodegradation， 2008， 19 ： 145-159】 。
发明内容 本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种联苯降解相关基因操纵子， 该操纵 子源自于红球菌属 (Rhodococcus sp.)。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种包含所述源于红球菌的联苯降解 相关基因操纵子的表达载体。
本发明所要解决的技术问题之三在于提供所述源于红球菌的联苯降解相关基因 操纵子及其表达载体在生物降解联苯和多氯联苯中的应用。
本发明的技术方案是通过如下方式来实现的。
所述的源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子， 其碱基序列如 SEQ ID No 1 所示， 其含有碱基 A 1595 个， 碱基 C 2610 个， 碱基 G 2816 个， 碱基 T 1613 个。
所述的源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子的制备方法， 包括以下步骤 ：
1) 菌株的筛选
选取土壤样品的地点为上海市浦东新区 ( 原南汇区 ) 老港一废弃化工厂附近 10 米的小河淤泥 ( 含有红球菌 (Rhodococcus))。将土样装入灭菌的纸袋中， 在超净工作台 上称取 10g 土样， 放入陶瓷研钵中， 加入 50mL 无菌水， 用无菌研棒捣碎， 静置 5 分钟后， 吸 1-5mL 上层清液加入到 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 液体基本培养基中， 于 28℃ 150 转 / 分钟培养 3 天， 从中取样 1mL 加入到新 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳 源的 M9 液体基本培养基中继续继代培养， 如此继代 4 次后， 取 20μL 涂板于含 0.01wt％三 氯联苯为唯一碳源的 M9 固体基本培养基上， 于 28℃培养 3 天， 将一个生长良好的红球菌株 挑选出来进行进一步研究。
2) 菌株总 DNA 的提取
将分离获得的红球菌株在 100mL 液体 LB 培养基中 28℃、 150 转 / 分钟培养过夜 (16 小时 )， 菌体培养液以 6,000g 重力加速度离心 5min， 得到菌体沉淀。 这些沉淀在 -20℃下冷 冻 1h。之后使用 TE(10mM Tris-HCl、 1mM EDTA， pH8.0) 溶液清洗一次。加入浓度为 10mg/ mL 溶菌酶的无菌水悬浮， 在 37℃下摇床培养 1h。加入 0.5M EDTA， 10％ (w/v)SDS 和浓度为 5M 的 NaCl 轻轻振荡混匀。再加入浓度为 20mg/mL 蛋白激 K， 反应物在 37℃下培养 1h。用 与培养菌液液体体积相当 (1 倍体积 ) 的苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 提取 DNA。水 相用与相当水相体积 1/2(0.5 倍体积 ) 的氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 萃取。振荡混匀后离心 5min。水相中加入与水相体积相当 (1 倍体积 ) 的异戊醇。振荡混匀后离心 15min。取沉 淀， 用 70％ (v/v) 酒精冲洗 DNA， 干燥， 之后在 TE 缓冲液中重悬浮。所得总 DNA 储存于 4℃ 下备用。
3) 基因组文库的构建
上述红球菌株总 DNA 用 Sau3A I 酶切， 经琼脂糖凝胶回收 10kb 左右的 DNA 片断备 用。此片断经过末端去磷酸化连接到同样去磷酸化的 pACYC184 质粒载体。上述连接产物 转入大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 电击感受态细胞， 涂布与 LB 固体培养基， 37℃下 培养 24h 进行质粒大抽。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。
5) 序列测定
对在 0.01wt％四氯联苯为唯一碳源的 M9 固体基本培养基上生长良好的红球菌落
接种于 LB 液体培养基中进行过夜培养， 质粒抽提后进行序列测定。
6) 序列分析
通过核苷酸序列测定分析， 获得联苯降解相关基因操纵子片段， 它具有如 SEQ ID No 1 所示的碱基信息。
7) 表达载体的构建
将联苯降解相关基因操纵子片段 SEQ ID No 1 的序列直接与表达载体 pMD-18 vector(takara 大连 ) 相连， 4℃下连接 12 小时， 然后将该载体转化大肠杆菌 DH5α 感受态 细胞 (takara 大连 ) 中。
