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与细菌 EAP、 EMP 和 / 或 ADSA 蛋白相关的组合物和方法
     发明背景技术领域 本申请要求 2008 年 10 月 6 日提交的美国临时申请序列号 61/103,196、 2008 年 10 月 6 日提交的美国临时申请序列号 61/103,190、 2009 年 4 月 20 日提交的美国临时申请序 列号 61/170,779 的优先权， 其全部内容通过引用并入本文。
     本发明一般性涉及免疫学、 微生物学和病理学领域。 更特别地， 本发明涵盖涉及细 菌蛋白质的方法和组合物， 所述细菌蛋白质可用于引发针对细菌的免疫应答或者提供被动 免疫治疗。所述蛋白质包括 Eap、 Emp、 细菌腺苷合酶 A(AdsA) 和 / 或包含 Eap、 Emp 和 / 或 AdsA 氨基酸序列的肽或蛋白质以及与它们结合的抗体。
     背景技术 近年来， 社区获得性感染和医院获得性感染的数目不断增加。医院获得性 ( 医源 性 ) 感染是致病和致死的主要原因。 在美国， 医院获得性感染每年感染超过 2 百万患者。 最 常见的感染是尿道感染 ( 占感染的 33％ )， 其次是肺炎 (15.5％ )、 手术部位感染 (14.8％ ) 和原发血流感染 (13％ )(Emorl 和 Gaynes， 1993)。
     金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 凝固酶阴性葡萄球菌 ( 主要是表皮 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis))、 肠 球 菌 属 (enterococcus) 物 种、 大肠杆菌 (Escherichia coli) 和绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 是主要的医源性病原体。 尽管这些病原体造成大致相同数目的感染， 但是它们可导致的疾病严重程度以及抗生素抗 性分离株的出现频率使得金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌成为最引人注目的医源性病原 体。
     表皮葡萄球菌是正常的皮肤共生物， 其也是造成受损医疗器械感染和手术部位感 染的重要机会性病原体。 由表皮葡萄球菌感染的医疗器械包括心脏起搏器、 脑脊液分流器、 连续可移动腹膜透析导管、 整形外科装置和假体心脏瓣膜。
     金黄色葡萄球菌是最常见的医源性感染原因， 其具有显著的致病性和致死率。 它可导致骨髓炎、 心内膜炎、 脓毒性关节炎、 肺炎、 脓肿和中毒性休克综合征。金黄色葡 萄球菌可在干燥表面上存活， 这增加了传播的机会。任何金黄色葡萄球菌感染均可导致 葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征 ( 皮肤对吸收进血液之外毒素的应答 )。它还可导致一 种称为脓血症的败血病， 其可危及生命。令人头痛地， 甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA) 已成为医院获得之感染的主要 原因。
     金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染通常用抗生素进行治疗， 所选药物是青霉 素， 但针对甲氧西林抗性分离株则使用万古霉素。表现出抗生素广谱抗性的葡萄球菌菌株 的比例日益增加， 这威胁到有效的抗微生物治疗。 另外， 最近出现的万古霉素抗性金黄色葡 萄球菌菌株引起了对 MRSA 菌株出现并传播且没有可用的有效治疗的担忧。
     针对金黄色葡萄球菌或针对其所产生的外蛋白质 (exoprotein) 的第一代疫苗获 得了有限的成功 (Lee， 1996)。 仍需要开发针对葡萄球菌感染的有效疫苗。 也需要治疗葡萄 球菌感染的另外的组合物。
     发明概述
     在住院或健康个体中， 金黄色葡萄球菌是唯一最常见的菌血症和软组织感染的原 因， 死亡率的显著提高归因于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌株的传播， 该菌株常 常对抗生素治疗不敏感 (Klevens 等， 2007 ； Klevens 等， 2006)。具有特征性纤维蛋白沉积 和大量免疫细胞浸润的脓肿代表了葡萄球菌感染的病理基质 (Lowy， 1998)。使用扫描电子 显微镜观察葡萄球菌脓肿中心的生物膜样结构。遗传分析显示， 体外生物膜形成与葡萄球 菌形成脓肿的能力有关， 本发明人鉴定了对于这两个过程来说必需的包膜蛋白质。当纯化 并用于免疫小鼠时， Emp 和 Eap 对葡萄球菌感染产生了保护性免疫。使用结合 Eap 之抗体 或结合 Emp 之抗体的被动免疫也证明了治疗作用。
     本申请在一个实施方案中描述了 Emp 和 / 或 Eap 或者结合 Emp 或 Eap 之全部或部 分的抗体在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。本申请还提供了 包含 Emp 和 / 或 Eap 抗原或者其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可 用于治疗 ( 例如在对象中限制葡萄球菌脓肿形成和 / 或持续存在 ) 或预防细菌感染的方法 和组合物。 在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或抗原之全部或部分以及 ( 在某些方面中 ) 其它细菌蛋白质的有效量的组合物。其它 细菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子， 和 / 或 (iii) 多糖， 等等。
     在另一些方面中， 可向对象施用 Emp 和 / 或 Eap 调节剂， 例如结合 Emp 和 / 或 Eap 的抗体 ( 例如多克隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 )。Emp 和 / 或 Eap 调节剂可直接结合 Emp 和 / 或 Eap。Emp 和 / 或 Eap 调节剂可以是结合 Emp 和 / 或 Eap 的抗体或细胞。抗体可 以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， Emp 和 / 或 Eap 调 节剂通过向对象或来源对象 ( 例如供体 ) 中提供能够产生结合 Emp 和 / 或 Eap 之抗体的 Emp 和 / 或 Eap 肽而得到。Emp 和 / 或 Eap 调节剂通常配制成可药用组合物。Emp 和 / 或 Eap 调 节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结合此类分子 ( 例如 EsxA、 EsxB、 EsaB、 EsaC、 SdrC、 SdrD、 Hla、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasH(AdsA、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SasF) 的抗体。 可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂组合使用的另外的葡 萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素 氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。葡萄球菌抗原或抗体可以与 Emp 和 / 或 Eap 调节 剂同时施用。葡萄球菌抗原或抗体以及 Emp 和 / 或 Eap 调节剂可以在同一组合物中施用。一些实施方案涉及在可药用组合物中包含结合 Emp 和 / 或 Eap 抗原或者其片段 的分离抗体或其片段的治疗性组合物， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染。所述抗体可以是人或人源化抗体。在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗 体或单链抗体或者其片段。抗体组合物还可包含结合选自以下一种或多种抗原之至少一 种另外的分离抗体或其片段 ： ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SdrC、 SdrD、 SdrE 和 SpA 抗原 )。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂组合使用的葡萄球菌抗原的额外抗体包括但不限于针对 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     Emp 和 / 或 Eap 调节剂还可以是编码 Emp 和 / 或 Eap 肽的重组核酸分子。重组核 酸分子可编码 Emp 和 / 或 Eap 肽， 以及至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。 核酸可编码 或者多肽可包含多种抗原， 所述抗原包括以下抗原之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA 或其变体。核 酸可编码额外的葡萄球菌抗原， 其包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， 所述方法和组合物使用或包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽、 肽 或抗原之全部或部分， 以及与它们结合的抗体。 在另一些方面中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡 萄球菌因子或细菌因子联用， 例如以下的全部或部分 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA， 或者其免疫原性片段或其组合。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂联用的额外葡萄球菌抗原 包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNAIII 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些实施方案中， 可以从本发明的方法、 组合物或制剂中具 体排除或包含以下分子中的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 种或更多种 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。可明确排除的额外葡萄球菌抗原包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。 本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或编码其的核苷酸。 在又一些方面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽是多聚化的， 例如二聚化的。在本发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个分离 的细胞表面蛋白质或其区段的多聚体。在另一方面中， 其它多肽或肽可表达或包含在细菌 组合物中， 其包括但不限于 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其免疫原性片 段。可表达或包含在细菌组合物中的额外的葡萄球菌多肽包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白 结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结 合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋 白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。或者， 所述组合物可以是或包含经重组改造的葡萄球菌， 其以某种方式被改变， 包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行特定改变。例如， 所述细菌可被重组修饰为表达与 未修饰时相比更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     术语 “Emp 多肽” 或 “Eap 多肽” 是指包括从葡萄球菌中分离的野生型 Emp 或 Eap 蛋白的多肽， 以及刺激针对葡萄球菌 Emp 或 Eap 蛋白之免疫应答的变体和区段或片段。类 似地， 术语 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白是指包括从葡萄球菌分离的野生型 EsaB、
     EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA) 或 SpA 多肽的蛋白质， 以及刺激针对葡萄球菌 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白之免疫应答的变体、 区段或片段。此外， 术语 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白表示包括从 葡萄球菌分离的野生型 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨 基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 以及刺激针对葡萄球菌 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白之免疫应答的 变体、 区段或片段。免疫应答是指生物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。可通过包 括下列但不限于此的测定来检测免疫应答 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体 的存在或量的测定、 测量 T 细胞活化或增殖的测定和 / 或测量与一种或多种细胞因子之活 性或表达有关的调节的测定。
     本发明的一些实施方案包括在对象中引发针对葡萄球菌之免疫应答的方法， 其 包括向对象提供 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种有效量的抗原或其区段 / 片段。葡萄 球菌抗原包括但不限于 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其 区段、 片段或免疫原性片段。额外的葡萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 多肽或其免疫原性片段可与以下一种或多种 蛋白的一种或多种抗原或免疫原性片段相组合地提供 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdSA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。 也可使用以下额外抗原或免疫原性片段 ： 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     本发明的一些实施方案包括可包含与以下蛋白在 5、 10、 15、 20、 50、 100、 200 或 更多连续氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 上有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或相似性之多肽、 肽或蛋白质的组合物 ： Emp、 Eap EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在本发明的另一实施 方案中， 组合物可包含与 Emp 多肽 (SEQ ID NO ： 2， 50-53) 和 / 或 Eap 多肽 (SEQ ID NO ： 4) 或 Emp 核酸 (SEQ ID NO ： 1) 和 / 或 Eap 核酸 (SEQ ID NO ： 3) 有或有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或相似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面 中， Emp 多肽或 Eap 多肽将分别具有 (SEQ ID NO ： 2) 或 (SEQ ID NO ： 4) 的氨基酸序列。类 似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于鉴定蛋白质 ( 或 核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似性使用本领域 已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序列同一性算法，通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软件包中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设置 )， 或者通过肉 眼比较。 优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计算同一性百分比。
     术语 “AdsA 多肽” 是指包括分离的野生型细菌 AdsA 蛋白的多肽， 例如葡萄球菌 ( 金 黄色葡萄球菌 SEQ ID NO ： 36) 或芽孢杆菌 ( 炭疽芽孢杆菌 (B.anthracis)SEQ ID NO ： 41)， 以及 AdsA 蛋白的变体和区段或片段。在某些方面中， AdsA 多肽刺激针对细菌 AdsA 蛋白的 免疫应答。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 8 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrD 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrD 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 10 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrE 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrE 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 16 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SpA 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， SpA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 18 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 20 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 22 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasF 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasF 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 24 的氨基酸序列。在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 26 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 28 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 30 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 32 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 34 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasH(AdsA) 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋 白质。在某些方面中， SasH(AdsA) 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 的氨基酸序 列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Hla 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在 某些方面中， Hla 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 37 的氨基酸序列。在某些方面中， Hla 变体包括 D24C、 H35C、 H35K、 H35L、 R66C、 E70C 或 K110C 的氨基酸替换或者其任何组合 ( 氨基酸使用 单字母代码表示 )。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Ebh 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Ebh 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 38 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Coa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Coa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 39 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 vWa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， vWa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸序列。
     在某些方面中， 多肽或区段 / 片段可具有与参考多肽有至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％或至少 99％或更高同一性的氨基酸序列。术语 “相似性” 表示其序列具有 一定百分比的与参考多肽相同或构成与参考多肽的保守性替换的氨基酸的多肽。
     本文所述多肽或区段或片段可包含 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ：30、 SEQ ID NO ： 32、 SEQ ID NO ： 34、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 37、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 39、 SEQ ID NO ： 40、 SEQ ID NO ： 41 或 SEQ ID NO ： 41 的下列或至少或至多 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550 或更多个连续氨 基酸或其间任何可得出的范围。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码下列蛋白之 1、 2、 3、 4 或更多种的重组核 酸分子 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或 多糖任意组合或排列的 Emp 和 / 或 Eap 多肽。
     又一些实施方案包括包含如下可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 或者其区段或片段， 或者本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方 面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 Emp 和 / 或非 Eap 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是这样的可药用组合物， 所述组合物具有编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核 酸， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。 在某些实施方案中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选 地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向对象施用有效量的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其区段 / 片段之组合物， 其包含下 列一种或多种 ： (i)EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外 毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾 液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白多肽或者其区段 或片段， 或者 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 Emp 和 / 或 Eap 组合物， 其 含有不同组合的下列 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种蛋白 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在又一方面中， 本发明包括缺少 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或 EsaB 多肽的葡萄球 菌。此类细菌在长期或持续脓肿形成和 / 或生物膜形成方面是有限的或减弱的。此特征可 用于提供生产减毒细菌的菌株， 所述菌株用于制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或 治疗。在又一方面中， Emp 和 / 或 Eap 可在减毒细菌中过表达， 以进一步提高或补充免疫应 答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面中所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特 别地， 述及 Emp 和 / 或 Eap 肽或核酸时的任何实施方案可针对以下蛋白或核酸或结合它 们的抗体来实施 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 反之亦然。
     本发明人研究了金黄色葡萄球菌逃脱血液中噬菌细胞清除的能力， 并鉴定了作为 关键毒力因子的腺苷合酶 A(AdsA)—— 一种将一磷酸腺苷转化为腺苷的锚定于细胞壁的 酶。在血液中葡萄球菌的腺苷合成、 逃脱噬菌细胞的清除以及随后形成器官脓肿全都依赖 于 adsA， 并且可通过外源提供腺苷来挽救。在炭疽病原体中鉴定到 AdsA 同源物， 腺苷合成 也使得炭疽芽胞杆菌能够逃脱噬菌细胞清除。 总之， 这些结果表明， 葡萄球菌及其它细菌病 原体利用腺苷的免疫调节性质来逃脱宿主免疫应答。本发明的某些实施方案基于以下发 现： 信号传导分子腺苷的合成具有免疫抑制作用， 对其合成活性的调节可用于治疗目的。 本申请在一个实施方案中描述了 AdsA 或者与 AdsA 之全部或部分结合的抗体或者 AdsA 活性抑制剂在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。 本申请还 提供了包含 AdsA 抗原或其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可用于治 疗 ( 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取 ) 或预防细菌感染的方法和组合物。在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用有效量的包含或编码细菌 AdsA 多肽或抗原之全部或 部分的组合物， 在某些方面所述组合物还包含或编码其它细菌蛋白质和细菌多糖。其它细 菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或者 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子。
     在另一些方面中， 可向对象施用 AdsA 调节剂， 例如结合 AdsA 的抗体 ( 例如多克 隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 ) 或者抑制 AdsA 活性或稳定性的小分子。AdsA 调节剂 可直接与 AdsA 结合。AdsA 调节剂可以是结合 AdsA 的抗体或细胞。抗体可以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， 通过提供导致在对象中产生结合 AdsA 之抗体的 AdsA 肽或表达其的细菌来产生 AdsA 调节剂。AdsA 调节剂通常配制成可药 用组合物。AdsA 调节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结 合这些 ( 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SasB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 Spa、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 Coa、 Ebh、 vWa 或 SasF) 的抗体。葡萄球菌抗原或抗体可以与 AdsA 调节剂同时施用。抗原和 / 或抗体和 / 或抗生素以及 AdsA 调节剂可以在同一组合物中施 用。
     一些实施方案涉及这样治疗性组合物， 其在可药用组合物中包含结合 AdsA 蛋白 或抗原或其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染， 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述调节剂可以是小分子， 例如腺苷类似物。所述抗 体可以是人或人源化抗体。 在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体， 或者单链 抗体， 或其片段。
     抗体组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 该抗体结合选自以下的抗原或其 片段 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。重组核酸分子可编码 AdsA 肽和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种 抗原， 其包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。 重组核酸分子可编码 AdsA 肽 和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种抗原， 其 包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 AdsA 多肽或编码其的核酸。在又一些方面中， 分离的 AdsA 多肽是多聚化的， 例如二聚化。在本 发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个分离的细胞表面蛋白 或其区段的多聚体。 在另一方面中， 所述其它多肽或肽可表达或包含于细菌组合物中， 其包 括但不限于 ： AdsA、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 或其免疫原性片段。或者， 所述 组合物可以是或包含以某种方式改变的经重组改造的葡萄球菌， 所述改造包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行了特定改变。例如， 所述细菌可被重组改变成表达 比未经改变时更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     类似地， 术语 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 Coa、 Ebh、 vWa、 SasF 或 SpA 蛋白是指包括含从葡萄球菌分离的各 野生型多肽的蛋白质， 以及刺激针对其之免疫应答的变体、 区段或片段。免疫应答是指生 物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。免疫应答可通过以下测定来测量， 其包括但 不限于 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体存在或数量的测定， 测量 T 细胞活 化或增殖的测定和 / 或测量一种或多种细胞因子之活性或表达方面的调节的测定。细菌 AdsA 多肽包括但不限于下列细菌之氨基酸序列 ( 登记号 ) 的全部或部分 ： 金黄色葡萄球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261、 ref|NP_370547、 ref|YP_042156、 ref|NP_644838、 ref|YP_415541、 dbj|BAA82250) ；溶 血 葡 萄 球 菌 (Staphlyococcus hemolyticus)(ref|YP_254367) ； 血链球菌 (Streptococcus sanguinis) (ref|YP_001035187) ； 格 氏 链 球 菌 (Streptococcus gordonii)(ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)(ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (Streptococcus suis) (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ； 变 形 链 球 菌 (Streptococcus mutans)(ref|NP_721592) ； 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)(ref|YP_141373、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP_001321391) ； 肉 毒 梭 菌(Clostridium botulinum)(ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ；类 芽 孢 杆 菌 属 (Paenibacillus)(ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克 劳 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillus clausii)(ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (Bacillus halodurans)(ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)(ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解 纤 维 梭 菌 (Clostridium cellulolyticum)(ref|ZP_01574143) ； 以 及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个均通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽 可与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 具有至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包括其间的所有值和范围。
     在本发明的又一实施方案中， 组合物可包含与 AdsA 多肽 (SEQ ID NO ： 36) 或 AdsA 核酸 (SEQ ID NO ： 35) 有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质， 在某些方面中， AdsA 多肽具有 SEQ ID NO ： 36 的 氨基酸序列。类似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于 鉴定蛋白质 ( 或核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似 性使用本领域已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序 列同一性算法， 通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软 件 包 中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设 置 )， 或者通过肉眼比较。优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计 算同一性百分比。
     所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 葡萄球菌是金黄色 葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在另一方面中， 细菌是芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌。
     可使用本领域技术人员已知的方法以及本文所述方法评估作为 AdsA 抑制剂之化 合物的活性。筛选测定可包含用于校准和验证测定组分之正确操作的对照。通常包含含 有除了化学文库成员之外所有反应物的空白孔。作为另一实例， AdsA 的已知抑制剂 ( 或 活化剂 ) 可与一个测定样品一起孵育， 所得酶活性的降低 ( 或升高 ) 用作比较或对照。应 理解， 所述调节剂还可与酶活化剂或抑制剂相组合， 以发现抑制酶活化或阻遏的调节剂， 否则其由已知酶调节剂的存在造成。本文使用的术语 “高通量筛选 (high throughput screening)” 或 “HTS” 是指测试成千上万个分子 ( 或测试化合物 ) 对蛋白质功能的作用。 就基团转移反应酶来说， 可测试许多分子对其催化活性的作用。HTS 方法是本领域已知的， 它们通常在多孔板中借助自动液体操作和检测装置来进行 ； 但是， 设想本发明的方法可利 用微阵列或微流体系统来实施。本文使用的术语 “文库” 或 “药物文库” 是指具有作为 AdsA 调节剂潜力的多种化学分子 ( 测试化合物 )、 多种核酸、 多种肽或多种蛋白质及其组合。其 中通过高通量筛选技术进行筛选， 其中该技术利用多孔板或微流体系统。
     评估 AdsA 活性的测定 / 试剂盒的一个实例包括但不限于 Diazyme 酶反应试剂盒 ： 该试剂盒是 5′ - 核苷酸酶 (5′ -NT) 测定试剂盒， 其通常用于测定人血清样品中的 5′ -NT 活性。5′ -NT 测定是基于 5′ - 单磷酸酯 (5′ -IMP) 酶促水解形成肌苷， 后者通过嘌呤核 苷磷酸化酶 (PNP) 转化为次黄嘌呤。次黄嘌呤随后由黄嘌呤氧化酶 (XOD) 转化为尿酸和过氧化氢 (H2O2)。在过氧化物酶 (POD) 存在下， H2O2 进一步与 N- 乙基 -N-(2- 羟基 -3- 磺丙 基 )-3- 甲基苯胺 (EHSPT) 和 4- 氨基安替比林 (4-aminoantipyrine， 4-AA) 反应产生醌染 料， 而后对该染料进行动力学监测。该方法快速但是不如放射性测定灵敏。
     抑制剂和候选抑制剂包括但不限于下列试剂的衍生物或类似物 ： α， β- 亚甲基 腺苷 5′ - 二磷酸 (AOPCP)、 5′ - 外核苷酸酶 ( 细菌 AdsA 的人同源物 ) 的抑制剂， 此抑制 剂不抑制来自鸟毛滴虫 (Trichomonas gallinae) 滋养体的分泌型 5′ - 核苷酸酶 (Borges 等， 2007) ； 杀核酶菌素 (nucleoticidin) 和黑杀菌素 (melanocidin)A 和 B， 这些化合物 显示针对来自大鼠肝膜和蛇毒的 5′ - 核苷酸酶的有力抑制活性 (Uchino 等， 1986) ； 多酚 化合物， 这些化合物具有抗肿瘤活性， 以及抑制来自多种来源的 5′ - 核苷酸酶， 并且已从 槟榔 (Areca catechu) 以及葡萄的种子中分离得到 (Iwamoto 等， 1988 ； Uchino 等， 1988 ； Toukairin 等， 1991)。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 AdsA 多肽或其区段 / 片段的重组核酸分 子。通常， 编码 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文在例如 AdsA 多 肽中所述的一种或多种多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种革兰氏阳性细 菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免疫应答的其它 动物。在另一些方面中， 含有或表达 AdsA 多肽的葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。在另一些实 施方案中， 免疫应答是保护性和 / 或治疗性的免疫应答。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)AdsA 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 AdsA 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或多糖任意组合或排列 的 AdsA 多肽。
