一种白英提取物以及包括其的抗癌药物 【技术领域】
本发明涉及医药领域， 具体而言， 涉及一种白英提取物、 其在抗癌、 抗肿瘤方面的 医药用途以及包括其的抗癌药物。背景技术
白英为茄科植物白英 Solanum lyratum Thunb. 的干燥全草， 主产浙江、 江苏、 安徽 等地。作为传统中药已有 2000 多年的应用历史， 具有清热解毒、 祛风化痰、 祛风除湿等功 效， 并具有抗癌作用， 临床用于多种癌症的治疗。
白英的化学成分研究始于 20 世纪 60 年代， 到目前为止， 研究人员已经从白英中分 离出 30 多种化合物， 化合物的类型主要包括甾体皂苷类、 甾体生物碱类、 有机酸类、 倍半萜 类、 甾醇类、 香豆素类及其它类型。
(1) 甾体皂苷类
目前从白英的乙醇提取物或水提取物中已分离出多种该类化合物。主要包括替 告皂苷元 -3-O-β-D- 吡喃葡萄糖基 -(1 → 2)-β-D- 吡喃葡萄糖基 -(1 → 4)-β-D- 吡 喃 半 乳 糖 苷， 新 替 告 皂 苷 元 -3-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 基 -(1 → 2)-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 基 -(1 → 4)-β-D- 吡喃半乳糖苷等。
(2) 甾体生物碱类
在 白 英 的 众 多 化 学 成 分 中， 具 有 明 显 生 物 活 性 和 生 理 功 能 的 是 β- 羟 基 甾 体 生 物 碱， 主 要 为 蜀 羊 泉 碱 (Soladulcidine)、 番 茄 烯 胺 (Tomatidenol)、 α- 苦 茄 碱 (α-Solamarine)、 β- 苦 茄 碱 (β-Solamarine)、 澳 洲 茄 胺 (solasodine)、 澳洲茄碱 (solasonine)。
(3) 有机酸类
主要含有咖啡酸， 香草酸。
其它类型， 主要含有倍半萜类化合物去氢假虎刺酮、 甾醇类化合物过氧麦角甾醇 和 9， 11- 去氢过氧麦角甾醇、 香豆素类 6- 甲氧基 -7- 羟基 - 香豆素、 N-( 对羟基苯乙基 )- 对 香豆酰胺。
虽然白英作为传统中药在临床上应用历史悠久， 但是作为现代意义上的药物， 尚 未有产品被开发出来应用于临床， 因为目前从白英提取出的物质其疗效并不理想。
现有的白英抗肿瘤药效学研究大多数采用的是水粗提取物进行的， 也有一部分试 验采用的是正丁醇萃取甾体皂苷。无论采用水粗提取物还是正丁醇萃取成分， 其组分都不 是专属富集的， 而是包含有非常复杂的多种类型成分， 因此其有效组分不清楚。 最终大多数 采用体外抗肿瘤药效学效果较好， 而体内整体抗肿瘤药效不好或不稳定。 发明内容
本发明旨在提供一种白英提取物， 以解决现有技术中白英提取物的有效成分不明 确， 体外抗肿瘤药效学效果较好， 而体内整体抗肿瘤药效不好或不稳定的技术问题。为了实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种白英提取物， 通过以下步 骤制得 ： 乙醇提取白英药材， 制得乙醇提取物 ； 精制 ： 将乙醇提取物用水分散形成溶液， 用 弱酸性阳离子交换大孔树脂柱吸附， 依次用乙醇和盐酸乙醇洗脱， 收集盐酸乙醇洗脱液， 用 氨水中和至中性， 脱盐制得白英提取物， 其中， 白英提取物包括 1％～ 60％的甾体生物碱。
进一步地， 弱酸性阳离子交换大孔树脂柱是 D151 丙烯酸系弱酸性阳离子交换大 孔树脂。
进一步地， 脱盐制得白英提取物的步骤是通过采用 AB-8 型树脂柱对盐酸乙醇洗 脱液进行脱盐处理实施的。
进一步地， 乙醇提取物水分散步骤包括用乙醇提取物 50 ～ 60 倍体积的水加热分 散或直接分散乙醇提取物。
进一步地， 盐酸乙醇是体积百分含量为 6‰的盐酸乙醇。
进一步地， 乙醇提取白英药材的步骤包括 ： 取白英， 切段， 加 10 倍生药量的 95％乙 醇浸泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤 ； 滤渣用 10 倍生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤 ； 合并三次提取液， 回收溶剂蒸发至干， 得乙醇提取物。