含有联苯降解相关基因操纵子 SEQ ID No 1 片段的表达载体转入原核微生物细胞 后， 该细胞能够合成联苯降解相关酶。将联苯加入菌液中， 经过培养联苯的含量下降。
本发明方案实现的有益效果 ：
本发明成功制得了一种源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子， 为了进一步分析 该红球菌来源的联苯降解相关基因操纵子在有机污染物降解中的作用与功能， 分析了含有 该操纵子大肠杆菌菌株对联苯的降解能力。 结果表明本发明的联苯降解相关基因操纵子及 其表达载体可以使联苯的含量下降， 可用于生物降解联苯和多氯联苯。 附图说明
图 1 为 Sau3AI 酶切的片段， 其中 A 为红球菌总 DNASau3AI 酶切的片段。具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案， 但不限于本发明。
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 菌株由上海市农业科学院生物技术研究所 植物基因工程研究室保存。载体、 各类限制性内切酶、 Taq 聚合酶、 连接酶、 dNTP、 10×PCR buffer 和 DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司和美国 New England Biolabs 公司。 所 有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。 ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA 测序试剂盒购自美国应用系统公司。
本 发 明 涉 及 的 分 子 生 物 学 实 验 若 没 有 特 殊 说 明， 均参考 《分 子 克 隆》一 书 【Sambrook J， Frets E F， Mannsdes T et al.In ： Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989】 。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分 子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。
实施例 1
降解多氯联苯菌株的筛选
( 一 ) 试验方法 ：
取土壤样品 [ 地点为上海市浦东新区 ( 原南汇区 ) 老港一废弃化工厂附近 10 米 的小河淤泥 ( 内含红球菌 )]， 将土样装入灭菌的纸袋中。
在超净工作台上称取 10g 土样， 放入陶瓷研钵中。
加入 50mL 无菌水， 用无菌研棒捣碎 ； 静置 5min 后 ； 吸 1-5mL 上层清液加入到 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 液体基本培养基中。 于 28℃ 150 转 / 分钟培养 3 天 ； 从中取样 1mL 加入到新 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 液体基本培养基中继续继代培养 ； 如此继代 4 次。取 20μL 图板于含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 固体 基本培养基上。
( 二 ) 试验结果 ：
于 28℃培养 3 天， 分离获得一个生长良好的红球菌株。
实施例 2
多氯联苯降解菌株总 DNA 的提取
( 一 ) 试验方法 ：
接种分离获得的红球菌株在 100mL 液体 LB 培养基中 ； 28℃、 150 转 / 分钟培养过 夜 (16h) ； 菌体培养液以 6,000g 重力加速度离心 5min， 得到菌体沉淀 ；
菌体沉淀在 -20 ℃下冷冻 1h ； 使用 TE(10mM Tris-HCl， 1mM EDTA， pH 8.0) 溶液 清洗一次 ； 加入含浓度为 10mg/mL 溶菌酶的无菌水悬浮 ； 在 37℃下摇床培养 1h ； 加入 0.5M EDTA， 10％ (w/v)SDS 和浓度为 5M 的 NaCl 轻轻振荡混匀 ； 再加入浓度为 20mg/mL 蛋白激 K ； 反应物在 37℃下培养 1h。用与培养菌液液体体积相当 (1 倍体积 ) 的苯酚∶氯仿∶异戊 醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 提取 DNA ； 加入与相当水相 0.5 倍体积的氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) ； 振荡 混匀后离心 5min ； 吸取水相 ； 加入与水相体积相当 (1 倍体积 ) 的异戊醇 ； 振荡混匀 ； 离心 15min ； 取沉淀 ； 用 70％ (v/v) 酒精冲洗 DNA ； 干燥 ； 50uL TE 缓冲液中重悬浮 ； 所得总 DNA 储 存于 4℃下备用。 ( 二 ) 试验结果 ：