     又一些实施方案包括包含可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 AdsA 多 肽、 其区段或片段、 或者本文所述蛋白质或肽的任何其它组合或排列， 其中所述组合物能够 刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 AdsA 多肽和 / 或本文所述蛋白质、 肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方面中， 分离的 AdsA 多肽或者本文所述 蛋白质或肽的任何其它组合或排列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 AdsA 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或 非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是如下可药用组合物， 其具有编码 AdsA 多肽之 全部或部分和 / 或本文所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸， 其中所述组合 物能够刺激针对葡萄球菌或芽孢杆菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 AdsA 多肽 之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。在某些实施方案 中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     在另一些实施方案中， 疫苗组合物是可药用组合物， 其包含结合 AdsA 蛋白或抗原 或者其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中的葡萄球菌感染， 例如 调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述抗体可以是人抗体或人源化抗体。在某些方面中， 所述 抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或者单链抗体， 或其片段。
     疫苗组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 其结合选自以下的抗原 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Emp、 Eap、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原， 或其片段。
     另一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 包括向所述对象施用有效量的 AdsA 多肽或其区段 / 片段的组合物， 所述组合物包含下 列一种或多种 ： (i)Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Spa、 ClfA、 ClfB、 Coa、 Ebh、 vWa、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 多肽， 或者其区段或片 段； 或 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 AdsA 组合物， 其含有不同组合的下 列蛋白的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 Spa。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在另一方面中， 本发明包括缺少 AdsA 多肽的葡萄球菌。这样的细菌在逃避吞噬细 胞摄取和 / 或识别的能力上有限或减弱。此特征可用于提供生产减毒细菌的菌株， 其用于 制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或治疗。在又一方面中， AdsA 可在减毒细菌中过 表达， 以进一步提高或补充免疫应答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特别地， 述及 AdsA 肽或核酸时的任何实施方案可针对其它分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或 核酸或结合它们的抗体来实施， 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 Coa、 Ebh、 vWa、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 蛋白， 反之亦 然。
     术语 “提供” 或 “施用” 根据其常规含义使用， 表示 “供给或供应以使用” 。在一些实 施方案中， 通过施用蛋白质直接提供蛋白质， 而在另一些实施方案中， 通过施用编码蛋白质 的核酸来有效提供或施用该蛋白质。在某些方面中， 本发明涵盖包含抗体、 核酸、 抗原、 肽、 表位和 / 或多糖等之多种组合的组合物。
     对象通常患有 ( 例如诊断患有持续葡萄球菌感染 )、 怀疑患有葡萄球菌感染， 或者 具有发生葡萄球菌感染的风险。本发明的组合物包括免疫原性组合物， 其中以有效实现预 定目的 ( 例如治疗或预防感染 ) 的量包含所述抗原或表位。更具体地， “有效量” 表示刺激 或引发免疫应答或者提供针对感染的抗性、 减轻或缓和感染所需的活性成分的量。在更具 体地方面中， 有效量预防、 减轻或改善疾病或感染的症状， 或者延长所治疗对象的存活。确 定有效量在本领域技术人员的能力范围内， 尤其是在本文所提供的详细公开的教导下。对 于本发明方法使用的任何制备物， 有效量或剂量最初可从体外、 细胞培养和 / 或动物模型 测定来估计。例如， 可在动物模型中制定实现期望之免疫应答或循环抗体浓度或效价的剂 量。这些信息可用于更精确地确定人中的有用剂量。
     本文使用的术语 “调节” 涵盖了 “增强” 或 “抑制” 的含义。活性的 “调节” 可以是活性提高或降低。本文使用的术语 “调节剂” 是指实现某部分之功能的化合物， 包括上调、 诱导、 刺激、 增强、 抑制、 下调或阻抑蛋白质、 核酸、 基因、 生物体等。
     术语 “分离的” 可表示基本上不含其来源的细胞物质、 细菌物质、 病毒物质或培养 基 ( 当通过重组 DNA 技术产生或者从天然生物体中分离时 ) 或者化学前体或其它化学物质 ( 当化学合成时 ) 的核酸或多肽或肽。 此外， 分离的化合物是指可作为分离的化合物施用给 对象的化合物 ； 换句话说， 如果附着在柱子上或者嵌在琼脂糖凝胶中， 则所述化合物不可以 简单地认为是 “分离的” 。此外， “分离的核酸片段” 或 “分离的肽” 是非天然的和 / 或以片 段起作用和 / 或通常不是功能性状态的核酸或蛋白质片段。
     本发明的部分 ( 例如抗体、 多肽、 肽、 抗原或免疫原 ) 可以与其它部分 ( 例如佐剂、 蛋白质、 肽、 支持物、 荧光部分或标签 ) 共价或非共价地缀合或连接。术语 “缀合” 或 “免疫 缀合” 广义地用于定义一个部分与另一物质的有效结合， 其不旨在仅仅表示任何类型的有 效结合， 还特别地不限于化学 “缀合” 。特别地， 还考虑到重组融合蛋白。本发明的组合物还 可包含佐剂或可药用赋形剂。佐剂可以与本发明的多肽或肽共价或非共价偶联。在某些方 面中， 佐剂与蛋白质、 多肽或肽化学缀合。 在另一方面中， 佐剂是重组蛋白质的一部分， 其包 含在含有一种或多种目的抗原的融合蛋白中。 所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 所述葡萄球菌是金 黄色葡萄球菌。
     在本发明的另一些方面中， 可超过一次地将组合物施用给对象， 可以施用 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20 或更多次。所述组合物的施用包括但不限于经鼻、 经胸膜、 经口、 肠 胃外、 皮下、 肌内、 静脉内施用， 或其多种组合， 包括吸入或吸取。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽或其区段 / 片段 的重组核酸分子。通常， 编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文所述的一种或 多种多肽， 例如 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种 革兰氏阳性细菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免 疫应答的其它动物。在另一些方面中， 含有或表达 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的葡萄球菌是 金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中， 免疫应答是保护性免疫应答。
     本发明的组合物通常施用给人对象， 但是设想施用给能够引发对葡萄球菌之免疫 应答的其它动物， 特别是小鼠、 狗、 猫、 牛、 马、 山羊、 绵羊及其它家畜， 即哺乳动物， 包括转基 因动物 ( 例如， 经操作表达人抗体的动物 )。
     在另一些方面中， 本发明的方法和组合物可用于预防、 改善、 减少或治疗组织或腺 体 ( 例如乳腺 ) 的感染， 特别是乳腺炎及其它感染。其它方法包括但不限于， 在未表现感染 征兆的对象 ( 特别是怀疑靶细菌定殖或具有该风险的对象， 例如在医院停留、 治疗和 / 或恢 复期间具有或将具有感染风险或者对其易感的患者 ) 中预防性地减少细菌负荷。
     本文提供的任何列表可特别地排除或包含列表中的任何 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个成员。
     实施例章节中的实施方案应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施方案。
     尽管本公开内容支持仅择一选择以及 “和 / 或” 的定义， 但是权利要求中使用的术 语 “或” 表示 “和 / 或” ， 除非另外指明仅择一选择或者可选项是互相排斥的。还考虑到， 使 用术语 “或” 列出的任何项也可特别地排除。
     在本申请全文中， 术语 “约” 用于表示数值包括测定该值所用仪器或方法的标准误 差。
     遵循长期以来的专利法， 在权利要求或说明书中， 与 “包含” 联用时， 无数量词修饰 的名词表示一个或多个， 除非具体指明。
     通过下文的详细描述， 本发明的其它目标、 特征和优点将是很明显的。但是， 应当 理解的是， 仅仅通过举例说明的方式给出了详细描述和具体实例 ( 即本发明的具体实施方 案 )， 因为通过这一详细描述， 在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员 而言将是很明显。 附图说明为了使本发明的上述特征、 优点和目的以及其它方面更加清楚，
     并且使详述便于理解， 附图中举例说明了上文简述的本发明的更具体描述和某些 实施方案。这些附图构成说明书的一部分。但是， 应注意， 附图举例说明了本发明的某些实 施方案， 因此不应视为对其范围的限制。
     图 1A-1H 检测金黄色葡萄球菌形成的脓肿。( 图 1A)Newman 株感染的肾脏的照 片。( 图 1B)srtA 突变体感染的肾脏的照片。( 图 1C)Newman 株感染的肾脏的 H&E 组织切 片。( 图 1D)ΔSrtA 感染的肾脏的组织切片。( 图 1E)Newman 株感染的肾脏的特写。( 图 1F)ΔSrtA 感染的肾脏的特写。( 图 1G)Newman 株脓肿的扫描电子显微镜照片。( 图 1H) ΔSrtA 感染的肾脏的 SEM 照片。
     图 2 鼠肾脓肿筛选。从各个突变株感染的肾脏回收的集落形成单位 (CFU)。
     图 3A-3G 生物膜筛选。( 图 3A) 体外生物膜生长的 96 孔板测定。( 图 3B)Newman 株体外生物膜的 SEM 照片。( 图 3C)ΔsrtA 生物膜。( 图 3D)ΔEmp 生物膜。( 图 3E)ΔIcaA 生物膜。( 图 3F)ΔIsdB 生物膜。( 图 3G)ΔSdrD 生物膜。
     图 4A-4B Emp 毒力。( 图 4A)Newman、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSrtA、 ΔEap/ΔSrtA、 ΔEmp/ ΔSrtA 回收的 CFU。( 图 4B) 各菌株的组织病理学。
     图 5A-5E Eap、 Emp 免疫。( 图 5A)Newman、 ΔSrtA、 ΔIsdB、 ΔIcaA、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSaeR 的 SDS 提取。( 图 5B)Eap(70kDa) 和 Emp(45kDa) 的蛋白质纯化。( 图 5C) 从用 PBS、 Eap 或 Emp 免疫并且用 Newman 株攻击的小鼠中回收的 CFU。( 图 5D) 来自经免疫小鼠的 ELISA IgG 效价。( 图 5E) 来自经免疫小鼠的组织病理学。
     图 6A-6B Ica 毒力。( 图 6A) 从用 Newman、 DIcaA、 DIcaB、 DIcaC、 DIcaD、 DIcaR、 DIca:tet( 整个操纵子缺失 ) 感染的小鼠回收的 CFU。( 图 6B) 来自被感染小鼠的组织病理 学。
     图 7A-7K 静脉内感染小鼠后的葡萄球菌脓肿形成。(A) 用 1×107 集落形成单位 (CFU) 的金黄色葡萄球菌 Newman 株通过眼眶后注射感染 BALB/c 小鼠。以一定的时间间 隔， 通过心脏穿刺检查一组五只小鼠的血液中细菌负荷 ； 将样品等分试样涂覆于琼脂培养
     基上， 对每毫升血液中的 CFU 进行统计。这些结果的平均值以黑色棒表示。(B) 以一定时间 间隔， 测量小鼠 ( 一组十只动物 ) 肾脏中金黄色葡萄球菌 Newman 株向外周器官组织的播散 以及病原体的复制， 对肾脏匀浆并涂覆于琼脂培养基上， 统计 CFU。(C) 以一定时间间隔， 在 受感染肾脏的苏木精 - 伊红染色组织薄切片中测量脓肿病变的直径。(D-K) 以一定时间间 隔， 在苏木精 - 伊红染色组织薄切片中分析受感染肾脏的图像。箭头指向脓肿病变。
     图 8A-8F 葡萄球菌脓肿群落的组织病理学。通过眼眶后注射用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染 BALB/c 小鼠。通过光学显微镜分析感染后第 2 天 (ABC) 和第 5 天 (DEF) 的 受感染肾脏的薄切片苏木精伊红染色的组织， 并获得图像。在第 2 天， 带有偶见的胞内葡萄 球菌 (C 中黄色箭头 ) 的多形核粒细胞 (PMN) 的大量浸润 (A 中蓝色箭头 ) 是感染病变早期 的特征。在第 5 天， 葡萄球菌脓肿群落形成中心病灶 (D， 黑色箭头 )。葡萄球菌由无定形的 嗜伊红假荚膜 ( 黑色框表示 ) 包覆， 周围是死的 PMN 的区域 ( 白色框表示 )、 看上去健康的 PMN 的区域 ( 红色框表示 ) 以及坏死 PMN 的边界 ( 绿色框表示 )， 其通过嗜伊红层与健康肾 组织隔开。
     图 9A-9P 分选酶 A 是宿主组织中脓肿形成和葡萄球菌持续存在所需的。在接种后 第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 的动物尸检过程中取出用金黄色葡萄球菌 Newman 株、 其同基 因型分选酶 A 突变体 (ΔsrtA) 或甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 USA300 感染的 BALB/c 小 鼠 ( 十只动物的组 ) 的肾脏。 肉眼检查肾脏的表面脓肿 (A、 F、 K)， 或者将其固定于福尔马林 中， 包埋， 切成薄片并用苏木精 - 伊红染色。用光学显微镜以 10×(B、 G、 L、 D、 I、 N) 或 100× 放大倍数 (C、 H、 M、 E、 J、 O) 获得组织病理学图像。(P) 在感染后第 5 和 15 天测量肾组织中 葡萄球菌复制和持续存在。 在尸检时从被感染的小鼠中取出肾脏， 将组织匀浆， 并铺板于琼 脂培养基上， 用以检测集落形成和统计数目。
     图 10A-10C 脓肿病变中心的葡萄球菌群落。对来自用金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 野生型 )、 其同基因型分选酶 A 突变株 (ΔsrtA) 或者用 MRSA 株 USA300 感染的小鼠的肾 组织切片， 固定， 脱水并用 80％铂 /20％钯喷射涂覆以进行扫描电子显微镜分析。(A) 在脓 肿的中心野生型病原体组织成紧密相连的菌苔——葡萄球菌脓肿群落 (SAC)， 其包含在无 定形假荚膜 ( 白色箭头 ) 中， 假荚膜将 SAC 与白细胞套隔开。红细胞位于葡萄球菌中 (R)。 (B) 分选酶突变株 (ΔsrtA， 箭头 ) 不形成 SAC， 在健康肾组织中发现分离的葡萄球菌。(C) 与金黄色葡萄球菌 Newman 株类似， MRSA 株 USA300 也形成包含在假荚膜中的 SAC( 白色箭 头 )。
     图 11A-11B 葡萄球菌脓肿群落的形成需要特定表面蛋白质。(A)BALB/c 小鼠 (20 只动物的组 ) 感染后五天， 研究了在表面蛋白质基因中具有 bursa aurealis 插入物的金 黄色葡萄球菌 Newman 变体在匀浆肾组织中的细菌负荷。(B) 通过光学显微镜研究了苏木 精 - 伊红染色的被感染肾脏的薄切片， 显示脓肿病变的 10× 倍放大 ( 白色箭头 )。
     图 12A-12L 葡萄球菌脓肿病变中的 Emp 和 Eap。在接种后第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 取出用在 emp 或 eap 中带有 bursa aurealis 插入物的金黄色葡萄球菌 Newman 变体 感染的 BALB/c 小鼠的肾脏。用苏木精 - 伊红对肾脏染色， 用光学显微镜以 10×(A、 C、 E、 H) 或 100× 放大倍数 (B、 D、 F、 I) 获得组织病理学图像。在为检测多形核白细胞核用 Hoechst 染料 ( 蓝色 ) 染色以及为显示葡萄球菌脓肿群落用 BODIPY- 万古霉素 ( 绿色 ) 染色的肾组 织中， 用兔抗 Emp 或抗 Eap 抗体以及第二 Alexafluor-647 标记的抗体 ( 红色 ) 检测野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株的脓肿病变中 Eap(J) 和 Emp(K) 表达。(L) 在静脉内接种后第 5 天、 15 天和 30 天测量肾组织中葡萄球菌复制和持续存在。从被感染的小鼠 (10 只动物的 组 ) 中取出肾脏， 将组织匀浆， 铺板于琼脂培养基上， 用以集落形成和统计数目。
     图 13A-13E 用 Eap 的主动和被动免疫产生对葡萄球菌攻击的保护。(A) 用纯化的 Eap 或 Emp 来免疫 BALB/c 小鼠或者仅用佐剂模拟处理， 通过 ELISA 分析血清 IgG 效价。(B) 免疫三周后， 通过静脉内接种葡萄球菌来攻击动物。感染后第 5 天， 在尸检时取出肾脏， 分 析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。 (C) 通过亲和色谱纯化针对 Eap 或 Emp 的兔抗体， 通过腹膜内注射被动转移进小鼠体内。24 小时后， 通过 ELISA 分析被动免疫之动物的血清 IgG 效价。(D) 随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击用抗 Eap 或 Emp 的纯化抗体被动免疫 的动物以及模拟免疫的动物， 在第 4 天对细菌负荷进行统计。 (E) 在苏木精 - 伊红染色的组 织薄切片中检测肾脏中脓肿形成。
     图 14 宿主组织中葡萄球菌脓肿形成和持续存在的工作模型。阶段 1- 静脉内接种 后， 金黄色葡萄球菌在血流中存活， 并通过脉管系统散播到外周器官组织。阶段 II- 在肾组 织中， 葡萄球菌吸引多形核白细胞以及其它免疫细胞的大量浸润。阶段 III- 脓肿成熟， 其 中心积累了病原体 ( 葡萄球菌脓肿群落 -SAC)， 由嗜伊红假荚膜所包覆。SAC 周围是死 PMN 的区域、 看上去健康的 PMN 以及最后具有嗜伊红物质边界的死 PMN 的外层区域。阶段 4- 脓 肿成熟， 在器官表面破裂， 从而释放葡萄球菌进入循环， 并引起新一轮的脓肿发生。葡萄球 菌脓肿发生特定阶段所需的细菌包膜组分的基因在这些基因发挥功能的相应阶段下以红 色显示。
     图 15A-15H AdsA 是在血液中存活所必需的细胞壁相关蛋白质。比较 BALB/c 小 鼠 ( 图 15A) 或 Sprague-Dawley 大鼠 ( 图 15D) 血液中野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 (WT) 和同基因型 srtA 变体的存活。数据是来自三个独立分析的平均值以及平均值的标准 差 (±SEM)。为了评估分选酶 A 锚定的细胞壁表面蛋白质对血液中葡萄球菌存活的相对贡 献， 将所示基因中具有转座子插入物的同基因型突变株在来自小鼠 ( 图 15B) 或大鼠 ( 图 15E) 血液中孵育 60 分钟。在来自小鼠 ( 图 15C)、 大鼠 ( 图 15F) 或人志愿者 ( 图 15G) 的 血液中， padsA 的表达挽救了 adsA 突变株的葡萄球菌存活。显示吉姆萨染色的人血液样本 中与吞噬细胞一起的 WT、 adsA 和 adsA(padsA) 葡萄球菌 ( 图 15H)。箭头指示细胞外的和 中性粒细胞相关的金黄色葡萄球菌。数据表示使用两个不同供体的两个独立分析。
     图 16A-16E AdsA 是在体内实现葡萄球菌复制和脓肿形成的毒力因子。 10 只 BALB/ c 小鼠的组被金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16A) 或 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16C) 感染后肾脏中的葡萄球菌负荷 ( 对于 Newman 和 USA300 感染， 均为 P ＜ 0.03， 不成对 t 检验 )。金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16B) 或金黄 色葡萄球菌 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16D) 感染的小鼠尸检后获得的苏木精 - 伊红 染色的肾组织在 10 倍 ( 上图 ) 和 100 倍放大 ( 下图 ) 下的显微镜照片。黑色箭头指示葡萄 球菌的中央浓度和 PMN 浸润。 数据是每种菌株 5 只动物的组的代表性样品和 2 个独立分析。 ( 图 16E) 细菌负荷测定为 30 或 90 分钟时从 BALB/c 小鼠获得的每 500 微升血液的 CFU， 所 述小鼠通过眼眶后注射感染野生型 (WT)、 adsA 或 adsA:padsA 金黄色葡萄球菌 Newman 株。 数据是每个时间点使用 10 只动物的组进行的两个独立分析的代表。使用不成对 t 检验进 行统计学分析。图 17A-17F AdsA 显示 5′ - 核苷酸酶活性并水解 AMP。将来自所示菌株的溶葡 萄菌素细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 测定 [14C] Ado( 腺苷 ) 产生。( 图 17A) 通过磷光成像仪 (PhosphorImager) 捕获 TLC 后的 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17B) 对来自 (a) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对金黄 色葡萄球菌 Newman 株的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行校准， 显示为百分比的量。 数据是三个 独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 WT 比 adsA， P ＜ 0.05)。( 图 17C) 在存在或不 存在纯化的 AdsA1-400(2μM) 以及存在或不存在 5mM 不同金属离子时孵育放射性标记的 [14C] AMP。用磷光成像仪捕获 TLC 后 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17D) 对来自 (c) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对氯化锰 (Mn2+) 存在时的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行 校准， 显示为百分比的量。显示的数据是 2 个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 +2 +2 +2 +2 Zn 比 Mn 和 Cu 比 Mn ， P ＜ 0.05)。( 图 17E) 从重组大肠杆菌纯化 GST-AdsA， 用凝血酶 切割产生 AdsA1-400， 通过考马斯染色的 SDS-PAGE 分析纯化的蛋白。( 图 17F) 在不同浓度腺 苷存在或不存在时， 大鼠血液中 adsA 葡萄球菌的存活。
     图 18A-18D 葡萄球菌 AdsA 在血液中合成腺苷。( 图 18A) 反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 定量腺苷 ( 左图， 100μM 腺苷 ) 并通过基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI-MS， 右图 ) 鉴定其单同位素离子。在没有 ( 图 18B) 或有金黄色葡萄球菌 Newman 野生型 (WT) ( 图 18C) 或其同基因型 adsA 变体 ( 图 18D) 存在下孵育小鼠血液一小时， 除去血浆中的蛋 白质， 过滤并进行 RP-HPLC， 以定量腺苷 ( 左图 )， 以及通过 MALDI-MS 鉴定其单同位素离子 ( 右图 )。 从纯化的腺苷对照外推计算得到的血液中腺苷丰度为 1.1μM(18B， 无葡萄球菌 )、 13.2μM(18C， WT 金黄色葡萄球菌 Newman 株 ) 和 2.1μM(18D， adsA 突变株葡萄球菌 )。
     图 19A-19E 5’ - 核苷酸酶活性增强炭疽芽孢杆菌的存活。 ( 图 19A) 来自炭疽芽孢 杆菌 Sterne 株 (WT， 野生型 ) 或 adsA(basA) 突变株芽孢杆菌的变溶菌素提取物与放射性标 14 记的 [ C]AMP 一起孵育， 通过 TLC 检测腺苷的产生。( 图 19B) 用针对不参与腺苷产生的对 照蛋白 BasA(αBasA) 或 BasC(αBasC) 的抗血清分析来自变溶菌素提取物的蛋白质。( 图 19C) 使用抗 BasA 抗血清 ( 上图 ) 或非反应性血清 (NRS) 以及 Cy3- 标记的第二抗体 ( 红 色 ) 染色的以及 Hoechst 对核酸染色 ( 蓝色 ) 的野生型 (WT) 炭疽芽孢杆菌 Sterne 株和其 同基因型 adsA 突变株的荧光显微照片。( 图 19D) 在 5mM 不同金属离子存在下放射性标记 的 [14C]AMP 与纯化的 BasA(2μM) 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 和磷光成像仪测量 [14C] Ado( 腺苷 ) 的产生。数据代表 3 个独立的分析。( 图 19E) 大鼠血液中野生型和 adsA/basA 突变株炭疽芽孢杆菌 Sterne 株随时间 ( 分钟 ) 的存活， 表示为琼脂板上的菌落形成单位。 数据是两个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。
     图 20 显示 adsA 破坏和 padsA 补偿。为了能够显示 AdsA， 我们使用蛋白 A 缺陷型 (Δspa) 金黄色葡萄球菌菌株 SEJ2， 因为蛋白 A 特异性结合抗体的 Fc 结构域并干扰免疫 印迹分析。通过 SDS-PAGE 分离来自转化有 padsA 的野生型 Δspa SEJ2( 泳道 1)、 Δspa、 adsA:ermB( 泳道 2) 或 Δspa、 adsA:ermB 细胞的细胞壁提取物， 用抗 GST-AdsA1-400 的抗血 清进行免疫印迹分析。* 表示非特异性反应物质。
     图 21 从感染 USA300 的小鼠分离的肾脏的组织学检查。 用金黄色葡萄球菌 USA300 野生型 ( 下图 ) 和 adsA 突变株 ( 上图 ) 感染 4 天的小鼠尸检后获得的肾组织苏木精 - 伊 红染色的 10× 显微照片。黑色箭头表示葡萄球菌的中央浓度和 PMN 浸润。数据是每种细菌菌株 5 只动物的组的代表性样品以及 2 个独立分析。
     发明详述
     生物膜是嵌入到分泌的细胞外基质中的微生物群落 (Hall-Stoodley 等， 2004 ； Kolter 和 Greenberg， 2006)。许多细菌物种能够从漂浮生长转换为形成生物膜， 从而显示 增强的抗生素抗性 (Drenkard 和 Ausubel， 2002)， 逃脱宿主免疫防御 (Singh 等， 2002)， 以及 更有利于在人中建立慢性感染 (Brady 等， 2008)。葡萄球菌物种的生物膜已经与许多疾病 包括心内膜炎 (Xiong 等， 2005)、 骨髓炎 (Brady 等， 2006) 以及多种植入物 ( 包括导尿管、 假体心脏瓣膜和人造关节 ) 介导的感染相关联 (Cassat 等， 2007)。这尤其适于表皮葡萄球 菌， 其是一种非常容易在体外和体内形成生物膜的机会致病菌 (Mack 等， 1996)。对于表皮 葡萄球菌来说， 形成生物膜的能力与毒力之间有明确的相关性， 该相关性此前未在金黄色 葡萄球菌中证实 (Cassat 等， 2007)。
     金黄色葡萄球菌是人皮肤和鼻孔的共生生物， 其是导致血流和皮肤 / 软组织感染 的主要原因 (Klevens 等， 2007)。葡萄球菌感染的致病是从细菌通过外伤、 手术创口或医疗 器械侵入皮肤或血流开始 (Lowy， 1998)。通过噬菌细胞的杀伤， 一些葡萄球菌从血流中被 清除， 但是逃脱了免疫防御的葡萄球菌将感染接种到器官组织， 并诱导促炎症应答， 其由来 自巨噬细胞、 中性粒细胞及其它吞噬细胞的细胞因子和趋化因子释放所介导 (Lowy， 1998)。 所导致的免疫细胞侵入感染部位伴随着中央液化性坏死以及形成外周纤维蛋白壁， 以试图 阻止微生物散布并允许除去坏死的组织碎片 (Lowy， 1998)。可通过显微镜观察到如下形式 的病变 ： 含有坏死组织、 白细胞和细菌中央病灶的多细胞区域。 器官脓肿在感染两天内发生 ( 未公开数据 )， 其代表了葡萄球菌疾病的标志。 I. 葡萄球菌抗原
     金黄色葡萄球菌 Ess 途径可视为配备了专门的转运组件 (Ess)、 辅助因子 (Esa) 和 同源分泌基质 (Esx) 的分泌模块。EssA、 EssB 和 EssC 是 EsxA 和 EsxB 分泌所必需的。因 为预计 EssA、 EssB 和 EssC 是跨膜蛋白质， 所以设想这些蛋白质形成分泌装置。ess 基因簇 中的某些蛋白质可主动转运分泌的底物 ( 作为马达 )， 而另一些可调节转运 ( 调节剂 )。调 节可通过分泌型多肽的转录或翻译后机制、 将特异性底物分选到限定的位置 ( 例如细胞外 基质或宿主细胞 )， 或者感染过程中分泌事件的时间安排来实现， 但不一定限于此。对于这 一点， 不清楚是否所有分泌的 Esx 蛋白质均起到毒素的作用或者间接导致发病。
     葡萄球菌依赖表面蛋白质介导的宿主细胞粘附或者组织侵入来作为逃脱免疫防 御的策略。此外， 在感染期间， 金黄色葡萄球菌利用表面蛋白质来螯合来自宿主的铁。大多 数参与葡萄球菌致病的表面蛋白质带有 C 端分选信号， 即它们通过分选酶与细胞壁包膜共 价连接。此外， 缺少表面蛋白质锚定所需基因 ( 即分选酶 A 和 B) 的葡萄球菌菌株在几种不 同的小鼠疾病模型中显示出毒力的显著缺陷。因此， 表面蛋白质抗原代表了有效的疫苗靶 标， 因为对应的基因是葡萄球菌疾病发生必需的， 并且可在本发明的多个实施方案中利用。 分选酶超家族是革兰氏阳性菌转肽酶， 其负责将表面蛋白质毒力因子锚定到肽聚糖细胞壁 层。已在金黄色葡萄球菌中鉴定出两种分选酶同工型—— SrtA 和 SrtB。这些酶已显示识 别底物蛋白中的 LPXTG 基序。SrtB 同工型似乎在血红素铁获得和铁动态平衡中非常重要， 而 SrtA 同工型则在革兰氏阳性细菌的致病中起关键作用 ( 其通过调节细菌粘附宿主组织 的能力而起作用， 所述粘附是通过粘附物和其它蛋白质与细胞壁肽聚糖的共价锚定来实现
     的 )。 本发明的实施方案包括但不限于涉及 Emp 和 / 或 Eap 的组合物和方法。在某些 实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡萄球菌蛋白 ( 例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 蛋白 ) 联用。Emp(SEQ ID NO ： 2) 或 Eap(SEQ ID NO ： 4) 是葡萄球菌多肽。 其它 Emp 和 / 或 Eap 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于登记号 ( 对于 Emp) YP_185731、 NP_371337、 NP_645584、 CAB75985、 YP_416239、 YP_040269 和 NM0758 以及 ( 对 于 Eap)YP_500650、 CAB94853、 YP_186825、 CAB51807、 NP_646697、 YP_041404、 NM1872， 其每 个均如同在本申请的优先权日通过引用并入本文。其它的葡萄球菌抗原包括 52kDa 玻连蛋 白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原 结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合 蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在哺乳动物中， 腺苷在调节固有和获得性免疫应答中起到关键性作用 (Thiel 等， 2003)。强的或过度的宿主炎性应答 ( 例如响应于细菌感染 ) 加剧了入侵病原体所致的组 织损伤 (Thiel 等， 2003)。因此， 成功的微生物免疫清除包括平衡促炎和抗炎介导物。细胞 因子 IL-4、 IL-10、 IL-13 和 TGF-β 限制了过度的炎症， 但是只有腺苷能够完全阻抑免疫应 答 (Nemeth 等， 2006)。腺苷的免疫调节特性由四个跨膜腺苷受体所介导—— A1、 A2A、 A2B 和 A3(Hasko 和 Pacher， 2008)。 T 淋巴细胞表达高亲和力 A2A 受体以及低亲和力 A2B 受体 (Thiel 等， 2003)。根据其活性状态， 巨噬细胞和中性粒细胞表达所有四种腺苷受体， 而 B 细胞仅 具有 A2A(Thiel 等， 2003)。A2A 的参与在单核细胞 (Khoa 等， 2001) 和树突状细胞 (Panther 等， 2001) 中抑制 IL-12 产生， 增加 IL-10， 以及在中性粒细胞中减少细胞毒性作用和趋化因 子产生 (McColl 等， 2006 ； Cronstein 等， 1986)。炎症、 缺氧、 器官损伤和外伤性休克部位产 生腺苷是先后由两种酶所介导的。胞外 -ATP 二磷酸水解酶 (CD39) 将循环中的三磷酸腺苷 (ATP) 和二磷酸腺苷 (ADP) 转化为 5′ - 一磷酸腺苷 (AMP)(Eltzshig 等， 2003)。内皮细胞 (Deussen 等， 1993) 和 T 细胞亚群 (Thompson 等， 1989 ； Thompson 等， 1987 ； Yang 等， 2005) 表面上表达的 CD73 随后将 5′ -AMP 转化为腺苷 (Zimmermann， 1992)。
     尽管细胞外腺苷对炎症抑制来说是必要的， 但是过量的腺苷积累也是有害的。 例如， 具有腺苷脱氨酶 (ADA) 缺陷的患者中的情形， 所述 ADA 是将腺苷转化为肌苷的 酶 (Giblett 等， 1972)。ADA 缺 陷 导 致 严 重 复 合 免 疫 缺 陷 综 合 征 (severe compromised immunodeficiency syndrome， SCID)， 其具有削弱的细胞免疫和显著减少的免疫球蛋白产 生 (Buckley 等， 1997)。因为细胞外腺苷的调节在维持免疫动态平衡中是关键的， 所以对腺 苷水平的扰动很可能影响感染期间的宿主免疫应答。本发明人在本文中描述了细菌 ( 例如 金黄色葡萄球菌和炭疽芽胞杆菌 ) 利用腺苷合成来逃脱宿主免疫应答， 并提供了利用这一 信息治疗和 / 或预防细菌感染 ( 例如菌血症 ) 的方法和组合物。
     本发明的某些实施方案涉及诱导免疫应答， 提供抗 AdsA 或抑制 AdsA 的抗体。 AdsA(SEQ ID NO ： 55) 是葡萄球菌多肽。其它 AdsA 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261 、 ref|NP_370547 、 ref|YP_042156 、 ref|NP_644838 、 ref|YP_415541 、 dbj|BAA82250) ； 溶 血 葡 萄 球 菌 (ref|YP_254367) ； 血 链 球 菌 (ref|YP_001035187) ； 格氏 链 球 菌 (ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ；变 形 链 球 菌 (ref|NP_721592) ；嗜 热 链 球 菌 (ref|YP_141373 、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP _001321391) ； 肉 毒 梭 菌 (ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ； 类芽孢杆菌属 (ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克劳氏芽孢杆 菌 (ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解纤维梭菌 (ref|ZP_01574143) ； 以及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个如同在 本申请优先权日通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽可具有与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包 括其间所有值和范围。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽、 结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： Emp 和 / 或 Eap 及其它 葡萄球菌抗原例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽和 / 或结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： AdsA 及其它葡萄 球菌抗原例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     这些多肽包含来自葡萄球菌属细菌的蛋白质的氨基酸序列。 所述序列可来自特定 的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 也可以来自特定的菌株 ( 例如 Newman 株 )。
     分选酶底物多肽包括但不限于下列氨基酸序列 ： 来自葡萄球菌属细菌的 SdrC、 SdrD、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC 或 SasF 蛋 白 质。 分 选 酶 底 物 多 肽序列可来自特定的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 可来自特定的菌株 ( 例 如 Newman 株 )。在某些实施方案中， SdrD 序列来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373773.1(gi|15926240) 获得， 其通过引用并入本文。在另一些实施方案中， SdrE 序列 来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373774.1(gi|15926241) 获得， 其通过引用并入 本文。在另一些实施方案中， IsdA 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1130( 其与 Newman 株具有 相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371654.1(gi|15924120) 获得， 其通过引用 并入本文。在另一些实施方案中， IsdB 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1129( 其与 Newman 株 具有相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371653.1(gi|15924119) 获得， 其通过 引用并入本文。在另一些实施方案中， 可使用通过 Ess 途径转运或通过分选酶加工的其它 多肽， 本领域技术人员可使用数据库和国际互联网可获取的资源来确定其序列。
     可通过分析细菌基因组的数据库提交来鉴定可用于本发明中的多种蛋白质实例， 其包括但不限于登录号 NC_002951(GI ： 57650036 和 GenBank CP000046)、 NC_002758(GI ： 57634611 和 GenBank BA000017)、 NC_002745(GI ： 29165615 和 GenBank BA000018)、 NC_003923(GI ： 21281729 和 GenBank BA000033)、 NC_002952(GI ： 49482253 和 GenBank BX571856)、 NC_002953(GI ： 49484912 和 GenBank BX571857)、 NC_007793(GI ： 87125858 和 GenBank CP000255)、 NC_007795(GI ： 87201381 和 GenBank CP000253)， 其每个均通过引用并 入本文。