进一步地， 上述白英提取物包括 50％～ 60％的甾体生物碱。 根据本发明的另一个方面， 提供了一种抗癌药物， 该抗癌药物包括治疗有效量的 上述任一种白英提取物。
本发明采用弱酸性阳离子交换大孔树脂专属性地富集了白英众多成分中的甾体 生物碱， 成分较为单一， 并且经实验证明了该类物质具有显著的抗肿瘤药效， 且其抗肿瘤的 药效远远高于现有技术中白英的水粗提取物和采用正丁醇萃取的甾体皂苷的药效。
具体实施方式
需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本发明中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
在本发明的一种典型的实施方式中， 提供了一种白英提取物。该白英提取物通过 以下步骤制得 ： 乙醇提取白英药材 ： 白英药材在乙醇中回流提取， 回收溶剂蒸发至干， 得乙 醇提取物 ； 精制 ： 将乙醇提取物用水分散形成溶液， 用弱酸性阳离子交换大孔树脂柱吸附， 依次用乙醇和盐酸乙醇洗脱， 收集盐酸乙醇洗脱液， 用氨水中和至中性， 脱盐制得白英提取 物， 其中， 白英提取物包括 1％～ 60％的甾体生物碱。
现有技术中， 本领域技术人员认为白英中抗癌、 抗肿瘤的有效组分是甾体皂苷， 通 常用正丁醇富集甾体皂苷， 当然这种富集并不是专属富集， 获得的甾体皂苷中可能包含许 多种其他成分， 例如少量的甾体生物碱。与现有技术不同的是本发明采用离子交换型大孔 树脂专属性地富集了白英众多成分中的甾体生物碱有效组分， 并用大量动物实验证明了该 成分对多种小鼠实体瘤具有显著的抗肿瘤药效， 这是现有研究尚未发现的， 且其抗肿瘤的 药效远远高于现有技术中白英的水粗提取物和采用的正丁醇萃取甾体皂苷的药效。
根据本发明的典型实施方式， 在精制步骤中采用弱酸性阳离子交换大孔树脂柱对 乙醇提取物中的甾体生物碱进行专属富集， 优选地， 采用 D151 丙烯酸系弱酸性阳离子交换 大孔树脂。
在精制步骤中的对盐酸乙醇洗脱液的脱盐制得白英提取物的步骤可以采用本领域技术人员通常使用的液体脱盐方式进行， 优选地， 采用 AB-8 型树脂柱对盐酸乙醇洗脱液 进行脱盐处理， 因为 AB-8 型树脂柱的对盐酸乙醇洗脱液的脱盐效果好， 且其具有使用寿命 长、 成本低廉的优点。
在上述乙醇提取物用水分散步骤中可以采用乙醇提取物 10 ～ 200 倍体积的水进 行加热分散或直接分散。优选地， 采用乙醇提取物 50 ～ 60 倍体积的水加热分散乙醇提取 物， 这样既使上清液容易分离， 又保证了充分溶解甾体生物碱， 并保持合适的上样浓度， 避 免上清液过粘， 有利于甾体生物碱的富集。
乙醇提取物用水分散后有部分粘液质， 使分散液浑浊， 根据本发明的典型实施方 式， 为了使乙醇提取物水分散后过吸附柱时更顺畅， 富集效果更好， 可以静置过夜或离心取 上清过弱酸性阳离子交换大孔树脂柱。
乙醇洗脱步骤中使用的乙醇可以是 60 ％～ 95 ％的乙醇， 优选地， 选用 95 ％的乙 醇。 洗脱盐酸乙醇可以是体积百分含量为 1‰～ 10‰的盐酸乙醇 ( 用质量百分数为 37％的 浓盐酸与乙醇混合制得 )， 优选地是体积百分含量为 6‰的盐酸乙醇， 此浓度的盐酸乙醇进 行洗脱， 具有降耗减排的优势。
乙醇提取白英药材的步骤可以采用现有技术中本领用技术人员通常使用的方法， 优选地， 采用以下步骤进行乙醇提取物的提取 ： 取白英， 切段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇浸 泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤 ； 滤渣用 10 倍生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤 ； 合并三次提取液， 回收溶剂蒸发至干， 得乙醇提取物。 当然这些溶剂的加入量、 乙醇的 浓度以及回流提取的时间和次数可以进行适当的调整。
经紫外分光光度法及高效液相色谱法测定， 采用上述方法提取得到的白英提取 物， 包括 1％～ 60％的甾体生物碱。优选地， 包括 50％～ 60％的甾体生物碱。该白英提取 物可用于制备抗癌药物和抗肿瘤药物， 且其药效显著， 下面将结合具体实验进一步说明本 发明所提供的白英提取物的有益效果。