接种分离获得的红球菌株在 100mL 液体 LB 培养基 28℃过夜培养生长良好。
实施例 3
降解多氯联苯菌株基因组文库的构建
( 一 ) 试验方法 ：
取 10μL 红球菌株的 DNA， 加入 1 ∶ 100 稀释的 Sau3A I 酶 1μL ； 37℃分别酶切 10min、 20min、 30min、 40min、 50min 和 60min ； 加入 10×loading buffer 1μL 终止反应 ； 电 泳检测最适酶切反应时间 ； 而后选择相同的体系酶切 30min 进行大量酶切 ； 0.7％ (w/v) 琼 脂糖凝胶电泳 ； 回收 5-8kb 的 DNA 片段 ； 回收片段采用杭州维特洁生化技术有限公司 DNA 琼 脂糖凝胶回收试剂盒回收。质粒载体 pACYC184 用 BamH I 完全酶切后 SAP 碱性磷酸酯酶进 行末端去磷酸化， 以减少载体自连 ； 上述回收后的红球菌株 DNA(200ng) 和末端去磷酸化的 质粒载体 pACYC184(150ng) 用 2U 的 T4 ligase 连接 ； 4℃下连接 16h ； 连接产物用正丁醇沉 淀后， 用 70％ (v/v) 的乙醇离心洗涤 ； 最后用 10μL 的超纯水溶解。
( 二 ) 试验结果 ：
0.7％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测分离获得的红球菌株的 DNA 的 Sau3A I 酶解， 发 现 37℃酶切 20min 的 DNA 片段呈现弥散状态 ( 参见图 1)。
实施例 4
电击法转化大肠杆菌
( 一 ) 试验方法 ：
接种固体培养基上生长良好的红球单菌落放入 250mL SOB 液体培养基中培养 ； 30 ℃， 275 转 / 分钟培养过夜 ； 长至 OD550 到 0.75 时， 将菌液倒入预冷的离心管中， 冰置 10min ； 4 ℃， 5500 转 / 分钟离心 5-6min， 倒上清 ； 加入无菌水重悬菌体 ； 4 ℃， 5500 转 / 分
钟离心 5-6min， 倒上清 ； 再用无菌水洗涤一遍， 4℃， 5500 转 / 分钟离心 5-6min， 倒上清 ； 加 入 10％无菌甘油重悬菌体。4℃， 5500 转 / 分钟离心 5-6min， 倒上清 ； 用 1mL 枪头吹起浓菌 液， 即为电击感受态细胞 ； 取微量 DNA(0.1-1ng) 样品于 80-100uL 感受态细胞中， 混匀， 冰 置 2min ； 将混合物加入预冷的 1mm 电击杯中， 进行电击， 电击参数为 ： 电脉冲为 2.5μF， 电 压 2.5kV， 电阻 200Ω， 电击时间为 4.5s) ； 立即加入 1mL 培养基， 于 37℃震荡培养 1 小时。
将菌液涂布于 LB( 含有 50μg/mL 氨苄青霉素 ) 平板上， 37℃培养 12-16h。抽提质 粒， -20℃保存。
( 二 ) 试验结果 ：
上述连接产物电击转入大肠杆菌 DH5α 电击感受态细胞， 涂布与 LB 固体培养基， 4 37℃下培养 24h 后， 转化子库容为 4×10 个。进行质粒大抽， 构建成了包含有目的基因的 基因组文库。
实施例 5
筛选降解多氯联苯的转化子
( 一 ) 试验方法 ：
将降解多氯联苯菌株基因组文库转入大肠杆菌 DH5α ； 图板于含 0.01wt％三氯联 苯为唯一碳源的 M9 固体基本培养基上 ； 于 28℃培养 3 天。 ( 二 ) 试验结果 ：
大肠杆菌菌落生长良好。
实施例 6
联苯降解相关基因操纵子的序列测定与分析
( 一 ) 试验方法 ：
将长势良好的大肠杆菌菌落接入 2mL 的 LB 培养基中进行过夜培养。
37℃振荡 (150 转 / 分钟 ) 过夜培养。
取 1.5ml， 13000rpm 离心 30 秒。
倒尽上清夜。悬浮菌体于 100ml 预冷的溶液 I 中， Vortex。
加入 200ul 新鲜配置的溶液 II， 快速上下混匀。
加入 150ul 预冷的溶液 III， 快速上下混匀， 冰上放置 15 分钟。
13000rpm， 4℃离心 15 分钟。
将上清转入另一离心管中， 加入 900ul 预冷的无水乙醇， 混匀。冰置 10 分钟。
13000rpm 4℃离心 15 分钟。
倒去上清， 加入 1ml 70％乙醇， 洗涤 DNA 沉淀。13000rpm 离心 5 分钟， 去上清。
加入 30μl TER 溶解沉淀， 37℃水浴 30 分钟后， -20℃保存待用。
进行抽提质粒的序列测定。
( 二 ) 试验结果 ：
大肠杆菌质粒后电泳检测， 质粒含量约为 100ng/μl。DNA 序列测定显示， 联苯降 解相关基因操纵子长度为 8634bp， 其中碱基 A 有 1595 个， 碱基 C 有 2610 个， 碱基 G 有 2816 个， 碱基 T 有 1613 个。具体见序列 SEQ ID NO 1。
实施例 7
HPLC 检测联苯降解