     本文所用的 “蛋白质” 或 “多肽” 是指含有至少十个氨基酸残基的分子。在一些实 施方案中， 使用蛋白质或多肽的野生型形式， 但是在本发明的许多实施方案中， 使用经修饰 的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可互换使用。 “经修饰的蛋白质” 或 “经修饰的 多肽” 是指其化学结构 ( 特别是其氨基酸序列 ) 与野生型蛋白质或多肽相比发生改变的蛋 白质或多肽。在一些实施方案中， 经修饰的蛋白质或多肽具有至少一种改变的活性或功能 ( 认为蛋白质或多肽可具有多种活性或功能 )。本发明特别涉及的是， 可针对某一活性或功 能来改变被修饰的蛋白质或多肽， 而在其它方面保留野生型活性或功能 ( 如免疫原性 )。
     在某些实施方案中， 蛋白质或多肽 ( 野生型或经修饰的 ) 的大小可以包括但不局 限于 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 450、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 625、 650、 675、 700、 725、 750、 775、 800、 825、 850、 875、 900、 925、 950、 975、 1000、 1100、 1200、 1300、 1400、 1500、 1750、 2000、 2250、 2500 个氨基分子或更多、 以及其中可得出的任何范围， 或者本文所述或所引用的对应氨基酸序列的衍生物。本发明还 涉及的是， 可通过截短 ( 使其短于相应的野生型形式 ) 来突变多肽， 也可通过融合或缀合具 有特定功能 ( 例如用于靶向或定位、 用于增强免疫原性、 用于纯化目的等 ) 的异源蛋白质序 列来改变多肽。
     本文使用的 “氨基分子” 是指本领域所知的任何氨基酸、 氨基酸衍生物或氨基酸模 拟物。 在某些实施方案中， 蛋白质性分子的残基是连续的， 没有任何非氨基分子间插氨基分 子残基的序列。在另一些实施方案中， 所述序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在一 些具体实施方案中， 蛋白质性分子的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分所间插。
     因此， 术语 “蛋白质性组合物” 包括氨基分子序列， 所述序列含有天然合成蛋白质 中 20 种常见氨基酸的至少一种或者至少一种经修饰的或非常见氨基酸。
     可采用本领域技术人员所知的任何技术来制造蛋白质性组合物， 所述技术包括 (i) 通过标准分子生物学技术表达蛋白质、 多肽或肽， (ii) 从天然来源中分离蛋白质性化 合物， 或 (iii) 化学合成蛋白质性材料。先前已经公开了多种基因的核苷酸及蛋白质、 多肽 和肽的序列， 还可以在公认的计算机化数据库中找到上述序列。其中一个数据库是国立生 物技术信息中心的 Genbank 和 GenPept 数据库 ( 网址为 ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文 公开的或为本领域普通技术人员所知的技术来扩增和 / 或表达这些基因的编码区。
     Emp 或 Eap 或 AdsA 以及下列本发明其它多肽的氨基酸序列变体可以是替换、 插入 或缺失变体 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。与野生型相比， 本发明 多肽的修饰可影响所述多肽的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500 或更多非连续或连续氨基 酸。
     本发明的抗原可包含本文所述抗原 (AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白 ) 的区段或片段， 其包含所述抗原的第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多 ( 包含其间所有值和范围 ) 位氨基酸至第 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多位氨基酸 ( 包含其间所有值和范 围 )， 包括其中所有区段和片段。 本发明的某些方面涉及结合上文所述一个或多个片段或区 段的抗体。
     缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质中的一个或多个残基。可以缺失单个残 基， 或者可以缺失多个连续的氨基酸。可将终止密码子 ( 通过替换或插入 ) 引入编码的核 酸序列中， 以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽非末端位点处加入物质。这 可包括插入一个或多个残基。还可产生末端添加， 称作 “融合蛋白” 。
     替换变体通常包含在蛋白质一个或多个位点处将一种氨基酸替换为另一种， 并可 被设计成调节多肽的一个或多个特性， 同时丢失或不丢失其它功能或特性。替换可以是保 守性的， 即将一种氨基酸替换成形状和电荷相似的氨基酸。 保守性替换为本领域所熟知， 包 括例如以下改变 ： 丙氨酸变为丝氨酸 ； 精氨酸变为赖氨酸 ； 天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨 酸； 天冬氨酸变为谷氨酸 ； 半胱氨酸变为丝氨酸 ； 谷氨酰胺变为天冬酰胺 ； 谷氨酸变为天冬 氨酸 ； 甘氨酸变为脯氨酸 ； 组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺 ； 异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨 酸； 亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸 ； 赖氨酸变为精氨酸 ； 甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸 ； 苯丙氨酸变为酪氨酸、 亮氨酸或甲硫氨酸 ； 丝氨酸变为苏氨酸 ； 苏氨酸变为丝氨酸 ； 色氨酸 变为酪氨酸 ； 酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸 ； 缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者， 替换可 以是非保守的， 从而影响多肽的功能或活性。非保守性改变通常包括将残基替换成化学性 质上不相似的残基， 如极性或带电氨基酸替换非极性或不带电氨基酸， 反之亦然。
     表 1. 金黄色葡萄球菌菌株的示例性表面蛋白质。
     39SAV# SpA FnBPA FnBPB ClfA ClfB Can SdrC SdrD SdrE Pls SasA SasB SasC SasD 241 2186 686 2481 213 241 2275 2271 2271 2481 2186 241 1141 1141 1141 1347 1385 1385 955 953 953 947 1315 1166 1183 907 877 877 913 873 1183 906 1137 1351 2222 2189 221 946 935 989 933 1029 943 961 961 965 1015 1038 1038 1015 957 928 905 1183 492 450 450 516 492SA#表面MW2Mu50N315NewmanMRSA252*MSSA476*SAV0111SA0107102333540 A CN 102333554SAV2503SA2291SAV2502SA2290SAV0811SA0742SAV2630SA2423Npnp说SAV0561SA0519957 1365 1141 2275 685 2186 241明40SAV0562SA0520书SAV0563SA0521NpnpSAV2654SA2447SAV2160SA1964SA1577SAV0134SA012929/86 页102333540 A CN 102333554说明书30/86 页
     SAV1130 41SA0977SasE/IsdA350350350354350
     SasF SasG SasH SasI SasJ/IsdB SasK SasL IsdC 227 227 232 227 198 211 211 645 645 645 895 891 891 772 772 1371 525 927 786 534 652 227 635 635 635 627 635 1371 786 895 645 197 227102333540 A CN 102333554SAV2646SA2439SAV2496SAV0023SA0022说SAV1731SA1552明本发明的蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者， 可以从细菌中分离出非重组 或重组的蛋白质。 还考虑可将含有上述变体的细菌应用于本发明的组合物和方法中。 因此， 不需要分离蛋白质。42SAV1129SA0976书SA2381NpSAV1131SA097831/86 页102333540 A CN 102333554
     说明书32/86 页本文中使用的术语 “功能等价密码子” 是指编码同一氨基酸的密码子 ( 如精氨酸 或丝氨酸的六个密码子 )， 也指编码生物学上等价之氨基酸的密码子 ( 见下面的表 2)。
     表 2 密码子表
     还应当理解， 氨基酸和核酸序列可包含额外的残基， 如分别为额外的 N 端或 C 端氨 基酸、 或 5′或 3′序列， 但仍然基本如本文公开的序列之一所示， 只要该序列满足上文设 定的标准 ( 包括保持与蛋白质表达相关的蛋白质生物活性 ) 即可。末端序列的添加特别适 用于核酸序列 ( 例如， 其可包含位于编码区 5′或 3′部分之侧翼的不同非编码序列 )。
     下文是基于改变蛋白质的氨基酸来产生等价或改进的第二代分子的讨论。例如， 蛋白质结构中的某些氨基酸可以替换为其它氨基酸， 而没有相互结合能力 ( 与例如抗体的 抗原结合区或底物分子上的结合位点之结构结合 ) 的明显损失。由于蛋白质的相互作用能 力和性质决定了蛋白质的生物学功能活性， 因此可在蛋白质序列 ( 及其 DNA 编码序列 ) 中 进行某些氨基酸替换， 而仍产生具有相似特性的蛋白质。因而， 本发明人考虑可在基因的 DNA 序列中进行多种改变， 而不导致其生物学应用和活性 ( 例如免疫原性 ) 的明显损失。
     进行这种改变时， 可考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质 以相互作用生物学功能中的重要性已为本领域所广泛了解 (Kyte 和 Doolittle、 1982)。为 人们所接受的是， 氨基酸的相对亲水性决定了产物蛋白质的二级结构， 其二级结构进而决 定了该蛋白质与其它分子 ( 例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等 ) 的相互作用。
     还为本领域所了解的是， 可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的替换。通过引 用并入本文的美国专利 4,554,101 陈述了蛋白质的最大局部平均亲水性 ( 由其邻近氨基酸 亲水性所决定 ) 与蛋白质的生物学特性相关。应理解的是， 氨基酸可以被替换为具有相似 亲水性值的其它氨基酸， 而仍产生生物学等价的或免疫学等价的蛋白质。
     如上所述， 氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性， 例如它们的
     疏水性、 亲水性、 电荷、 大小等。将前述多种特征考虑在内的示例性替换是众所周知的， 包 括： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 以及缬氨 酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
     本发明涉及的是， 在每 ml 本发明组合物中有约 0.001mg 至约 10mg 的总多肽、 肽和 / 或蛋白质。因此， 组合物中的蛋白质浓度可以是约、 至少约或至多约 0.001、 0.010、 0.050、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 9.5、 10.0μg 或 mg/ml 或更高 ( 或其中可得出的任何范 围 )。在其中， 约、 至少约或至多约 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100％可以是 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 并且可与本文所述其它多肽序列联用。
     本发明还公开了葡萄球菌抗原的组合， 当组合时， 其导致产生有效治疗或预防葡 萄球菌感染的免疫原性组合物。葡萄球菌感染经历几个不同阶段。例如， 葡萄球菌的生活 周期包含共生定殖， 通过进入邻近组织或血流起始感染， 在血液中厌氧性扩增， 金黄色葡萄 球菌毒力决定簇与宿主防御机制相互作用， 以及诱导并发症包括心内膜炎、 转移性脓肿形 成和败血症综合征。细菌表面上的不同分子参与了感染周期的不同阶段。某些抗原的组合 可引发免疫应答， 其针对葡萄球菌感染的多个阶段进行保护。可在动物模型测定中和 / 或 使用调理吞噬测定来测量免疫应答的效力。
     多肽和多肽产生
     本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、 肽和蛋白质及其免疫原性片段。 例如， 对特定多肽进行测定或用于引发免疫应答。 在一些具体实施方案中， 也可根据常规技 术在溶液中或在固体支持物上合成本发明蛋白质的全部或部分。 多种自动合成仪是可购得 的， 且可以根据已知的方案加以使用。参见例如 Stewart 和 Young(1984)、 Tam 等 (1983)、 Merrifield(1986)、 Barany 和 Merrifield(1979)， 其均通过引用并入本文。或者， 可使用重 组 DNA 技术， 其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体中， 转化或转染入合适的宿 主细胞并在适于表达的条件下培养细胞。
     本发明的一个实施方案包括利用转移至细胞 ( 包括微生物 ) 中的基因来产生和 / 或呈现蛋白质。可将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中， 接着在合适条件下培养 细胞。 可使用编码几乎任何多肽的核酸。 本文讨论了重组表达载体的产生及其包含的元件。 或者， 要生产的蛋白质可以是由用于蛋白质生产的细胞所正常合成的内源蛋白质。
     本发明的另一实施方案使用了自体 B 淋巴细胞细胞系， 所述细胞系转染有表达免 疫原产物 ( 更具体地为具有免疫原活性的蛋白质 ) 的病毒载体。哺乳动物宿主细胞系的其 它实例包括但不局限于 Vero 和 HeLa 细胞、 其它 B 和 T 细胞系 ( 如 CEM、 721.221、 H9、 Jurkat、 Raji)、 以及中国仓鼠卵巢细胞系、 W138、 BHK、 COS-7、 293、 HepG2、 3T3、 RIN 和 MDCK 细胞。此 外， 可选择调节插入序列表达的或以期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质 产物的这种修饰 ( 例如糖基化 ) 和加工 ( 例如切割 ) 可以对蛋白质功能是重要的。不同宿 主细胞在蛋白质的翻译后加工和修饰方面具有特征性的和特定的机制。 可选择合适的细胞 系或宿主系统来确保所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。可使用多种选择系统， 包括但不局限于分别位于 tk、 hgprt 或 aprt 细胞中的 HSV 胸苷激酶、 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、 腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外， 还可使 用抗代谢物抗性作为选择基础 ： dhfr 赋予对甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性 ； gpt 赋予对 霉酚酸的抗性 ； neo 赋予对氨基糖苷 G418 的抗性 ； hygro 赋予对潮霉素的抗性。
     动物细胞可以两种方式在体外增殖 ： 非锚着依赖性细胞， 其在整个培养物体积中 悬浮培养， 或者锚着依赖性细胞， 其需要附着在固体基底上进行增殖 ( 即单层类型的细胞 培养 )。
     来源于连续的已建立细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养物是大规模生产细胞和 细胞产物的最常用方法。 但是， 悬浮培养的细胞具有局限性， 例如致瘤潜力和低于附着细胞 的蛋白质产量。
     当本文具体提及蛋白质时， 优选表示天然或重组蛋白质， 或者任选地已去除任何 信号序列的蛋白质。所述蛋白质可直接从葡萄球菌菌株分离出来或者通过重组 DNA 技术产 生。蛋白质的免疫原性片段可并入本发明的免疫原性组合物中。它们是包含连续取自蛋白 质氨基酸序列的至少 10 个氨基酸、 20 个氨基酸、 30 个氨基酸、 40 个氨基酸、 50 个氨基酸或 100 个氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 的片段。另外， 此类免疫原性片段与针对葡萄球 菌蛋白产生的抗体或者与用葡萄球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体具有免疫反应性。 免疫 原性片段还包括当以有效剂量施用时 ( 单独地或作为结合运载体的半抗原 ) 引发针对葡萄 球菌感染之保护性免疫应答的片段， 在某些方面， 其具有针对金黄色葡萄球菌和 / 或表皮 葡萄球菌感染的保护作用。这些免疫原性片段可包含例如缺少 N 端前导序列和 / 或跨膜结 构域和 / 或 C 端锚定结构域的蛋白质。在一个优选方面中， 本发明的免疫原性片段包含与 片段序列长度上所选序列有至少 85％同一性、 至少 90％同一性、 至少 95％同一性或者至少 97-99％同一性 ( 包括其间所有值和范围 ) 的蛋白质的基本上全部的细胞外结构域。
     本发明的免疫原性组合物还包含由葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白免疫原性片段 组成的融合蛋白。这些融合蛋白可以通过重组产生， 可包含至少 2、 3、 4、 5 或 6 种葡萄球菌 蛋白的一部分。或者， 融合蛋白可包含至少 1、 2、 3、 4 或 5 种葡萄球菌蛋白的多个部分。它 们可在同一蛋白质中组合不同的葡萄球菌蛋白和 / 或多个相同的蛋白质或蛋白质片段或 者其免疫原性片段。 或者， 本发明还包括葡萄球菌蛋白或其免疫原性片段的各个融合蛋白， 所述融合蛋白具有异源序列， 例如提供 T- 细胞表位或纯化标签 ( 例如 ： β- 半乳糖苷酶、 谷 胱甘肽 -S- 转移酶、 绿色荧光蛋白 (GFP))、 表位标签 ( 例如 FLAG、 myc 标签、 多组氨酸 ) 或 者病毒表面蛋白质 ( 例如流感病毒血细胞凝集素 ) 或细菌蛋白质 ( 例如破伤风类毒素、 白 喉类毒素和 CRM197)。
     治疗方法
     使用疫苗进行主动免疫和使用免疫球蛋白进行被动免疫是替代经典小分子 ( 例 如抗生素 ) 治疗的具有前景的方案。曾经造成大范围疾病、 残疾和死亡的一些细菌性疾病 如今可以通过使用疫苗进行预防。疫苗是基于削弱 ( 减毒 ) 或死亡的细菌、 细菌表面的组 分或失活的毒素。疫苗产生的免疫应答主要涉及免疫原性结构 ； 由免疫系统主动加工的细 菌上有限数目的蛋白质或糖结构。
     本发明的方法包括治疗由细菌性病原体 ( 例如葡萄球菌或芽胞杆菌 ) 引起或与其 有关的疾病或病症。免疫原性多肽和 / 或与其结合的抗体可用于在感染细菌或怀疑暴露于细菌的人中诱导或提供治疗性应答。 该方法可用于经测试为暴露于葡萄球菌或芽胞杆菌呈 阳性的个体， 或者用于根据可能的暴露被认定为具有感染风险的个体。
     本发明涵盖了葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的治疗方法。特别 地， 本发明涵盖了细菌感染 ( 特别是菌血症 ) 的治疗方法。本发明的治疗性组合物和疫苗 对于非紧急手术 (elective surgery) 来说是特别有利的。这些患者预先知晓手术的日期， 因此可预先进行接种或治疗。本发明的免疫原性组合物和疫苗对于接种医疗工作者、 第一 急救者 (first responder) 等也是有利的。
     在一些实施方案中， 所述治疗在佐剂或运载体或其它葡萄球菌抗原存在下施用。 此外， 在某些实例中， 治疗包括施用常用于抗细菌感染的其它药剂， 例如一种或多种抗生 素。
     A. 疫苗
     本发明包括预防或减轻葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的方法。 因此， 本发明涉及在主动和被动免疫的实施方案中使用的疫苗。被认为适合用作疫苗的免 疫原性组合物可以从免疫原性 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽 ( 例如全长的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原或其免疫原性片段 ) 制备。在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与其 它分泌型毒力蛋白、 表面蛋白或其免疫原性片段联合使用， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白或者本领域技术人员已知的其它葡萄球菌抗原、 肽或蛋白质 )。优选地， 将抗原性 材料充分透析以去除不需要的小分子量分子， 和 / 或冻干以更容易配制进期望的运载体。
     对基于蛋白质 / 肽的疫苗而言其它可行且重要的替代方案包括引入编码抗原的 核酸作为 DNA 疫苗。就这一点而言， 近期的报道描述了构建重组痘苗病毒， 并成功使用此类 构建体免疫小鼠， 用于引发保护性免疫应答， 所述重组痘苗病毒表达 10 个连续最小 CTL 表 位 (Thomson， 1996) 或者来自几种微生物的 B 细胞、 细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 和 T 辅助细胞 (Th) 表位的组合 (An， 1997)。因此， 对成功利用肽、 肽冲击 (peptide-pulsed) 抗原呈递细 胞 (APC) 和编码肽之构建体在体内有效引发保护性免疫应答已在文献中有充分的证据。美 国专利 5,958,895 和 5,620,896 中示例了使用核酸序列作为疫苗， 其每个通过引用以整体 并入本文。
     包含多肽或肽序列作为活性成分的疫苗的制备一般为本领域所充分理解， 如美国 专利 4,608,251、 4,601,903、 4,599,231、 4,599,230、 4,596,792 和 4,578,770 所示例， 所述 专利都通过引用并入本文。 这种疫苗通常以注射剂 ( 作为液体溶液或混悬液 ) 的形式制备 ； 还可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂也可以被乳化。活性免疫原性成分通常与可药用并与活性成分相容的赋形剂相混合。合适的赋形剂为例如水、 盐 溶液、 右旋糖、 甘油、 乙醇等， 及其组合。此外， 如有需要， 疫苗可含有一定量的辅助性物质， 如润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲剂或者增强疫苗效力的佐剂。 在一些具体实施方案中， 疫苗与多 种物质的组合一起进行配制， 如通过引用并入本文的美国专利 6,793,923 和 6,733,754 中 所述的。
     疫苗可常规地通过吸入和 / 或胃肠外注射 ( 例如皮下注射或肌内注射 ) 来施用。 适用于其它施用方式的另外制剂包括栓剂， 以及在某些情况下的口服制剂。 对于栓剂， 传统 粘合剂和运载体可包括例如聚亚烷基二醇 (polyalkalene glycol) 或甘油三脂 ； 这些栓剂 可由含有活性成分 ( 范围为约 0.5％至约 10％， 优选约 1％至约 2％ ) 的混合物形成。口服 制剂包含常用的赋形剂， 例如药用级的甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 纤维素、 碳酸 镁等。 这些组合物采用溶液、 混悬液、 片剂、 丸剂、 胶囊、 持续释放制剂或粉末剂的形式， 包含 约 10％至约 95％ ( 优选约 25％至约 70％ ) 的活性成分。
     多肽、 肽和编码肽之 DNA 构建体可以配制成中性或盐形式的疫苗。可药用的盐包 括酸加成盐 ( 由肽的游离氨基形成 ) 和与无机酸 ( 例如盐酸或磷酸 ) 或有机酸 ( 例如乙 酸、 草酸、 酒石酸、 杏仁酸等 ) 形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱 ( 例如氢氧 化钠、 氢氧化钾、 氢氧化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 和有机碱 ( 例如异丙胺、 三甲胺、 2- 乙胺 基乙醇、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     疫苗一般以与药剂剂型相匹配的方式、 以能够有效治疗和产生免疫的量来施用。 施用量取决于待治疗的对象， 包括个体免疫系统合成抗体的能力和所需的保护程度。需要 施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。但是， 合适的剂量范围为每次免疫几百微克 活性成分的数量级。初次施用和加强免疫的合适方案也是可变的， 但一般为初次施用之后 再进行后续接种或其它施用。
     应用的方式可以是多种多样的。疫苗施用的任何常规方法都是可应用的。这些方 法应包括利用生理学可接受的固体基质口服应用， 或者作为生理学可接受的分散体系以肠 胃外、 通过注射等来施用。 疫苗的剂量取决于施用途径， 且根据对象的体形和健康状况而变 化。
     在许多情形中， 需要多次施用疫苗， 通常至多、 至少或不超过六次疫苗接种， 更通 常四次疫苗接种， 通常一次或多次、 经常至少约三次疫苗接种。 疫苗接种一般间隔 1、 2、 3、 4、 5、 6 至 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 至 12 周， 包括其间所有值和范围， 更通常为间隔 3 至 5 周。通常， 间隔 1 ～ 5 年 ( 通常为 3 年 ) 进行定期加强免疫可维持保护性抗体的水平。在免疫过程之 后可测定针对该抗原的抗体， 如上文所述， 美国专利 3,791,932、 4,174,384 和 3,949,064 是 这些类型测定的示例。
     用于免疫之肽的使用通常需要所述肽与免疫原性运载体蛋白 ( 例如乙型肝炎表 面抗原、 匙孔槭血蓝蛋白或牛血清白蛋白 ) 或佐剂相缀合。实施此缀合的方法是本领域公 知的。
     1. 运载体
     给定的组合物的免疫原性可能有所不同。因此往往有必要加强宿主的免疫系统， 这可通过将肽或多肽偶联至运载体来实现。运载体包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白 (KLH) 和 牛血清白蛋白 (BSA)。其它白蛋白如卵白蛋白、 小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作运载体。 将多肽缀合到运载体蛋白的手段为本领域所熟知， 包括戊二醛、 间马来酰亚胺苯甲 酰 -N- 羟基琥珀酰亚胺酯、 碳二亚胺和双重氮联苯胺。
     2. 佐剂
     可通过使用免疫应答的非特异性刺激剂 ( 称为佐剂 ) 来增强多肽或肽组合物的免 疫原性。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物， 如细胞因子、 毒素或合成组合物。
     多种佐剂可用于增强抗体针对 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 肽或本文所述任何其它抗原 的应答。在另一些方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 肽 或蛋白质联用。佐剂可 (1) 滞留体内的抗原使其缓慢释放 ； (2) 将参与免疫应答的细胞吸 引到施用部位 ； (3) 诱导免疫系统细胞的增殖或活化 ； 或 (4) 促进抗原在对象整个身体中的 扩散。
     佐剂包括但不局限于水包油乳剂、 油包水乳剂、 矿物盐、 多核苷酸和天然物质。可 使用的具体佐剂包括 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-7、 IL-12、 γ- 干扰素、 GMCSP、 BCG、 铝盐 ( 例如氢 氧化铝或其它铝化合物 )、 MDP 化合物 ( 如 thur-MDP 和 nor-MDP)、 CGP(MTP-PE)、 脂质 A 和 单磷酰脂质 A(MPL)。也可使用 RIBI， 其包含在 2％角鲨烯 / 吐温 80 乳剂中的三种从细菌中 提取的组分——MPL、 海藻糖二分枝酸酯 (trehalose dimycolate， TDM) 和细胞壁骨架 (cell wall skeleton， CWS)。还可使用 MHC 抗原。其它佐剂或方法示例于美国专利 6,814,971、 5,084,269、 6,656,462， 其均通过引用并入本文。
     对疫苗实现佐剂效应的多种方法包括使用制剂如氢氧化铝或磷酸铝 ( 明矾 )， 通常以磷酸盐缓冲液中约 0.05 ％至约 0.1 ％的溶液使用， 其与以约 0.25 ％溶液使用的合 成多聚糖 (Carbopol ) 混合， 通过以约 70 ℃至约 101 ℃的温度分别热处理 30 秒至 2 分 钟来聚集疫苗中的蛋白质。还可采用以下方法来产生佐剂效应 ： 通过用胃蛋白酶处理的 (Fab) 白蛋白抗体的再次活化进行聚集 ； 与革兰氏阴性菌的细菌细胞 ( 例如短小棒状杆 菌 (C.parvum))、 内毒素或脂多糖组分混合 ； 在生理学可接受的油介质 ( 例如二缩甘露醇 一油酸 (Aracel A)) 中乳化 ； 或用作为封闭替代物 (block substitute) 的 20％全氟化碳 (Fluosol-DA ) 溶液乳化。
     常见佐剂包括弗氏完全佐剂 ( 包含灭活的结核分枝杆菌的免疫应答非特异性刺 激物 )、 弗氏不完全佐剂和氢氧化铝。
     在一些方面中， 优选地选择佐剂为 Th1 或 Th2 型应答的优先诱导物。高水平 Th1 型细胞因子倾向于偏好诱导针对给定抗原的细胞介导之免疫应答， 而高水平 Th2 型细胞因 子则倾向于偏好诱导针对抗原的体液免疫应答。
     Th1 和 Th2 型免疫应答的区别不是绝对的。实际上， 个体支持称为主要 Th1 或主 要 Th2 的免疫应答。但是， 常常方便地以 Mosmann 和 Coffman 在鼠 CD4+T 细胞克隆中所述 的形式定义细胞因子家族 (Mosmann 和 Coffman， 1989)。传统上， Th1 型应答与 T 淋巴细胞 产生 INF-γ 和 IL-2 细胞因子有关。经常直接与 Th1 型免疫应答诱导相关的其它细胞因子 ( 例如 IL-12) 不由 T 细胞产生。相比之下， Th2 型应答与 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10 的分泌 有关。
     除 了 佐 剂 之 外， 还 可 能 需 要 共 施 用 生 物 应 答 调 节 剂 (biologic response modifier， BRM) 来增强免疫应答。BRM 已显示能够上调 T 细胞免疫或下调细胞活性抑制剂。这些 BRM 包括但不局限于西咪替丁 (CIM ； 1200mg/ 天 )(Smith/Kline， PA) 或低剂量的环磷 2 酰胺 (CYP ； 300mg/m )(Johnson/Mead， NJ) 和细胞因子如 γ- 干扰素、 IL-2 或 IL-12， 或编码 参与免疫辅助功能之蛋白质 ( 如 B-7) 的基因。
     B. 抗体和被动免疫
     直接施用治疗性免疫球蛋白 ( 也称为 “被动免疫” ) 不需要来自患者的免疫应答， 因此给予即时的保护。另外， 被动免疫可针对并非免疫原性以及对于生物体来说特异性较 低的细菌结构。针对致病生物的被动免疫已基于来源于人或非人供体血清的免疫球蛋白。
     本发明的一个方面是制备用于预防或治疗葡萄球菌感染之免疫球蛋白的方法， 其 包括用本发明的疫苗免疫接受者以及从接受者分离免疫球蛋白或抗体的步骤。 此方法制备 的免疫球蛋白是本发明的另一个方面。 包含本发明免疫球蛋白和可药用运载体的药物组合 物是本发明又一个方面， 其可用于制备治疗或预防葡萄球菌疾病的药物。治疗或预防葡萄 球菌感染的方法是本发明的另一个方面， 其包括向患者施用有效量之本发明药物制剂的步 骤。
     用于产生多克隆抗体的接种物通常通过在生理耐受稀释剂 ( 例如盐水或其它适 于人使用的佐剂 ) 中分散抗原组合物以形成水性组合物来制备。向哺乳动物施用免疫激 活量的接种物， 然后使被接种的哺乳动物维持足以使得抗原组合物诱导出保护性抗体的时 间。可通过公知技术 ( 例如亲和色谱 ) 将抗体分离到所需的程度 (Harlow 和 Lane， 1988)。
     抗体可包括来自多种常用动物 ( 例如山羊、 灵长类动物、 驴、 猪、 马、 豚鼠、 大鼠或 人 ) 的抗血清制备物。对动物取血并回收血清。
     根据本发明产生的免疫球蛋白可包括完整抗体、 抗体片段或子片段。抗体可以是 完整的免疫球蛋白、 针对本发明两种或更多种抗原具有双特异性的嵌合抗体或杂合抗体。 它们也可以是片段， 例如 F(ab′ )2、 F(ab′ )、 Fab、 Fv 等， 包括杂合片段。免疫球蛋白还包 括天然、 合成或经遗传改造的蛋白质， 其通过结合特异性抗原形成复合物而如抗体一样起 作用。本文使用的术语 “免疫球蛋白” 包括本领域已知的所有免疫球蛋白类型和亚型， 包括 IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 及其亚型 ( 同种型 )， 例如 IgA1、 IgA2、 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgG4。 优选地， 本发明的免疫球蛋白是人免疫球蛋白。 另外， 还包括包含免疫球蛋白片段的抗原结 合结构与和 / 或可变结构域。抗原结合片段包括 Fab、 F(ab′ )、 F(ab′ )2、 Fv、 dAb、 Fd、 互 补决定区 (CDR) 片段、 单链抗体 (scFv)、 二价单链抗体、 单链噬菌体抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 含有至少足以赋予该 ( 多 ) 肽以特异性抗原结合之免疫球蛋白片段的 ( 多 ) 肽， 等 等。
     本发明抗原之组合物或疫苗可施用给接受者， 其随后作为应答于来自特异性疫苗 之攻击而产生的免疫球蛋白的来源。因此， 所治疗的对象可捐赠血浆， 从其中可通过常规 血浆分级分离方法获得超免疫球蛋白。可将超免疫球蛋白施用给另一个对象， 以赋予针对 葡萄球菌感染的抗性或者对其进行治疗。 本发明的超免疫球蛋白特别可用于治疗或预防婴 儿、 免疫缺陷个体的葡萄球菌疾病， 或者在需要治疗但没有时间让个体应答于疫苗接种而 产生抗体的情况下用于治疗或预防葡萄球菌疾病。
     本发明的另一个方面是包含一种或多种单克隆抗体 ( 或其片段 ； 优选人的或人源 化的 ) 的药物组合物， 所述抗体与本发明免疫原性组合物的成分具有反应性， 所述药物组 合物可用于治疗或预防革兰氏阳性细菌 ( 优选葡萄球菌， 更优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌 ) 的感染。这些药物组合物包含单克隆抗体， 其可以是与本发明抗原具有特异性的 任何类型的完整免疫球蛋白， 例如 IgG、 IgM、 IgA、 IgD 或 IgE、 嵌合抗体或杂合抗体。它们也 可以是片段， 例如 F(ab′ )2、 Fab′、 Fab、 Fv 等， 包括杂合片段。
     制备单克隆抗体的方法是本领域公知的， 可包括将脾细胞与骨髓瘤细胞的融合 (Kohler 和 Milstein， 1975 ； Harlow 和 Lane， 1988)。或者， 可通过筛选合适的噬菌体展示文 库获得单克隆 Fv 片段 (Vaughan 等， 1998)。单克隆抗体可以是人的、 通过已知方法人源化 的或部分人源化的。
     C. 联合治疗
     本发明的组合物和相关方法 ( 特别是向患者 / 对象施用葡萄球菌抗原 ) 也可 与传统治疗的施用联合使用， 所述葡萄球菌抗原包括 Emp、 AdsA 和 / 或 Eap 的多肽或肽 以及下列一种或多种肽或蛋白质 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。这些包括但 不限于 ： 抗生素的施用， 例如链霉素、 环丙沙星、 强力霉素、 庆大霉素、 氯霉素、 三甲氧苄二氨 嘧啶、 磺胺甲恶唑、 氨苄青霉素、 四环素或不同抗生素组合。 在一个方面中， 设想多肽疫苗和 / 或治疗与小分子或非肽类 AdsA 活性抑制剂联合使用。
     在一方面中， 本发明涉及的是， 多肽疫苗和 / 或疗法与抗菌治疗联合使用。或者， 所述疗法可在其它制剂治疗之前或之后， 间隔数分钟至数周。在单独施用其它制剂和 / 或 蛋白质或多核苷酸的实施方案中， 一般应确保每次递送之间的时间不会过长， 以便所述制 剂和抗原组合物仍能对对象发挥有利的组合疗效。 在这些情形中， 本发明涉及的是， 可在约 12-24 小时之内 ( 更优选地在约 6 ～ 12 小时之内 ) 施用两种疗法。然而， 在一些情况下， 可 能期望显著延长施用的时间， 这时在各次施用之间间隔几天 (2、 3、 4、 5、 6 或 7) 到几周 (1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8)。
     可采用不同组合， 例如抗生素疗法为 “A” ， 作为免疫疗法方案一部分给予的免疫原 性分子或抗体 ( 如抗原或 AdsA 调节剂 ) 为 “B” ：
     A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
     B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
     B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
     向患者 / 对象施用本发明免疫原性组合物应遵从施用这些化合物的一般方案， 其中考虑 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 组合物或本文所述任何其它抗原组合物或抗原组合的毒 性 ( 如果有的话 )。预计可根据需要重复治疗周期。还涉及的是， 多种标准疗法如水疗 (hydration) 可与所述疗法组合应用。III. 药物组合物
     在一些实施方案中， 向对象施用药物组合物。本发明的不同方面包括向对象施用 有效量的组合物。在本发明的一些实施方案中， 可向患者施用 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原并 与 Ess 途径成员 ( 包括 Esa 或 Esx 类的多肽或肽 ) 和 / 或分选酶底物成员和 / 或分泌型毒 力因子和或多糖联用， 以保护其免受一种或多种葡萄球菌病原体的感染或者进行治疗。或 者， 可将编码一种或多种这种多肽或肽的表达载体给予患者， 作为预防性治疗。此外， 这些 化合物可与抗生素联用。这些组合物一般可溶解或分散在可药用的运载体或含水介质中。
     本文使用的术语 “可药用” 是指在安全的医学判断范围内适于接触人体和动物组 织并且没有过度毒性、 刺激性、 变态反应或其它问题并发症且具有合理之益处 / 风险比的 化合物、 物质、 组合物和 / 或剂型。术语 “可药用运载体” 表示参与携带或运送化学物质的可 药用的材料、 组合物或介质， 例如液体或固体填充剂、 稀释剂、 赋形剂、 溶剂或包封材料。可 药用运载体包括任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延 迟剂等。这些针对药物活性物质的介质和制剂的用途为本领域所熟知。考虑在免疫原性和 治疗性组合物中使用任何常规介质或制剂， 除非其与活性成分不相容。还可将补充性活性 成分 ( 如其它抗菌剂 ) 掺入组合物中。
     除了配制成肠胃外施用的化合物 ( 如用于静脉内注射或肌内注射的那些 )， 其它 可药用的形式包括例如用于口服施用的片剂或其它固体 ； 缓释胶囊 ； 以及目前所用的其它 任何形式， 包括霜剂、 洗剂、 漱口剂、 吸入剂等。
     可将本发明的活性化合物配制成用于肠胃外施用， 例如配制成用于静脉内、 肌内、 皮下或腹膜内途径的注射。
     可在与表面活性剂 ( 如羟丙基纤维素 ) 适当混合的水中， 制备以游离碱或可药用 盐的形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、 液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制 备分散体系。在普通的储藏和使用条件下， 这些制备物含有防止微生物生长的防腐剂。
     适于注射使用的药用形式包括无菌水溶液或分散体系 ； 包括芝麻油、 花生油或含 水丙二醇的制剂 ； 用于即时制备无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末剂。 在所有情况下， 剂 型必须是无菌的， 而且必须达到可容易注射的流动程度。它还应当在加工和储藏条件下是 稳定的， 而且应当免受微生物 ( 如细菌和真菌 ) 的污染作用。