一、 不同提取方法获得的白英提取物中甾体生物碱的含量
由于白英药材不同批次之间甾体生物碱含量存在很大的差异， 因此通过同种方法 提取的甾体生物碱也可能存在较大的差异。 以下实验采用三个不同批次白英药材作为实验 药材。
实施例 1
制备方法 ： 乙醇提取 ： 取白英原药材 ( 茄科植物白英 Solanum lyratum Thunb. 的 干燥全草 )， 切段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇浸泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤， 滤渣用 10 倍 生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤， 合并三次提取液， 回收溶剂蒸发至干， 得乙醇提取物。
精制 ： 取乙醇提取物， 用 50 倍体积的水加热溶解， 放置过夜， 上清液上样于 D151 大 孔树脂柱， 用 95％乙醇漂洗， 再用 6‰的盐酸乙醇洗脱。 收集 6‰的盐酸乙醇洗脱液， 上 AB-8 型大孔树脂脱盐， 洗脱液浓缩至干， 得精制白英提取物。
实施例 2
制备方法 ： 乙醇提取 ： 取白英原药材 ( 白英为茄科植物白英 Solanum lytatum Thunb. 的干燥全草 )， 切段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇浸泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤， 滤 渣用 10 倍生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤， 合并三次提取液， 回收溶剂蒸发至于， 得乙醇提取物。
精制 ： 取乙醇提取物， 用 55 倍体积的水加热溶解， 放置过夜， 上清液上样于 D151 大 孔树脂柱， 用 95％乙醇漂洗， 再用 6‰的盐酸乙醇洗脱。 收集 6‰的盐酸乙醇洗脱液， 上 AB-8 型大孔树脂脱盐， 洗脱液浓缩至干， 得精制白英提取物。
实施例 3
制备方法 ： 乙醇提取 ： 取白英原药材 ( 白英为茄科植物白英 Solanum lytatum Thunb. 的干燥全草 )， 切段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇浸泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤， 滤 渣用 10 倍生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤， 合并三次提取液， 回收溶剂 蒸发至干， 得乙醇提取物。
精制 ： 取乙醇提取物， 用 60 倍体积的水加热溶解， 放置过夜， 上清液上样于 D151 大 孔树脂柱， 用 95％乙醇漂洗， 再用 6‰的盐酸乙醇洗脱。 收集 6‰的盐酸乙醇洗脱液， 上 AB-8 型大孔树脂脱盐， 洗脱液浓缩至干， 得精制白英提取物。
水提法 ：
取白英原药材 ( 白英为茄科植物白英 Solanum lyfatum Thunb. 的干燥全草 )， 切 段， 加 10 倍生药量的水浸泡 30 分钟后， 回流提取 3 次， 每次 1 小时， 自然冷却， 过滤， 弃去滤 渣， 旋转蒸发去溶剂， 得白英水粗提取物。 正丁醇提取法 ：
取白英原药材 ( 白英为茄科植物白英 Solanum lyratum Thunb. 的干燥全草 )， 切 段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇加热回流提取 3 次， 每次 1 小时， 合并提取液， 浓缩得乙醇浸 膏。用适量水将乙醇浸膏分散， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 回收正丁醇萃取液， 得正丁醇部位。
表1
实施例 1 甾体生物碱含量 ( 批次一 )
甾体生物碱含量 ( 批次二 ) 甾体生物碱含量 ( 批次三 )