( 一 ) 试验方法 ：
在 250mL 锥形瓶中加入 100mL LB 培养液， 接入红球菌种 100μL ； 28℃， 120 转 / 分 钟过夜培养 ； 加入 1mL 配好的联苯溶液 (50mg/mL， 1g 联苯溶于 20mL 甲醇 ) ； 继续 28℃， 120 转 / 分钟培养 ； 3 天后， 吸取 500uL 菌液于 dorf 管， 再加入 500μL 乙醚 ； 振荡器振荡 5-10min 充分混匀 ； 吸取上清， 置于新的 dorf 管中 ； 在 dorf 管中加入 500μL 甲醇， 混匀后进行旋转 蒸发 ； 吸出剩余的甲醇， 再加入 500μL 甲醇 ； 过滤膜过滤于新的 dorf 管中 ； 上柱， HPLC 条 件： 机器为安捷伦 1100 系列， 流动相 ( 乙腈∶水＝ 70 ∶ 30)， 流速 1.0mL/min， 固定相 (C18 反向柱 )， 柱温 ( 常温 )， 检测波长 (254nm)， 进样量 (20μL)。
( 二 ) 试验结果 ：
联苯纯品的浓度为 100μg/mL， 出峰时间为 5.9min 左右。经过 1 天的含联苯降解 相关基因操纵子的大肠杆菌降解了培养基约 35％的联苯， 而对照空白为降解了 1％， 空白 大肠杆菌降解了约 3％。含联苯降解相关基因操纵子的大肠杆菌具有明显的降解联苯能力 ( 参见表 1)。
表 1 HPLC 检测联苯降解分析
背景技术 多氯联苯 (Polychlorinated biphenyls， PCBs) 是通过联苯直接氯代反应， 形成的 最多带有十个氯元素的复杂化合物， 随着工业的生产和应用， 多氯联苯被持续排放到环境 中 【Furukawa 和 Gen， Appl Microbiol， 2000， 46 ： 283-296】 。由于它们的疏水性， PCBs 非常 容易被土壤、 沉淀物和淤泥中的有机物质所吸收， PCBs 主要被排放到水生环境中。另外， 各 种 PCBs 化合物的辛醇 / 水分离系数很高， 这就导致了他们很容易被脂肪组织所吸收。PCBs 具备典型的持久性有机污染物的特性 ： (1) 难降解性。PCBs 结构稳定， 自然条件下不易降 解。(2) 远距离迁移性。PCBs 物质具有半挥发性， 能够从水体或土壤中以蒸汽形式进入大 气环境或被大气颗粒物吸附， 通过大气环流远距离迁移 【Wiegel 和 Wu， FEMS Microbiology Ecology， 2000， 32， 1-15 ； Jim 和 Reyes， Environmental Pollution， 2008， 155 ： 1-12】 。 因此， PCBs 对自然环境和人类健康都存在着较大的威胁， 降解和修复 PCBs 污染迫在眉睫。PCBs 是一种持久性有机污染物， 对人类和自然环境具有很大的威胁， 降解 PCBs 一直是研究的热 点。在目前的研究方法中生物降解最具潜力。生物降解主要分为微生物降解和、 植物修复 和微生物 - 植物共同修复三个方面。
目 前， 许 多 降 解 PCBs 的 菌 株 被 分 离， 包 括 革 兰 氏 阴 性 菌， 例 如 Pseudomona、 Alcaligenes、 Achromobacte、 Janibacter、 Burkholderia、 Acinetobacter、 Comamonas、 Sphingomonas、 Paenibacillus 和 Ralstonia ；革 兰 氏 阳 性 菌 包 括 Arthrobacter、 Corynebacterium、 Rhodococcus 和 Bacillus【Bedard 等， Microb.Ecol， 1990， 20 ： 87-102 ； Erickson 和 Mondello， J Bact， 1992， 174 ： 2903-2312 ； Kim 等， J Microbiol Biotechnol， 1996， 6： 167-172 ； Shimura 等， FEMS Microbiol Lett， 1999， 178 ： 87-93 ； Sakai 等， Appl Microbiol Biotechnol， 2005， 68 ： 111-116】 。
PCBs 的降解是一系列联苯降解酶控制辅助代谢的过程， 这些酶主要分为四类， 包 括联苯双加氧酶 (BphA)， 二氢二羟基脱氢酶 (BphB)， 2， 3 二羟基双加氧酶 (BphC) 和水解酶 (BphD)【Furukawa 和 Miyazaki， J Bacteriol， 1986， 166 ： 392-398 ； Abramowicz， Cri Rev Biotech， 1990 ； 10 ： 241-251 ； Furukawa， Biodegradation， 1994， 5： 289-300 ； Furukawa 和 Gen， Appl Microbiol， 2000， 46 ： 283-296 ； Furukawa 和 Fujihara， J Biosci Bioeng， 2008， 105 ： 433-449】 。降解 PCBs 主要的酶主要是由 bph 基因簇的 bphA、 bphB、 bphC 和 bphD 四 5： 个基因编码 【Abramowicz， Cri Rev Biotech， 1990 ； Furukawa， Biodegradation， 1994， 289-300 ； Masayuki 等， J Biosci Bioeng， 2002， 421-427 ； Adebusoye 等， Biodegradation， 2008， 19 ： 145-159】 。