     可将蛋白质性组合物配制成中性或盐形式。可药用的盐包括酸加成盐 ( 由蛋白质 的游离氨基形成 ) 和由无机酸 ( 例如盐酸或磷酸 ) 或有机酸 ( 例如乙酸、 草酸、 酒石酸、 扁 桃酸等 ) 形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱 ( 例如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧 化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 和有机碱 ( 例如异丙胺、 三甲胺、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     运载体也可以是溶剂或分散介质， 其含有例如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如甘油、 丙二 醇和液体聚乙二醇等 )、 其合适的混合物以及植物油。可通过例如使用包衣 ( 如卵磷脂 )、 通过维持所需的粒径 ( 对于分散体系的情况 ) 以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动 性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂 ( 例如对羟苯甲酸酯类、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸、 硫柳汞 等 ) 来实现对微生物作用的预防。在许多情况下， 可优选包括等渗剂， 例如糖或氯化钠。可 通过在组合物中使用延迟吸收剂 ( 例如单硬脂酸铝和明胶 ) 来实现对注射组合物的延长吸 收。
     通过将所需量的活性化合物掺入具有上面所列举的多种成分的合适溶剂中来制备无菌注射溶液， 根据需要再进行过滤除菌。 一般地， 通过将多种无菌活性成分掺入无菌运 载体 ( 其含有基本分散介质和所需的其它上面所列举的成分 ) 来制备分散体系。对用于制 备无菌注射液的无菌粉末剂而言， 优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术， 由预先经 过滤除菌的溶液产生活性成分和所有其它所需成分的粉末剂。
     本发明组合物的施用通常可经由任何常见的途径。这包括但不局限于口服、 经鼻 或含服施用。或者， 可通过原位、 皮内、 皮下、 肌内、 腹膜内、 鼻内或静脉内施用来施用。在 某些实施方案中， 可吸入疫苗组合物 ( 例如美国专利 6,651,655， 其通过引用具体并入本文 中 )。 这些组合物通常作为可药用的组合物 ( 含有生理学可接受的运载体、 缓冲剂或其它赋 形剂 ) 来施用。
     就水溶液的肠胃外施用而言， 例如， 必要时可适当地缓冲溶液， 而且液体稀释剂应 首先用足量的盐水或葡萄糖进行等渗处理。 这些特定的水溶液特别适于静脉内、 肌内、 皮下 和腹膜内施用。 在这一点上， 根据本公开内容， 可采用的无菌含水介质为本领域技术人员所 知。例如， 可将一剂药物溶于等渗 NaCl 溶液中， 并且加入到皮下输液中或注射到建议的输 注位点 ( 参见例如， Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 1990)。根据对象的身体状 况， 剂量有必要发生一些改变。不管怎样， 负责施用的人会决定个体对象的合适剂量。
     治疗性或预防性组合物的有效量基于预期目标来确定。 术语 “单位剂量” 或 “剂量” 是指适于对象中使用的物理上分离的单位， 每个单位包含为产生上述与其施用 ( 即适当途 径和方案 ) 相关的预期应答而计算得出的组合物预定量。所要施用的量 ( 根据治疗次数和 单位剂量 ) 取决于期望的保护作用。
     组合物的精确剂量也取决于医生的判断， 且为特定针对每个个体的。影响给药的 因素包括对象的身体和临床状态、 施用途径、 治疗的预期目标 ( 减轻症状还是治愈 ) 以及特 定组合物的效力、 稳定性和毒性。
     制备后， 将以与给药剂型相匹配的方式、 以有效治疗或预防的量来施用溶液。 可容 易地以多种剂型 ( 如上文所述的注射液类型 ) 来施用制剂。
     体外、 离体或体内施用
     本文所用的术语 “体外施用” 是指对从动物中取出的或在动物体外的细胞 ( 包括 但不局限于培养中的细胞 ) 进行操作。术语 “离体施用” 是指将已在体外进行了操作的细 胞随后施用于活的动物。术语 “体内施用” 包括在动物体内进行的所有操作。
     在本发明的某些方面中， 可通过体外、 离体或体内施用组合物。在某些体外实施 方案中， 将自体 B 淋巴细胞细胞系与本发明的病毒载体孵育 24 ～ 48 小时， 或与 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 和 / 或 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 vWa、 Coa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白 ( 或其任何组合 ) 一起孵 育。经转导的细胞接着可用于体外分析， 或用于离体施用。
     通过引用并入本文的美国专利 4,690,915 和 5,199,942 公开了离体操作血液单核 细胞和骨髓细胞用于治疗性应用的方法。
     脂质组分和部分
     在某些实施方案中， 本发明涉及包含一种或多种与核酸或多肽 / 肽结合之脂质的 组合物。脂质是不溶于水且可用有机溶剂萃取的物质。本领域技术人员了解除了本文具体 描述的那些之外的脂质化合物， 并且其涵盖在本发明的组合物和方法中。脂质组分和非脂 质可以共价或非共价地彼此相连。
     脂质可以是天然脂质或合成脂质。但是， 脂质通常是生物物质。生物脂质是本领 域中公知的， 包括例如中性脂、 磷脂、 磷酸甘油酯、 类固醇、 萜烯、 溶血脂类、 鞘糖脂、 糖脂、 硫 酸酯、 具有醚和酯连接之脂肪酸的脂类以及多聚化脂质， 及其组合。
     与脂质相结合的核酸分子或多肽 / 肽可分散在含有脂质的溶液中， 溶于脂质中， 被脂质乳化， 与脂质混合， 与脂质化合， 与脂质共价键合， 作为悬浮物包含在脂质中或者以 其它方式与脂质相关联。本发明的脂质相关组合物不限于任何特定结构。例如， 它们还可 简单地散布于溶液中， 可能形成大小或形状都不均一的聚集体。在另一实例中， 它们可以 双层结构存在、 以胶束形式存在或者具有 “瓦解的” 结构。在另一非限制性实例中， 还考虑 lipofectamine(Gibco BRL) 或 Superfect(Qiagen) 复合物。
     在某些实施方案中， 组合物可包含约 1％、 约 2％、 约 3％、 约 4％、 约 5％、 约 6％、 约 7％、 约 8％、 约 9％、 约 10％、 约 11％、 约 12％、 约 13％、 约 14％、 约 15％、 约 16％、 约 17％、 约 18 ％、 约 19 ％、 约 20 ％、 约 21 ％、 约 22 ％、 约 23 ％、 约 24 ％、 约 25 ％、 约 26 ％、 约 27 ％、 约 28 ％、 约 29 ％、 约 30 ％、 约 31 ％、 约 32 ％、 约 33 ％、 约 34 ％、 约 35 ％、 约 36 ％、 约 37 ％、 约 38 ％、 约 39 ％、 约 40 ％、 约 41 ％、 约 42 ％、 约 43 ％、 约 44 ％、 约 45 ％、 约 46 ％、 约 47 ％、 约 48 ％、 约 49 ％、 约 50 ％、 约 51 ％、 约 52 ％、 约 53 ％、 约 54 ％、 约 55 ％、 约 56 ％、 约 57 ％、 约 58 ％、 约 59 ％、 约 60 ％、 约 61 ％、 约 62 ％、 约 63 ％、 约 64 ％、 约 65 ％、 约 66 ％、 约 67 ％、 约 68 ％、 约 69 ％、 约 70 ％、 约 71 ％、 约 72 ％、 约 73 ％、 约 74 ％、 约 75 ％、 约 76 ％、 约 77 ％、 约 78 ％、 约 79 ％、 约 80 ％、 约 81 ％、 约 82 ％、 约 83 ％、 约 84 ％、 约 85 ％、 约 86 ％、 约 87 ％、 约 88％、 约 89％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或其间任何范围的特定脂质、 脂质类型或者非脂质组分 ( 例如佐剂、 抗原、 肽、 多肽、 糖、 核酸或者本文公开的或本领域技术人员已知的其它物质 )。在一个非限制性实例 中， 组合物可包含约 10％至约 20％的中性酯， 以及约 33％至约 34％的脑苷脂和约 1％的胆 固醇。在另一非限制性实例中， 脂质体可包含约 4％至约 12％的萜烯， 其中约 1％的胶束具 体地是番茄红素， 剩余约 3％至约 11％的脂质体包含其它萜烯 ； 以及约 10％至约 35％的磷 脂酰胆碱， 和约 1％的非脂质组分。因此， 设想本发明的组合物可包含任何组合或百分比范 围的任何脂质、 脂质类型或其它组分。
     IV. 多糖
     本发明的免疫原性组合物还可包含荚膜多糖， 包括下列一种或多种 ： PIA( 也称为 PNAG) 和 / 或金黄色葡萄球菌 V 型和 / 或 VIII 型荚膜多糖和 / 或表皮葡萄球菌 I 型和 / 或 II 型和 / 或 III 型荚膜多糖。A.PIA(PNAG)
     现在知道， 鉴定为 PS/A、 PIA 和 SAA 的多种形式葡萄球菌表面多糖是同一化学实 体—— PNAG(Maira-Litran 等， 2004)。因此， 术语 PIA 或 PNAG 涵盖所有这些多糖或衍生自 它们的寡糖。
     PIA 是 多 糖 细 胞 间 粘 附 素， 其 由 N- 乙 酰 基 和 O- 琥 珀 酰 基 成 分 取 代 的 β-(1 → 6)- 连接葡糖胺组成。 此多糖在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都存在， 并可从 任一来源中分离出来 (Joyce 等， 2003 ； Maira-Litran 等， 2002)。例如， PNAG 可分离自金黄 色葡萄球菌 MN8m 株 (WO04/43407)。分离自表皮葡萄球菌的 PIA 是生物膜的整合成分。它 负责介导细胞 - 细胞粘附， 可能也发挥为生长的群落屏蔽宿主免疫应答的功能。
     先前称为聚 -N- 琥珀酰 -β-(1 → 6)- 葡糖胺 (PNSG) 的多糖最近显示出不具有预 期的结构， 这是因为对 N- 琥珀酰基化的鉴定是不正确的 (Maira-Litran 等， 2002)。因此， 之前称为 PNSG 现在被称为 PNAG 的多糖也涵盖在术语 PIA 中。PIA( 或 PNAG) 可具有不同的 大小， 从超过 400kDa 到 75 ～ 400kDa 到 10 ～ 75kDa 到最多由 30 个重复单位 (N- 乙酰基和 O- 琥珀酰基组分取代的 β-(1 → 6)- 连接的葡糖胺 ) 组成的寡糖不等。任何大小的 PIA 多 糖或寡糖都可用于本发明的免疫原性组合物中， 但是优选超过 40kDa 的大小。可通过本领 域已知的任何方法实现大小的调整， 例如微流化 (microfluidization)、 超声照射或化学切 割 (WO 03/53462、 EP497524、 EP497525)。PIA(PNAG) 的优选大小范围是 40 ～ 400kDa、 40 ～ 300kDa、 50 ～ 350kDa、 60 ～ 300kDa、 50 ～ 250kDa 和 60 ～ 200kDa。
     由于乙酸酯对氨基的取代， PIA(PNAG) 可具有不同程度的乙酰化。体外产生的 PIA 在氨基上几乎完全被取代 (95 ～ 100 ％ )。或者， 可使用具有少于 60 ％、 优选少于 50 ％、 40％、 30％、 20％、 10％乙酰化的脱乙酰化 PIA(PNAG)。脱乙酰化 PIA(PNAG) 的使用是优选 的， 因为 PNAG 的非乙酰化表位在介导调理素杀伤革兰氏阳性细菌 ( 优选金黄色葡萄球菌和 / 或表皮葡萄球菌 ) 方面是高效的。最优选地， PIA(PNAG) 具有 40kDa 至 300kDa 的大小， 并 且是脱乙酰化的， 从而少于 60％、 50％、 40％、 30％或 20％的氨基是乙酰化的。 术语 “脱乙酰 化 PNAG(dPNAG)” 是指 PNAG 多糖或寡糖， 其中少于 60％、 50％、 40％、 30％、 20％或 10％的氨 基是乙酰化的。
     在一个实施方案中， 通过化学处理天然多糖使得 PNAG 脱乙酰化形成 dPNAG。 例如， 用碱溶液处理天然 PNAG， 使得 pH 升高至 10 以上。例如， 用 0.1 ～ 5M、 0.2 ～ 4M、 0.3 ～ 3M、 0.5 ～ 2M、 0.75 ～ 1.5M 或 1M 的 NaOH、 KOH 或 NH4OH 处理 PNAG。在 20 ～ 100、 25 ～ 80、 30 ～ 60 或 30 ～ 50 或 35 ～ 45℃下处理至少 10 ～ 30 分钟， 或者 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15 或 20 个小时。 dPNAG 可如 WO 04/43405 所述制备。
     本发明免疫原性组合物中包含的多糖优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非 缀合的。
     B. 来自葡萄球菌的 5 型和 8 型多糖
     大多数在人体中造成感染的金黄色葡萄球菌含有 5 型或 8 型多糖。约 60％的人 菌株是 8 型， 约 30 ％的是 5 型。5 型和 8 型荚膜多糖抗原的结构由 Moreau 等 (1990) 和 Fournier 等 (1984) 所描述。两者都在重复单元中具有 FucNAcp 以及可用于引入巯基的 ManNAcA。据报道， 其结构为 ：
     5 型 → 4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1 → 4)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
     8 型 → 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNA 最近 (Jones， 2005)， NMR 谱将结构修正为 ： 5 型 → 4)-β-D-ManNAcA-(1 → 4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
     c-(1 → 8 型→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-α-D-FucNAc(1 →
     可使用已知方法 ( 美国专利 6,294,177) 从合适的金黄色葡萄球菌菌株提取多糖。 ATCC 12902 是 5 型金黄色葡萄球菌菌株， ATCC 12605 是 8 型金黄色葡萄球菌菌株。
     多糖具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学处理改变其大小。 本发明 免疫原性组合物中包含的 5 型和 8 型多糖优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非缀合 的。或者， 本发明的免疫原性组合物含有 5 型或 8 型多糖。
     C. 金黄色葡萄球菌 336 抗原
     在一个实施方案中， 本发明免疫原性组合物包含美国专利 6,294,177 中所述的金 黄色葡萄球菌 336 抗原。所述 336 抗原包含 β- 连接己糖胺， 其不含 O- 乙酰基， 并特异性 结合针对金黄色葡萄球菌 336 型 ( 以 ATCC 55804 保藏 ) 的抗体。在一个实施方案中， 所述 336 抗原是多糖， 其具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学处理改变其大小。 本 发明还涵盖了来源于 336 抗原的寡糖。当包含在本发明免疫原性组合物中时， 所述 336 抗 原优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非缀合的。
     D. 来自表皮葡萄球菌的 I、 II 和 III 型多糖
     表皮葡萄球菌的 ATCC-31432、 SE-360 和 SE-10 菌株的特征分别是三种不同的荚膜 类型—— I、 II 和 III 型 (Ichiman 和 Yoshida， 1981)。提取自每种表皮葡萄球菌血清型的 荚膜多糖构成 I、 II 和 III 型多糖。可通过一些方法提取多糖， 包括美国专利 4,197,290 中 所述的或者 Ichiman 等， 1991 所述的方法。
     在本发明的一个实施方案中， 免疫原性组合物包含来自表皮葡萄球菌的 I 和 / 或 II 和 / 或 III 型多糖或寡糖。
     多糖具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学切割改变其大小。 本发明 还涵盖提取自表皮葡萄球菌菌株的寡糖。这些多糖是非缀合的， 或者优选地如下所述进行 缀合。
     E. 多糖的缀合
     在与免疫接种中使用多糖有关的问题中， 事实是多糖本身是弱的免疫原。 优选地， 本发明中所用的多糖与蛋白质运载体相连以改善免疫原性。 此类可缀合多糖免疫原的运载 体的实例包括白喉和破伤风类毒素 ( 分别为 DT、 DT CRM197 和 TT)、 匙孔槭血蓝蛋白 (KLH) 和纯化的结核菌素蛋白衍生物 (PPD)、 绿脓假单胞菌外蛋白 A(rEPA)、 来自流感嗜血杆菌的 蛋白 D、 肺炎球菌溶血素或者上述任一的片段。适用的片段包括含有 T 辅助细胞表位的片 段。特别地， 来自流感嗜血杆菌的蛋白 D 片段优选含有所述蛋白 N 端 1/3。蛋白 D 是来自流 感嗜血杆菌的 IgD 结合蛋白 (EP 0 594 610 B1)， 其为潜在的免疫原。另外， 葡萄球菌蛋白 / 抗原可用作本发明多糖缀合物中的运载蛋白。
     特别有利地用于葡萄球菌疫苗背景中的运载蛋白是葡萄球菌 α 类毒素。其天然
     形式可与多糖缀合， 因为缀合的加工过程减少了毒性。优选地， 由于残存毒性较低， 所以经 遗传改造解毒的 α 毒素 ( 例如 His35Leu 或 His35Arg 变体 ) 用作运载体。或者， 通过用交 联剂甲醛或戊二醛处理对 α 毒素进行化学解毒。
     可以通过任何已知方法 ( 例如美国专利 4,372,945、 4,474,757 和 4,356,170) 将 多糖与运载蛋白相连。
     优选地， 进行 CDAP 缀合化学方法 ( 参见 WO95/08348)。在 CDAP 中， 优选使用氰基 化剂 1- 氰基 - 二甲基氨基吡啶四氟硼酸 (CDAP) 合成多糖 - 蛋白质缀合物。氰基化反应可 在相对温和条件下进行， 其避免了碱敏感多糖的水解。该合成允许直接偶联运载体蛋白。
     所述多糖溶于水或盐溶液。CDAP 溶于乙腈， 并立刻添加至多糖溶液。CDAP 与多糖 的羟基反应形成氰酸酯。在活化步骤之后， 添加运载体蛋白。赖氨酸的氨基与活化的多糖 反应形成异脲共价连接。 在偶联反应后， 添加大量过剩的甘氨酸以淬灭残余的活化官能团。 然后， 使产物通过凝胶渗透柱， 以除去未反应的运载体蛋白和残余的试剂。
     缀合优选包括在运载体蛋白和多糖之间产生直接连接。任选地， 可在运载体蛋白 和多糖之间引入间隔物 ( 例如二氢己二酸 (adipic dihydride， ADH))。
     V. 免疫应答和测定
     如上文所述， 本发明涉及引发或诱导对象中针对 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的免疫 应答。 在另一些实施方案中， 可引发或诱导针对其它肽或抗原的免疫应答， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡萄球菌肽或蛋白。在一个实施方案中， 免疫应答可 保护或治疗患有、 怀疑患有发生感染或相关疾病 ( 特别是与葡萄球菌有关的那些 ) 或具有 此种风险的对象 ( 例如限制脓肿持续存在 )。本发明的免疫原性组合物的一种用途是通过 在住院治疗前接种或治疗对象来预防医源性感染。
     A. 免疫测定
     本发明包括实施血清学测定以评价 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 以及本文所述的任何其 它多肽或肽物质是否诱导或引发免疫应答。有许多类型的免疫测定可以实施。本发明所涵 盖的免疫测定包括但不限于美国专利 4,367,110( 双单克隆抗体夹心法测定 ) 和美国专利 4,452,901(western 印迹 ) 所述的那些。其它测定包括体外和体内的带标记配体的免疫沉 淀和免疫细胞化学。
     免疫测定一般是结合测定。 某些优选免疫测定是本领域已知的多种类型的酶联免 疫吸附测定 (ELISA) 和放射免疫测定 (RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别 有用的。在一个实例中， 将抗体或抗原固定在所选表面 ( 例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔、量尺或柱支持物 ) 上。然后， 将怀疑含有目标抗原或抗体的测试组合物 ( 例如临床样品 ) 添加到孔中。在结合以及清洗以除去非特异性结合之免疫复合物之后， 可检测所结合的抗 原或抗体。 检测一般通过添加另一种与可检出标记相连的特异性针对目标抗原或抗体的抗 体来实现。此类 ELISA 被称为 “夹心法 ELISA” 。检测也可通过下述步骤实现 ： 添加特异性 针对目标抗原的第二抗体， 然后添加对第二抗体有结合亲和力的第三抗体， 第三抗体连接 有可检出标记。
     对 ELISA 技术的改动是本领域技术人员已知的。在一种此类改动中， 将怀疑含有 靶抗原或抗体的样品固定于孔表面上， 然后与本发明的抗体或抗原相接触。在结合以及适 当清洗之后， 检测所结合的免疫复合物。 当最初的抗原特异性抗体与可检出标记相连时， 可 直接检测免疫复合物。另外， 也可使用对第一抗原特异抗体有结合亲和力的第二抗体检测 免疫复合物， 第二抗体连接有可检出标记。
     也可以实施竞争性 ELISA， 其中测试样品竞争性结合已知量的经标记抗原或抗体。 通过在与经包被的孔一起孵育之前或其间， 将样品与已知经标记物质混合来确定未知样品 中反应性物质的量。样品中反应性物质的存在减少了可用于结合孔的经标记物质的量， 因 此减少了最终的信号。
     不论所使用的形式如何， ELISA 都具有某些共同的特征， 例如包被、 孵育或结合， 清 洗以除去非特异性结合的物质， 以及检测所结合的免疫复合物。
     在 ELISA 中， 更常见的是使用第二或第三检测手段， 而不是直接检测。因此， 在抗 原或抗体与孔结合、 用非反应性物质进行包被以降低背景以及清洗以除去未结合物质之 后， 将固定化的表面在有效允许免疫复合物 ( 抗原 / 抗体 ) 形成的条件下与待测试的临床 或生物学样品相接触。 然后， 免疫复合物的检测需要经标记的第二结合配体或抗体， 或者与 经标记之第三抗体或第三结合配体连接的第二结合配体或抗体。
     进行所有 ELISA 孵育步骤之后， 清洗接触面以除去未复合的物质。清洗常包括用 PBS/ 吐温溶液或者硼酸盐缓冲液清洗。 在测试样品和最初结合物质之间形成特异性免疫复 合物之后， 进行清洗， 可测定甚至微小量的免疫复合体的存在。
     为了提供检测手段， 第二或第三抗体可具有相连的标记用以检测。 在某些方面中， 该标记是酶， 其在与合适显色底物一起孵育之后会显色。因此， 例如， 期望在利于其它免疫 复合物形成的条件下将第一或第二免疫复合物与经尿素酶、 葡萄糖氧化酶、 碱性磷酸酶或 过氧化氢酶缀合的抗体相接触并孵育一段时间， 例如在含有 PBS 的溶液 ( 如 PBS 吐温 ) 中 于室温下孵育 2 小时。
     与经标记之抗体一起孵育后， 清洗以除去未结合的物质， 继而对标记物的量进行 定量， 例如， 对于过氧化物酶作为酶标记的情况， 通过与显色底物 ( 例如尿素和溴甲酚紫或 者 2， 2′ - 叠氮 - 二 (3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸 [ABTS] 和 H2O2) 一起孵育。然后， 通过测 量产生颜色的程度实现定量， 例如使用可见光谱分光光度计。 或者， 所述标记物可以是化学 发光标记物 ( 参见美国专利 5,310,687、 5,238,808 和 5,221,605)。
     B. 细菌感染的诊断
     除了如上所述使用蛋白质、 多肽和 / 或肽， 以及结合这些多肽、 蛋白质和 / 或肽的 抗体来治疗或预防感染之外， 本发明还考虑到以多种方式使用这些多肽、 蛋白质、 肽和 / 或 抗体， 包括检测葡萄球菌的存在以及诊断感染， 不论是在患者中还是在也可被污染的医疗器械上。根据本发明， 检测感染存在的优选方法包括下列步骤 ： 获得怀疑被一种或多种葡 萄球菌物种或菌株感染的样品， 例如取自个体的样品 ( 例如来自其血液、 唾液、 组织、 骨、 肌 肉、 软骨或皮肤 )。分离出样品之后， 可利用本发明多肽、 蛋白质、 肽和 / 或抗体进行诊断测 定， 以检测葡萄球菌的存在， 并且确定样品中此类存在的这种测定技术是本领域技术人员 公知的， 包括例如放射性免疫测定、 western 印迹分析和 ELISA 测定的方法。一般说来， 根 据本发明， 设想了下述诊断感染的方法， 其中将怀疑感染葡萄球菌的样品加入到本发明的 多肽、 蛋白质、 肽、 抗体或单克隆抗体中， 通过与所述多肽、 蛋白质和 / 或肽结合的抗体或者 与样品中所述抗体结合的多肽、 蛋白质和 / 或肽来指示葡萄球菌。
     因此， 本发明的抗体可用于预防葡萄球菌的感染， 用于治疗进行中的感染， 或者用 作研究工具。本文使用的术语 “抗体” 包括单克隆抗体、 多克隆抗体、 嵌合抗体、 单链抗体、 双特异性抗体、 人抗体、 猿源化抗体和人源化抗体或者灵长动物源化抗体以及 Fab 片段， 例 如保持所述抗体结合特异性的片段， 包括 Fab 免疫球蛋白表达文库的产物。因此， 本发明 设想了使用单链抗体， 例如抗体可变重链和轻链。任意这些类型抗体或抗体片段的产生 是本领域技术人员公知的。产生针对细菌蛋白质之抗体的具体实例可见于美国专利公开 20030153022， 其通过引用以整体并入本文。
     可直接用可检出标记对任意上述多肽、 蛋白质、 肽和 / 或抗体进行标记， 用以鉴定 和定量葡萄球菌。 用于免疫测定的标记物是本领域技术人员一般所知的， 包括酶、 放射性同 位素以及荧光、 发光和显色物质， 包括有色颗粒 ( 例如胶体金或乳胶珠 )。合适的免疫测定 包括 ELISA。
     C. 保护性免疫
     在本发明的一些实施方案中， 蛋白质性组合物向对象提供了保护性免疫。 “保护性 免疫” 是指机体建立特异性免疫应答的能力， 其保护对象免于发生某种病原体参与的特定 疾病或病症， 其中所述病原体会引发免疫应答。 免疫原性有效量能够赋予对象保护性免疫。
     本文说明书和后附权利要求书中使用的术语 “多肽” 和 “肽” 是指通过肽键彼此共 价相连的一段氨基酸。根据本发明， 不同的多肽具有不同的功能。根据一个方面， 多肽源自 为诱导接受者中的主动免疫应答而设计的免疫原， 根据本发明的另一方面， 多肽源自在例 如动物中引发主动免疫应答后产生的、 且可用于诱导接受者中的被动免疫应答的抗体。但 是， 在这两种情况下， 多肽均可根据任何可能的密码子使用由多核苷酸编码。
     本文使用的短语 “免疫应答” 是指在接受患者中产生针对本发明蛋白质、 肽、 碳水 化合物或多肽的体液应答 ( 由抗体介导 )、 细胞应答 ( 由抗原特异性 T 细胞或其分泌产物介 导 ) 或其两者兼有。这些应答可以是由施用免疫原诱导的主动应答， 或者是由施用抗体、 含 抗体之物质或预致敏 T 细胞诱导的被动应答。
     呈递与 I 类或 II 类 MHC 分子相结合的多肽抗原或表位引发细胞免疫应答， 从而活 化了抗原特异性 CD4(+)T 辅助细胞和 / 或 CD8(+) 细胞毒 T 细胞。所述应答也可包括单核 细胞、 巨噬细胞、 NK 细胞、 嗜碱细胞、 树突状细胞、 星形细胞、 小胶质细胞、 嗜酸性粒细胞或固 有免疫其它组分的活化。
     本文使用的 “主动免疫” 是指通过施用抗原赋予对象的任何免疫力。
     本文使用的 “被动免疫” 是指不向对象施用抗原而赋予对象的任何免疫力。因此 “被动免疫” 包括但不限于 ： 施用活化的免疫效应物 ( 其包括免疫应答的细胞介导物或蛋白质介导物， 例如单克隆和 / 或多克隆抗体 )。
     单克隆或多克隆抗体组合物可用于被动免疫， 用以预防或治疗生物体的感染， 所 述生物体携带或可暴露于被所述抗体识别的抗原。 抗体组合物可包含与不同抗原结合的抗 体， 所述抗体可与不同生物相关。所述抗体组分可以是多克隆抗血清。在某些方面中， 从已 用抗原攻击的动物或第二对象亲和纯化抗体。或者， 可使用抗体混合物， 其是针对同一、 相 关或不同微生物或生物体 ( 例如革兰氏阳性细菌、 革兰氏阴性细菌， 包括但不限于葡萄球 菌 ) 中存在之抗原的单克隆和 / 或多克隆抗体的混合物。
     可通过向患者施用免疫球蛋白 (Ig) 和 / 或其它免疫因子向患者或对象给予被动 免疫， 所述免疫球蛋白和 / 或其它免疫因子获得自供体或其它具有已知免疫反应性的非患 者来源。 在另一些方面中， 可向作为球蛋白来源或供体之对象施用本发明的抗原组合物， 所 述球蛋白响应于抗原组合物的攻击而产生， 其含有针对葡萄球菌或其它生物体的抗体 ( “超 免疫球蛋白” )。因此， 如此处理的对象贡献出血浆， 然后通过常规血浆分级分离方法从中 获得超免疫球蛋白， 并施用给另一对象从而赋予其对葡萄球菌感染的抗性或者治疗。根据 本发明， 超免疫球蛋白特别可用于免疫受损的个体、 接受了介入性方法的个体或者时间不 允许个体响应于疫苗接种而产生自身抗体的情况。 对于涉及被动免疫的示例性方法和组合 物， 参见美国专利 6,936,258、 6,770,278、 6,756,361、 5,548,066、 5,512,282、 4,338,298 和 4,748,018， 其每篇均通过引用以整体并入本文。
     在某些方面中， 方法包括通过向有此需要的对象施用所述抗体组合物 ( 例如结合 上述抗原的抗体 ) 治疗或预防感染。治疗和预防感染的靶标患者群体包括感染了细菌性病 原体或者具有感染其之风险的哺乳动物， 例如人。 在一个实施方案中， 待治疗或预防的感染 是金黄色葡萄球菌感染， 包括甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或产生 α- 毒素的金黄色葡 萄球菌的感染， 或者表皮葡萄球菌感染。
     根据一个实施方案， 本发明提供了治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法， 其使 用包含下列一项或多项的组合物 ： 金黄色葡萄球菌 AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 vWa、 Coa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白抗体， 以及可药用运载体。金黄色葡萄球菌抗体可结合上述任何抗原。在一个实 施方案中， 所述抗体组合物是抗体组合物或超免疫组合物。 在另一实施方案中， 所述抗体是 重组抗体、 人抗体或人源化抗体。在又一实施方案中， 所述抗体是单克隆抗体或其片段。
     可通过本领域常规方法确定所述抗体组合物的治疗或预防有效量。 本领域技术人 员应了解， 所述量可根据所述组合物中特定抗体、 所述组合物中抗体的浓度、 施用频率、 待 治疗或预防之感染的严重程度以及对象的具体状况 ( 例如年龄、 体重和免疫状态 ) 而有所变化。在一些实施方案中， 所述剂量是每千克体重至少 1、 5、 10、 25、 50 或 100μg 或 mg 抗体 组合物 (mg/kg)， 包括至少 100mg/kg、 至少 150mg/kg、 至少 200mg/kg、 至少 250mg/kg、 至少 500mg/kg、 至少 750mg/kg 和至少 1000mg/kg。 单克隆抗体组合物的剂量通常可以较低， 例如 抗体组合物剂量的 1/10， 例如至少约 1、 5、 10、 25 或 50μg/kg 或 mg/kg， 至少约 10mg/kg、 至 少约 15mg/kg、 至少约 20mg/kg 或者至少约 25mg/kg。施用途径可以是适于被动免疫的任何 途径。因此， 涵盖了静脉内、 皮下、 肌内、 腹膜内、 吸入及其它施用途径。如上所述， 抗体的治 疗或预防有效量是足以实现治疗或预防有益作用的量。
     保护性抗体组合物可中和和 / 或预防感染。保护性抗体组合物可包含一定量 的 AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白的抗体， 其在单独使用时 不具有保护性， 而当组合时其产生保护性抗体组合物。
     所述抗体组合物可在联合治疗中与抗感染剂、 抗生素药剂和 / 或抗微生物剂联合 施用。抗感染剂包括但不限于万古霉素和溶葡萄菌素。抗生素药剂和抗微生物剂包括但不 限于青霉素酶抗性青霉素、 先锋霉素和碳青霉烯类 (carbapenems)， 包括万古霉素、 溶葡萄 菌素、 青霉素 G、 氨苄西林、 苯唑西林、 萘夫西林、 氯唑西林、 双氯西林、 头孢噻吩、 头孢唑林、 头孢氨苄、 环己烯胺头孢菌素、 头孢孟多、 头孢西丁、 亚胺培南、 美罗培南、 庆大霉素、 替考拉 宁、 林可霉素和克林霉素。这些抗生素的剂量是本领域公知的。参见， 例如 Merck Manual Of Diagnosis And Therapy， §13， 157 章， 第 100 版 (Beers & Berkow 编， 2004)。可以在 本文所述主动或被动免疫疗法施用之前、 施用同时或施用之后联合抗感染、 抗生素和 / 或 抗微生物剂使用。
     在一些实施方案中， 施用相对少给药次数的抗体组合物， 例如一次或两次给药， 以 及应用常规抗生素疗法， 其通常包括在数天或数星期内多次给药。 因此， 所述抗生素可以在 一段时期内 ( 例如至少 5 天、 10 天或甚至 14 或更多天 ) 每天一次、 两次或三次或更多次， 而 所述抗体组合物通常仅施用一次或两次。 但是， 可选择抗体组合物和抗生素的不同剂量、 给 药时间和相对量， 并且可由本领域技术人员来作出判断。
     出于本说明书和权利要求的目的， 术语 “表位” 和 “抗原决定簇” 可互换地用于表示 抗原上 B 和 / 或 T 细胞应答或识别的部位。B 细胞表位可由连续氨基酸形成， 或者由通过蛋 白质三级折叠而靠近的非连续氨基酸形成。 由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶 剂后仍保留， 而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理之后丢失。表位通常包括独 特空间构象中至少 3 个、 更常见至少 5 个或 8 ～ 10 个氨基酸。确定表位空间构象的方法包 括例如 X- 射线晶体衍射和二维核磁共振。参见例如 Epitope Mapping Protocols(1996)。可在简单的免疫测定中鉴定出识别相同表位的抗体， 所述免疫测定显示一种抗体阻断另一 种抗体与靶抗原结合的能力。对于 CD8 细胞， T 细胞识别约 9 个氨基酸的连续表位， 而对于 CD4 细胞， 为约 13 ～ 15 个氨基酸。可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定鉴定出识别所 述表位的 T 细胞， 如下所述进行 ： 测定预致敏 T 细胞响应于表位的 3H- 胸苷掺入 (Bruke 等， 1994)、 测定抗原依赖性杀伤 (cytotoxic T lymphocyte assay， Tigges 等， 1996) 或者测定 细胞因子分泌。
     可通过增殖测定 (CD4(+)T 细胞 ) 或 CTL( 细胞毒 T 细胞 ) 测定来确定细胞介导免 疫应答的存在。 体液应答和细胞应答对免疫原的保护性或治疗性作用的相对贡献可通过以 下方式进行区分 ： 从经免疫的同基因动物中单独分离 IgG 和 T 细胞， 在第二对象中测量保护 性或治疗性作用。
     本文和权利要求中使用的术语 “抗体” 或 “免疫球蛋白” 可互换地使用， 并表示作 为动物或接受者免疫应答的一部分发挥作用的几类结构上相关蛋白质中的任意种， 所述蛋 白质包括 IgG、 IgD、 IgE、 IgA、 IgM 和相关蛋白。
     在正常生理条件下， 抗体存在于血浆及其它体液中以及某些细胞的膜中， 其由称 为 B 细胞的淋巴细胞类型或者其功能等同物产生。IgG 类别的抗体由通过二硫键连接的四 条多肽链组成。完整 IgG 分子的四条链是两条相同的重链 ( 称为 H 链 ) 和两条相同的轻链 ( 称为 L 链 )。
     为了产生多克隆抗体， 用抗原或抗原片段 ( 通常与佐剂一起， 必要时， 与运载体偶 连 ) 免疫宿主例如兔、 山羊、 绵羊或人。随后从宿主的血清中收集针对所述抗原的抗体。可 针对所述抗原亲和纯化多克隆抗体， 使其成为单特异性的。
     为了产生单克隆抗体， 用所述抗原对合适供体 ( 通常为小鼠 ) 进行超免疫。然后， 分离产生抗体的脾细胞。将这些细胞与具有永生化特征的细胞 ( 例如骨髓瘤细胞 ) 融合， 以提供融合细胞杂交体 ( 杂交瘤 )， 其可在培养物中维持并分泌所需单克隆抗体。然后， 大 量培养所述细胞， 从培养基中收获单克隆抗体备用。 根据定义， 单克隆抗体对单个表位具有 特异性。为此， 对于类似的抗原， 单克隆抗体往往具有比多克隆抗体更低的亲和常数。
     也可通过使用脾细胞或来源于脾的细胞系的原代培养物产生单克隆抗体 (Anavi， 1998)。 为 产 生 重 组 抗 体 ( 一 般 性 参 见 Huston 等， 1991 ； Johnson 等， 1991 ； Mernaugh 等， 1995)， 将来自产生抗体之 B 淋巴细胞的动物或杂交瘤的信使 RNA 逆转录得到互补 DNA(cDNA)。 扩增抗体 cDNA( 可以是全长或部分长度 )， 并克隆进噬菌体或质粒中。 所述 cDNA 可以是重链和轻链 cDNA 的部分长度， 其为间隔的或者通过接头相连。使用合适表达系统表 达所述抗体或抗体片段， 得到重组抗体。也可通过筛选相关表达文库获得抗体 cDNA。
     如本领域公知地， 所述抗体可以与固体支持物基底结合， 或者与可检出部分缀合， 或者两者皆有。与荧光部分或酶部分缀合的一般性讨论参见 Johnstone 等 (1982)。抗体与 固体支持物基底的结合也是本领域公知的 (Harlow 等， 1988 ； Borrebaeck， 1992)。
     本文及权利要求中所用的短语 “抗体的免疫部分” 包括抗体的 Fab 片段、 抗体的 Fv 片段、 抗体的重链、 抗体的轻链、 抗体的重链和轻链非连接混合物、 由抗体的重链和轻链组 成的异二聚体、 抗体重链的催化结构域、 抗体轻链的催化结构域、 抗体轻链的可变片段、 抗 体重链的可变片段以及抗体的单链变体 ( 也称为 scFv)。另外， 该术语包括嵌合免疫球蛋 白， 其是来源于不同物种之融合基因的表达产物。 所述物种之一可以是人， 此时嵌合免疫球蛋白称为人源化的。通常， 抗体的免疫部分与其所来源的完整抗体竞争特异性结合抗原。
     任选地， 抗体 ( 或优选地， 抗体的免疫部分 ) 可以与其它蛋白质化学缀合或者表达 为融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求的目的， 所有此类融合蛋白均包含在抗体或抗 体免疫部分的定义中。
     本文使用的术语 “免疫原性物质” 或 “免疫原” 或 “抗原” 可互换地用于表示在施用 给接受者后 ( 单独地、 与佐剂一起或者呈现于展示载体上 ) 能够诱导针对其自身的免疫应 答的分子。
     VI. 核酸
     在某些实施方案中， 本发明涉及编码本发明蛋白质、 多肽和肽的重组多核苷酸。 包 括针对 Emp、 Eap 或 AdsA 以及其它细菌蛋白质 ( 包括但不限于 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 Coa、 vWa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基 葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白 ) 的核酸序列。
     本申请使用的术语 “多核苷酸” 是指重组的或者已分离出的不含总基因组核酸的 核酸分子。术语 “多核苷酸” 是寡核苷酸 ( 长度为 100 个残基或更少的核酸 )、 重组载体 ( 其 包括例如质粒、 粘粒、 噬菌体、 病毒等 )。在某些方面中， 多核苷酸包含调节序列， 其基本上 与其天然基因或蛋白质编码序列相分隔。多核苷酸可以是单链 ( 编码链或反义链 ) 或双链 的， 其可以是 RNA、 DNA( 基因组、 cDNA 或合成的 )、 其类似物或其组合。另外的编码或非编码 序列可以存在于多核苷酸中， 但这不是必需的。
     在这方面， 术语 “基因” 、 “多核苷酸” 或 “核酸” 用于表示编码蛋白质、 多肽或肽的 核酸 ( 包含正确转录、 翻译后修饰或定位所需的任何序列 )。如本领域技术人员所了解地， 此术语涵盖基因组序列、 表达盒、 cDNA 序列、 mRNA 序列和较小的经改造核酸区段， 其表达或 可适于表达蛋白质、 多肽、 结构域、 肽、 融合蛋白和突变体。 编码多肽之全部或部分的核酸可 含有编码该多肽之全部或部分的连续核酸序列， 其长度为 ： 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 260、 270、 280、 290、 300、 310、 320、 330、 340、 350、 360、 370、 380、 390、 400、 410、 420、 430、 440、 441、 450、 460、 470、 480、 490、 500、 510、 520、 530、 540、 550、 560、 570、 580、 590、 600、 610、 620、 630、 640、 650、 660、 670、 680、 690、 700、 710、 720、 730、 740、 750、 760、 770、 780、 790、 800、 810、 820、 830、 840、 850、 860、 870、 880、 890、 900、 910、 920、 930、 940、 950、 960、 970、 980、 990、 1000、 1010、 1020、 1030、 1040、 1050、 1060、 1070、 1080、 1090、 1095、 1100、 1500、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 9000、 10000 个或更多的本发明多肽的核苷 酸、 核苷或碱基对。还考虑到， 特定多肽可由含有变化的核酸所编码， 所述核酸具有稍有不同的核酸序列， 但是尽管如此仍编码相同或基本上相似的蛋白质 ( 参见上文表 2)。
     在一些特定实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 的核酸序列， 其还可与下列相组合 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻 连蛋白结合蛋白。因此， 分离的核酸区段或含有核酸区段的载体可编码例如具有免疫原 性的 ： Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 和 / 或 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。术语 “重组” 可与 “多肽” 或具体的多肽名称联用， 其一般是指由已经过体外操作的核酸分子或者这些分 子之复制产物的核酸分子所产生的多肽。
     在另一些实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其包含编码用于 在对象中产生免疫应答之肽或多肽的核酸序列。在多个实施方案中， 本发明的核酸可用于 基因疫苗。