43％ 2％ 42％ 5％ 46％ 4％ 0.04％ 0.05％ 0.11％ 0.15％ 55％ 实施例 2 56％ 实施例 3 52％ 水提法 正丁醇提取法 0.05％ 0.12％由表 1 可见本发明提供的白英提取物是对白英中甾体生物碱专属性富集得到的。
二、 白英不同提取组分对小鼠移植性肿瘤作用的体内筛选实验
材料
1) 白英提取物 ( 本实验中后续称之为 “甾体生物碱” )， 按实施例 1 方法制得。
使用时， 用生理盐水溶解， 现配现用。经测定， 该白英提取物中甾体生物碱的含量 为 55％。
2) 甾体皂苷， 按如下方法制得 ( 其药效与现有技术中用正丁醇提取的甾体皂苷在 抗肿瘤方面的药效相当 ) ：取白英原药材切段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇浸泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤， 滤渣用 10 倍生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤， 合并三次提取液， 回收溶 剂蒸发至干， 得白英乙醇提取物。取乙醇提取物， 用 50 倍体积的水加热溶解， 放置过夜， 上 清液用 D151 大孔树脂柱吸附， 先用水洗脱载药大孔树脂， 弃去水洗脱液， 继续用 95％乙醇 洗脱载药大孔树脂。收集 95％乙醇洗脱液， 洗脱液浓缩至干， 得白英皂苷。
3) 甾体生物碱 + 甾体皂苷
根据上述甾体生物碱和甾体皂苷制备工艺制备后， 按提取其的白英原药材的重量 比 1 ∶ 1 进行配比。
4) 原药提取液， 按如下方法制得
取白英原药材切段， 加 10 倍生药量的 95％乙醇浸泡过夜， 回流提取 3 小时， 过滤， 滤渣用 10 倍生药量的 70％乙醇回流提取两次， 每次 3 小时， 过滤， 合并三次提取液， 回收溶 剂蒸发至干， 得白英乙醇提取物。取乙醇提取物适量， 用水分散， 即为原药提取液。
5) 注射用环磷酰胺 (CTX， 山西普德药业有限公司， 批号 ： 20070106)
6) 氟尿嘧啶注射液 ( 上海旭东海普药业有限公司， 批号 ： 070606)。
实 验 动 物 昆 明 种 小 鼠，雄 性，购 自 中 国 医 学 科 学 院，许 可 证 号 ： SCXK( 京 )2004-0001。 瘤株 S180 肉瘤瘤株购自中国医学科学院药物研究所， 由本实验室传代接种 ； 艾氏 腹水瘤 (EAC) 细胞瘤株购自北京肿瘤防治研究所， 由本实验室传代接种。
仪器消毒锅， 无菌层流操作台， 恒温干燥箱， 消毒的镊子、 剪刀、 移液管、 移液枪、 eppendorf 离心管 (0.5mL)、 肝素管、 红细胞计数板， 1mL、 5mL 无菌注射器数个。
试剂苦味酸， 生理盐水， 75％医用酒精， 碘酊， 0.4％台盼蓝染液。
实验内容
(1) 接种 S180 肉瘤瘤细胞浓度的选择
根据实体瘤疗效评价标准 ： 阴性对照组小鼠肿瘤平均重量小于 1g 或 20％小鼠的 瘤重小于 400mg， 表示肿瘤生长不良 ； 在治疗期间给药组鼠死亡超过 20％， 或平均体重 ( 去 瘤后 ) 下降 ( 自身对照 ) 超过 15％者， 表示药物有毒， 应减小剂量。瘤细胞的接种浓度是本 实验的关键。当瘤细胞数接种量过小时， 肉瘤不生长或重量过小， 无法评价药效 ； 而瘤细胞 数接种量过大， 实验组药物无法抑制肿瘤的生长， 药效体现不出来， 因此要对接种瘤细胞浓 度进行选择， 以接种 10 天后瘤块重量 2g 左右的瘤细胞为最终接种浓度。操作步骤 ：
①于无菌条件下取一定量接种于健康昆明小鼠约 7 天的 S180 腹水 0.1mL， 以生理盐 水稀释 100 倍。 取 0.5mL 的瘤细胞稀释液， 加入 0.5mL 0.2％的台盼蓝或伊红染料， 混匀后， 用细胞计数板在显微镜下计数 ( 按白细胞的计数方式进行计数 )， 得到原腹水的白细胞数。 5 6 7
②将原腹水用生理盐水配制成瘤细胞数为 10 、 10 、 10 个·mL-1 的瘤细胞悬液， 分 别接种于三组昆明小鼠前肢腋下， 每只接种 0.2mL， 每组八只， 十天后处死小鼠， 剖取各组动 物的肿瘤， 称重。结果见表 2。
表 2S180 肉瘤小鼠瘤细胞接种浓度的考查