目 前， 许 多 降 解 PCBs 的 菌 株 被 分 离， 包 括 革 兰 氏 阴 性 菌， 例 如 Pseudomona、 Alcaligenes、 Achromobacte、 Janibacter、 Burkholderia、 Acinetobacter、 Comamonas、 Sphingomonas、 Paenibacillus 和 Ralstonia ；革 兰 氏 阳 性 菌 包 括 Arthrobacter、 Corynebacterium、 Rhodococcus 和 Bacillus【Bedard 等， Microb.Ecol， 1990， 20 ： 87-102 ； Erickson 和 Mondello， J Bact， 1992， 174 ： 2903-2312 ； Kim 等， J Microbiol Biotechnol， 1996， 6： 167-172 ； Shimura 等， FEMS Microbiol Lett， 1999， 178 ： 87-93 ； Sakai 等， Appl Microbiol Biotechnol， 2005， 68 ： 111-116】 。
PCBs 的降解是一系列联苯降解酶控制辅助代谢的过程， 这些酶主要分为四类， 包 括联苯双加氧酶 (BphA)， 二氢二羟基脱氢酶 (BphB)， 2， 3 二羟基双加氧酶 (BphC) 和水解酶 (BphD)【Furukawa 和 Miyazaki， J Bacteriol， 1986， 166 ： 392-398 ； Abramowicz， Cri Rev Biotech， 1990 ； 10 ： 241-251 ； Furukawa， Biodegradation， 1994， 5： 289-300 ； Furukawa 和 Gen， Appl Microbiol， 2000， 46 ： 283-296 ； Furukawa 和 Fujihara， J Biosci Bioeng， 2008， 105 ： 433-449】 。降解 PCBs 主要的酶主要是由 bph 基因簇的 bphA、 bphB、 bphC 和 bphD 四 5： 个基因编码 【Abramowicz， Cri Rev Biotech， 1990 ； Furukawa， Biodegradation， 1994， 289-300 ； Masayuki 等， J Biosci Bioeng， 2002， 421-427 ； Adebusoye 等， Biodegradation， 2008， 19 ： 145-159】 。
发明内容 本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种联苯降解相关基因操纵子， 该操纵 子源自于红球菌属 (Rhodococcus sp.)。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种包含所述源于红球菌的联苯降解 相关基因操纵子的表达载体。
本发明所要解决的技术问题之三在于提供所述源于红球菌的联苯降解相关基因 操纵子及其表达载体在生物降解联苯和多氯联苯中的应用。
本发明的技术方案是通过如下方式来实现的。
所述的源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子， 其碱基序列如 SEQ ID No 1 所示， 其含有碱基 A 1595 个， 碱基 C 2610 个， 碱基 G 2816 个， 碱基 T 1613 个。
所述的源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子的制备方法， 包括以下步骤 ：
1) 菌株的筛选
选取土壤样品的地点为上海市浦东新区 ( 原南汇区 ) 老港一废弃化工厂附近 10 米的小河淤泥 ( 含有红球菌 (Rhodococcus))。将土样装入灭菌的纸袋中， 在超净工作台 上称取 10g 土样， 放入陶瓷研钵中， 加入 50mL 无菌水， 用无菌研棒捣碎， 静置 5 分钟后， 吸 1-5mL 上层清液加入到 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 液体基本培养基中， 于 28℃ 150 转 / 分钟培养 3 天， 从中取样 1mL 加入到新 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳 源的 M9 液体基本培养基中继续继代培养， 如此继代 4 次后， 取 20μL 涂板于含 0.01wt％三 氯联苯为唯一碳源的 M9 固体基本培养基上， 于 28℃培养 3 天， 将一个生长良好的红球菌株 挑选出来进行进一步研究。