     本发明中所用的核酸区段， 不管其编码序列长度如何， 可以与其它核酸序列 ( 例 如启动子、 多聚腺苷酸化信号、 额外的限制性酶切位点、 多克隆位点、 其它编码区段等 ) 相 组合， 从而使它们的全长可变化很大。因此， 考虑到可使用几乎任何长度的核酸片段， 其总 长度优选受到制备简便性和在预定重组核酸方案中用途的限制。在某些情况下， 核酸序列 可编码具有额外异源编码序列的多肽序列， 例如以允许纯化所述多肽、 转运、 分泌、 翻译后 修饰或者为了治疗益处 ( 例如靶向或效力 )。 如上所述， 可将标签或其它异源多肽添加到所 修饰的多肽编码序列， 其中 “异源” 表示与所修饰多肽不同的多肽。
     在另一些实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其在序列中包含 来自下列的连续核酸序列 ： SEQ ID NO ： 1(Emp)、 SEQ ID NO ： 3(Eap)、 SEQ ID NO ： 5(EsxA)、 SEQ ID NO ： 7(EsxB)、 SEQ ID NO ： 9(SdrD)、 SEQ ID NO ： 11(SdrE)、 SEQ ID NO ： 13(IsdA)、 SEQ ID NO ： 15(IsdB)、 SEQ ID NO ： 17(SpA)、 SEQ ID NO ： 19(ClfB)、 SEQ ID NO ： 21(IsdC)、 SEQ IDNO ： 23(SasF)、 SEQ ID NO ： 25(SdrC)、 SEQ ID NO ： 27(ClfA)， SEQ ID NO ： 29(EsaB)、 SEQ ID NO ： 31(EsaC)、 SEQ ID NO ： 33(SasB) 或 SEQ ID NO ： 35(Sas) 或者编码分泌型毒力因子和 / 或表面蛋白的任何其它核酸序列。
     在某些实施方案中， 本发明提供了与本文公开的序列具有显著同一性的多核苷酸 变体， 使用本文所述方法 ( 例如使用标准参数的 BLSAT 分析 )， 它们与本发明的多核苷酸序 列相比它们包含至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％或更高序 列同一性 ( 包括其间的所有值和范围 )。在某些方面中， 本发明的分离多核苷酸包含编码 如下多肽的核苷酸序列， 所述多肽与本发明的氨基酸序列在所述序列整个长度上具有至少 90％、 优选 95％及更高的同一性 ； 或者包含与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
     本发明还考虑使用与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸。
     本发明还提供了本发明多核苷酸片段的用途， 其在施用给对象时具有与多核苷酸 相同的免疫原性。
     本发明还提供了编码如上所述本发明蛋白质免疫片段的多核苷酸的用途。
     A. 载体
     本发明的多肽可由载体中包含的核酸分子编码。 所使用的术语 “载体” 是指运载体 核酸分子， 异源核酸序列可插入其中用以引入到其可复制和表达的细胞中。核酸序列可以 是 “异源的” ， 在上下文中其表示对于所述载体待引入其中的细胞或者待掺入其中的核酸而 言是外源的， 其包含与所述细胞或核酸中之序列同源的序列， 但是其是在宿主细胞或核酸 中其通常不存在的位置。载体包括 DNA、 RNA、 质粒、 粘粒、 病毒 ( 噬菌体、 动物病毒和植物病 毒 ) 和人工染色体 ( 例如 YAC)。本领域技术人员能够通过标准重组技术 ( 例如 Sambrook 等， 2001 ； Ausubel 等， 1996， 其两者通过引用并入本文 ) 容易地构建载体。除了编码 Emp、 Eap 或 AdsA 多肽之外， 载体还可编码 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡 萄球菌肽或蛋白质， 载体可编码多肽序列 ( 例如标签或免疫原性增强肽 )。 编码这些融合蛋 白的可用载体包括 pIN 载体 (Inouye 等， 1985)、 编码一段组氨酸的载体和用于产生谷胱甘 肽 S- 转移酶 (GST) 可溶性融合蛋白的 pGEX 载体， 以用于后期纯化和分离或切割。
     本发明的载体可用于宿主细胞中产生 Emp 或 Eap 或 AdsA 多肽。在某些方面中， 所述载体还可产生 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡萄球菌肽或 蛋白质， 其随后可纯化用于施用给对象， 或者所述载体可纯化用以直接施用给对象， 从而在 对象中表达所述蛋白质。
     术语 “表达载体” 是指含有编码能够转录的基因产物之至少一部分的核酸序列的 载体。在一些情况下， RNA 分子随后翻译成蛋白质、 多肽或肽。表达载体可含有多种 “控制 序列” ， 其表示有效连接的编码序列在特定宿主生物体内转录和可能的翻译所需的核酸序 列。除了调节转录和翻译的控制序列之外， 载体和表达载体还可含有用作其它功能的核酸 序列， 其在本文中有所描述。
     1. 启动子和增强子
     “启动子” 是控制序列。启动子通常是控制转录起始和速率的核酸序列区域。它可 含有可在此结合调节性蛋白和分子 ( 例如 RNA 聚合酶及其它转录因子 ) 的遗传元件。短语 “有效位于” 、 “有效连接” 、 “控制之下” 和 “处于转录控制之下” 表示启动子相对于核酸序列 处于正确功能的位置和 / 或方向， 以控制该序列的转录起始和表达。 启动子可以或不与 “增 强子” 配合使用， 所述增强子是指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。
     启动子可以是与基因或序列天然相连的启动子， 如可通过将位于编码区段或外显 子上游的 5′非编码序列分离而获得。这样的启动子可称为 “内源的” 。类似地， 增强子可 以是与核酸序列天然相连的增强子， 其位于该序列的下游或上游。 或者， 将编码核酸区段置 于重组或异源启动子控制下会获得某些优势， 所述启动子是指在其自然环境中通常不与核 酸序列相连的启动子。重组或异源增强子还指在其自然状态下通常不与核酸序列相连的 增强子。这些启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子， 以及分离自任何其它原 核、 病毒或真核细胞的启动子或增强子， 以及非 “天然” 的启动子或增强子， 即含有不同转录 调节区域的不同元件和 / 或改变其表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列 之外， 可使用重组克隆和 / 或核酸扩增技术 ( 包括 PCRTM) 以及本文公开的组合物产生序列 ( 参见美国专利 4,683,202、 美国专利 5,928,906， 其各自通过引用并入本文 )。
     自然地， 利用在选择用于表达的细胞类型或生物体中有效指导 DNA 区段表达的启 动子和 / 或增强子可以是重要的。分子生物学领域技术人员一般知晓启动子、 增强子和细 胞类型的组合用于蛋白质表达的用途 ( 参见 Sambrook 等， 2001， 通过引用并入本文 )。 可用 的启动子可以是组成型、 组织特异性或可诱导的， 在某些实施方案中， 在特定条件下 ( 例如 大规模生产重组蛋白质或肽 ) 可指导引入的 DNA 区段高水平表达。
     在本发明的背景下， 可利用多个元件 / 启动子来调节基因的表达。作为可响应于 特定刺激而活化的核酸序列区域的这些可诱导元件的实例包括但不限于 ： 免疫球蛋白重 链 (Banerji 等， 1983 ； Gilles 等， 1983 ； Grosschedl 等， 1985 ； Atchinson 等， 1986， 1987 ； Imler 等， 1987 ； Weinberger 等， 1984 ； Kiledjian 等， 1988 ； Porton 等 ； 1990)、 免疫球蛋白 轻 链 (Queen 等， 1983 ； Picard 等， 1984)、 T 细 胞 受 体 (Luria 等， 1987 ； Winoto 等， 1989 ；Redondo 等 ； 1990)、 HLA DQα 和 / 或 DQ β(Sullivan 等， 1987)、 β 干扰素 (Goodbourn 等， 1986 ； Fujita 等， 1987 ； Goodbourn 等， 1988)、 白介素 -2(Greene 等， 1989)、 白介素 -2 受体 (Greene 等， 1989 ； Lin 等， 1990)、 MHC II 类 5(Koch 等， 1989)、 MHC II 类 HLA-DRα(Sherman 等， 1989)、 β- 肌动蛋白 (Kawamoto 等， 1988 ； Ng 等 ； 1989)、 肌肉肌酸激酶 (MCK)(Jaynes 等， 1988 ； Horlick 等， 1989 ； Johnson 等， 1989)、 前白蛋白 ( 转甲状腺素 )(Costa 等， 1988)、 弹性蛋白酶 I(Ornitz 等， 1987)、 金属硫蛋白 (MTII)(Karin 等， 1987 ； Culotta 等， 1989)、 胶原酶 (Pinkert 等， 1987 ； Angel 等， 1987)、 白蛋白 (Pinkert 等， 1987 ； Tronche 等， 1989， 1990)、 α- 甲 胎 蛋 白 (Godbout 等， 1988 ； Campere 等， 1989)、 γ- 珠 蛋 白 (Bodine 等， 1987 ； Perez-Stable 等， 1990)、 β- 珠 蛋 白 (Trudel 等， 1987)、 c-fos(Cohen 等， 1987)、 c-Ha-Ras(Triesman， 1986 ； Deschamps 等， 1985)、 胰 岛 素 (Edlund 等， 1985)、 神经细胞粘 附分子 (NCAM)(Hirsh 等， 1990)、 α1- 抗胰蛋白酶 (Latimer 等， 1990)、 H2B(TH2B) 组蛋白 (Hwang 等， 1990)、 小鼠和 / 或 I 型胶原 (Ripe 等， 1989)、 葡萄糖调节蛋白 (GRP94 和 GRP78) (Chang 等， 1989)、 大 鼠 生 长 素 (Larsen 等， 1986)、 人 血 清 淀 粉 样 蛋 白 A(SAA)(Edbrooke 等， 1989)、 肌 钙 蛋 白 I(TN I)(Yutzey 等， 1989)、 血 小 板 来 源 生 长 因 子 (PDGF)(Pech 等， 1989)、 杜 氏 肌 营 养 不 良 (Klamut 等， 1990)、 SV40(Banerji 等， 1981 ； Moreau 等， 1981 ； Sleigh 等， 1985 ； Firak 等， 1986 ； Herr 等， 1986 ； Imbra 等， 1986 ； Kadesch 等， 1986 ； Wang 等， 1986 ； Ondek 等， 1987 ； Kuhl 等， 1987 ； Schaffner 等， 1988)、多 形 瘤 (Swartzendruber 等， 1975 ； Vasseur 等， 1980 ； Katinka 等， 1980， 1981 ； Tyndell 等， 1981 ； Dandolo 等， 1983 ； de Villiers 等， 1984 ； Hen 等， 1986 ； Satake 等， 1988 ； Campbell 等， 1988)、 逆转录病毒 (Kriegler 等， 1982， 1983 ； Levinson 等， 1982 ； Kriegler 等， 1983， 1984a， b， 1988 ； Bosze 等， 1986 ； Miksicek 等， 1986 ； Celander 等， 1987 ； Thiesen 等， 1988 ； Celander 等， 1988 ； Choi 等， 1988 ； Reisman 等， 1989)、 乳 头 状 瘤 病 毒 (Campo 等， 1983 ； Lusky 等， 1983 ； Spandidos 和 Wilkie， 1983 ； Spalholz 等， 1985 ； Lusky 等， 1986 ； Cripe 等， 1987 ； Gloss 等， 1987 ； Hirochika 等， 1987 ； Stephens 等， 1987)、 乙肝病毒 (Bulla 等， 1986 ； Jameel 等， 1986 ； Shaul 等， 1987 ； Spandau 等， 1988 ； Vannice 等， 1988)、 人免疫缺陷病毒 (Muesing 等， 1987 ； Hauber 等， 1988 ； Jakobovits 等， 1988 ； Feng 等， 1988 ； Takebe 等， 1988 ； Rosen 等， 1988 ； Berkhout 等， 1989 ； Laspia 等， 1989 ； Sharp 等， 1989 ； Braddock 等， 1989)、 巨细胞病毒 (CMV)IE(Weber 等， 1984 ； Boshart 等， 1985 ； Foecking 等， 1986)、 长臂猿类人猿白血病病毒 (Holbrook 等， 1987 ； Quinn 等， 1989)。
     可诱导元件包括但不限于 ： MT II- 佛波酯 (TFA)/ 重金属 (Palmiter 等， 1982 ； Haslinger 等， 1985 ； Searle 等， 1985 ； Stuart 等， 1985 ； Imagawa 等， 1987 ； Karin 等， 1987 ； Angel 等， 1987b ； McNeall 等， 1989) ； MMTV( 小鼠乳腺瘤病毒 )- 糖皮质激素 (Huang 等， 1981 ； Lee 等， 1981 ； Majors 等， 1983 ； Chandler 等， 1983 ； Lee 等， 1984 ； Ponta 等， 1985 ； Sakai 等， 1988) ； β- 干扰素 - 聚 (rI)x/ 聚 (rc)(Tavernier 等， 1983) ； 腺病毒 5E2-ElA(Imperiale 等， 1984) ； 胶原酶 - 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987a) ； 基质裂解素 - 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987b) ； SV40- 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987b) ； 鼠 MX 基因 - 干扰素， 新城疫病毒 (Hug 等， 1988) ； GRP78 基 因 -A23187(Resendez 等， 1988) ； α-2- 巨 球 蛋 白 -IL-6(Kunz 等， 1989) ； 中间丝蛋白 - 血清 (Rittling 等， 1989) ； MHC I 类基因 H-2κb- 干扰素 (Blanar 等， 1989) ； HSP70-ElA/SV40 大 T 抗 原 (Taylor 等， 1989， 1990a， 1990b) ； 增殖蛋白 - 佛波酯 /TPA(Mordacq 等， 1989) ； 肿瘤坏死因子 -PMA(Hensel 等， 1989) ； 以及甲状腺刺激激素 α 基 因 - 甲状腺素 (Chatterjee 等， 1989)。
     认为可用于控制编码本发明多核苷酸的肽或蛋白质表达的特定启动子不是关键 性的， 只要其能够在靶细胞 ( 优选细菌细胞 ) 中表达所述多核苷酸即可。当靶向人细胞时， 优选使得多核苷酸编码区域位于邻近能够在人细胞中表达的启动子并且处于其控制之下。 一般而言， 此类启动子可包括细菌、 人或病毒启动子。
     在多个实施方案中， 人巨细胞病毒 (CMV) 立即早期基因启动子、 SV40 早期启动子 或者劳氏肉瘤病毒长末端重复可用于获得 Emp、 AdsA 和 / 或 Eap 多核苷酸的高水平表达。 在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可用于与下列相组合地表达 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 vWa、 Coa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自 溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受 体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化 蛋 白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它细菌多肽。使用本领域中公知的其它病毒或哺乳动物 细胞或细菌噬菌体启动子来实现多核苷酸的表达也在考虑之中。
     在向对象施用载体以表达蛋白质的实施方案中， 考虑用于所述载体的理想的启动 子是不受细胞因子下调的启动子， 或者是足够强到即使下调也能产生引发免疫应答的有效 量的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的启动子。这样的非限制性实例有 CMV IE 和 RSV LTR。在 另一些实施方案中， 使用在细胞因子存在下被上调的启动子。MHC I 启动子在 IFN-γ 存在 下增强表达。
     可使用组织特异性启动子， 特别是如果表达是在希望表达抗原的细胞 ( 例如树突 状细胞或巨噬细胞 ) 中进行的话。哺乳动物 MHC I 和 MHC II 启动子是此类组织特异性启 动子的实例。
     2. 起始信号和内部核糖体结合位点 (IRES)
     特异性起始信号也可以是编码序列有效翻译所需的。这些信号包括 ATG 起始密码 子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号， 包括 ATG 起始密码子。本领域技术人员 能够容易地确定这一点并提供必要的信号。公知的是， 起始密码子必须与所需编码序列是 “同框的” ， 以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合 成的， 并且可以是在细菌或哺乳动物细胞中有效的。可通过包含合适的转录增强子元件来 提高表达效率。
     在本发明的某些实施方案中， 使用内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 元件产生多基因或多顺反子 mRNA。IRES 元件能够绕过 5′ - 甲基化帽 依赖性翻译的核糖体扫描模型， 并在内部位点开始翻译 (Pelletier 和 Sonenberg， 1988)。 已记载了来自微小 RNA 病毒科两个成员 ( 骨髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒 ) 的 IRES 元件 (Pelletier 和 Sonenberg， 1988)， 以及来自哺乳动物 mRNA 的 IRES(Macejak 和 Sarnow， 1991)。IRES 元件可与异源开放读码框相连。多个开放读码框可一起转录， 其各自被 IRES 隔开， 形成多顺反子 mRNA。借助于 IRES 元件， 每个开放读码框能够接近核糖体从而有效翻 译。可使用单个启动子 / 增强子有效地表达多个基因， 从而转录单个 mRNA( 参见美国专利 5,925,565 和 5,935,819， 其通过引用并入本文 )。
     3. 多克隆位点
     载体可包含多克隆位点 (MCS)， 其是含有多个限制性酶切位点的核酸区域， 任意所 述位点可与标准重组技术结合使用来消化载体 ( 参见 Carbonelli 等， 1999， Levenson 等， 1998 以及 Cocea， 1997， 通过引用并入本文 )。通常， 使用限制性酶使载体线性化或片段化， 所述限制性酶在 MCS 内切割以使得外源序列连接至所述载体。涉及限制性酶和连接反应的 技术是重组技术领域技术人员公知的。
     4. 剪接位点
     大多数经转录的真核 RNA 分子要经历 RNA 剪接， 以从原始转录本中除去内含子。 含 有基因组真核序列的载体可需要供体和 / 或接受体剪接位点， 以确保正确加工转录本用于 蛋白质表达。( 参见 Chandler 等， 1997， 通过引用并入本文。)
     5. 终止信号
     本发明的载体或构建物通常包含至少一个终止信号。 “终止信号” 或 “终止子” 由 参与特异性终止 RNA 聚合酶进行的 RNA 转录的 DNA 序列构成。因此， 在某些实施方案中， 考 虑了结束 RNA 转录本产生的终止信号。在体内终止子可能是实现期望之 mRNA 水平所必需 的。
     在真核系统中， 终止子区域还可包含允许位点特异性切割新转录本的特异性 DNA 序列， 使得暴露多腺苷酸化位点。该信号使得专门的内源聚合酶加入一段约 200 个 A 残基 ( 多聚 A) 至转录本的 3′端。此多聚 A 尾修饰的 RNA 分子似乎更稳定的， 并且更有效地翻 译。因此， 在涉及真核生物的另一些实施方案中， 优选终止子包含用于切割 RNA 的信号， 更 优选终止子信号促进 mRNA 的多腺苷酸化。
     考虑用于本发明中的终止子包括本文所述的或者本领域技术人员已知的任何已 知转录终止子， 包括但不限于例如牛生长素终止子或病毒终止序列 ( 例如 SV40 终止子 )。 在某些实施方案中， 终止信号可缺少可转录或可翻译序列， 例如由于序列截短所致。
     6. 多腺苷酸化信号
     在表达中， 尤其是真核表达中， 通常包括多腺苷酸化信号， 以实现合适的转录本多 腺苷酸化。认为多腺苷酸化信号的性质对于本发明成功实施来说不是关键性的， 和 / 或可 使用任何这样的序列。优选实施方案包括 SV40 多腺苷酸化信号和 / 或牛生长素多腺苷酸 化信号， 其在多种靶细胞中是方便的和 / 或已知很好地发挥功能。多腺苷酸化可增加转录 本的稳定性或可利于细胞质转运。
     7. 复制起点
     为了在宿主细胞中扩增载体， 其可含有一个或多个复制起点 ( 常称为 “ori” )， 其是起始复制的特定核酸序列。或者， 如果宿主细胞是酵母的话， 则可使用自主复制序列 (autonomously replicating sequence， ARS)。
     8. 选择和筛选标记在本发明的某些实施方案中， 可通过在表达载体中编码筛选或选择标记从而在体 外或体内鉴定含有本发明核酸构建物的细胞。当转录和翻译时， 标记物赋予细胞可鉴定的 改变， 其使得容易鉴定含有所述表达载体的细胞。 通常， 选择标记是赋予允许进行选择之性 质的标记物。阳性选择标记是指标记物的存在允许其进行选择的标记物， 而阴性选择标记 是指其存在阻碍其进行选择的标记物。阳性选择标记的实例有抗药性标记物。
     通常， 包含药物选择标记有助于克隆和鉴定转化体， 例如， 赋予了新霉素、 嘌呤霉 素、 潮霉素、 DHFR、 GPT、 zeocin 或组氨醇抗性的标记物是可用的选择标记。除了赋予基于 条件来区分转化体之表型的标记物之外， 其它类型标记物包括筛选标记， 例如用于显色分 析的 GFP。或者， 可利用可筛选的酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶 (tk) 或氯霉素乙酰转移酶 (CAT)。本领域技术人员也了解如何利用免疫标记物， 其可与 FACS 分析结合使用。认为所 用的标记物不是关键性的， 只要其能够与编码本发明蛋白质的核酸同时表达即可。选择标 记和筛选标记的其它实例是本领域技术人员公知的。
     B. 宿主细胞
     本文使用的术语 “细胞” 、 “细胞系” 和 “细胞培养物” 可互换地使用。所有这些术 语还包括其后代 ( 其为任意和所有的后代 )。应了解， 由于人为或偶然的突变， 可能并非所 有后代都是相同的。在表达异源核酸序列的情形下， “宿主细胞” 是指原核或真核细胞， 其 包括任何可进行转化的、 能够复制载体或表达由载体编码之异源基因的生物体。宿主细胞 可以并且已用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以被 “转染” 或 “转化” ， 其表示外源核酸 ( 例如重组的蛋白质编码序列 ) 转移或引入宿主细胞的过程。经转化细胞包括原代对象细 胞及其后代。
     宿主细胞可来源于原核生物或真核生物， 包括细菌、 酵母细胞、 昆虫细胞和哺乳动 物细胞， 用以复制载体或者表达核酸序列的部分或全部。许多细胞系和培养物可用作宿主 细胞， 并且它们可通过美国典型培养物保藏中心 (ATCC)( 其为作为活培养物和遗传物质存 档的机构 (www.atcc.org)) 获得。本领域技术人员根据载体主链和所期望结果可确定合适 的宿主。例如， 可将质粒或粘粒引入原核生物宿主细胞， 用以复制多种载体或表达所编码 蛋白质。用作宿主细胞进行载体复制和 / 或表达的细菌细胞包括葡萄球菌属菌株、 DH5a、 TM JM109 和 KC8， 以及多种市售细菌宿主 ( 例如 SURE 感受态细胞和 SOLOPACK Gold 细胞 (STRATAGENE La Jolla， CA)。或者， 细菌细胞 ( 例如大肠杆菌 LE392) 可用作噬菌体病 毒的宿主细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 裂殖酵母 (Saccharomyces pombe) 和毕赤酵母 (Pichia pastoris)。 用于载体复制和 / 或表达的真核宿主细胞的实例包括 HeLa、 NIH3T3、 Jurkat、 293、 Cos、 CHO、 Saos 和 PC12。可获得来自多种细胞类型和生物体的多种宿主细胞， 并且为本领域 技术人员所知。类似地， 病毒载体可与真核或原核宿主细胞 ( 特别是允许所述载体复制或 表达的那些 ) 结合使用。
     一些载体可使用控制序列， 所述控制序列允许载体在原核和真核细胞中均能复制 和 / 或表达。本领域技术人员还应了解， 孵育所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复 制的条件。还应了解且已知的是允许大规模生产载体的技术和条件， 以及产生载体所编码 之核酸及其相关多肽、 蛋白质或肽的技术和条件。
     C. 表达系统
     存在多种表达系统， 其包括上述组合物的至少一部分或全部。基于原核生物和 / 或真核生物的系统可用于本发明， 以产生核酸序列或其相关多肽、 蛋白质和肽。 许多这样的 系统是可购得的并且易于得到。
     昆虫细胞 / 杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白质表达， 例如美国 专利 5,871,986、 4,879,236 中所述 ( 其两者均通过引用并入本文 )， 并且其可例如以商品名 TM MAXBAC 2.0 购自 INVITROGEN 以及以 BACPACK BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM 购自 CLONTECH
     除 了 公 开 的 本 发 明 表 达 系 统 之 外， 其 它 表 达 系 统 实 例 包 括 STRATAGENE 的 TM COMPLETE CONTROL 可诱导哺乳动物表达系统， 其涉及合成的蜕皮素诱导受体， 或者其 pET 表达系统 ( 一种大肠杆菌表达系统 )。 可诱导表达系统的另一个例子可得自 INVITROGEN TM 其具有 T-REX ( 四环素调节表达 ) 系统——一种使用全长 CMV 启动子的可诱导哺乳动物表 达系统。INVITROGEN 还提供了酵母表达系统， 称为甲醇毕赤酵母 (Pichia methanolica) 表达系统， 其设计成在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白质。本领域技 术人员了解如何表达载体 ( 例如表达构建物 )， 以产生核酸序列或其相关多肽、 蛋白质或 肽。
     D. 核酸的扩增
     可根据标准方法 (Sambrook 等， 2001) 从细胞、 组织或其它样品中分离用作扩增模 板的核酸。在某些实施方案中， 对基本上没有纯化模板核酸的样品进行分析。核酸可以是 基因组 DNA。当使用 RNA 时， 首先将 RNA 转化为互补 DNA 可能是理想的。
     本文使用的术语 “引物” 意在涵盖任何能够在模板依赖性方法中引发新生核酸合 成的任何核酸。通常， 引物是十至二十和 / 或三十个碱基对长的寡核苷酸， 但是可使用更长 的序列。引物可以双链和 / 或单链形式提供， 尽管优选单链形式。
     将设计用于与对应于本文所鉴定基因之序列的核酸选择性杂交的引物对在允许 选择性杂交的条件下与模板核酸相接触。 取决于期望的应用， 可选择高严格杂交条件， 所述 条件仅会使得与引物完全互补的序列进行杂交。在另一些实施方案中， 杂交可在低严格条 件下发生， 以允许用引物序列扩增出含有一个或多个错配的核酸。一旦杂交， 模板 - 引物复 合物与一种或多种利于模板依赖性核酸合成的酶相接触。进行多轮扩增 ( 也称为 “多个循 环” ) 直至产生足够量的扩增产物。
     有许多模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的寡核苷酸序列。 最广为 TM 人知的扩增方法之一是聚合酶链式反应 ( 称为 PCR )， 其在美国专利 4,683,195、 4,683,202 和 4,800,159 以及 Innis 等 (1988) 中有详述， 其每篇均通过引用以整体并入本文。
     可用于实施本发明的扩增靶标核酸序列的替代性方法公开于美国专利 5,843,650 、 5,846,709 、 5,846,783 、 5,849,546 、 5,849,497 、 5,849,547 、 5,858,652 、 5,866,366 、 5,916,776 、 5,922,574 、 5,928,905 、 5,928,906 、 5,932,451 、 5,935,825 、 5,939,291 和 5,942,391、 GB 申请 No.2 202 328 和 PCT 申请 No.PCT/US89/01025， 其每篇均 通过引用以整体并入本文。
     E. 基因转移的方法
     认为适于核酸递送从而有效表达本发明组合物的方法包括几乎任何可将核酸 ( 例如 DNA， 包括病毒和非病毒载体 ) 引入细胞、 组织或生物体的方法， 如本文所述或者本领域普通技术人员已知的。这些方法包括但不限于 DNA 直接递送， 例如通过注射 ( 美国 专 利 5,994,624、 5,981,274、 5,945,100、 5,780,448、 5,736,524、 5,702,932、 5,656,610、 5,589,466 和 5,580,859， 其 每 篇 均 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 包 括 显 微 注 射 (Harland 和 Weintraub， 1985 ； 美国专利 5,789,215， 其通过引用并入本文 ) ； 通过电穿孔 ( 美国专利 No.5,384,253， 其通过引用并入本文 ) ； 通过磷酸钙沉淀 (Graham 和 Van Der Eb， 1973 ； Chen 和 Okayama， 1987 ； Rippe 等， 1990) ； 通过使用 DEAE 葡聚糖然后使用聚乙二醇 (Gopal， 1985) ； 通过直接音速加载 (sonic loading)(Fechheimer 等， 1987) ； 通过脂质体介导的转 染 (Nicolau 和 Sene， 1982 ； Fraley 等， 1979 ； Nicolau 等， 1987 ； Wong 等， 1980 ； Kaneda 等， 1989 ； Kato 等， 1991) ； 或者通过微粒轰击 (PCT 申请 No.WO 94/09699 和 95/06128 ； 美国专 利 5,610,042、 5,322,783、 5,563,055、 5,550,318、 5,538,877 和 5,538,880， 其每篇均通过 引用并入本文 )。通过应用例如这些技术， 可稳定地或瞬时转化细胞器、 细胞、 组织或生物 体。
     VII. 实施例
     给出以下实施例以举例说明本发明的多个实施方案， 但不意在以任何方式限制本 发明。本领域技术人员会了解本发明很好地适于实现目的， 以及获得所提及的目标和优势 以及本文中固有的目的、 目标和优势。现有的实施例以及本文所述的方法是优选实施方案 的代表， 其为示例性的， 并且不意在限制本发明的范围。 本领域技术人员会了解权利要求范 围所限定的在本发明宗旨之内涵盖的变动及其它用途。
     实施例 1
     与脓肿形成相关的包膜蛋白质以及疫苗保护
     A. 结果
     本发明人试图研究葡萄球菌脓肿形成的发病机理， 并鉴定出使得葡萄球菌在此病 变内存活和增殖的细菌因子。该研究使用了鼠肾脓肿模型， 其中用半致死量的金黄色葡萄 球菌感染小鼠以产生持续的感染 (Burts 等， 2005)。在感染后第 5 天杀死小鼠， 切除它们 的肾脏， 进行薄切片苏木精伊红染色组织的组织病理学研究， 或者通过将组织匀浆铺板来 统计葡萄球菌负荷的集落形成单位 (CFU)。与野生型临床分离的金黄色葡萄球菌 Newman 株相比 (Baba 等， 2008)， 在分选酶 A 的结构基因中具有转座子插入物的同基因型变体不形 成脓肿 ( 图 1B、 1D 和 1F)。分选酶 A 将许多种具有 LPXTG 基序分选信号的表面蛋白质与细 胞壁包膜锚定， 其负责许多不同毒力因子的表面展示 (Mazmanian 等， 2000 ； Mazmanian 等， 1999)。为了对脓肿形成定量， 目测检查肾脏， 对每个器官给予 1( 存在表面脓肿 ) 或 0( 不 存在 ) 的得分。最终的加和除以肾脏总数得到一个分数值。另外， 将三个随机选择的右侧 肾脏置于 10％福尔马林中过夜， 包埋， 切片， 并用苏木精和伊红染色。 对于每个肾脏， 用显微 镜观察间隔 200μM 的四个箭头状切片。如果病变在检查的任意平面均能观察到， 则将该器 7 官判断为脓肿形成阳性。用 3×10 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌 Newman 株感染的小鼠显示在 16/20 肾脏上有可见病变 (80％表面脓肿 )， 并且在组织病理学检查的 3/3 肾脏中呈脓肿形 成阳性 ( 表 3)。相反， 用 ΔsrtA 突变体感染的小鼠显示 0％的表面脓肿， 以及 0/3 组织学 病变 ( 表 3)。
     表 3. 回收的 CFU( 含标准差 )， 相对于 Newman 株的 log 减少， P 值 (student′ s t 检验 )， 所观察到的表面脓肿百分比， 所观察到的组织学脓肿数。
     用集落形成单位 (CFU) 表示的葡萄球菌负荷平均值， 计算为针对每种攻击菌株使 用十五只一组的 BALB/c 小鼠感染 5 天后匀浆肾组织中的 log10CFU g-1， 显示为平均值的标 准差 (±SEM)。 b
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录为 P 值。 c -1
     细菌负荷的减少， 计算为 log10CFU g 。 c
     通过目测观察 ( 阳性百分比 ) 以及对来自三只动物的苏木精 - 伊红染色薄切片 组织进行的组织病理学测量感染五天后肾组织中的脓肿形成， 由此记录阳性组织的分数值 (3/n)。
     回收的 CFU( 含标准差 )， 相对于 Newman 株的 log 减少， P 值 (student ′ s t 检 验 )， 所观察到的表面脓肿百分比， 所观察到的组织学脓肿数。
     使用扫描电子显微镜来检查感染组织。将肾脏切片、 固定、 在六甲基二硅氮烷 (HMDS) 中脱水， 用 80％铂 /20％钯喷射涂覆， 然后观察。感染了金黄色葡萄球菌 Newman 株 的肾组织在脓肿中心区域内具有细菌。 在紧密连结的菌苔中发现野生型葡萄球菌 ( 图 1G)， 其包含在较大的纤维蛋白荚膜内的纤维结构。这些葡萄球菌巢 (nest) 中没有白细胞， 并且 似乎被粘附性细胞外基质所包埋。感染了 srtA 突变体的肾组织也具有葡萄球菌， 但是， 该72
     a102333540 A CN 102333554说明书62/86 页细菌分散在整个健康肾组织中， 并且其数量比野生型显著减少 ( 图 1H)。
     为了鉴定负责脓肿形成的特异性分选酶 A 底物， 本发明人将含有 bursa aurealis 插入物 (Bae 等， 2004) 的 17 个分选酶底物基因转导进金黄色葡萄球菌 Newman 株中， 并筛 选毒力缺陷的变体。sdrD、 isdB、 clfB、 isdA、 sasB 和 sasD 中的突变造成细菌负荷显著降 低 (P ＜ 0.05)( 图 2)。另外， 在用目测和显微技术分析时， sdrD、 isdB 和 isdA 中的突变显 示较少的脓肿 ( 表 3)。本发明人认为， 表面脓肿＜ 30％以及组织学得分＜ 1/3 的突变显示 出脓肿形成的显著缺陷。表面组织学得分不匹配的突变体不记为缺陷的 ； 而将其归为筛选 误差。令人感兴趣地， clfB 和 sasB 中的突变显示葡萄球菌负荷的缺陷， 但是在脓肿形成方 面不显示缺陷， 而蛋白 A 中的突变显示负荷增加， 同时还显示脓肿形成的缺陷。本发明人想 要知道肾组织中脓肿形成和存活的缺陷是否是由这些突变体无法形成功能性生物膜所致。 换句话说， 脓肿形成的缺陷是否归咎于体外生物膜生长的缺陷？为了研究这一问题， 本发 明人在 96 孔测定板中或盖玻片上培养葡萄球菌， 通过 405nm 的吸光度测量番红精染色的生 物膜。在实验室液体培养基中， 金黄色葡萄球菌 Newman 株不形成生物膜， 但是 Morrissey 及其同事报道了在铁耗尽的 RPMI 中以及 5％大气 CO2 下的生物膜生长 (Johnson 等， 2008)。 使用这些条件， 这里测试的所有突变体菌株均同样良好地生长 ( 数据未显示 )， 但是 srtA、 isdB、 sdrD 或 isdA 中的突变则显示生物膜形成的显著缺陷 (P ＜ 0.05)。这些结果由扫描 电子显微镜实验证实 ( 图 3B、 3C、 3D、 3E、 3F、 3G 和表 4)， 其中金黄色葡萄球菌 Newman 株以 包埋在颗粒状细胞外基质中的多细胞复合物的形式生长 ( 图 3B)。在具有 srtA、 isdB 或 sdrD 突变的葡萄球菌中， 多细胞复合物减少， 细胞外基质减少， 同样的突变也在小鼠中减少 了脓肿形成。因此， 体外生物膜形成可能的确与葡萄球菌形成脓肿的能力相关。本发明人 还测试了消除葡萄球菌中其它包膜因子合成的基因 ( 包括聚 -N- 乙酰葡糖胺 (PNAG/PIA， 其 由 ica 基因的产物合成 )(Heilmann 等， 1996 ； Gotz， 2002) 以及细胞壁相关蛋白 Eap(Scriba 等， 2008 ； Xie 等， 2006) 和 Emp(Hussain 等， 2001)) 中的突变。还测试了葡萄球菌毒力的调 节因子 ： saeR(Novick 和 Jiang， 2003)、 sarA(Cheung 等， 1992)、 mgrA(Chen 等， 2006)、 agrC 和 agrA(Novick， 2003)。emp 中的突变显示最显著的生物膜形成缺陷， 其中番红精吸光度减 少 86％， 扫描 EM 显示无多细胞复合物， 该结果与 Johnson 等 (2008) 的类似研究一致。相 反， Eap 突变体显示轻微但明显的生物膜形成缺陷 ( 图 3A， 表 4)。Emp 和 Eap 是包膜粘附 素， 其介导葡萄球菌和宿主细胞外基质蛋白质纤连蛋白、 玻连蛋白和胶原之间的相互作用 (Scriba 等， 2008 ； Xie 等， 2006 ； Hussain 等， 2001)。所有经测序的金黄色葡萄球菌菌株均 具有这两种蛋白质的基因， 其受两组分系统 SaeRS 以及通用转录因子 SarA 的正调控， 其中 的突变也影响生物膜的形成 (Harraghy 等， 2005)( 图 3A， 表 4)。
     表 4. 体外生物膜测定的 96 孔板。 450nm 下的平均吸光度 ( 含标准差 )， 相比 Newman 株的吸光度降低分数， P 值 (student′ s t 检验 )
     为了研究 Emp 是否是脓肿形成必需的， 用 emp 突变体葡萄球菌攻击小鼠， 在感染后 五天分析肾脏。emp 突变体葡萄球菌分离自肾脏组织， 其与野生型亲本具有相似丰度 ( 图 4A)， 但是这些突变体不能形成脓肿， 而是在整个肾脏组织中保持分散 ( 图 4B)。这些结果 表明， Emp 是体外和体内脓肿和生物膜形成特别必需的包膜因子。注意到， 介导 PNAG 合成 (Heilmann 等， 1997) 之 ica 基因的突变 (icaABCDR) 仅显示生物膜形成的略微减少。尽管 不能产生外多糖， ica 突变体能够产生可通过电子显微镜检测的细胞外基质。另外， ica 突 变体未在体外显示出脓肿形成或细菌负荷的缺陷 ( 图 6A、 6B、 表 5)。因此这些数据表明， 金 黄色葡萄球菌 Newman 株生物膜的细胞外基质不包含 PNAG。Emp 和 Eap 是细胞壁相关表面 蛋白， 其产生可通过葡萄球菌的 SDS 提取以及考马斯染色的 PAGE 分离来检测 ( 图 5A)。使 用此测定， 观察到金黄色葡萄球菌 Newman 株产生大量 Eap 和 Emp。srtA 或 isdB 中的突变 不影响 Emp 和 Eap 的产生或者与细胞壁的结合， 这与以下推测相一致， 即观察到的 srtA 和 isdB 突变体在脓肿和生物膜形成中的缺陷不是由于 Eap 和 Emp 继发作用所导致的。 值得注 意的是， emp 中的突变影响 Eap 的丰度， 推测 Emp 的包膜沉积可能影响 Eap 的表面展示。
     表 5.Ica 毒力。回收的 CFU 平均值， 相比 Newman 株的 log 减少， P 值 (student′ s t 检验 )， 观察到的表面脓肿百分比， 组织学脓肿数。
     因为两种蛋白质主要展示在葡萄球菌表面上， 本发明人设想 Emp 和 Eap 用作合适 的疫苗抗原来预防葡萄球菌疾病。将每个蛋白质的结构基因克隆进 pET15b， 在变性条件下 通过借助 N 端 His-6 标签的亲和色谱纯化重组产物。纯化后， Eap 可被折叠， 并在复性缓冲 液中通过第二轮 Ni-NTA 色谱纯化可溶性产物。纯化的 Emp 不能再折叠， 随后保存在 8M 尿 素中 ( 图 5B)。用完全弗氏佐剂 (CFA) 乳化的 PBS、 Eap 或 Emp 免疫小鼠， 用 3×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击小鼠。图 5C 显示， 用 Emp 或 Eap 免疫赋予了对葡萄球菌感染的 有效保护 (P ＜ 0.05)。经 Eap 免疫的小鼠显示葡萄球菌负荷降低 2log， 而经 Emp 免疫的小 鼠显示降低 2.5log。用 Eap(1 ∶ 24000) 或 Emp( ＞ 64000) 免疫的小鼠产生高效价的反应 性 IgG( 图 5D)。如预期地， 用 PBS 模拟免疫的动物产生 70％的表面脓肿和 4/5 的组织学脓 肿。相反， 用 Eap 和 Emp 免疫的小鼠表现出＜ 20％的表面脓肿和 1/5 的组织病变 ( 图 5E)。 因此， 用 Eap 或 Emp 免疫产生针对葡萄球菌感染的特异性体液免疫应答和保护性免疫。