结果显示 ： 瘤细胞浓度为 105 个·mL-1 时， 瘤重很小， 只有一些微小的颗粒， 根据实 7 -1 验结果选择瘤细胞浓度 10 个· mL 为接种浓度。重复上述实验操作过程， 接种瘤细胞浓度 6 7 8 -1 为 10 10 、 10 个·mL ， 结果见表 3。
表 3S180 肉瘤小鼠瘤细胞接种浓度的考查
根据上述结果及动物实验方法学的实验要求 ( 选取瘤块重量为 2g 左右的瘤细胞 浓度为最终接种浓度 )， 选择瘤细胞浓度 107 个·mL-1 为最终接种浓度。依上述实验方法进 行白英不同提取组分对 S180 小鼠肿瘤生长的抑制作用实验。
(2)S180 肉瘤抗肿瘤实验过程
实验第 0 天接种动物。第 1 天将小鼠称体重后随机分组， 每组 10 只， 并开始给药。 每日 1 次， 连续 10d。 阴性对照组灌胃 (ig) 给予等体积无菌生理盐水 ； 阳性对照组腹腔注射 -1 (ip)CTX， 剂量为 0.02g·kg ； 甾体生物碱、 甾体皂苷、 甾体生物碱 + 甾体皂苷以及原药提取 液的高、 中、 低剂量组分别灌胃 (ig)， 给予相当于原药材 32、 16、 8g·kg-1 的药物。第 10 天， 将小鼠称体重并处死， 剖取各组动物的肿瘤， 称重。根据公式计算各组的肿瘤抑制率， 根据 实验结果可知生物碱低剂量组的抑瘤率高于中高剂量组， 所以第二次实验的剂量改为 16、 -1 8、 4g·kg 进行实验， 并按第二次过程重复实验。
(3) 艾氏腹水瘤体内实验
选择腹腔接种 7-9 天生长良好的荷艾氏腹水瘤细胞株小鼠， 断茎处死， 无菌抽取 7 -1 腹水， 用无菌生理盐水稀释成 10 个·mL 瘤细胞悬液， 无菌腹腔注射， 每只 0.2mL， 第1天 将小鼠称体重后随机分组， 每组 10 只， 并开始给药。每日 1 次， 连续 10d。阴性对照组灌 胃 (ig) 给予等体积无菌生理盐水 ； 阳性对照组腹腔注射 (ip)5- 氟尿嘧啶 (5-Fu)， 剂量为 -1 10mg· kg ； 甾体生物碱、 甾体皂苷、 甾体生物碱 + 甾体皂苷以及原药提取液的高、 中、 低组灌 -1 胃 (ig) 给药， 给相当于原药材 16、 8、 4g·kg 的药物。
实验结果
白英组分对小鼠移植性肿瘤 S180 肉瘤作用的三次实验数据见表 4 ～ 6， 统计结果见 表 7。
8102319319 A CN 102319322
说明书(一)7/16 页表 4 白英不同提取组分对 S180 小鼠肿瘤生长的抑制作用
* ** 与阴性组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 表 5 白英不同提取组分对 S180 小鼠肿瘤生长的抑制作用(二)
9102319319 A CN 102319322
说明书(三)8/16 页* ** 与阴性组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 表 6 白英不同提取组分对 S180 小鼠肿瘤生长的抑制作用
* ** 与阴性组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 表 7 白英不同提取组分对 S180 小鼠肿瘤生长的抑制作用三次实验结果一览表
* ** 与阴性组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01结果分析
从表 4-7 中的结果可看出， 白英中甾体生物碱在抗肿瘤方面的药效明显优于甾体 皂苷、 甾体生物碱 + 甾体皂苷， 以及原药提取液。白英水提物抗肿瘤作用的初步研究 ( 赵立 新等， 《中草药》 2006 年第 37 卷第 1 期 ) 中的实验数据显示， 白英水提物在本实验条件下的 抑瘤率大约为 30％， 且剂量关系为线性关系， 完全不具备靶向性的药效特征 ； 而采用正丁 醇萃取的甾体皂苷的药效与甾体皂苷在抗肿瘤方面的药效相当， 即本发明提供的白英提取 物 ( 甾体生物碱 ) 抗肿瘤的药效远远高于现有技术中白英的水粗提取物和采用正丁醇萃取 的甾体皂苷的药效。