2) 菌株总 DNA 的提取
将分离获得的红球菌株在 100mL 液体 LB 培养基中 28℃、 150 转 / 分钟培养过夜 (16 小时 )， 菌体培养液以 6,000g 重力加速度离心 5min， 得到菌体沉淀。 这些沉淀在 -20℃下冷 冻 1h。之后使用 TE(10mM Tris-HCl、 1mM EDTA， pH8.0) 溶液清洗一次。加入浓度为 10mg/ mL 溶菌酶的无菌水悬浮， 在 37℃下摇床培养 1h。加入 0.5M EDTA， 10％ (w/v)SDS 和浓度为 5M 的 NaCl 轻轻振荡混匀。再加入浓度为 20mg/mL 蛋白激 K， 反应物在 37℃下培养 1h。用 与培养菌液液体体积相当 (1 倍体积 ) 的苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 提取 DNA。水 相用与相当水相体积 1/2(0.5 倍体积 ) 的氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 萃取。振荡混匀后离心 5min。水相中加入与水相体积相当 (1 倍体积 ) 的异戊醇。振荡混匀后离心 15min。取沉 淀， 用 70％ (v/v) 酒精冲洗 DNA， 干燥， 之后在 TE 缓冲液中重悬浮。所得总 DNA 储存于 4℃ 下备用。
3) 基因组文库的构建
上述红球菌株总 DNA 用 Sau3A I 酶切， 经琼脂糖凝胶回收 10kb 左右的 DNA 片断备 用。此片断经过末端去磷酸化连接到同样去磷酸化的 pACYC184 质粒载体。上述连接产物 转入大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 电击感受态细胞， 涂布与 LB 固体培养基， 37℃下 培养 24h 进行质粒大抽。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。
5) 序列测定
对在 0.01wt％四氯联苯为唯一碳源的 M9 固体基本培养基上生长良好的红球菌落
接种于 LB 液体培养基中进行过夜培养， 质粒抽提后进行序列测定。
6) 序列分析
通过核苷酸序列测定分析， 获得联苯降解相关基因操纵子片段， 它具有如 SEQ ID No 1 所示的碱基信息。
7) 表达载体的构建
将联苯降解相关基因操纵子片段 SEQ ID No 1 的序列直接与表达载体 pMD-18 vector(takara 大连 ) 相连， 4℃下连接 12 小时， 然后将该载体转化大肠杆菌 DH5α 感受态 细胞 (takara 大连 ) 中。
含有联苯降解相关基因操纵子 SEQ ID No 1 片段的表达载体转入原核微生物细胞 后， 该细胞能够合成联苯降解相关酶。将联苯加入菌液中， 经过培养联苯的含量下降。
本发明方案实现的有益效果 ：
本发明成功制得了一种源于红球菌的联苯降解相关基因操纵子， 为了进一步分析 该红球菌来源的联苯降解相关基因操纵子在有机污染物降解中的作用与功能， 分析了含有 该操纵子大肠杆菌菌株对联苯的降解能力。 结果表明本发明的联苯降解相关基因操纵子及 其表达载体可以使联苯的含量下降， 可用于生物降解联苯和多氯联苯。 附图说明
图 1 为 Sau3AI 酶切的片段， 其中 A 为红球菌总 DNASau3AI 酶切的片段。具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案， 但不限于本发明。
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 菌株由上海市农业科学院生物技术研究所 植物基因工程研究室保存。载体、 各类限制性内切酶、 Taq 聚合酶、 连接酶、 dNTP、 10×PCR buffer 和 DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司和美国 New England Biolabs 公司。 所 有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。 ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA 测序试剂盒购自美国应用系统公司。