     研究表明， 在受感染宿主组织中葡萄球菌生物膜生长和形成脓肿能力之间的相关 性。 先前的工作证实， 生物膜是植入式医疗器械的定殖和持续感染所必需的， 并且带来针对 抗生素、 抗体和吞噬细胞的保护。本文给出的证据表明， 生物膜是葡萄球菌在器官组织中 有效定殖 (seeding) 和持续增殖所必需的。鉴定到三个分选酶底物基因—— sdrD、 isdB 和 isdA， 其显示在受感染组织中脓肿形成、 葡萄球菌负荷以及体外生物膜生长方面的组合缺 陷。 值得注意地， 在葡萄球菌分选酶锚定表面蛋白质的比较性评价中， 这些表面蛋白质基因 的产物也被鉴定为首选的候选疫苗 (Stranger-Jones 等， 2006)。这些特征现在也可扩展到 两种细胞壁相关因子 Emp 和 Eap。至少 emp 是脓肿形成和生物膜生长所需的， 用 Emp 产物进 行免疫提供了针对葡萄球菌疾病的保护性免疫。因此， 这些研究扩展到预防金黄色葡萄球 菌对人的感染的合适候选疫苗列表， 从而选择细胞壁锚定和细胞壁相关蛋白， 其组合制剂 应提供针对所有葡萄球菌菌株的强保护性免疫。
     葡萄球菌脓肿形成和持续感染的动物模型。 为了表征金黄色葡萄球菌脓肿形成的 发病机理， 对肾脓肿模型进行了修饰 (Albus 等， 1991)， 其中用 1×107CFU 的人临床分离物 金黄色葡萄球菌 Newman 株通过静脉内注射感染 BALB/c 小鼠 (Baba 等， 2007)。在感染后 的 6 个小时内， 99.999％的葡萄球菌从血流中消失， 通过脉管系统分布 ( 图 7A)。葡萄球菌快速扩散到外周组织， 因为肾脏及其它外周器官组织中的细菌负荷在最初三个小时内达到 5 -1 1×10 CFU g ( 图 7B)。肾脏组织中葡萄球菌负荷在 24 小时内增加了 1.5log CFU( 图 7B)。 感染 48 小时后， 小鼠在多个器官中产生分散的脓肿， 这可由对苏木精伊红染色的薄切片肾 脏组织进行光学显微镜观察而检出 ( 图 7D-K)。初始脓肿直径为 524μM(±65μM) ； 病变 最初的特征是多形核白细胞 (PMN) 流入， 并且没有可辨别的葡萄球菌组织， 其大部分似乎 位于 PMN 内 ( 图 8A-C)。感染第 5 天， 脓肿的大小增加， 并且包裹了葡萄球菌的中心群体， 其由嗜伊红的无定形物质的层和一条大的 PMN 带所围绕 ( 图 8D-F)。组织病理学显示， 在 脓肿病变的中心与葡萄球菌病灶接近处有大量 PMN 坏死， 以及健康吞噬细胞的覆盖层 ( 图 8D-F)。还观察到， 脓肿病变周围的坏死 PMN 边界将健康肾组织和受感染病变分隔开的边缘 的嗜伊红无定形物质 ( 图 8D-F)。在第 15 天或第 36 天， 脓肿最终达到≥ 1,524μM 的直径 4 ( 图 7K)。在较晚的时间间隔， 葡萄球菌负荷增加到 10 -106CFU g-1， 生长的脓肿病变朝器官 被膜迁移 ( 图 7J-K)。 外周病变易于破裂， 从而释放坏死的物质和葡萄球菌进入腹膜腔或腹 膜后隙。这些事件导致菌血症以及第二波脓肿， 最终造成这些感染的致死结局 ( 数据未显 示 )。
     葡萄球菌脓肿群落由假荚膜所包裹。为了对肾组织中葡萄球菌负荷进行统计， 将 动物杀死， 切除其肾脏， 将组织匀浆散布到琼脂培养基上进行集落形成。在感染第 5 天， 观 6 -1 察到金黄色葡萄球菌 Newman 株平均 1×x10 CFU g 肾组织 ( 图 9P)。为了对脓肿形成定 量， 目测检查肾脏， 对每个器官给予 1( 图 9A) 或 0( 图 9F) 的得分。将最终的加和除以肾脏 总数， 计算出表面脓肿百分比 ( 表 6)。 另外， 将随机选择的肾脏在福尔马林中固定， 包埋， 薄 切片， 并用苏木精和伊红染色。对于每个肾脏， 通过显微镜观察 200μM 间隔的四个箭头状 切片 ( 图 9)。对每个切片的病变数计数， 求平均值以定量肾脏内的脓肿数目。金黄色葡萄 球菌 Newman 株导致每个肾脏 4.364±0.889 个脓肿， 在 20 个肾脏中的 14 个上观察到表面 脓肿 (70％ )( 表 6)。
     对肾脏切片， 固定， 脱水并用铂 / 钯喷射涂覆进行扫描电子显微镜观察。图 10A 显 示脓肿中心紧密连结的菌苔中的金黄色葡萄球菌 Newman 株。葡萄球菌包含在无定形假荚 膜中 ( 白色箭头， 图 10A)， 所述假荚膜将细菌与脓肿白细胞的带分隔开。在这些葡萄球菌 中心巢中未观察到免疫细胞， 但是偶然有红细胞位于细菌中 (R， 图 10A)。脓肿中心的细菌 群落 ( 称为葡萄球菌脓肿群落 (SAC)) 显示为均一的， 并且由高电子密度的颗粒状物质所包 覆。出现感染病变的动力学以及金黄色葡萄球菌 Newman 株形成的脓肿的形态学特征类似 于用金黄色葡萄球菌 USA300(LAC) 感染小鼠后所观察到的， 所述金黄色葡萄球菌 USA300 是 在美国目前流行群落获得的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (CA-MRSA) 克隆 (Diep 等， 2006) ( 图 9K-O 和 10C)。
     表 6. 小鼠中金黄色葡萄球菌 Newman 株脓肿形成的基因需求。
     葡萄球菌负荷平均值计算为针对每种攻击菌株使用十五只一组的 BALB/c 小鼠感 染 5 天后匀浆肾组织中的 log10CFU g-1， 显示为平均值的标准差 (±SEM)。 b
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录为 P 值 ： P 值＜ 0.05 认为具有显 著性。 c
     细菌负荷的减少， 计算为 log10CFU g-1。 d
     通过目测观察测量感染五天后肾组织中脓肿形成 ( 阳性百分比 ) e
     来自 8 至 10 只动物的苏木精 - 伊红染色薄切片组织的组织病理学 ： 记录每个肾 脏的平均脓肿数， 再次平均获得最终的平均值 (±SEM)。 f
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录 P 值 ： P 值＜ 0.05 认为具有显著 性。
     分选酶突变体不导致脓肿病变并且无法持续存在。分选酶 A 是一种转肽酶， 其使 金黄色葡萄球菌 Newman 株包膜中的 19 种表面蛋白质固定 (Mazmanian 等， 1999 ； Mazmanian 等， 2000)。早期工作在多个动物模型系统中将分选酶 A 鉴定为毒力因子， 但是该酶对脓肿 形成或持续存在的贡献以及其锚定的表面蛋白质尚未阐明 (Jonsson 等， 2002 ； Weiss 等， 2004)。相比于野生型亲本 (Baba 等， 2007)， 在第 2、 5 或 15 天的目测或组织病理学检查中 同基因型 srtA 变体 (ΔsrtA) 不形成脓肿病变 ( 图 9F-J 和表 6)。在用 strA 突变体感染
     77a102333540 A CN 102333554说明书67/86 页的小鼠中， 在感染第 5 天仅从肾组织回收到 1×104CFU g-1， 其相比于野生型亲本菌株减少了 -1 -6 2.046log10 CFU g 的减少 (P ＝ 6.73×10 )( 图 9P)。MRSA 菌株 USA300 的 srtA 突变体也 观察到类似缺陷 ( 数据未显示 )。扫描电子显微镜显示， srtA 突变体 ( 箭头 ) 是高度分散 的， 并且在否则是健康的肾组织中经常与白细胞相结合 ( 图 10B)。在感染后第 15 天， srtA -1 突变体从肾组织中被清除， 相比于野生型减少了≥ 3.5log10CFU g ( 图 9P)。因此， 锚定表 面蛋白质的分选酶 A 使得在宿主组织中脓肿病变得以形成以及细菌持续存在， 其中葡萄球 菌以群落的形式复制， 所述群落包埋在细胞外基质中并且无定形假荚膜屏蔽了周围的白细 胞。
     葡萄球菌表面蛋白质的基因需求。分选酶 A 将许多种具有 LPXTG 基序分选信号 的蛋白质与细胞壁包膜锚定， 从而提供了许多毒力因子的表面展示 (Mazmanian 等， 2002)。 为了鉴定葡萄球菌脓肿形成所需的表面蛋白质， 将 bursa aurealis 插入物引入编码具有 LPXTG 基序蛋白质之多肽的基因 5′编码序列中 (Bae 等， 2004) 并将这些突变转导进金黄 色葡萄球菌 Newman 株中。静脉内感染小鼠并通过肾脓肿模型进行分析之后， 对所观察到的 -1 毒力缺陷严重程度分级为平均葡萄球菌 CFU g 的 log10 减少 ( 图 11 和表 6)。sdrD、 isdB、 clfB、 isdA、 clfA 和 isdC 中的突变导致细菌负荷减少 ( 表 6)。本发明人认为＜ 30％或更 少的表面脓肿以及组织学脓肿平均值 P ＜ 0.05 的突变体为显著性脓肿形成缺陷， 其包括具 有 sdrD、 isdB 和 isdA 中突变的变体 ( 表 6)。令人感兴趣地是， clfA 和 clfB 中的突变显示 葡萄球菌负荷的缺陷， 但是不显示脓肿形成的缺陷 ( 图 11)。 这些毒力因子的发现与之前的 研究相一致， 后者表明聚集因子蛋白介导纤维蛋白原结合以及对细菌吞噬清除的抗性， 而 这正是血液中病原体存活和扩散所需的特征 (McDevitt 等， 1994 ； Ni Eidhin 等， 1998)。蛋 白 A 通过与免疫球蛋白的 Fc 组分结合而阻碍噬菌作用 (Uhlen 等， 1984 ； Jensen 等， 1958)， 通过血管性血友病因子 (von Willebrand factor) 活化血小板凝集 (Hartleib 等， 2000)， 通过捕获带有 VH3 的 IgM 的 Fab 区域用作 B 细胞超级抗原 (Roben 等， 1995) 以及通过其对 TNFR1 的活化可引发葡萄球菌肺炎 (Gomez 等， 2004)。蛋白 A 突变体 (spa) 显示葡萄球菌负 荷少量减少 ( 第 5 天 )， 但是， 与野生型、 clfA 和 clfB 菌株不同， spa 变体形成脓肿的能力 降低 ( 图 11 和表 6)。
     葡萄球菌的碳水化合物和包膜相关蛋白。 金黄色葡萄球菌显示两种碳水化合物结 构——荚膜多糖 (CPS)(Jones 2005) 和聚 -N- 乙酰葡糖胺 (PNAG)(Gotz 2002)。金黄色葡 萄球菌 Newman 株和 USA300 合成 5 型 CPS， 其由重复三糖亚单位 [ → 4)-β-D-ManAcA-(1 → 4) -α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 → ] 构成 (Baba 等， 2007)。 cap5 基因簇的核 苷酸序列包含 16 基因的操纵子 (capA-P) 及其产物中的两个——CapP 和 CapO， 它们在合成 UDP-N- 乙酰基氨基甘露醇醛酸 (UDP-N-acetylmannosaminuronic acid， UDP-ManNAcA) 中 作为差向异构酶和脱氢酶来起作用 (O’ Riordan 和 Lee， 2004 ； Sau 等， 1997)。 如预期地， capO 中 bursa aurealis 插入消除了 CPS5 的合成 ( 数据未显示 )。PNAG( 或 PIA)——一种线性 β(1-6)- 连接葡糖胺聚糖——由 2- 脱氧 -2- 氨基 -D- 吡喃葡萄糖基残基构成， 其 80-85％ 是 N9 乙酰基化的 (Mack 等， 1996) ； 剩余的葡糖胺残基带正电， 并促进多糖与细菌包膜的结 合 (Vuong 等， 2004)。PNAG 由细胞内粘附素基因座 (icaADBC) 的产物所合成 (Heilmann 等， 1996 ； Cramton 等， 1999)。金黄色葡萄球菌两种碳水化合物结构并非动物感染致病性必需 的， 因为 capO 以及 icaADBC 中的突变或者调节子 icaR 不影响第 5 天的细菌负荷、 葡萄球菌群落的建立或者肾脓肿形成 ( 表 6)。还研究了包膜相关蛋白对葡萄球菌脓肿形成的贡献。 包膜相关蛋白的标志是它们可通过在热 SDS 中煮沸来提取。此方法用于检测两种此类蛋白 质 Eap 和 Emp 在金黄色葡萄球菌 Newman 株包膜中的沉积。除了宿主组织中脓肿形成和细 菌持续存在的显著缺陷之外， 在 emp 中具有 bursa aurealis 插入的突变体显示在感染第 5 天肾组织中细菌负荷降低 ( 图 12， 表 6)。对于 eap 突变体未观察到脓肿形成的减少， 而第 5 天和 15 天葡萄球菌负荷的减少表明宿主组织中细菌持续存在的缺陷 ( 图 12， 表 6)。使用 免疫荧光实验测定感染期间 Emp 和 Eap 的表达 ( 图 12J-K)。在假荚膜中发现 Eap 沉积， 而 在葡萄球菌脓肿群落中检测到 Emp。 这些结果支持了以下模型， 其中 Emp 对葡萄球菌群落的 形成有贡献， 其引发了脓肿病变， 而假荚膜中 Eap 沉积促进宿主组织中细菌的持续存在。
     作为疫苗抗原的包膜相关蛋白质。之前的工作试图通过研究纯化的分选酶 A 底物引发针对葡萄球菌疾病的保护性免疫的能力来表征金黄色葡萄球菌疫苗抗原 (Stranger-Jones 等， 2006)。 当用作单个亚单位疫苗抗原时， 表面蛋白质产生不同程度的保 护； 用 SdrD、 IsdA、 IsdB、 SdrE、 SpA ClfA 和 ClfB 进行免疫显著减少了细菌负荷， 但是这些 疫苗中均不提供完全的保护。相反， 四种抗原的组合产生强得多的针对脓肿形成或几种不 同金黄色葡萄球菌菌株致死攻击的疫苗保护 (Stranger-Jones 等， 2006)。重组 Eap 和 Emp 纯化自大肠杆菌， 使用这些蛋白质免疫 BALB/c 小鼠， 以应对随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株的攻击 ( 图 13)。免疫后， 小鼠产生对两种包膜相关蛋白的体液免疫应答 ( 图 13A)。用 Emp 免疫导致肾组织中葡萄球菌负荷少量的降低 0.959log10CFU g-1(P ＝ 0.5114)， 而用 Eap -1 实现了显著水平的保护 ( 细菌负荷降低 1.939log10 CFU g ， P ＝ 0.0079)( 图 13B)。为了 检测 Emp 或 Eap 特异性抗体是否提供对葡萄球菌攻击的保护， 免疫兔子， 并通过亲和色谱纯 化 Emp 特异性抗体和 Eap 特异性抗体。
     将 5mg kg-1(85μg/ 动物 ) 纯化的抗体被动免疫接种到幼稚BALB/c 小鼠的腹腔中， 在转移后 24 小时导致虽低但是可检出水平的血清 IgG( 对于 Eap 抗体效价为 1,000±110， 对于 Emp 为 1,124±236， 图 13C)。平行地， 通过静脉内接种注射金黄色葡萄 球菌 Newman 株攻击经被动免疫的动物， 在与模拟对照比较时， 其导致对于经 Eap 免疫的动 -1 物 (n ＝ 10) 在第 4 天葡萄球菌负荷减少 1.36log10 CFU g (P ＝ 0.0085)， 以及脓肿形成数 目减少 ( 经模拟处理的为 4.64±1.09 脓肿 / 肾脏， 相比于经 Eap 免疫的 1.40±0.48， P＝ 0.028， n ＝ 14 和 10， 图 13D-E)。
     接受 Emp 特异性抗体的动物 (n ＝ 9) 显示在第 4 天葡萄球菌负荷减少 1.20log10 -1 CFU g (P ＝ 0.0132)， 但是脓肿形成数量仅略微减少 (2.0±0.98， P ＝ 0.1362， 图 13D-E)。 总之， 与分选酶锚定表面蛋白相似， 针对包膜相关因子的抗体可在小鼠中产生对葡萄球菌 感染的保护。
     B. 材料和方法
     细菌菌株和培养。 葡萄球菌培养于 37℃的胰酶大豆琼脂或液体培养基中。 大肠杆 菌菌株 DH5α 和 BL21(DE3) 培养于 37℃的 Luria 琼脂或液体培养基中。分别使用氨苄西林 (100μg/ml) 和红霉素 (10μg/ml) 进行质粒和转座子突变体选择。
     转座子诱变。将来自 Phoenix 文库的插入突变转导进人临床分离物金黄色葡萄球 菌 Newman 株。每个突变体带有转座子 bursa aurealis， 其在目的基因中含有红霉素抗性 盒。如之前所述验证突变 (Bae 等， 2004)。简言之， 提取染色体 DNA(Promega Wizard Kit)，用 AciI(NEB) 消化， 用 T4 连接酶 (Promega) 重新连接形成单个质粒， 使用转座子 bursa aurealis 特异性的引物进行 PCR 扩增。对这些产物测序， 以验证靶基因中的转座子插入。
     克隆、 纯化和抗体产生。使用金黄色葡萄球菌 Newman 株模板 DNA 通过 PCR 扩增 Eap 和 Emp 的编码序列 (Baba 等， 2007)。将 PCR 产物克隆进 pET15b， 以表达具有 N 端 His6 标签融合物的重组蛋白。在弗式压碎器 (French press) 中破碎细菌， 通过超速离心沉淀膜 和不溶成分。通过亲和色谱纯化天然状态的带有 His 标签的 Emp。将含有 Eap 的提取物在 室温下溶于 8M 尿素、 50mM Tris-HCl(pH 8.0)4 ～ 5 小时， 然后以 10,000×g 离心。将含有 变性蛋白的上清进行镍 - 次氨基三乙酸 (Ni-NTA) 亲和色谱 (Promega)。 在含有逐渐增高浓 度 (100-500mM) 的咪唑的 PBS-8M 尿素中洗脱蛋白质。合并 Eap 阳性的洗脱级分， 在 PBS-1M Urea 中稀释， 使其通过第二 Ni-NTA 柱。用含有咪唑的 PBS 缓冲液洗脱重折叠的 Eap。通 过 280nm 的吸光度确定蛋白质浓度。在第 24 天和 48 天用 CFA(Difco)( 初次免疫 ) 以及 IFA( 加强免疫 ) 乳化的 500μg 蛋白质免疫兔子 (6 月龄新西兰白兔， 雌性， Charles River Laboratories)。在第 60 天， 从兔子取血， 回收血清用于免疫印迹、 免疫荧光显微术或者被 动转移实验。
     扫描电子显微镜。将感染的肾脏 ( 右侧 ) 在 8％戊二酸醛中 4℃下固定 24-48 小 时， 切成 2-5mm 的片， 以暴露内部组织或脓肿。 然后， 通过依次在 25、 50、 75、 90、 100％乙醇中 孵育， 然后在 100％ HMDS 中孵育， 使样品脱水。 脱水后， 装载样品， 用 80％铂 /20％钯喷射涂 覆至 8nm， 然后在 Fei NovaNano SEM200 扫描电子显微镜下观察。对于生物膜测定， 葡萄球 菌培养于 5％ CO2 中盖玻片上除去铁的 RPMI 中， 并在 PBS 中清洗 3 遍。通过在乙醇和 HMDS 中孵育将盖玻片依次脱水， 装载并喷射涂覆， 然后在扫描电子显微镜下观察。
     生物膜形成。 金黄色葡萄球菌菌株培养于用添加了 10％ RPMI1640 和 1％ Casamino acids(Difco) 的 RPMI 1640(Gibco) 处理的 Chelex(Sigma) 中。将过夜培养物培养于 37℃ 下 6％ CO2 中， 然后以 1 ∶ 10 一式四份接种于含有新鲜培养基的 96 孔平底培养板 (Costar) 中。这些平板静置孵育于 37℃下 6％ CO2 中 24 小时。用 1×PBS 将孔清洗三遍， 在 37℃下 干燥 2 小时， 用 1％番红染色。测量 450nm 的吸光度以定量生物膜形成。在至少 3 个独立实 验中测试每个菌株， 使用双尾 student’ s t 检验比较突变体与野生型。
     肾脏脓肿。将金黄色葡萄球菌 Newman 株过夜培养物以 1 ∶ 100 接种于新鲜胰酶 大豆液体培养基， 在 37℃下培养 2 小时。沉淀葡萄球菌， 用 1x PBS 清洗， 悬浮于一定体积 8 的 PBS 中， 使得产生 0.6 的 A600(3×10 CFU/ml)。通过铺板和菌落计数验证接种物。通 过腹膜内注射每千克体重 100mg/ml 的氯胺酮和 2mg/ml 的赛拉嗪麻醉小鼠。用 100μl 细菌悬浮物 (3×107CFU) 通过眶后注射感染 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠 (Charles River Laboratories)。每个葡萄球菌菌株感染 10 或 20 只小鼠的组。感染后第 5 天， 通过吸入 CO2 处死小鼠， 解剖， 切除肾脏， 在 0.01％ Triton X-100 中使用超声仪进行匀浆。依次稀释 等分试样 (20μl)， 铺板用以确定 CFU。将来自每组小鼠的三至四个右侧肾脏固定于室温下 10％甲福尔马林 24 小时。将组织包埋于石蜡中， 薄切片， 用苏木精伊红染色， 进行显微镜检 查。使用 3-4 周龄雌性 BALB/c 小鼠进行持续存在研究。
     免疫。通过将纯化的蛋白质肌内注射到后腿中免疫 BALB/c 小鼠 (24 天龄雌性， 每 组 8 ～ 10 只小鼠， Charles River Laboratories， Wilmington， MA)。 在第 0 天 ( 用完全弗氏 佐剂 1 ∶ 1 乳化 ) 和第 11 天 ( 用不完全弗氏佐剂 1 ∶ 1 乳化 ) 施用抗原 ( 每只动物 25μg纯化蛋白质 )。在第 20 天对小鼠进行眶周取血， 然后第 21 天在另一只眼睛处用 107CFU/ml 细菌进行眶后攻击。在第 25 天处死小鼠， 根据肾脏脓肿模型进行处理。
     免疫荧光显微镜。解剖受感染动物的肾脏， 将其置于冰上 1×PBS 中， 然后速冻于 冷冻模具 (cryomold) 中的 Tissue Tek OCT Compound 中。将样品进行薄切片 (4μm 厚 )， 装载于载玻片上， 保存于 -80℃。 染色前， 将载玻片升至室温， 保持 30 分钟， 固定于冰冷的丙 酮中 10 分钟， 用冰冷的 PBS 清洗两遍。 在室温下用 3％ BSA、 1 ∶ 20 人 IgG(Sigma)、 1×PBS、 0.1％ Tween-80 将载玻片振摇封闭 1 小时。 将特异性兔抗体 (1 ∶ 2,000) 添加到混合物中， 使载玻片再孵育 1 小时。 弃去溶液， 用 PBS 将玻璃载玻片清洗 3 遍， 每次孵育 10 分钟。 将载玻 片置于 3％ BSA、 1×PBS、 0.1％ Tween-80、 1 ∶ 200AlexaFluor-647 小鼠抗兔第二抗体中， 使 之在室温下避光振摇孵育。弃去溶液， 用 PBS 清洗载玻片 3 遍， 置于含有 1 ∶ 1,000Hoechst 染料 (Invitrogen) 以及 1μg/ml BODIPY- 万古霉素的 PBS 中， 使之避光振摇孵育 5 分钟。 用 PBS 再将载玻片清洗一遍， 装载于 Npropylgallate 中， 在 Leica SP5 AOBS 光谱双光子共 聚焦显微镜下观察。
     主动和被动免疫。用纯化的 Eap 或 Emp 或 PBS 在第 0、 11 天免疫 BALB/c 小鼠 (n ＝ 15)。 在免疫后第 20 天， 对 5 只小鼠取血， 获得血清以确定抗体效价， 在第 21 天， 用 1×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击所有小鼠。感染后第 5 天， 在尸检中取出肾脏， 分析肾组织 的葡萄球菌负荷或组织病理学。
     通过亲和色谱 ( 与 sepharose 共价连接的纯化 Eap 或 Emp) 纯化兔 Eap 或 Emp 抗体， 通过腹膜内注射转移到小鼠中。 24 小时后通过眶后注射 1×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击经被动免疫的动物。通过 ELISA 分析主动或被动免疫动物的血清 IgG 效价。感染后 第 4 天， 在尸检中取出肾脏， 分析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。
     实施例 2
     金黄色葡萄球菌合成腺苷以逃脱宿主免疫应答
     A. 结果
     AdsA 是葡萄球菌在血液中存活必需的。为了鉴定逃脱固有免疫应答所需的葡萄 球菌基因， 通过菌落在琼脂培养基上的形成以一定时间间隔记录细菌负荷， 从而研究金黄 色葡萄球菌 Newman 株在 BLAB/c 小鼠或 Sprague-Dawley 大鼠全血中存活的能力 ( 图 15)。 如预期地， 缺少葡萄球菌特异性抗体的幼稚小鼠和大鼠血液中的免疫细胞 ( 数据未显示 ) 无法吞噬并杀死金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 图 15A 和 15D)。与野生型菌株相反， 缺少分 选酶 A 结构基因 (srtA) 的变体显示葡萄球菌逃脱吞噬杀伤的缺陷 (P ＜ 0.05)( 图 15A 和 15D)。分选酶 A 锚定葡萄球菌包膜中多种不同的多肽， 其使用转肽机制和表面蛋白质 C 端 的 LPXTG 基序分选信号来实现 (Mazmanian 等， 2002)。为了研究这些表面蛋白质对葡萄球 菌逃脱吞噬杀伤的贡献， 本发明人将含有 bursa aurealis 插入 (Bae 等， 2004) 的表面蛋白 质基因转导进野生型菌株金黄色葡萄球菌 Newman 株， 测定葡萄球菌变体在血液中的存活 ( 图 15B 和 15E)。clfA 和 sasH(Staphylococcus aureus surface protein， 金黄色葡萄球 菌表面蛋白质 ) 中的突变 ( 下文称为 adsA) 显示一致的存活缺陷。clfA 突变体的表型显 示预期的结果， 因为所编码的凝聚因子 A(ClfA) 产物已知沉淀血纤蛋白并干扰巨噬细胞和 中性粒细胞的吞噬 (Palmqvist 等， 2004 ； Higgins 等， 2006)。AdsA 对致病性的贡献尚不清 楚。AdsA 具有 5’ - 核苷酸酶结构域， 其具有两个特征序列 ILHTnDiHGrL(124-134 位残基 )和 YdamaVGNHEFD(189-201 位残基 )， 表明该蛋白质可催化从 5’ -AMP 合成腺苷。 为了进一步 研究 adsA 在葡萄球菌毒力中的重要性， 本发明人通过将完整的 adsA 基因和上游启动子序 列克隆进表达载体 pOS1， 产生 padsA 来补偿 adsA 基因。用 padsA 转化 adsA 突变体葡萄球 菌恢复了其在小鼠或大鼠血液中存活的能力， 表明所观察到的毒力缺陷确实是由 adsA 表 达缺少造成的 ( 图 15C 和 15F， 以及图 20)。还研究了金黄色葡萄球菌在人志愿者血液中的 存活。如使用鼠血液一样， 相比于野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株， adsA 突变体葡萄球菌 的数目减少， 中性粒细胞的葡萄球菌吞噬增加 ( 图 15G 和 15H)。
     AdsA 是葡萄球菌毒力和脓肿形成所必需的。为了研究 adsA 在侵入性葡萄球菌疾 病中的贡献， 通过静脉内接种 107 菌落形成单位 (CFU) 的野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 或其同基因 asdA 变体感染 BALB/c 小鼠。感染后第 5 天杀死动物， 取出双侧肾脏。将右侧 肾脏匀浆， 通过在琼脂上铺板和菌落形成对葡萄球菌负荷计数 ( 图 16A)。用戊二醛酸固定 左侧肾脏， 在石蜡中包埋， 薄切片并通过组织学进行分析 ( 图 16B)。如预期地， 野生型金黄 7 色葡萄球菌 Newman 株在肾组织中形成脓肿， 平均细菌负荷为每克器官组织 10 CFU。相反， 与野生型相比， adsA 突变体葡萄球菌不能形成脓肿， 并显示减少十倍以上的细菌负荷 ( 图 16A)。
     通过脉冲场凝胶电泳和 DNA 测序表征了从美国社区中获得的 MRSA 菌株 (CA-MRSA) 的感染。目前， 主要的 CA-MRSA 克隆是 USA300(McDougal 等， 2003)， 其是皮肤和软组织感染 以及菌血症的主要原因 (Carleton 等， 2004)。 为了评估 adsA 对 USA300 毒力的贡献， 使用噬 菌体转导和金黄色葡萄球菌 LAC 菌株 (USA300) 分离同基因型 adsA 突变体 (Bae 等， 2004)。 通过将葡萄球菌眼眶后注射进血流感染 BALB/c 小鼠。攻击后第 5 天， 在匀浆肾组织中对葡 萄球菌计数， 在该器官的苏木精 - 伊红染色的薄切片中观察脓肿的组织病理学 ( 图 16C)。 类似于金黄色葡萄球菌 Newman 株， 本发明人观察到用金黄色葡萄球菌 USA300 的 adsA 突变 体感染动物的肾脏回收的 CFU 减少了 1log。 另外， 在 adsA 变体感染的小鼠肾脏中观察到较 少的脓肿和较小的病变 ( 图 16D 和图 21)。这些结果一起说明了 adsA 对于两种临床分离 物——金黄色葡萄球菌 Newman 株和 USA300 毒力的必要性。
     受感染小鼠肾脏中脓肿形成和 CFU 回收的差异可能由于血流中细菌清除的增强 所致， 其导致较少的细菌到达外周器官组织。或者， adsA 可在脓肿和感染病灶的形成中起 直接的作用。为了明确这些可能性， 通过眼眶后接种感染 BALB/c 小鼠， 以一定时间间隔通 过心脏穿刺对外周血取样。与 adsA 突变体葡萄球菌的清除增强的体外结果相一致地， 与野 生型亲本菌株金黄色葡萄球菌 Newman 株相比， 感染后 90 分钟获取的 adsA 突变体葡萄球菌 CFU 显著较少。另外， 用 padsA 转化 adsA 突变体菌株恢复了静脉内攻击后其在血液中存活 的能力 ( 图 16E)。 尽管我们不能排除 adsA 也特异性地贡献于脓肿形成的可能性， 但是这些 数据表明， adsA 突变体葡萄球菌毒力的降低是由于其在血液中存活的减少所致。
     AdsA 介导的腺苷合成与葡萄球菌在血液中的存活相关。由于 AdsA 具有 5’ 核苷酸 酶特征序列， 产生了 AdsA 是否可从 AMP 合成腺苷的疑问。用溶葡萄球菌素降解金黄色葡萄 球菌野生型、 adsA 和 isdB(iron surface determinant B， 铁表面决定因子 B， 不对 AMP 水 解起作用的基因 )(Mazmanian 等， 2003) 突变体菌株以及 adsA:padsA 菌株的细胞壁肽聚糖 (Schindler 和 Schuhardt， 1964)， 将细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育。通 过薄层色谱 (TLC) 监测腺苷的产生。 adsA 突变体葡萄球菌的溶葡萄球菌素提取物显示显著降低的腺苷合酶活性 ( 约为野生型的 25％ )。当用 padsA 转化 adsA 突变体时腺苷合酶活 性恢复到野生型水平 ( 图 17A)。相反地， isdB 的破坏不影响金黄色葡萄球菌生成腺苷。
     为了表征 AdsA 的酶活性， 我们表达并纯化了来自大肠杆菌的可溶性重组形式的 14 AdsA。纯化的 AdsA 切割 [ C]AMP 从而产生腺苷， 在 5mM MgCl2 或 5mM MnCl2 存在时观察到 最大活性 (KM ＝ 44nM)， 这类似于其它腺苷合酶对金属的需求 (Zimmermann， 1992)。另一方 14 面， 在添加 [ C]AMP 之前， 将 AdsA 与 5mM ZnCl2 或 5mM CuSO4 一起孵育， 完全抑制腺苷合酶 活性 ( 图 17B， 泳道 6 和 7)。当添加 EDTA( 一种二价金属离子螯合剂 ) 至 AdsA 时观察到类 似的抑制作用， 表明在体外 AdsA 需要二价阳离子用于腺苷合酶活性。
     设想葡萄球菌通过合成腺苷来逃脱吞噬清除。 adsA 突变体葡萄球菌在血液中的存 活缺陷可通过外源添加腺苷来挽救。 对此进行测试， 显示在添加 1 ～ 100μM 腺苷后 adsA 突 变体葡萄球菌存活的剂量依赖性增加 ( 图 17F)。在生理条件下， 细胞外环境中 AMP 的浓度 估计为纳摩尔范围。但是， 免疫损害或组织损伤导致 AMP 释放， 其浓度可增加到 100μM。因 此， 似乎可解释为， 在葡萄球菌感染过程中这些 AMP 储藏可转变为腺苷。为了评估葡萄球菌 感染过程中腺苷的相对丰度， 用金黄色葡萄球菌感染小鼠血液 60 分钟。获取血浆， 除去蛋 白质， 对样品进行反相高效液相色谱 (rpHPLC)。为了校准， 通过 rpHPLC 分离市售纯化的腺 苷， 并在洗脱液中确定其分子量 ( 图 18A)。 未感染血液的色谱显示腺苷吸收峰， 通过质谱确 定其身份 ( 图 18A)。用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染后， 血液中腺苷峰增加了 10 倍 ( 图 18C)， 而用同基因型 adsA 突变体的感染产生少于 2 倍的腺苷增加 ( 图 18D)。值得注意的 是， 细胞外腺苷通过血细胞快速输入 ( 半衰期＜ 1 分钟 )(Thiel 等， 2003)。考虑到这一点， 金黄色葡萄球菌感染过程中观察到的血液中腺苷增加 10 倍表示此信号分子的大量积累以 及葡萄球菌借此用于对抗宿主免疫力的重要毒力策略。
     炭疽芽孢杆菌在血液中存活并合成腺苷。为了研究其它致病细菌是否可利用腺 苷合酶来促进逃脱吞噬清除， 检索细菌基因组序列中带有 AdsA 腺苷合酶结构域的产物， 并 鉴定到几个不同的基因 ( 表 3)。炭疽芽孢杆菌的基因组编码 BasA(Bacillus anthracis surface protein， 炭疽芽孢杆菌表面蛋白质， NCBI 基因座标签 BAS4031)， 其具有 5’ - 核苷 酸酶特征序列 (YdvisLGNHEFN， 131-142 位残基 ) 和 C 端 LPXTG 分选信号， 表明此表面蛋白 质也由分选酶 A 沉积至细胞壁包膜中 (Gaspar 等， 2005)。为了确定 BasA 是否用作腺苷合 酶并且贡献于逃脱固有免疫应答， 我们通过等位基因替换构建了 basA 的缺失突变体 ( 图 19)。变溶菌素 (mutanolysin) 是一种切割肽聚糖中 N- 乙酰基胞壁酰基 -(β1 → 4)-N- 乙 酰基葡糖胺的胞壁质水解酶， 其用来产生细胞壁裂解物 (Yokigawa 等， 1974)。来自野生型 芽孢杆菌的细胞壁提取物具有腺苷合酶活性， 但是来自 basA 突变体芽孢杆菌的提取物显 示此活性降低 ( 图 19A)。结构基因 basA 的缺失在炭疽芽孢杆菌中消除了 BasA 的表达 ( 图 19B) 和表面展示 ( 图 19C)， 并降低了芽孢杆菌合成腺苷的能力 ( 图 19A)。AMP 水解的残余 量可来自于其它磷酸酶 ( 例如碱性磷酸酶 ) 的贡献。本发明人表达并亲和纯化了来自大肠 杆菌的带标签的 BasA。与金黄色葡萄球菌 AdsA 类似， 在 5mM MnCl2(KM ＝ 2.01nM) 存在时 观察到最优的 BasA 腺苷合酶活性， 而 5mM MgCl2 则显示活性降低 ( 图 19D)。当接种进小鼠 血液中时， 与野生型亲本炭疽芽孢杆菌 Sterne 株相比， 观察到 basA 突变体的吞噬清除增加 ( 图 19E)。这些实验共同表明， 与葡萄球菌类似， 炭疽芽孢杆菌也利用 AdsA 合成腺苷并逃 脱固有免疫应答。表 7. 具有推定 5’ - 核苷酸酶的其它微生物具有推定 5’ - 核苷酸酶的其它微生物代表了公知的病原体 ( 表 7)， 我们尝试分析 其合成腺苷的能力。类似于来自金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌的细胞壁提取物， 粪肠球 菌和表皮葡萄球菌都从 AMP 合成腺苷， 而非致病的微生物枯草芽孢杆菌则不然 ( 数据未显 示 )。 本发明人得出如下结论， 细菌病原体合成腺苷并将此免疫抑制化合物释放进宿主组织 的能力可能代表了普遍的毒力策略。
     B. 材料和方法
     细菌菌株。金黄色葡萄球菌菌株在 37℃下培养于 TSB 中。金黄色葡萄球菌菌株 USA300 通过 Network on Antimicrobial Resistance in S.aureus(NARSA， NIAID) 获得。 本研究中所用的所有突变体均获得自 Phoenix(ΦNΞ) 文库 (Bae 等， 2004)。如所示， 每种 Phoenix 分离物均是临床分离物 Newman 株 (Duthie 和 Lorenz， 1952) 或 USA300(Carleton
     等， 2004) 的衍生物。所有 bursa aurealis 插入均通过使用噬菌体转导进野生型金黄色葡萄球菌 Newman 或 USA300， 并通过 PCR 分析进行验证。 使用 10mg l-1 的氯霉素进行具 有 padsA 的质粒和等位基因的选择。使用 10mg l-1 的红霉素进行金黄色葡萄球菌 Newman 株中等位基因的选择， 使用 50mg l-1 进行 USA300 中的等位基因的选择。使用含有热敏感复 制起点的 pLM4 产生炭疽芽孢杆菌 Sterne 株的突变体。将突变每一侧有 1kb DNA 序列的质 粒转化进炭疽芽孢杆菌， 在 LB 液体培养基 (20μg ml-1 卡那霉素 ) 中 30℃ ( 允许温度 ) 下 培养转化子。以 1 ∶ 100 稀释培养物， 铺板于 LB 琼脂 (20μg ml-1 卡那霉素 ) 上， 在 43℃ 下 ( 限制性温度 ) 过夜。将单菌落接种进不含抗生素的 LB 液体培养基， 在 30℃下过夜培 养。为了确保基于 pLM4 的质粒的丢失， 将这些培养物在无抗生素压力的新鲜 LB 液体培养 基中稀释四次， 在 30℃下增殖。稀释培养物， 铺板于 LB 琼脂上， 检查菌落的卡那霉素抗性。 通过 PCR 分析来自卡那霉素敏感性菌落的 DNA 中突变体等位基因的存在与否。
     质粒。利用下列引物进行 PCR 扩增反应 ： P55(5’ -TTTCCCGGGACGATCCAGCTCTAATCG CTG-3′ )(SEQ ID NO ： 42)， P56(5’ -TTTGAGCTCAAAGCAAATAGATAATCGAGAAATATAAAAAG-3′ ) (SEQ ID NO ： 43)， P57(5’ -TTTGAGCTCAGTTGCTCCAGCCAGCAT T-3′ )(SEQ ID NO ： 44)， P58(5 ’ -TTTGAATTCAAACGGATTCATTCCAGCC-3′ )(SEQ ID NO ： 45)， FP10(5’ -TACGAATTCGACTTGGCAG )(SEQ GCAATTGAAAA-3’ )(SEQ ID NO ： 46)， RP10(5’ -TGTGAATTCTTAGCTAGCTTTTCTACGTCG-3’ ID NO ： 47)， FP3C(5’ -TCGGGATCCGCTGAGCAGCATACACCAATG-3’ )(SEQ ID NO ： 48)， RPB(5’ -T GTGGATCCTTATTGATTAATTTGTTCAGCTAATGC-3’ )(SEQ ID NO ： 49)。将 FP10/RP10(adsA+ 起始 位点上游 700bp)PCR 产物连接进 pOS1(EcoRI) 产生 padsA。将 P55/P56(basA 1kb5’ 侧翼序 列 ) 和 P57/P58(basA 1kb 3’ 侧翼序列 )PCR 产物插入到 pLM4(EcoRI、 SacI 和 XmaI 位点 ) 中产生 pJK34。使用此质粒来缺失 basA 编码序列。将连接产物转化进大肠杆菌 DH5α， 将 质粒 DNA 转化进大肠杆菌 K1077(dam ， dcm ) 以及按照之前成熟的方案 (Gaspar 等， 2005) 将 纯化的 ( 非甲基化 ) 质粒 DNA 转化进炭疽芽孢杆菌。将 FP3C/RPB( 起始自信号肽后 5’ 的 adsA 的 1.2kb 截短 )PCR 产物连接进 pGEX-2T(GE Healthcare) 产生 adsA 表达载体 pVT1， 将此质粒转化进大肠杆菌 BL21。
     动物实验。 所有实验方案均经过芝加哥大学学术生物安全委员会 (Institutional Biosafety Committee， IBC) 和学术生物管理及使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee， IACUC) 的审查、 批准并在其规定下实施。BALB/c 小鼠购自 Charles River Laboratories， Sprague-Dawley 大鼠购自 Harlan。金黄色葡萄球菌菌株的过夜培 养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 清洗两遍， 在 8 -1 PBS 中稀释得到 0.5 的 OD600 值 (1×10 CFU ml )。通过胰酶大豆琼脂平板上菌落形成对活 的葡萄球菌进行计数， 从而对感染量进行定量。通过腹膜内注射每千克体重 80-120mg 氯胺 酮和 3-6mg 赛拉嗪麻醉小鼠。通过眼眶后注射将一百微升细菌悬液 (1×107CFU) 静脉内施 用到 BALB/c 小鼠 (6 周龄雌性 )。在第 5 天， 通过压缩 CO2 吸入杀死小鼠。取出肾脏， 在含 有 1％ Triton X-100 的 PBS 中匀浆。稀释匀浆液的等分试样， 在琼脂培养基上铺板以用于 一式三份地确定 CFU。使用 Prizm 软件进行 student’ s t 检验统计学分析。对于组织病理 学， 在室温下将肾脏组织在 10％福尔马林中孵育 24 小时。 将组织包埋于石蜡中， 薄切片， 用 苏木精 - 伊红染色， 并进行显微镜检查。
     为了测定葡萄球菌在血液中的存活， 用 1×107CFU 葡萄球菌通过眼眶后注射感染 6周龄雌性 BALB/c 小鼠。在第 30 或 90 分钟， 通过压缩 CO2 吸入杀死小鼠， 通过使用 25 号针 的心脏穿刺收集血液。 将等分试样在冰上 0.5％皂苷 /PBS 终浓度下孵育 30 分钟， 以裂解宿 主真核细胞。将稀释物在 TSA 上铺板， 从而对两个不同时间点的存活 CFU 进行计数。
     化学物质。变溶菌素 (Sigma) 以 5,000 单位 ml-1 的浓度悬浮于含有 1mM PMSF 的 100mM 磷酸钠 (pH 6.0) 中， 保存于 -20C。 [14C]AMP 和 [14C] 腺苷购自 Moravek Biochemicals。 溶葡萄球菌素 (Lysostaphin) 购自 AMBI， 纯化的腺苷购自 Sigma。
     血液中的细菌存活。将金黄色葡萄球菌菌株过夜培养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37 ℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 清洗两遍并在 PBS 中稀释至 OD600 为 8 -1 0.5(1×10 CFU ml )。 通过对 Sprague-Dawley 大鼠或 BALB/c 小鼠进行心脏穿刺收集全血， -1 并立刻添加 5μg ml 的来匹卢定抗凝剂。将 100μl 的 105CFU ml-1 细菌与 900μl 大鼠或 小鼠血清相混合。对于人血研究， 将 100μl 的 108CFUml-1 细菌与 900μl 新鲜提取的人血 液相混合。 然后， 将试管在 37℃下以低转速孵育所示时间， 在所示时间点将等分试样在冰上 0.5％皂苷 /PBS 终浓度下孵育 30 分钟， 以裂解真核细胞。 将葡萄球菌稀释物在 TSA 上铺板， 以计数存活的 CFU。使用来自人志愿者的血液的实验包括了经过芝加哥大学学术评审会议 (Institutional Review Board， IRB) 的评审、 批准并在其规定下实施的方案。
