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1、10申请公布号CN102370993A43申请公布日20120314CN102370993ACN102370993A21申请号201010259345022申请日20100823A61K47/48200601A61K47/42200601A61K47/34200601A61K38/42200601A61P7/0820060171申请人王革地址250101山东省济南市高新区天辰大街978号申请人谷劲松叶春江72发明人谷劲松王革叶春江54发明名称一种新型红细胞代用品人工红细胞荧光纳米粒的制备方法57摘要本发明公开了一种红细胞代用品人工红细胞荧光纳米粒的制备方法。采用双功能试剂戊二醛交联技术将血红蛋。
2、白HB与过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD以及碳酸酐酶CA交联生成POLYHBSODCATCA复合体，并进一步通过聚乳酸、聚乙二醇共聚物PLAPEG纳米粒包埋。复合体中的抗氧化酶SOD和CAT可消除输血过程中产生的氧自由基，从而避免了血液替换过程中极易出现的缺血再灌注损伤；碳酸酐酶使该红细胞代用品不仅具有携氧的性能，而且能输送二氧化碳；PLAPEG微囊包埋既能延长这种人工血液制品的半衰期，又能增加其生物相容性。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页CN102370994A1/1页21一种通过戊二醛交联及聚乳酸、聚乙二醇共聚物PLAPE。
3、G纳米粒包埋牛血红蛋白与过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD以及碳酸酐酶CA交联生成POLYHBSODCATCA复合体，以制备一种具有治疗意义人工红细胞纳米粒的方法。2如权利要求1所述POLYHBSODCATCA复合体，其特征在于1通过戊二醛交联牛血红蛋白与过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD以及碳酸酐酶CA生成；2过氧化氢酶超氧化物歧化酶碳酸酐酶血红蛋白的比例为300,000U15,000U100U1G；3POLYHBSODCAT能在较大程度上消除了氧自由基及过氧化物，另外，它还能抑制聚合血红蛋白制备过程中高铁血红蛋白的形成，不仅在血液替换时能预防缺血再灌注损伤I/RI的发生，还有潜力成。
4、为I/RI治疗剂，以治疗其他原因造成的I/RI；4交联的碳酸酐酶CA对碳酸和重碳酸离子起到迅速转换的作用，在血液中维持酸碱平衡，并帮助排除二氧化碳。3如权利要求1所述戊二醛交联反应，其特征在于1戊二醛与血红蛋白摩尔比为171；2交联反应操作过程在4，通氮气保护环境下进行；3交联反应前赖氨酸与血红蛋白摩尔比为101。4如权利要求1所述聚乳酸、聚乙二醇共聚物PLAPEG，其特征在于1PLAPEG共聚物可溶于丙酮；2PLAPEG制备采用的DL一聚乳酸分子量为6,00016,000；3PLAPEG制备采用的甲氧基聚乙二醇分子量为2,0005,000；4PLAPEG制备采用2一乙基己酸亚锡催化反应。5如。
5、权利要求1所述人工红细胞纳米粒，其特征在于1人工红细胞纳米粒包埋材料由PLAPEG共聚物与氢化的大豆卵磷脂混合反应生成；2人工红细胞纳米粒包埋材料采用005香豆素6作为荧光标记物；3人工红细胞纳米粒制备整个操作过程在4和氮气保护下完成；4纳米粒包埋POLYHBSODCATCA增加了该复合体的稳定性，延长其体内半衰期。6如权利要求1所述牛血红蛋白，其特征在于1通过低渗溶牛血红细胞制备得到；2牛血红蛋白制备步骤包括甲苯抽提、高速离心净化、离子交换层析；3牛血红蛋白制备采用低渗溶液为125MM、PH74的磷酸钾缓冲液；4牛血红蛋白制备整个操作过程在4和氮气保护下完成；5牛血红蛋白比人血红蛋白更稳定，。