从白英中提取的甾体生物碱并非浓度越高抗癌性越好， 其抗癌性最佳剂量为中剂 量， 相当于生药量 8g/kg， 这一剂量折算成临床人体等效剂量， 恰好与白英临床常用剂量完 全一致， 进一步支持该方法富集的白英提取物完全能代表白英的抗肿瘤效果。由于大剂量 和小剂量的抗肿瘤药效均较低， 说明白英甾体生物碱的对 S180 抑制作用量效关系为倒 “U” 型关系。这是典型的靶向型量效关系， 说明白英提取物具有靶向型抗肿瘤作用特点。临床 应用研究表明白英对治疗毛细血管瘤具有特殊的疗效， 用白英每日 60g 或加少许红枣煎服 治疗毛细血管瘤 3 例， 均在 1 个月左右痊愈。 白英对治疗毛细血管瘤具有特殊的疗效， 预示白英可能通过抑制肿瘤血管新生机 制实现抗肿瘤作用。 大量证据表明， 肿瘤血管新生在肿瘤从良性向恶性转变、 癌细胞进入血 液以及转移灶形成和发展中均起关键作用。目前大多数抗肿瘤药物由于基因 ( 如 p53) 的 变异等因素导致多药耐药 (multiple drug resistance， MDR) 现象， 但是因为和正常机体细 胞相比， 肿瘤细胞的发育更依赖于血管新生， 这使抗血管新生的抗肿瘤药物不存在多药耐 药性。因此抗血管新生机制为从肿瘤发生、 发展过程中的多个环节创制抗肿瘤新药提供了 崭新思路， 成为肿瘤细胞毒类治疗药物研究的前沿领域之一， 具有广阔的发展前景。
由于抑制血管新生必须通过整体动物实验才能体现， 而体外细胞培养则药效较 差， 由于白英甾体生物碱的抑制肿瘤可能是通过抑制血管新生机制实现， 这也恰好解释了 白英甾体生物碱整体动物疗效好， 离体细胞药效差的实验结果。实验表明白英具有抗肿瘤 血管新生的药效活性， 非常有希望发展为不存在多药耐药性的抗肿瘤新药。
三、 小鼠肺癌细胞 Lewis 移植瘤的药效实验
根据 《抗肿瘤药物药效学指导原则》 和 《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导 原则》 的要求， 测试受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强 度。
受试药物 ： 白英提取物按照实施例 1 方法获得。
使用时， 用生理盐水溶解， 现配现用。
经测定， 该白英提取物中甾体生物碱的含量为 55％。
对照药物 ：
名称 ： 注射环磷酰胺
厂家 ： 江苏恒瑞医药股份有限公司
批号 ： 10041021
组别与给药方案 ( 表 8) ：
表8
p.o ： 灌胃， w： 周， d： 天， ED ： 每天一次
细胞株 ：
小鼠肺癌细胞 Lewis 由南京凯基生物凯基发展有限公司提供。
受试动物 ：
来源、 种系、 品系 ： ICR 小鼠， 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供， 实验动 物生产许可证 ： SCXK( 沪 )2007-005， 合格证编号 ： 2007000511091 ； 实验动物使用许可证 ： SYXK
( 军 )2007-030
日龄 ： 21-35 天
体重 ： 18-22g
性别 ： 雌性
动物数 ： 每组 8 只， 共 40 只
实验方法 ：
1 制备模型
将液氮中冻存的细胞 37℃水浴中快速解冻 ； 在超净工作台内， PBS 清洗复苏的细 胞两次， 0.2mlPBS 重新混匀细胞， 接种于小鼠腹腔内 ； 8 天后， 小鼠腹部肿大， 断颈处死种 鼠， 乙醇浸泡后于超净工作台内抽取腹水 ； 离心抽取的腹水， 用 PBS 清洗细胞 2 次， PBS 重悬 7 细胞， 计数， 调整细胞悬液浓度为 1X10 个 /ml ； 每只 ICR 右侧腋窝皮下内接种 0.1ml(1X106 个细胞 )。
2 分组与给药
小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径， 待肿瘤生长至 50-100mm3 后将动物随机 分组， 每组 10 只。接种后 3 天开始给药， 给药方案见表 8 组别与给药方案， 使用测量瘤径的 方法， 动态观察被试物抗肿瘤的效应， 给药 11 天后小鼠处死， 手术剥取瘤块称重。
3 观测指标
肿瘤体积 (tumor volume， TV) 的计算公式为 ： 2
TV ＝ 1/2×a×b 其中 a、 b 分别表示长宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积 (relativetumorvolume， RTV)， 计算公式 为：
RTV ＝ Vt/V0。其中 V0 为分笼给药时 ( 即 d0) 测量所得肿瘤体积， Vt 为每一次测量 时的肿瘤体积。