     腺苷合酶活性。 将金黄色葡萄球菌菌株过夜培养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 用 PBS 清洗两遍。离心下来 3ml 的细胞， 将其在 100μL TSM 缓冲液 (50mM Tris-HCL(pH 7.5)， 10mM MgCl2 和 0.5M 蔗糖 ) 中重悬， 然后添加 2μl 的溶葡萄球菌素， 使之在 37℃下孵育 30 分钟。然后， 以 10k rpm 将溶液离心 5 分钟， 收集含有释放的细胞表面蛋白质的上清。 然后， 将 15μl 溶葡萄球菌素提取物与 3μCi[14C] AMP 在 37℃下一起孵育 30 分钟。随后， 将样品点样于硅平板上， 之后使用 (75 ∶ 25 异丙 醇∶ ddH2O)0.2M 碳酸氢铵溶剂通过 TLC 进行分离。对于用变溶菌素消化的金黄色葡萄球 菌、 粪肠球菌、 炭疽芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的细胞壁提取物， 用变溶菌素替代溶葡萄球菌 素， 并且根据制造商建议的条件使用。当用纯化的蛋白进行测定时， 在 TSM 缓冲液中所示金 属阳离子存在下， 将 2μM 纯化的 AdsA 或 BasA 在 15μl 终体积中与 3μCi[14C]AMP 一起孵 育。
     血液中腺苷浓度。如上所述进行葡萄球菌的全血杀死测定。如上所述进行血浆提 取 (Mo 和 Ballard， 2001)。简言之， 全血杀死测定的结束后， 将血液样本以 13k rpm 离心 5 分钟， 收集无细胞血浆。然后， 用 75μl 全氯酸 (1.5M) 和 1mM EDTA 萃取 600μl 血浆。以 13k rpm 离心 5 分钟后， 吸取上清 (500μl)， 用 29μl 4M KOH 中和。用冰冷却 10 分钟后， 将样品再次以 13k rpm 离心 5 分钟。最终将上清的 pH 调节至 6-7， 用 PBS 以 1 ∶ 4 稀释， 用 0.22μm 注射器滤器过滤， 然后进行反相高效液相色谱 (rpHPLC)。
     HPLC 和质谱。通过 rpHPLC 确定腺苷的产生。将样品利用 250mm×3mm 柱 (BDS Hypersil C18， 5μm 粒径， Thermoscientific) 进行色谱。流动相由溶液 A(dH2O ∶ 0.1％三 氟乙酸 ) 和溶液 B( 乙腈∶ 0.1％三氟乙酸 ) 组成。用 1 ～ 100％的溶剂 B 梯度洗脱腺苷， 从 5 分钟运行到 50 分钟。溶剂流速为 0.5ml/ 分钟。通过 280nm 的 UV 吸收检测峰。通过 将其驻留时间与用作标准样品的纯化腺苷 (Sigma) 的驻留时间进行比较鉴定 HPLC 色谱图 中腺苷的峰。然后， 将含有腺苷的级分与基质 (α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 ) 共同点样， 在具 有反射器的条件 (reflector positive condition) 下进行 MALDI-MS。参考文献
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     发明背景技术领域 本申请要求 2008 年 10 月 6 日提交的美国临时申请序列号 61/103,196、 2008 年 10 月 6 日提交的美国临时申请序列号 61/103,190、 2009 年 4 月 20 日提交的美国临时申请序 列号 61/170,779 的优先权， 其全部内容通过引用并入本文。
     本发明一般性涉及免疫学、 微生物学和病理学领域。 更特别地， 本发明涵盖涉及细 菌蛋白质的方法和组合物， 所述细菌蛋白质可用于引发针对细菌的免疫应答或者提供被动 免疫治疗。所述蛋白质包括 Eap、 Emp、 细菌腺苷合酶 A(AdsA) 和 / 或包含 Eap、 Emp 和 / 或 AdsA 氨基酸序列的肽或蛋白质以及与它们结合的抗体。
     本发明一般性涉及免疫学、 微生物学和病理学领域。 更特别地， 本发明涵盖涉及细 菌蛋白质的方法和组合物， 所述细菌蛋白质可用于引发针对细菌的免疫应答或者提供被动 免疫治疗。所述蛋白质包括 Eap、 Emp、 细菌腺苷合酶 A(AdsA) 和 / 或包含 Eap、 Emp 和 / 或 AdsA 氨基酸序列的肽或蛋白质以及与它们结合的抗体。
    背景技术 近年来， 社区获得性感染和医院获得性感染的数目不断增加。医院获得性 ( 医源 性 ) 感染是致病和致死的主要原因。 在美国， 医院获得性感染每年感染超过 2 百万患者。 最 常见的感染是尿道感染 ( 占感染的 33％ )， 其次是肺炎 (15.5％ )、 手术部位感染 (14.8％ ) 和原发血流感染 (13％ )(Emorl 和 Gaynes， 1993)。
     金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 凝固酶阴性葡萄球菌 ( 主要是表皮 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis))、 肠 球 菌 属 (enterococcus) 物 种、 大肠杆菌 (Escherichia coli) 和绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 是主要的医源性病原体。 尽管这些病原体造成大致相同数目的感染， 但是它们可导致的疾病严重程度以及抗生素抗 性分离株的出现频率使得金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌成为最引人注目的医源性病原 体。
     表皮葡萄球菌是正常的皮肤共生物， 其也是造成受损医疗器械感染和手术部位感 染的重要机会性病原体。 由表皮葡萄球菌感染的医疗器械包括心脏起搏器、 脑脊液分流器、 连续可移动腹膜透析导管、 整形外科装置和假体心脏瓣膜。
     金黄色葡萄球菌是最常见的医源性感染原因， 其具有显著的致病性和致死率。 它可导致骨髓炎、 心内膜炎、 脓毒性关节炎、 肺炎、 脓肿和中毒性休克综合征。金黄色葡 萄球菌可在干燥表面上存活， 这增加了传播的机会。任何金黄色葡萄球菌感染均可导致 葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征 ( 皮肤对吸收进血液之外毒素的应答 )。它还可导致一 种称为脓血症的败血病， 其可危及生命。令人头痛地， 甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA) 已成为医院获得之感染的主要 原因。
     金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染通常用抗生素进行治疗， 所选药物是青霉 素， 但针对甲氧西林抗性分离株则使用万古霉素。表现出抗生素广谱抗性的葡萄球菌菌株 的比例日益增加， 这威胁到有效的抗微生物治疗。 另外， 最近出现的万古霉素抗性金黄色葡 萄球菌菌株引起了对 MRSA 菌株出现并传播且没有可用的有效治疗的担忧。
     金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 凝固酶阴性葡萄球菌 ( 主要是表皮 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis))、 肠 球 菌 属 (enterococcus) 物 种、 大肠杆菌 (Escherichia coli) 和绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 是主要的医源性病原体。 尽管这些病原体造成大致相同数目的感染， 但是它们可导致的疾病严重程度以及抗生素抗 性分离株的出现频率使得金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌成为最引人注目的医源性病原 体。
     表皮葡萄球菌是正常的皮肤共生物， 其也是造成受损医疗器械感染和手术部位感 染的重要机会性病原体。 由表皮葡萄球菌感染的医疗器械包括心脏起搏器、 脑脊液分流器、 连续可移动腹膜透析导管、 整形外科装置和假体心脏瓣膜。
     金黄色葡萄球菌是最常见的医源性感染原因， 其具有显著的致病性和致死率。 它可导致骨髓炎、 心内膜炎、 脓毒性关节炎、 肺炎、 脓肿和中毒性休克综合征。金黄色葡 萄球菌可在干燥表面上存活， 这增加了传播的机会。任何金黄色葡萄球菌感染均可导致 葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征 ( 皮肤对吸收进血液之外毒素的应答 )。它还可导致一 种称为脓血症的败血病， 其可危及生命。令人头痛地， 甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA) 已成为医院获得之感染的主要 原因。
     金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染通常用抗生素进行治疗， 所选药物是青霉 素， 但针对甲氧西林抗性分离株则使用万古霉素。表现出抗生素广谱抗性的葡萄球菌菌株 的比例日益增加， 这威胁到有效的抗微生物治疗。 另外， 最近出现的万古霉素抗性金黄色葡 萄球菌菌株引起了对 MRSA 菌株出现并传播且没有可用的有效治疗的担忧。
     针对金黄色葡萄球菌或针对其所产生的外蛋白质 (exoprotein) 的第一代疫苗获 得了有限的成功 (Lee， 1996)。 仍需要开发针对葡萄球菌感染的有效疫苗。 也需要治疗葡萄 球菌感染的另外的组合物。
     发明概述
     在住院或健康个体中， 金黄色葡萄球菌是唯一最常见的菌血症和软组织感染的原 因， 死亡率的显著提高归因于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌株的传播， 该菌株常 常对抗生素治疗不敏感 (Klevens 等， 2007 ； Klevens 等， 2006)。具有特征性纤维蛋白沉积 和大量免疫细胞浸润的脓肿代表了葡萄球菌感染的病理基质 (Lowy， 1998)。使用扫描电子 显微镜观察葡萄球菌脓肿中心的生物膜样结构。遗传分析显示， 体外生物膜形成与葡萄球 菌形成脓肿的能力有关， 本发明人鉴定了对于这两个过程来说必需的包膜蛋白质。当纯化 并用于免疫小鼠时， Emp 和 Eap 对葡萄球菌感染产生了保护性免疫。使用结合 Eap 之抗体 或结合 Emp 之抗体的被动免疫也证明了治疗作用。
     本申请在一个实施方案中描述了 Emp 和 / 或 Eap 或者结合 Emp 或 Eap 之全部或部 分的抗体在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。本申请还提供了 包含 Emp 和 / 或 Eap 抗原或者其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可 用于治疗 ( 例如在对象中限制葡萄球菌脓肿形成和 / 或持续存在 ) 或预防细菌感染的方法 和组合物。 在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或抗原之全部或部分以及 ( 在某些方面中 ) 其它细菌蛋白质的有效量的组合物。其它 细菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子， 和 / 或 (iii) 多糖， 等等。
     在另一些方面中， 可向对象施用 Emp 和 / 或 Eap 调节剂， 例如结合 Emp 和 / 或 Eap 的抗体 ( 例如多克隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 )。Emp 和 / 或 Eap 调节剂可直接结合 Emp 和 / 或 Eap。Emp 和 / 或 Eap 调节剂可以是结合 Emp 和 / 或 Eap 的抗体或细胞。抗体可 以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， Emp 和 / 或 Eap 调 节剂通过向对象或来源对象 ( 例如供体 ) 中提供能够产生结合 Emp 和 / 或 Eap 之抗体的 Emp 和 / 或 Eap 肽而得到。Emp 和 / 或 Eap 调节剂通常配制成可药用组合物。Emp 和 / 或 Eap 调 节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结合此类分子 ( 例如 EsxA、 EsxB、 EsaB、 EsaC、 SdrC、 SdrD、 Hla、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasH(AdsA、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SasF) 的抗体。 可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂组合使用的另外的葡 萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素 氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。葡萄球菌抗原或抗体可以与 Emp 和 / 或 Eap 调节 剂同时施用。葡萄球菌抗原或抗体以及 Emp 和 / 或 Eap 调节剂可以在同一组合物中施用。一些实施方案涉及在可药用组合物中包含结合 Emp 和 / 或 Eap 抗原或者其片段 的分离抗体或其片段的治疗性组合物， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染。所述抗体可以是人或人源化抗体。在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗 体或单链抗体或者其片段。抗体组合物还可包含结合选自以下一种或多种抗原之至少一 种另外的分离抗体或其片段 ： ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SdrC、 SdrD、 SdrE 和 SpA 抗原 )。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂组合使用的葡萄球菌抗原的额外抗体包括但不限于针对 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     Emp 和 / 或 Eap 调节剂还可以是编码 Emp 和 / 或 Eap 肽的重组核酸分子。重组核 酸分子可编码 Emp 和 / 或 Eap 肽， 以及至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。 核酸可编码 或者多肽可包含多种抗原， 所述抗原包括以下抗原之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA 或其变体。核 酸可编码额外的葡萄球菌抗原， 其包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， 所述方法和组合物使用或包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽、 肽 或抗原之全部或部分， 以及与它们结合的抗体。 在另一些方面中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡 萄球菌因子或细菌因子联用， 例如以下的全部或部分 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA， 或者其免疫原性片段或其组合。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂联用的额外葡萄球菌抗原 包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNAIII 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些实施方案中， 可以从本发明的方法、 组合物或制剂中具 体排除或包含以下分子中的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 种或更多种 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。可明确排除的额外葡萄球菌抗原包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。 本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或编码其的核苷酸。 在又一些方面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽是多聚化的， 例如二聚化的。在本发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个分离 的细胞表面蛋白质或其区段的多聚体。在另一方面中， 其它多肽或肽可表达或包含在细菌 组合物中， 其包括但不限于 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其免疫原性片 段。可表达或包含在细菌组合物中的额外的葡萄球菌多肽包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白 结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结 合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋 白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。或者， 所述组合物可以是或包含经重组改造的葡萄球菌， 其以某种方式被改变， 包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行特定改变。例如， 所述细菌可被重组修饰为表达与 未修饰时相比更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     术语 “Emp 多肽” 或 “Eap 多肽” 是指包括从葡萄球菌中分离的野生型 Emp 或 Eap 蛋白的多肽， 以及刺激针对葡萄球菌 Emp 或 Eap 蛋白之免疫应答的变体和区段或片段。类 似地， 术语 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白是指包括从葡萄球菌分离的野生型 EsaB、
     EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA) 或 SpA 多肽的蛋白质， 以及刺激针对葡萄球菌 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白之免疫应答的变体、 区段或片段。此外， 术语 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白表示包括从 葡萄球菌分离的野生型 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨 基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 以及刺激针对葡萄球菌 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白之免疫应答的 变体、 区段或片段。免疫应答是指生物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。可通过包 括下列但不限于此的测定来检测免疫应答 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体 的存在或量的测定、 测量 T 细胞活化或增殖的测定和 / 或测量与一种或多种细胞因子之活 性或表达有关的调节的测定。
     本发明的一些实施方案包括在对象中引发针对葡萄球菌之免疫应答的方法， 其 包括向对象提供 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种有效量的抗原或其区段 / 片段。葡萄 球菌抗原包括但不限于 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其 区段、 片段或免疫原性片段。额外的葡萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 多肽或其免疫原性片段可与以下一种或多种 蛋白的一种或多种抗原或免疫原性片段相组合地提供 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdSA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。 也可使用以下额外抗原或免疫原性片段 ： 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     本发明的一些实施方案包括可包含与以下蛋白在 5、 10、 15、 20、 50、 100、 200 或 更多连续氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 上有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或相似性之多肽、 肽或蛋白质的组合物 ： Emp、 Eap EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在本发明的另一实施 方案中， 组合物可包含与 Emp 多肽 (SEQ ID NO ： 2， 50-53) 和 / 或 Eap 多肽 (SEQ ID NO ： 4) 或 Emp 核酸 (SEQ ID NO ： 1) 和 / 或 Eap 核酸 (SEQ ID NO ： 3) 有或有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或相似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面 中， Emp 多肽或 Eap 多肽将分别具有 (SEQ ID NO ： 2) 或 (SEQ ID NO ： 4) 的氨基酸序列。类 似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于鉴定蛋白质 ( 或 核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似性使用本领域 已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序列同一性算法，通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软件包中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设置 )， 或者通过肉 眼比较。 优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计算同一性百分比。
     术语 “AdsA 多肽” 是指包括分离的野生型细菌 AdsA 蛋白的多肽， 例如葡萄球菌 ( 金 黄色葡萄球菌 SEQ ID NO ： 36) 或芽孢杆菌 ( 炭疽芽孢杆菌 (B.anthracis)SEQ ID NO ： 41)， 以及 AdsA 蛋白的变体和区段或片段。在某些方面中， AdsA 多肽刺激针对细菌 AdsA 蛋白的 免疫应答。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 8 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrD 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrD 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 10 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrE 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrE 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 16 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SpA 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， SpA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 18 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 20 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 22 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasF 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasF 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 24 的氨基酸序列。在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 26 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 28 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 30 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 32 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 34 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasH(AdsA) 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋 白质。在某些方面中， SasH(AdsA) 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 的氨基酸序 列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Hla 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在 某些方面中， Hla 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 37 的氨基酸序列。在某些方面中， Hla 变体包括 D24C、 H35C、 H35K、 H35L、 R66C、 E70C 或 K110C 的氨基酸替换或者其任何组合 ( 氨基酸使用 单字母代码表示 )。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Ebh 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Ebh 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 38 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Coa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Coa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 39 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 vWa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， vWa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸序列。
     在某些方面中， 多肽或区段 / 片段可具有与参考多肽有至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％或至少 99％或更高同一性的氨基酸序列。术语 “相似性” 表示其序列具有 一定百分比的与参考多肽相同或构成与参考多肽的保守性替换的氨基酸的多肽。
     本文所述多肽或区段或片段可包含 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ：30、 SEQ ID NO ： 32、 SEQ ID NO ： 34、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 37、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 39、 SEQ ID NO ： 40、 SEQ ID NO ： 41 或 SEQ ID NO ： 41 的下列或至少或至多 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550 或更多个连续氨 基酸或其间任何可得出的范围。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码下列蛋白之 1、 2、 3、 4 或更多种的重组核 酸分子 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或 多糖任意组合或排列的 Emp 和 / 或 Eap 多肽。
     又一些实施方案包括包含如下可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 或者其区段或片段， 或者本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方 面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 Emp 和 / 或非 Eap 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是这样的可药用组合物， 所述组合物具有编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核 酸， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。 在某些实施方案中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选 地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向对象施用有效量的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其区段 / 片段之组合物， 其包含下 列一种或多种 ： (i)EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外 毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾 液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白多肽或者其区段 或片段， 或者 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 Emp 和 / 或 Eap 组合物， 其 含有不同组合的下列 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种蛋白 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在又一方面中， 本发明包括缺少 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或 EsaB 多肽的葡萄球 菌。此类细菌在长期或持续脓肿形成和 / 或生物膜形成方面是有限的或减弱的。此特征可 用于提供生产减毒细菌的菌株， 所述菌株用于制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或 治疗。在又一方面中， Emp 和 / 或 Eap 可在减毒细菌中过表达， 以进一步提高或补充免疫应 答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面中所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特 别地， 述及 Emp 和 / 或 Eap 肽或核酸时的任何实施方案可针对以下蛋白或核酸或结合它 们的抗体来实施 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 反之亦然。
     本发明人研究了金黄色葡萄球菌逃脱血液中噬菌细胞清除的能力， 并鉴定了作为 关键毒力因子的腺苷合酶 A(AdsA)—— 一种将一磷酸腺苷转化为腺苷的锚定于细胞壁的 酶。在血液中葡萄球菌的腺苷合成、 逃脱噬菌细胞的清除以及随后形成器官脓肿全都依赖 于 adsA， 并且可通过外源提供腺苷来挽救。在炭疽病原体中鉴定到 AdsA 同源物， 腺苷合成 也使得炭疽芽胞杆菌能够逃脱噬菌细胞清除。 总之， 这些结果表明， 葡萄球菌及其它细菌病 原体利用腺苷的免疫调节性质来逃脱宿主免疫应答。本发明的某些实施方案基于以下发 现： 信号传导分子腺苷的合成具有免疫抑制作用， 对其合成活性的调节可用于治疗目的。 本申请在一个实施方案中描述了 AdsA 或者与 AdsA 之全部或部分结合的抗体或者 AdsA 活性抑制剂在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。 本申请还 提供了包含 AdsA 抗原或其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可用于治 疗 ( 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取 ) 或预防细菌感染的方法和组合物。在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用有效量的包含或编码细菌 AdsA 多肽或抗原之全部或 部分的组合物， 在某些方面所述组合物还包含或编码其它细菌蛋白质和细菌多糖。其它细 菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或者 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子。
     在另一些方面中， 可向对象施用 AdsA 调节剂， 例如结合 AdsA 的抗体 ( 例如多克 隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 ) 或者抑制 AdsA 活性或稳定性的小分子。AdsA 调节剂 可直接与 AdsA 结合。AdsA 调节剂可以是结合 AdsA 的抗体或细胞。抗体可以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， 通过提供导致在对象中产生结合 AdsA 之抗体的 AdsA 肽或表达其的细菌来产生 AdsA 调节剂。AdsA 调节剂通常配制成可药 用组合物。AdsA 调节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结 合这些 ( 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SasB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 Spa、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 Coa、 Ebh、 vWa 或 SasF) 的抗体。葡萄球菌抗原或抗体可以与 AdsA 调节剂同时施用。抗原和 / 或抗体和 / 或抗生素以及 AdsA 调节剂可以在同一组合物中施 用。
     一些实施方案涉及这样治疗性组合物， 其在可药用组合物中包含结合 AdsA 蛋白 或抗原或其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染， 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述调节剂可以是小分子， 例如腺苷类似物。所述抗 体可以是人或人源化抗体。 在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体， 或者单链 抗体， 或其片段。
     抗体组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 该抗体结合选自以下的抗原或其 片段 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。重组核酸分子可编码 AdsA 肽和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种 抗原， 其包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。 重组核酸分子可编码 AdsA 肽 和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种抗原， 其 包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 AdsA 多肽或编码其的核酸。在又一些方面中， 分离的 AdsA 多肽是多聚化的， 例如二聚化。在本 发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个分离的细胞表面蛋白 或其区段的多聚体。 在另一方面中， 所述其它多肽或肽可表达或包含于细菌组合物中， 其包 括但不限于 ： AdsA、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 或其免疫原性片段。或者， 所述 组合物可以是或包含以某种方式改变的经重组改造的葡萄球菌， 所述改造包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行了特定改变。例如， 所述细菌可被重组改变成表达 比未经改变时更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     类似地， 术语 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 Coa、 Ebh、 vWa、 SasF 或 SpA 蛋白是指包括含从葡萄球菌分离的各 野生型多肽的蛋白质， 以及刺激针对其之免疫应答的变体、 区段或片段。免疫应答是指生 物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。免疫应答可通过以下测定来测量， 其包括但 不限于 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体存在或数量的测定， 测量 T 细胞活 化或增殖的测定和 / 或测量一种或多种细胞因子之活性或表达方面的调节的测定。细菌 AdsA 多肽包括但不限于下列细菌之氨基酸序列 ( 登记号 ) 的全部或部分 ： 金黄色葡萄球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261、 ref|NP_370547、 ref|YP_042156、 ref|NP_644838、 ref|YP_415541、 dbj|BAA82250) ；溶 血 葡 萄 球 菌 (Staphlyococcus hemolyticus)(ref|YP_254367) ； 血链球菌 (Streptococcus sanguinis) (ref|YP_001035187) ； 格 氏 链 球 菌 (Streptococcus gordonii)(ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)(ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (Streptococcus suis) (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ； 变 形 链 球 菌 (Streptococcus mutans)(ref|NP_721592) ； 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)(ref|YP_141373、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP_001321391) ； 肉 毒 梭 菌(Clostridium botulinum)(ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ；类 芽 孢 杆 菌 属 (Paenibacillus)(ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克 劳 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillus clausii)(ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (Bacillus halodurans)(ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)(ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解 纤 维 梭 菌 (Clostridium cellulolyticum)(ref|ZP_01574143) ； 以 及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个均通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽 可与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 具有至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包括其间的所有值和范围。