6、而且不需要2，3二磷酸甘油酸2，3DPG来调节载氧能力，聚合后其值P50接近天然血红蛋白；6交联后牛血红蛋白基本无免疫原性。权利要求书CN102370993ACN102370994A1/3页3一种新型红细胞代用品人工红细胞荧光纳米粒的制备方法技术领域0001本发明涉及红细胞代用品，具体涉及通过戊二醛交联及聚乳酸、聚乙二醇共聚物PLAPEG纳米粒包埋牛血红蛋白与过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD以及碳酸酐酶CA交联生成POLYHBSODCATCA复合体，以制备一种具有治疗意义人工红细胞纳米粒的方法。背景技术0002近年来，地震、海啸、台风等突发事件造成了大量人员死亡，其中无法及时输血抢救是原。
7、因之一。在我国，各大城市几乎都发生过“血荒”，一些手术不得不等待血液到来才能实施。血液的运输、保存都需要特殊的低温条件，而且保存期最多不过一个月，艾滋病、肝炎等病毒的输血传染更加加剧了安全血液紧缺的难题。多年来，人们一直在探索是否能够造出一种血液代用品，在紧急时刻不需验对血型即可直接使用，而且可以长期保存以备急需。0003人体血液由血浆、红细胞、白细胞和血小板组成，成分非常复杂，要制造出一种完全代替血液的溶液非常困难，或者说几乎不可能；但研制一种在急需情况下代替血液中主要组分红细胞作用的替代品却具有可行性。目前发展良好的红细胞代用品主要有全氟碳化合物、各种血红蛋白氧载体和血红蛋白微囊。0004。
8、氟碳化合物产品主要用于临床急救手术的血液供给，如心肺分流术及冠状动脉成型术等。但是，全氟碳乳剂输入到体内后会引起短暂的流感样综合症，如发热、寒战、恶心等，这是由于血液中的氟碳化合物微粒被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬，伴随前列腺素和某些具有致热活性的细胞活素释放，导致流感样综合症产生。0005血红蛋白HB是红细胞中执行载氧功能的蛋白，由4个亚基组成，亚基间的协同效应决定了血红蛋白的载氧功能。从红细胞中分离纯化的无基质血红蛋白SFH不能直接应用于人体，因为调节氧亲和力的重要化合物2，3二磷酸甘油酸在纯化过程中被去除，导致SFH氧亲和力较高P50约为1316MMHG，很难在组织中释放氧。同时，SFH失。
9、去了胞膜和胞内还原酶系统的保护，会迅速离解成为、二聚体，并进一步被氧化，引起肾毒性。此外，血红蛋白失去红细胞抗氧化酶系统的调节作用，易氧化成高铁血红蛋白METHB，失去携氧能力并产生自由基。因此，SFH无法作为血液代用品直接应用。发明内容0006本发明的目的就是首先将高纯度的牛血红蛋白HB用双功能试剂戊二醛交联起来，形成初步交联血红蛋白POLYHEMOGLOBIN，POLYHB，从而解决了血红蛋白直接使用的不稳定和毒性问题；POLYHB进一步交联超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和碳酸酐酶CA，形成POLYHBSODCATCA复合体；交联形成的POLYHBSODCATCA复合体，进一步通过。
10、具有良好生物相容性的通过聚乳酸、聚乙二醇共聚物PLAPEG纳米粒包埋，形成纳米级的人工红细胞微体。说明书CN102370993ACN102370994A2/3页40007该产品优势在于0008分子量增大的血红蛋白可在血红蛋白浓度较高时仍保持低渗透压，并防止血红蛋白透出血管壁，半衰期延长；0009牛血红蛋白比人血红蛋白更稳定，而且不需要2，3二磷酸甘油酸2，3DPG来调节载氧能力，聚合后其值P50接近天然血红蛋白；0010不需验对血型即可直接使用；0011可以长期保存以备急需；0012无艾滋病、肝炎等病毒污染；0013动物血红蛋白来源广泛，价格低廉；0014交联后牛血红蛋白基本无免疫原性；001。