抗肿瘤活性的评价指标 ： 相对肿瘤增殖率 T/C(％ )， 计算公式如下 ：
TRTV ： 治疗组 RTV ； CRTV ： 阴性对照组 RTV 抗肿瘤活性的评价指标 ： 肿瘤生长抑制率 (％ )， 计算公式如下 ：4 统计处理
均值用 X±SD 表示， 组间分析用 t 检验进行统计学处理， 应用 SPSS(Staffstical Package for the Social Science)17.0 对结果进行统计分析。
实验结果 ：
实验结果 ： 表 9 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 荷瘤鼠体重的影响 ； 表 10 受试药 物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤体积影响 ； 表 11 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿 瘤生长的抑制作用。
表 9 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 荷瘤鼠体重的影响 (X±SD， n ＝ 8， 体重 ： 单位 g)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 10 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤体积影响 (X±SD， n ＝ 8， 肿瘤体积 ： 单位 cm3)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ；表 10 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤体积影响 ( 续表 10) (X±SD， n ＝ 8， 肿瘤体积 ： 单位 cm3)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ；表 10 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤体积影响 ( 续表 10) (X±SD， n ＝ 8， 肿瘤体积 ： 单位 cm3)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 11 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤生长的抑制作用 (X±SD， n ＝ 8)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 11 受试药物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤生长的抑制作用 ( 续表 11)(X±SD， n ＝ 8)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ；
结论讨论 ：
本实验建立了小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤模型， 利用该模型评价了受试药物的 抗肿瘤活性。实验结果显示 ： 受试药物 12mg/kg、 24mg/kg、 48mg/kg 对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤有一定的抑制作用， T/C( ％ ) 分别为 79.06 ％、 36.88 ％、 55.59 ％， 抑瘤率分别为 32.02 ％、 52.40 ％、 46.08 ％ ； 而相同条件下， 环磷酰胺 T/C( ％ ) 为 5.15 ％ ； 抑瘤率分别为 90.63％。说明本发明提供的白英提取物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤最佳抑制剂量为 中剂量。由于大剂量和小剂量的抑瘤药效均小， 说明白英甾体生物碱的对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤抑制作用量效关系为倒 “U” 型关系。这进一步支持白英提取物具有靶向型 抗肿瘤作用特点。 而现有技术中的正丁醇提取物及水提物在本实验条件下的抑瘤率大约为