本 发 明 涉 及 的 分 子 生 物 学 实 验 若 没 有 特 殊 说 明， 均参考 《分 子 克 隆》一 书 【Sambrook J， Frets E F， Mannsdes T et al.In ： Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989】 。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分 子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。
实施例 1
降解多氯联苯菌株的筛选
( 一 ) 试验方法 ：
取土壤样品 [ 地点为上海市浦东新区 ( 原南汇区 ) 老港一废弃化工厂附近 10 米 的小河淤泥 ( 内含红球菌 )]， 将土样装入灭菌的纸袋中。
在超净工作台上称取 10g 土样， 放入陶瓷研钵中。
加入 50mL 无菌水， 用无菌研棒捣碎 ； 静置 5min 后 ； 吸 1-5mL 上层清液加入到 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 液体基本培养基中。 于 28℃ 150 转 / 分钟培养 3 天 ； 从中取样 1mL 加入到新 100mL 含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 液体基本培养基中继续继代培养 ； 如此继代 4 次。取 20μL 图板于含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的 M9 固体 基本培养基上。
( 二 ) 试验结果 ：
于 28℃培养 3 天， 分离获得一个生长良好的红球菌株。
实施例 2
多氯联苯降解菌株总 DNA 的提取
( 一 ) 试验方法 ：
接种分离获得的红球菌株在 100mL 液体 LB 培养基中 ； 28℃、 150 转 / 分钟培养过 夜 (16h) ； 菌体培养液以 6,000g 重力加速度离心 5min， 得到菌体沉淀 ；
菌体沉淀在 -20 ℃下冷冻 1h ； 使用 TE(10mM Tris-HCl， 1mM EDTA， pH 8.0) 溶液 清洗一次 ； 加入含浓度为 10mg/mL 溶菌酶的无菌水悬浮 ； 在 37℃下摇床培养 1h ； 加入 0.5M EDTA， 10％ (w/v)SDS 和浓度为 5M 的 NaCl 轻轻振荡混匀 ； 再加入浓度为 20mg/mL 蛋白激 K ； 反应物在 37℃下培养 1h。用与培养菌液液体体积相当 (1 倍体积 ) 的苯酚∶氯仿∶异戊 醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 提取 DNA ； 加入与相当水相 0.5 倍体积的氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) ； 振荡 混匀后离心 5min ； 吸取水相 ； 加入与水相体积相当 (1 倍体积 ) 的异戊醇 ； 振荡混匀 ； 离心 15min ； 取沉淀 ； 用 70％ (v/v) 酒精冲洗 DNA ； 干燥 ； 50uL TE 缓冲液中重悬浮 ； 所得总 DNA 储 存于 4℃下备用。 ( 二 ) 试验结果 ：
接种分离获得的红球菌株在 100mL 液体 LB 培养基 28℃过夜培养生长良好。
实施例 3
降解多氯联苯菌株基因组文库的构建
( 一 ) 试验方法 ：
取 10μL 红球菌株的 DNA， 加入 1 ∶ 100 稀释的 Sau3A I 酶 1μL ； 37℃分别酶切 10min、 20min、 30min、 40min、 50min 和 60min ； 加入 10×loading buffer 1μL 终止反应 ； 电 泳检测最适酶切反应时间 ； 而后选择相同的体系酶切 30min 进行大量酶切 ； 0.7％ (w/v) 琼 脂糖凝胶电泳 ； 回收 5-8kb 的 DNA 片段 ； 回收片段采用杭州维特洁生化技术有限公司 DNA 琼 脂糖凝胶回收试剂盒回收。质粒载体 pACYC184 用 BamH I 完全酶切后 SAP 碱性磷酸酯酶进 行末端去磷酸化， 以减少载体自连 ； 上述回收后的红球菌株 DNA(200ng) 和末端去磷酸化的 质粒载体 pACYC184(150ng) 用 2U 的 T4 ligase 连接 ； 4℃下连接 16h ； 连接产物用正丁醇沉 淀后， 用 70％ (v/v) 的乙醇离心洗涤 ； 最后用 10μL 的超纯水溶解。
( 二 ) 试验结果 ：
0.7％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测分离获得的红球菌株的 DNA 的 Sau3A I 酶解， 发 现 37℃酶切 20min 的 DNA 片段呈现弥散状态 ( 参见图 1)。
实施例 4
电击法转化大肠杆菌
( 一 ) 试验方法 ：