11、5POLYHBSODCAT能在较大程度上消除了氧自由基及过氧化物，另外，它还能抑制聚合血红蛋白制备过程中高铁血红蛋白的形成，不仅在血液替换时能预防缺血再灌注损伤I/RI的发生，还有潜力成为I/RI治疗剂，以治疗其他原因造成的I/RI；0016交联的碳酸酐酶CA对碳酸和重碳酸离子起到迅速转换的作用，在血液中维持酸碱平衡，并帮助排除二氧化碳；0017PLAPEG纳米粒包埋增加了该红细胞代用品的稳定性，延长其体内半衰期。附图说明0018图1为人工红细胞纳米粒制备原理图001900200021具体实施方式0022实施例1无基质血红蛋白HB的制备0023无基质血红蛋白是通过低渗溶牛血红细胞，并通过甲苯抽。
12、提、高速离心净化、离子交换层析来制得。最终溶液含有01015G/ML血红蛋白。为了减少高铁血红蛋白的形成，操作过程在4，通氮气环境下进行，血红蛋白溶液的PH值为74。00241、牛血红细胞的分离0025取新鲜牛血分装入数个无菌处理过的离心管中，4000XG离心10分钟。取出后，吸出上层血浆和中层白细胞，下层红细胞以09生理盐水混匀，4000XG离心10分钟。弃上清，下层红细胞再以生理盐水洗涤，重复三次，获得红细胞。00262、红细胞的裂解和离心去基质0027将所获洗涤红细胞与125MM、PH74的磷酸钾缓冲液以体积比12充分混匀，静置30分钟裂解红细胞，得到红细胞溶血液。溶血液中脂类基质通过加。
13、入1/2体积冰冷的甲苯萃取两次去除。再将溶血液倒入高速离心容器中，15000XG离心2小时去除细胞碎片，取上清血红蛋白溶液作进一步处理。00283、血红蛋白的纯化0029上清血红蛋白溶液以50MM、PH74的磷酸钾缓冲液平衡后进行离子交换层析，洗说明书CN102370993ACN102370994A3/3页5脱收集后进行超滤处理，滤出限30KDA，最后得到纯化的无基质血红蛋白溶液。0030实施例2与超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和碳酸酐酶CA交联的多聚血红蛋白POLYHBSODCATCA复合体的制备0031以300,000U过氧化氢酶15,000U超氧化物歧化酶100U碳酸酐酶1G血红。
14、蛋白的比例向纯化的血红蛋白溶液中加入三种酶。交联前以摩尔比赖氨酸血红蛋白101加入13M赖氨酸振荡1小时，然后以摩尔比171戊二醛血红蛋白加入05M戊二醛，交联1024小时，以HPLC监测分子交联程度，当达到所需交联程度后，向溶液中加入2M赖氨酸溶液终止交联反应。LACTATERINGER溶液过夜透析后，通过SEPHADEXG25色谱柱脱除过量的修饰剂和其他的小分子物质。操作过程在4，通氮气保护环境下进行。0032实施例3聚乳酸、聚乙二醇共聚物PLAPEG纳米粒包埋POLYHBSODCATCA复合体制备人工红细胞纳米粒00331、PLAPEG共聚物的制备003415克DL一聚乳酸分子量16,0。
15、00和075克甲氧基聚乙二醇分子量2,000在真空中干燥过夜。在氮气保护下加温到180保持2小时。在加人10L的2乙基己酸亚锡之后，混合物在氮气保护下加温到180保持3小时，得到最终的聚合物PLAPEG共聚物，PLAPEG共聚物可溶于丙酮。00352、人工红细胞纳米粒的制备0036有机相150毫克PLAPEG共聚物溶于8毫升丙酮，与溶于4毫升乙醇的50毫克氢化的大豆卵磷脂混合，加入005香豆素6作为荧光标记物。0037水相取004毫升吐温20与25毫升的015G/ML的血红蛋白溶液相混合。0038制备在磁力搅拌下4下将有机相缓慢注人水相，注射头用02毫升的移液管头制得，纳米粒微囊立刻形成，继续维持搅拌悬浮液15分钟。所得的悬浮液为37毫升。在4和真空下通过旋转蒸发仪从上述悬浮液中除去部份有机溶剂，用时大约10分钟。这样就获得了33毫升的悬浮液即除去4毫升有机溶剂。剩余的悬浮液与15毫升的09生理盐水相混合。然后，有机溶剂和游离的血红蛋白通过超滤除去用AMICON超滤膜，分子量截留值为500,000，悬浮液用09生理盐水通过超滤重复洗净，整个操作在4和氮气保护下完成。说明书CN102370993ACN102370994A1/1页6图1说明书附图CN102370993A。