30％， 且剂量关系为线性关系， 完全不具备靶向性的药效特征 ( 白英水提物抗肿瘤作用的 初步研究， 赵立新等， 《中草药》 2006 年第 37 卷第 1 期 )。
四、 受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 移植瘤的药效实验
根据 《抗肿瘤药物药效学指导原则》 和 《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导 原则》 的要求， 测试受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。
受试药物 ： 白英提取物按照实施例 1 方法获得
经测定， 该白英提取物中甾体生物碱的含量为 55％。
对照药物 ：
名称 ： 注射环磷酰胺
厂家 ： 江苏恒瑞医药股份有限公司
批号 ： 10041021
组别与给药方案 ( 表 12) ：
表 12
p.o ： 灌胃， w： 周， d： 天， ED ： 每天一次
细胞株 ：
小鼠肝癌细胞 H22 由南京凯基生物凯基发展有限公司提供。
受试动物 ：
来源、 种系、 品系 ： ICR 小鼠， 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供， 实验动 物生产许可证 ： SCXK( 沪 )2007-005， 合格证编号 ： 2007000511091 ； 实验动物使用许可证 ： SYXK( 军 )2007-030
日龄 ： 21-35 天
体重 ： 18-22g
性别 ： 雌性
动物数 ： 每组 10 只， 共 50 只
表 13 受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 荷瘤鼠体重的影响 (X±SD， n ＝ 10， 体重 ： 单位 g)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 14 受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 移植肿瘤体积影响 (X±SD， n ＝ 8， 肿瘤体积 ： 单位 cm3)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 14 受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 移植肿瘤体积影响 ( 续表 14) (X±SD， n ＝ 10， 肿瘤体积 ： 单位 cm3)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 15 受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 移植肿瘤生长的抑制作用 (X±SD， n ＝ 10)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ； 表 15 受试药物对小鼠肝癌细胞 H22 移植肿瘤生长的抑制作用 ( 续表 15) (X±SD， n ＝ 10)
* ** 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 ；
结果分析
实验结果显示 ： 受试药物 12mg/kg、 24mg/kg、 48mg/kg 对小鼠肺癌细胞 H22 移植肿 瘤有一定的抑制作用， 其中中剂量抑瘤率最佳， 远高于小剂量和大剂量。 说明本发明提供的
白英提取物对小鼠肺癌细胞 Lewis 移植肿瘤抑制作用量效关系为倒 “U” 型关系。本发明的 多种动物移植肿瘤试验反复证明了本发明白英提取物这一特点， 而且这些试验是由不同实 验室和不同操作者分别完成的， 这些结果明确支持白英提取物具有靶向型抗肿瘤的作用特 点。而现有技术中的正丁醇提取物及水提物在本实验条件下的抑瘤率大约为 30％， 且剂量 关系为线性关系。完全不具备靶向性的药效特征 ( 白英水提物抗肿瘤作用的初步研究， 赵 立新等， 《中草药》 2006 年第 37 卷第 1 期 )。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。18