接种固体培养基上生长良好的红球单菌落放入 250mL SOB 液体培养基中培养 ； 30 ℃， 275 转 / 分钟培养过夜 ； 长至 OD550 到 0.75 时， 将菌液倒入预冷的离心管中， 冰置 10min ； 4 ℃， 5500 转 / 分钟离心 5-6min， 倒上清 ； 加入无菌水重悬菌体 ； 4 ℃， 5500 转 / 分
钟离心 5-6min， 倒上清 ； 再用无菌水洗涤一遍， 4℃， 5500 转 / 分钟离心 5-6min， 倒上清 ； 加 入 10％无菌甘油重悬菌体。4℃， 5500 转 / 分钟离心 5-6min， 倒上清 ； 用 1mL 枪头吹起浓菌 液， 即为电击感受态细胞 ； 取微量 DNA(0.1-1ng) 样品于 80-100uL 感受态细胞中， 混匀， 冰 置 2min ； 将混合物加入预冷的 1mm 电击杯中， 进行电击， 电击参数为 ： 电脉冲为 2.5μF， 电 压 2.5kV， 电阻 200Ω， 电击时间为 4.5s) ； 立即加入 1mL 培养基， 于 37℃震荡培养 1 小时。
将菌液涂布于 LB( 含有 50μg/mL 氨苄青霉素 ) 平板上， 37℃培养 12-16h。抽提质 粒， -20℃保存。
( 二 ) 试验结果 ：
上述连接产物电击转入大肠杆菌 DH5α 电击感受态细胞， 涂布与 LB 固体培养基， 4 37℃下培养 24h 后， 转化子库容为 4×10 个。进行质粒大抽， 构建成了包含有目的基因的 基因组文库。
实施例 5
筛选降解多氯联苯的转化子
( 一 ) 试验方法 ：
将降解多氯联苯菌株基因组文库转入大肠杆菌 DH5α ； 图板于含 0.01wt％三氯联 苯为唯一碳源的 M9 固体基本培养基上 ； 于 28℃培养 3 天。 ( 二 ) 试验结果 ：
大肠杆菌菌落生长良好。
实施例 6
联苯降解相关基因操纵子的序列测定与分析
( 一 ) 试验方法 ：
将长势良好的大肠杆菌菌落接入 2mL 的 LB 培养基中进行过夜培养。
37℃振荡 (150 转 / 分钟 ) 过夜培养。
取 1.5ml， 13000rpm 离心 30 秒。
倒尽上清夜。悬浮菌体于 100ml 预冷的溶液 I 中， Vortex。
加入 200ul 新鲜配置的溶液 II， 快速上下混匀。
加入 150ul 预冷的溶液 III， 快速上下混匀， 冰上放置 15 分钟。
13000rpm， 4℃离心 15 分钟。
将上清转入另一离心管中， 加入 900ul 预冷的无水乙醇， 混匀。冰置 10 分钟。
13000rpm 4℃离心 15 分钟。
倒去上清， 加入 1ml 70％乙醇， 洗涤 DNA 沉淀。13000rpm 离心 5 分钟， 去上清。
加入 30μl TER 溶解沉淀， 37℃水浴 30 分钟后， -20℃保存待用。
进行抽提质粒的序列测定。
( 二 ) 试验结果 ：
大肠杆菌质粒后电泳检测， 质粒含量约为 100ng/μl。DNA 序列测定显示， 联苯降 解相关基因操纵子长度为 8634bp， 其中碱基 A 有 1595 个， 碱基 C 有 2610 个， 碱基 G 有 2816 个， 碱基 T 有 1613 个。具体见序列 SEQ ID NO 1。
实施例 7
HPLC 检测联苯降解
( 一 ) 试验方法 ：
在 250mL 锥形瓶中加入 100mL LB 培养液， 接入红球菌种 100μL ； 28℃， 120 转 / 分 钟过夜培养 ； 加入 1mL 配好的联苯溶液 (50mg/mL， 1g 联苯溶于 20mL 甲醇 ) ； 继续 28℃， 120 转 / 分钟培养 ； 3 天后， 吸取 500uL 菌液于 dorf 管， 再加入 500μL 乙醚 ； 振荡器振荡 5-10min 充分混匀 ； 吸取上清， 置于新的 dorf 管中 ； 在 dorf 管中加入 500μL 甲醇， 混匀后进行旋转 蒸发 ； 吸出剩余的甲醇， 再加入 500μL 甲醇 ； 过滤膜过滤于新的 dorf 管中 ； 上柱， HPLC 条 件： 机器为安捷伦 1100 系列， 流动相 ( 乙腈∶水＝ 70 ∶ 30)， 流速 1.0mL/min， 固定相 (C18 反向柱 )， 柱温 ( 常温 )， 检测波长 (254nm)， 进样量 (20μL)。
( 二 ) 试验结果 ：
联苯纯品的浓度为 100μg/mL， 出峰时间为 5.9min 左右。经过 1 天的含联苯降解 相关基因操纵子的大肠杆菌降解了培养基约 35％的联苯， 而对照空白为降解了 1％， 空白 大肠杆菌降解了约 3％。含联苯降解相关基因操纵子的大肠杆菌具有明显的降解联苯能力 ( 参见表 1)。
表 1 HPLC 检测联苯降解分析
编号 空白对照 空白大肠杆菌菌株 含本发明的联苯降解相关基因操纵子的大肠杆菌降解效率 1％ 3％ 35％最后应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。8102373203 A CN 102373206
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