     在本发明的又一实施方案中， 组合物可包含与 AdsA 多肽 (SEQ ID NO ： 36) 或 AdsA 核酸 (SEQ ID NO ： 35) 有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质， 在某些方面中， AdsA 多肽具有 SEQ ID NO ： 36 的 氨基酸序列。类似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于 鉴定蛋白质 ( 或核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似 性使用本领域已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序 列同一性算法， 通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软 件 包 中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设 置 )， 或者通过肉眼比较。优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计 算同一性百分比。
     所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 葡萄球菌是金黄色 葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在另一方面中， 细菌是芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌。
     可使用本领域技术人员已知的方法以及本文所述方法评估作为 AdsA 抑制剂之化 合物的活性。筛选测定可包含用于校准和验证测定组分之正确操作的对照。通常包含含 有除了化学文库成员之外所有反应物的空白孔。作为另一实例， AdsA 的已知抑制剂 ( 或 活化剂 ) 可与一个测定样品一起孵育， 所得酶活性的降低 ( 或升高 ) 用作比较或对照。应 理解， 所述调节剂还可与酶活化剂或抑制剂相组合， 以发现抑制酶活化或阻遏的调节剂， 否则其由已知酶调节剂的存在造成。本文使用的术语 “高通量筛选 (high throughput screening)” 或 “HTS” 是指测试成千上万个分子 ( 或测试化合物 ) 对蛋白质功能的作用。 就基团转移反应酶来说， 可测试许多分子对其催化活性的作用。HTS 方法是本领域已知的， 它们通常在多孔板中借助自动液体操作和检测装置来进行 ； 但是， 设想本发明的方法可利 用微阵列或微流体系统来实施。本文使用的术语 “文库” 或 “药物文库” 是指具有作为 AdsA 调节剂潜力的多种化学分子 ( 测试化合物 )、 多种核酸、 多种肽或多种蛋白质及其组合。其 中通过高通量筛选技术进行筛选， 其中该技术利用多孔板或微流体系统。
     评估 AdsA 活性的测定 / 试剂盒的一个实例包括但不限于 Diazyme 酶反应试剂盒 ： 该试剂盒是 5′ - 核苷酸酶 (5′ -NT) 测定试剂盒， 其通常用于测定人血清样品中的 5′ -NT 活性。5′ -NT 测定是基于 5′ - 单磷酸酯 (5′ -IMP) 酶促水解形成肌苷， 后者通过嘌呤核 苷磷酸化酶 (PNP) 转化为次黄嘌呤。次黄嘌呤随后由黄嘌呤氧化酶 (XOD) 转化为尿酸和过氧化氢 (H2O2)。在过氧化物酶 (POD) 存在下， H2O2 进一步与 N- 乙基 -N-(2- 羟基 -3- 磺丙 基 )-3- 甲基苯胺 (EHSPT) 和 4- 氨基安替比林 (4-aminoantipyrine， 4-AA) 反应产生醌染 料， 而后对该染料进行动力学监测。该方法快速但是不如放射性测定灵敏。
     抑制剂和候选抑制剂包括但不限于下列试剂的衍生物或类似物 ： α， β- 亚甲基 腺苷 5′ - 二磷酸 (AOPCP)、 5′ - 外核苷酸酶 ( 细菌 AdsA 的人同源物 ) 的抑制剂， 此抑制 剂不抑制来自鸟毛滴虫 (Trichomonas gallinae) 滋养体的分泌型 5′ - 核苷酸酶 (Borges 等， 2007) ； 杀核酶菌素 (nucleoticidin) 和黑杀菌素 (melanocidin)A 和 B， 这些化合物 显示针对来自大鼠肝膜和蛇毒的 5′ - 核苷酸酶的有力抑制活性 (Uchino 等， 1986) ； 多酚 化合物， 这些化合物具有抗肿瘤活性， 以及抑制来自多种来源的 5′ - 核苷酸酶， 并且已从 槟榔 (Areca catechu) 以及葡萄的种子中分离得到 (Iwamoto 等， 1988 ； Uchino 等， 1988 ； Toukairin 等， 1991)。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 AdsA 多肽或其区段 / 片段的重组核酸分 子。通常， 编码 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文在例如 AdsA 多 肽中所述的一种或多种多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种革兰氏阳性细 菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免疫应答的其它 动物。在另一些方面中， 含有或表达 AdsA 多肽的葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。在另一些实 施方案中， 免疫应答是保护性和 / 或治疗性的免疫应答。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)AdsA 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 AdsA 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或多糖任意组合或排列 的 AdsA 多肽。
     又一些实施方案包括包含可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 AdsA 多 肽、 其区段或片段、 或者本文所述蛋白质或肽的任何其它组合或排列， 其中所述组合物能够 刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 AdsA 多肽和 / 或本文所述蛋白质、 肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方面中， 分离的 AdsA 多肽或者本文所述 蛋白质或肽的任何其它组合或排列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 AdsA 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或 非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是如下可药用组合物， 其具有编码 AdsA 多肽之 全部或部分和 / 或本文所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸， 其中所述组合 物能够刺激针对葡萄球菌或芽孢杆菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 AdsA 多肽 之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。在某些实施方案 中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     在另一些实施方案中， 疫苗组合物是可药用组合物， 其包含结合 AdsA 蛋白或抗原 或者其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中的葡萄球菌感染， 例如 调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述抗体可以是人抗体或人源化抗体。在某些方面中， 所述 抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或者单链抗体， 或其片段。
     疫苗组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 其结合选自以下的抗原 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Emp、 Eap、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原， 或其片段。
     另一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 包括向所述对象施用有效量的 AdsA 多肽或其区段 / 片段的组合物， 所述组合物包含下 列一种或多种 ： (i)Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Spa、 ClfA、 ClfB、 Coa、 Ebh、 vWa、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 多肽， 或者其区段或片 段； 或 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 AdsA 组合物， 其含有不同组合的下 列蛋白的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 Spa。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在另一方面中， 本发明包括缺少 AdsA 多肽的葡萄球菌。这样的细菌在逃避吞噬细 胞摄取和 / 或识别的能力上有限或减弱。此特征可用于提供生产减毒细菌的菌株， 其用于 制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或治疗。在又一方面中， AdsA 可在减毒细菌中过 表达， 以进一步提高或补充免疫应答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特别地， 述及 AdsA 肽或核酸时的任何实施方案可针对其它分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或 核酸或结合它们的抗体来实施， 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 Coa、 Ebh、 vWa、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 蛋白， 反之亦 然。
     术语 “提供” 或 “施用” 根据其常规含义使用， 表示 “供给或供应以使用” 。在一些实 施方案中， 通过施用蛋白质直接提供蛋白质， 而在另一些实施方案中， 通过施用编码蛋白质 的核酸来有效提供或施用该蛋白质。在某些方面中， 本发明涵盖包含抗体、 核酸、 抗原、 肽、 表位和 / 或多糖等之多种组合的组合物。
     对象通常患有 ( 例如诊断患有持续葡萄球菌感染 )、 怀疑患有葡萄球菌感染， 或者 具有发生葡萄球菌感染的风险。本发明的组合物包括免疫原性组合物， 其中以有效实现预 定目的 ( 例如治疗或预防感染 ) 的量包含所述抗原或表位。更具体地， “有效量” 表示刺激 或引发免疫应答或者提供针对感染的抗性、 减轻或缓和感染所需的活性成分的量。在更具 体地方面中， 有效量预防、 减轻或改善疾病或感染的症状， 或者延长所治疗对象的存活。确 定有效量在本领域技术人员的能力范围内， 尤其是在本文所提供的详细公开的教导下。对 于本发明方法使用的任何制备物， 有效量或剂量最初可从体外、 细胞培养和 / 或动物模型 测定来估计。例如， 可在动物模型中制定实现期望之免疫应答或循环抗体浓度或效价的剂 量。这些信息可用于更精确地确定人中的有用剂量。
     本文使用的术语 “调节” 涵盖了 “增强” 或 “抑制” 的含义。活性的 “调节” 可以是活性提高或降低。本文使用的术语 “调节剂” 是指实现某部分之功能的化合物， 包括上调、 诱导、 刺激、 增强、 抑制、 下调或阻抑蛋白质、 核酸、 基因、 生物体等。
     术语 “分离的” 可表示基本上不含其来源的细胞物质、 细菌物质、 病毒物质或培养 基 ( 当通过重组 DNA 技术产生或者从天然生物体中分离时 ) 或者化学前体或其它化学物质 ( 当化学合成时 ) 的核酸或多肽或肽。 此外， 分离的化合物是指可作为分离的化合物施用给 对象的化合物 ； 换句话说， 如果附着在柱子上或者嵌在琼脂糖凝胶中， 则所述化合物不可以 简单地认为是 “分离的” 。此外， “分离的核酸片段” 或 “分离的肽” 是非天然的和 / 或以片 段起作用和 / 或通常不是功能性状态的核酸或蛋白质片段。
     本发明的部分 ( 例如抗体、 多肽、 肽、 抗原或免疫原 ) 可以与其它部分 ( 例如佐剂、 蛋白质、 肽、 支持物、 荧光部分或标签 ) 共价或非共价地缀合或连接。术语 “缀合” 或 “免疫 缀合” 广义地用于定义一个部分与另一物质的有效结合， 其不旨在仅仅表示任何类型的有 效结合， 还特别地不限于化学 “缀合” 。特别地， 还考虑到重组融合蛋白。本发明的组合物还 可包含佐剂或可药用赋形剂。佐剂可以与本发明的多肽或肽共价或非共价偶联。在某些方 面中， 佐剂与蛋白质、 多肽或肽化学缀合。 在另一方面中， 佐剂是重组蛋白质的一部分， 其包 含在含有一种或多种目的抗原的融合蛋白中。 所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 所述葡萄球菌是金 黄色葡萄球菌。
     在本发明的另一些方面中， 可超过一次地将组合物施用给对象， 可以施用 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20 或更多次。所述组合物的施用包括但不限于经鼻、 经胸膜、 经口、 肠 胃外、 皮下、 肌内、 静脉内施用， 或其多种组合， 包括吸入或吸取。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽或其区段 / 片段 的重组核酸分子。通常， 编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文所述的一种或 多种多肽， 例如 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种 革兰氏阳性细菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免 疫应答的其它动物。在另一些方面中， 含有或表达 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的葡萄球菌是 金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中， 免疫应答是保护性免疫应答。
     本发明的组合物通常施用给人对象， 但是设想施用给能够引发对葡萄球菌之免疫 应答的其它动物， 特别是小鼠、 狗、 猫、 牛、 马、 山羊、 绵羊及其它家畜， 即哺乳动物， 包括转基 因动物 ( 例如， 经操作表达人抗体的动物 )。
     在另一些方面中， 本发明的方法和组合物可用于预防、 改善、 减少或治疗组织或腺 体 ( 例如乳腺 ) 的感染， 特别是乳腺炎及其它感染。其它方法包括但不限于， 在未表现感染 征兆的对象 ( 特别是怀疑靶细菌定殖或具有该风险的对象， 例如在医院停留、 治疗和 / 或恢 复期间具有或将具有感染风险或者对其易感的患者 ) 中预防性地减少细菌负荷。
     本文提供的任何列表可特别地排除或包含列表中的任何 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个成员。
     实施例章节中的实施方案应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施方案。
     尽管本公开内容支持仅择一选择以及 “和 / 或” 的定义， 但是权利要求中使用的术 语 “或” 表示 “和 / 或” ， 除非另外指明仅择一选择或者可选项是互相排斥的。还考虑到， 使 用术语 “或” 列出的任何项也可特别地排除。
     在本申请全文中， 术语 “约” 用于表示数值包括测定该值所用仪器或方法的标准误 差。
     遵循长期以来的专利法， 在权利要求或说明书中， 与 “包含” 联用时， 无数量词修饰 的名词表示一个或多个， 除非具体指明。
     通过下文的详细描述， 本发明的其它目标、 特征和优点将是很明显的。但是， 应当 理解的是， 仅仅通过举例说明的方式给出了详细描述和具体实例 ( 即本发明的具体实施方 案 )， 因为通过这一详细描述， 在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员 而言将是很明显。 附图说明为了使本发明的上述特征、 优点和目的以及其它方面更加清楚，
     并且使详述便于理解， 附图中举例说明了上文简述的本发明的更具体描述和某些 实施方案。这些附图构成说明书的一部分。但是， 应注意， 附图举例说明了本发明的某些实 施方案， 因此不应视为对其范围的限制。
     图 1A-1H 检测金黄色葡萄球菌形成的脓肿。( 图 1A)Newman 株感染的肾脏的照 片。( 图 1B)srtA 突变体感染的肾脏的照片。( 图 1C)Newman 株感染的肾脏的 H&E 组织切 片。( 图 1D)ΔSrtA 感染的肾脏的组织切片。( 图 1E)Newman 株感染的肾脏的特写。( 图 1F)ΔSrtA 感染的肾脏的特写。( 图 1G)Newman 株脓肿的扫描电子显微镜照片。( 图 1H) ΔSrtA 感染的肾脏的 SEM 照片。
     图 2 鼠肾脓肿筛选。从各个突变株感染的肾脏回收的集落形成单位 (CFU)。
     图 3A-3G 生物膜筛选。( 图 3A) 体外生物膜生长的 96 孔板测定。( 图 3B)Newman 株体外生物膜的 SEM 照片。( 图 3C)ΔsrtA 生物膜。( 图 3D)ΔEmp 生物膜。( 图 3E)ΔIcaA 生物膜。( 图 3F)ΔIsdB 生物膜。( 图 3G)ΔSdrD 生物膜。
     图 4A-4B Emp 毒力。( 图 4A)Newman、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSrtA、 ΔEap/ΔSrtA、 ΔEmp/ ΔSrtA 回收的 CFU。( 图 4B) 各菌株的组织病理学。
     图 5A-5E Eap、 Emp 免疫。( 图 5A)Newman、 ΔSrtA、 ΔIsdB、 ΔIcaA、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSaeR 的 SDS 提取。( 图 5B)Eap(70kDa) 和 Emp(45kDa) 的蛋白质纯化。( 图 5C) 从用 PBS、 Eap 或 Emp 免疫并且用 Newman 株攻击的小鼠中回收的 CFU。( 图 5D) 来自经免疫小鼠的 ELISA IgG 效价。( 图 5E) 来自经免疫小鼠的组织病理学。
     图 6A-6B Ica 毒力。( 图 6A) 从用 Newman、 DIcaA、 DIcaB、 DIcaC、 DIcaD、 DIcaR、 DIca:tet( 整个操纵子缺失 ) 感染的小鼠回收的 CFU。( 图 6B) 来自被感染小鼠的组织病理 学。
     图 7A-7K 静脉内感染小鼠后的葡萄球菌脓肿形成。(A) 用 1×107 集落形成单位 (CFU) 的金黄色葡萄球菌 Newman 株通过眼眶后注射感染 BALB/c 小鼠。以一定的时间间 隔， 通过心脏穿刺检查一组五只小鼠的血液中细菌负荷 ； 将样品等分试样涂覆于琼脂培养
     基上， 对每毫升血液中的 CFU 进行统计。这些结果的平均值以黑色棒表示。(B) 以一定时间 间隔， 测量小鼠 ( 一组十只动物 ) 肾脏中金黄色葡萄球菌 Newman 株向外周器官组织的播散 以及病原体的复制， 对肾脏匀浆并涂覆于琼脂培养基上， 统计 CFU。(C) 以一定时间间隔， 在 受感染肾脏的苏木精 - 伊红染色组织薄切片中测量脓肿病变的直径。(D-K) 以一定时间间 隔， 在苏木精 - 伊红染色组织薄切片中分析受感染肾脏的图像。箭头指向脓肿病变。
     图 8A-8F 葡萄球菌脓肿群落的组织病理学。通过眼眶后注射用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染 BALB/c 小鼠。通过光学显微镜分析感染后第 2 天 (ABC) 和第 5 天 (DEF) 的 受感染肾脏的薄切片苏木精伊红染色的组织， 并获得图像。在第 2 天， 带有偶见的胞内葡萄 球菌 (C 中黄色箭头 ) 的多形核粒细胞 (PMN) 的大量浸润 (A 中蓝色箭头 ) 是感染病变早期 的特征。在第 5 天， 葡萄球菌脓肿群落形成中心病灶 (D， 黑色箭头 )。葡萄球菌由无定形的 嗜伊红假荚膜 ( 黑色框表示 ) 包覆， 周围是死的 PMN 的区域 ( 白色框表示 )、 看上去健康的 PMN 的区域 ( 红色框表示 ) 以及坏死 PMN 的边界 ( 绿色框表示 )， 其通过嗜伊红层与健康肾 组织隔开。
     图 9A-9P 分选酶 A 是宿主组织中脓肿形成和葡萄球菌持续存在所需的。在接种后 第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 的动物尸检过程中取出用金黄色葡萄球菌 Newman 株、 其同基 因型分选酶 A 突变体 (ΔsrtA) 或甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 USA300 感染的 BALB/c 小 鼠 ( 十只动物的组 ) 的肾脏。 肉眼检查肾脏的表面脓肿 (A、 F、 K)， 或者将其固定于福尔马林 中， 包埋， 切成薄片并用苏木精 - 伊红染色。用光学显微镜以 10×(B、 G、 L、 D、 I、 N) 或 100× 放大倍数 (C、 H、 M、 E、 J、 O) 获得组织病理学图像。(P) 在感染后第 5 和 15 天测量肾组织中 葡萄球菌复制和持续存在。 在尸检时从被感染的小鼠中取出肾脏， 将组织匀浆， 并铺板于琼 脂培养基上， 用以检测集落形成和统计数目。
     图 10A-10C 脓肿病变中心的葡萄球菌群落。对来自用金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 野生型 )、 其同基因型分选酶 A 突变株 (ΔsrtA) 或者用 MRSA 株 USA300 感染的小鼠的肾 组织切片， 固定， 脱水并用 80％铂 /20％钯喷射涂覆以进行扫描电子显微镜分析。(A) 在脓 肿的中心野生型病原体组织成紧密相连的菌苔——葡萄球菌脓肿群落 (SAC)， 其包含在无 定形假荚膜 ( 白色箭头 ) 中， 假荚膜将 SAC 与白细胞套隔开。红细胞位于葡萄球菌中 (R)。 (B) 分选酶突变株 (ΔsrtA， 箭头 ) 不形成 SAC， 在健康肾组织中发现分离的葡萄球菌。(C) 与金黄色葡萄球菌 Newman 株类似， MRSA 株 USA300 也形成包含在假荚膜中的 SAC( 白色箭 头 )。
     图 11A-11B 葡萄球菌脓肿群落的形成需要特定表面蛋白质。(A)BALB/c 小鼠 (20 只动物的组 ) 感染后五天， 研究了在表面蛋白质基因中具有 bursa aurealis 插入物的金 黄色葡萄球菌 Newman 变体在匀浆肾组织中的细菌负荷。(B) 通过光学显微镜研究了苏木 精 - 伊红染色的被感染肾脏的薄切片， 显示脓肿病变的 10× 倍放大 ( 白色箭头 )。
     图 12A-12L 葡萄球菌脓肿病变中的 Emp 和 Eap。在接种后第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 取出用在 emp 或 eap 中带有 bursa aurealis 插入物的金黄色葡萄球菌 Newman 变体 感染的 BALB/c 小鼠的肾脏。用苏木精 - 伊红对肾脏染色， 用光学显微镜以 10×(A、 C、 E、 H) 或 100× 放大倍数 (B、 D、 F、 I) 获得组织病理学图像。在为检测多形核白细胞核用 Hoechst 染料 ( 蓝色 ) 染色以及为显示葡萄球菌脓肿群落用 BODIPY- 万古霉素 ( 绿色 ) 染色的肾组 织中， 用兔抗 Emp 或抗 Eap 抗体以及第二 Alexafluor-647 标记的抗体 ( 红色 ) 检测野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株的脓肿病变中 Eap(J) 和 Emp(K) 表达。(L) 在静脉内接种后第 5 天、 15 天和 30 天测量肾组织中葡萄球菌复制和持续存在。从被感染的小鼠 (10 只动物的 组 ) 中取出肾脏， 将组织匀浆， 铺板于琼脂培养基上， 用以集落形成和统计数目。
     图 13A-13E 用 Eap 的主动和被动免疫产生对葡萄球菌攻击的保护。(A) 用纯化的 Eap 或 Emp 来免疫 BALB/c 小鼠或者仅用佐剂模拟处理， 通过 ELISA 分析血清 IgG 效价。(B) 免疫三周后， 通过静脉内接种葡萄球菌来攻击动物。感染后第 5 天， 在尸检时取出肾脏， 分 析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。 (C) 通过亲和色谱纯化针对 Eap 或 Emp 的兔抗体， 通过腹膜内注射被动转移进小鼠体内。24 小时后， 通过 ELISA 分析被动免疫之动物的血清 IgG 效价。(D) 随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击用抗 Eap 或 Emp 的纯化抗体被动免疫 的动物以及模拟免疫的动物， 在第 4 天对细菌负荷进行统计。 (E) 在苏木精 - 伊红染色的组 织薄切片中检测肾脏中脓肿形成。
     图 14 宿主组织中葡萄球菌脓肿形成和持续存在的工作模型。阶段 1- 静脉内接种 后， 金黄色葡萄球菌在血流中存活， 并通过脉管系统散播到外周器官组织。阶段 II- 在肾组 织中， 葡萄球菌吸引多形核白细胞以及其它免疫细胞的大量浸润。阶段 III- 脓肿成熟， 其 中心积累了病原体 ( 葡萄球菌脓肿群落 -SAC)， 由嗜伊红假荚膜所包覆。SAC 周围是死 PMN 的区域、 看上去健康的 PMN 以及最后具有嗜伊红物质边界的死 PMN 的外层区域。阶段 4- 脓 肿成熟， 在器官表面破裂， 从而释放葡萄球菌进入循环， 并引起新一轮的脓肿发生。葡萄球 菌脓肿发生特定阶段所需的细菌包膜组分的基因在这些基因发挥功能的相应阶段下以红 色显示。
     图 15A-15H AdsA 是在血液中存活所必需的细胞壁相关蛋白质。比较 BALB/c 小 鼠 ( 图 15A) 或 Sprague-Dawley 大鼠 ( 图 15D) 血液中野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 (WT) 和同基因型 srtA 变体的存活。数据是来自三个独立分析的平均值以及平均值的标准 差 (±SEM)。为了评估分选酶 A 锚定的细胞壁表面蛋白质对血液中葡萄球菌存活的相对贡 献， 将所示基因中具有转座子插入物的同基因型突变株在来自小鼠 ( 图 15B) 或大鼠 ( 图 15E) 血液中孵育 60 分钟。在来自小鼠 ( 图 15C)、 大鼠 ( 图 15F) 或人志愿者 ( 图 15G) 的 血液中， padsA 的表达挽救了 adsA 突变株的葡萄球菌存活。显示吉姆萨染色的人血液样本 中与吞噬细胞一起的 WT、 adsA 和 adsA(padsA) 葡萄球菌 ( 图 15H)。箭头指示细胞外的和 中性粒细胞相关的金黄色葡萄球菌。数据表示使用两个不同供体的两个独立分析。
     图 16A-16E AdsA 是在体内实现葡萄球菌复制和脓肿形成的毒力因子。 10 只 BALB/ c 小鼠的组被金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16A) 或 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16C) 感染后肾脏中的葡萄球菌负荷 ( 对于 Newman 和 USA300 感染， 均为 P ＜ 0.03， 不成对 t 检验 )。金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16B) 或金黄 色葡萄球菌 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16D) 感染的小鼠尸检后获得的苏木精 - 伊红 染色的肾组织在 10 倍 ( 上图 ) 和 100 倍放大 ( 下图 ) 下的显微镜照片。黑色箭头指示葡萄 球菌的中央浓度和 PMN 浸润。 数据是每种菌株 5 只动物的组的代表性样品和 2 个独立分析。 ( 图 16E) 细菌负荷测定为 30 或 90 分钟时从 BALB/c 小鼠获得的每 500 微升血液的 CFU， 所 述小鼠通过眼眶后注射感染野生型 (WT)、 adsA 或 adsA:padsA 金黄色葡萄球菌 Newman 株。 数据是每个时间点使用 10 只动物的组进行的两个独立分析的代表。使用不成对 t 检验进 行统计学分析。图 17A-17F AdsA 显示 5′ - 核苷酸酶活性并水解 AMP。将来自所示菌株的溶葡 萄菌素细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 测定 [14C] Ado( 腺苷 ) 产生。( 图 17A) 通过磷光成像仪 (PhosphorImager) 捕获 TLC 后的 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17B) 对来自 (a) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对金黄 色葡萄球菌 Newman 株的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行校准， 显示为百分比的量。 数据是三个 独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 WT 比 adsA， P ＜ 0.05)。( 图 17C) 在存在或不 存在纯化的 AdsA1-400(2μM) 以及存在或不存在 5mM 不同金属离子时孵育放射性标记的 [14C] AMP。用磷光成像仪捕获 TLC 后 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17D) 对来自 (c) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对氯化锰 (Mn2+) 存在时的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行 校准， 显示为百分比的量。显示的数据是 2 个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 +2 +2 +2 +2 Zn 比 Mn 和 Cu 比 Mn ， P ＜ 0.05)。( 图 17E) 从重组大肠杆菌纯化 GST-AdsA， 用凝血酶 切割产生 AdsA1-400， 通过考马斯染色的 SDS-PAGE 分析纯化的蛋白。( 图 17F) 在不同浓度腺 苷存在或不存在时， 大鼠血液中 adsA 葡萄球菌的存活。
     图 18A-18D 葡萄球菌 AdsA 在血液中合成腺苷。( 图 18A) 反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 定量腺苷 ( 左图， 100μM 腺苷 ) 并通过基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI-MS， 右图 ) 鉴定其单同位素离子。在没有 ( 图 18B) 或有金黄色葡萄球菌 Newman 野生型 (WT) ( 图 18C) 或其同基因型 adsA 变体 ( 图 18D) 存在下孵育小鼠血液一小时， 除去血浆中的蛋 白质， 过滤并进行 RP-HPLC， 以定量腺苷 ( 左图 )， 以及通过 MALDI-MS 鉴定其单同位素离子 ( 右图 )。 从纯化的腺苷对照外推计算得到的血液中腺苷丰度为 1.1μM(18B， 无葡萄球菌 )、 13.2μM(18C， WT 金黄色葡萄球菌 Newman 株 ) 和 2.1μM(18D， adsA 突变株葡萄球菌 )。
     图 19A-19E 5’ - 核苷酸酶活性增强炭疽芽孢杆菌的存活。 ( 图 19A) 来自炭疽芽孢 杆菌 Sterne 株 (WT， 野生型 ) 或 adsA(basA) 突变株芽孢杆菌的变溶菌素提取物与放射性标 14 记的 [ C]AMP 一起孵育， 通过 TLC 检测腺苷的产生。( 图 19B) 用针对不参与腺苷产生的对 照蛋白 BasA(αBasA) 或 BasC(αBasC) 的抗血清分析来自变溶菌素提取物的蛋白质。( 图 19C) 使用抗 BasA 抗血清 ( 上图 ) 或非反应性血清 (NRS) 以及 Cy3- 标记的第二抗体 ( 红 色 ) 染色的以及 Hoechst 对核酸染色 ( 蓝色 ) 的野生型 (WT) 炭疽芽孢杆菌 Sterne 株和其 同基因型 adsA 突变株的荧光显微照片。( 图 19D) 在 5mM 不同金属离子存在下放射性标记 的 [14C]AMP 与纯化的 BasA(2μM) 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 和磷光成像仪测量 [14C] Ado( 腺苷 ) 的产生。数据代表 3 个独立的分析。( 图 19E) 大鼠血液中野生型和 adsA/basA 突变株炭疽芽孢杆菌 Sterne 株随时间 ( 分钟 ) 的存活， 表示为琼脂板上的菌落形成单位。 数据是两个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。
     图 20 显示 adsA 破坏和 padsA 补偿。为了能够显示 AdsA， 我们使用蛋白 A 缺陷型 (Δspa) 金黄色葡萄球菌菌株 SEJ2， 因为蛋白 A 特异性结合抗体的 Fc 结构域并干扰免疫 印迹分析。通过 SDS-PAGE 分离来自转化有 padsA 的野生型 Δspa SEJ2( 泳道 1)、 Δspa、 adsA:ermB( 泳道 2) 或 Δspa、 adsA:ermB 细胞的细胞壁提取物， 用抗 GST-AdsA1-400 的抗血 清进行免疫印迹分析。* 表示非特异性反应物质。
     图 21 从感染 USA300 的小鼠分离的肾脏的组织学检查。 用金黄色葡萄球菌 USA300 野生型 ( 下图 ) 和 adsA 突变株 ( 上图 ) 感染 4 天的小鼠尸检后获得的肾组织苏木精 - 伊 红染色的 10× 显微照片。黑色箭头表示葡萄球菌的中央浓度和 PMN 浸润。数据是每种细菌菌株 5 只动物的组的代表性样品以及 2 个独立分析。
     发明详述
     生物膜是嵌入到分泌的细胞外基质中的微生物群落 (Hall-Stoodley 等， 2004 ； Kolter 和 Greenberg， 2006)。许多细菌物种能够从漂浮生长转换为形成生物膜， 从而显示 增强的抗生素抗性 (Drenkard 和 Ausubel， 2002)， 逃脱宿主免疫防御 (Singh 等， 2002)， 以及 更有利于在人中建立慢性感染 (Brady 等， 2008)。葡萄球菌物种的生物膜已经与许多疾病 包括心内膜炎 (Xiong 等， 2005)、 骨髓炎 (Brady 等， 2006) 以及多种植入物 ( 包括导尿管、 假体心脏瓣膜和人造关节 ) 介导的感染相关联 (Cassat 等， 2007)。这尤其适于表皮葡萄球 菌， 其是一种非常容易在体外和体内形成生物膜的机会致病菌 (Mack 等， 1996)。对于表皮 葡萄球菌来说， 形成生物膜的能力与毒力之间有明确的相关性， 该相关性此前未在金黄色 葡萄球菌中证实 (Cassat 等， 2007)。
     金黄色葡萄球菌是人皮肤和鼻孔的共生生物， 其是导致血流和皮肤 / 软组织感染 的主要原因 (Klevens 等， 2007)。葡萄球菌感染的致病是从细菌通过外伤、 手术创口或医疗 器械侵入皮肤或血流开始 (Lowy， 1998)。通过噬菌细胞的杀伤， 一些葡萄球菌从血流中被 清除， 但是逃脱了免疫防御的葡萄球菌将感染接种到器官组织， 并诱导促炎症应答， 其由来 自巨噬细胞、 中性粒细胞及其它吞噬细胞的细胞因子和趋化因子释放所介导 (Lowy， 1998)。 所导致的免疫细胞侵入感染部位伴随着中央液化性坏死以及形成外周纤维蛋白壁， 以试图 阻止微生物散布并允许除去坏死的组织碎片 (Lowy， 1998)。可通过显微镜观察到如下形式 的病变 ： 含有坏死组织、 白细胞和细菌中央病灶的多细胞区域。 器官脓肿在感染两天内发生 ( 未公开数据 )， 其代表了葡萄球菌疾病的标志。 I. 葡萄球菌抗原
     金黄色葡萄球菌 Ess 途径可视为配备了专门的转运组件 (Ess)、 辅助因子 (Esa) 和 同源分泌基质 (Esx) 的分泌模块。EssA、 EssB 和 EssC 是 EsxA 和 EsxB 分泌所必需的。因 为预计 EssA、 EssB 和 EssC 是跨膜蛋白质， 所以设想这些蛋白质形成分泌装置。ess 基因簇 中的某些蛋白质可主动转运分泌的底物 ( 作为马达 )， 而另一些可调节转运 ( 调节剂 )。调 节可通过分泌型多肽的转录或翻译后机制、 将特异性底物分选到限定的位置 ( 例如细胞外 基质或宿主细胞 )， 或者感染过程中分泌事件的时间安排来实现， 但不一定限于此。对于这 一点， 不清楚是否所有分泌的 Esx 蛋白质均起到毒素的作用或者间接导致发病。
     葡萄球菌依赖表面蛋白质介导的宿主细胞粘附或者组织侵入来作为逃脱免疫防 御的策略。此外， 在感染期间， 金黄色葡萄球菌利用表面蛋白质来螯合来自宿主的铁。大多 数参与葡萄球菌致病的表面蛋白质带有 C 端分选信号， 即它们通过分选酶与细胞壁包膜共 价连接。此外， 缺少表面蛋白质锚定所需基因 ( 即分选酶 A 和 B) 的葡萄球菌菌株在几种不 同的小鼠疾病模型中显示出毒力的显著缺陷。因此， 表面蛋白质抗原代表了有效的疫苗靶 标， 因为对应的基因是葡萄球菌疾病发生必需的， 并且可在本发明的多个实施方案中利用。 分选酶超家族是革兰氏阳性菌转肽酶， 其负责将表面蛋白质毒力因子锚定到肽聚糖细胞壁 层。已在金黄色葡萄球菌中鉴定出两种分选酶同工型—— SrtA 和 SrtB。这些酶已显示识 别底物蛋白中的 LPXTG 基序。SrtB 同工型似乎在血红素铁获得和铁动态平衡中非常重要， 而 SrtA 同工型则在革兰氏阳性细菌的致病中起关键作用 ( 其通过调节细菌粘附宿主组织 的能力而起作用， 所述粘附是通过粘附物和其它蛋白质与细胞壁肽聚糖的共价锚定来实现
     的 )。 本发明的实施方案包括但不限于涉及 Emp 和 / 或 Eap 的组合物和方法。在某些 实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡萄球菌蛋白 ( 例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 蛋白 ) 联用。Emp(SEQ ID NO ： 2) 或 Eap(SEQ ID NO ： 4) 是葡萄球菌多肽。 其它 Emp 和 / 或 Eap 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于登记号 ( 对于 Emp) YP_185731、 NP_371337、 NP_645584、 CAB75985、 YP_416239、 YP_040269 和 NM0758 以及 ( 对 于 Eap)YP_500650、 CAB94853、 YP_186825、 CAB51807、 NP_646697、 YP_041404、 NM1872， 其每 个均如同在本申请的优先权日通过引用并入本文。其它的葡萄球菌抗原包括 52kDa 玻连蛋 白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原 结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合 蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
    在哺乳动物中， 腺苷在调节固有和获得性免疫应答中起到关键性作用 (Thiel 等， 2003)。强的或过度的宿主炎性应答 ( 例如响应于细菌感染 ) 加剧了入侵病原体所致的组 织损伤 (Thiel 等， 2003)。因此， 成功的微生物免疫清除包括平衡促炎和抗炎介导物。细胞 因子 IL-4、 IL-10、 IL-13 和 TGF-β 限制了过度的炎症， 但是只有腺苷能够完全阻抑免疫应 答 (Nemeth 等， 2006)。腺苷的免疫调节特性由四个跨膜腺苷受体所介导—— A1、 A2A、 A2B 和 A3(Hasko 和 Pacher， 2008)。 T 淋巴细胞表达高亲和力 A2A 受体以及低亲和力 A2B 受体 (Thiel 等， 2003)。根据其活性状态， 巨噬细胞和中性粒细胞表达所有四种腺苷受体， 而 B 细胞仅 具有 A2A(Thiel 等， 2003)。A2A 的参与在单核细胞 (Khoa 等， 2001) 和树突状细胞 (Panther 等， 2001) 中抑制 IL-12 产生， 增加 IL-10， 以及在中性粒细胞中减少细胞毒性作用和趋化因 子产生 (McColl 等， 2006 ； Cronstein 等， 1986)。炎症、 缺氧、 器官损伤和外伤性休克部位产 生腺苷是先后由两种酶所介导的。胞外 -ATP 二磷酸水解酶 (CD39) 将循环中的三磷酸腺苷 (ATP) 和二磷酸腺苷 (ADP) 转化为 5′ - 一磷酸腺苷 (AMP)(Eltzshig 等， 2003)。内皮细胞 (Deussen 等， 1993) 和 T 细胞亚群 (Thompson 等， 1989 ； Thompson 等， 1987 ； Yang 等， 2005) 表面上表达的 CD73 随后将 5′ -AMP 转化为腺苷 (Zimmermann， 1992)。
     尽管细胞外腺苷对炎症抑制来说是必要的， 但是过量的腺苷积累也是有害的。 例如， 具有腺苷脱氨酶 (ADA) 缺陷的患者中的情形， 所述 ADA 是将腺苷转化为肌苷的 酶 (Giblett 等， 1972)。ADA 缺 陷 导 致 严 重 复 合 免 疫 缺 陷 综 合 征 (severe compromised immunodeficiency syndrome， SCID)， 其具有削弱的细胞免疫和显著减少的免疫球蛋白产 生 (Buckley 等， 1997)。因为细胞外腺苷的调节在维持免疫动态平衡中是关键的， 所以对腺 苷水平的扰动很可能影响感染期间的宿主免疫应答。本发明人在本文中描述了细菌 ( 例如 金黄色葡萄球菌和炭疽芽胞杆菌 ) 利用腺苷合成来逃脱宿主免疫应答， 并提供了利用这一 信息治疗和 / 或预防细菌感染 ( 例如菌血症 ) 的方法和组合物。
     本发明的某些实施方案涉及诱导免疫应答， 提供抗 AdsA 或抑制 AdsA 的抗体。 AdsA(SEQ ID NO ： 55) 是葡萄球菌多肽。其它 AdsA 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261 、 ref|NP_370547 、 ref|YP_042156 、 ref|NP_644838 、 ref|YP_415541 、 dbj|BAA82250) ； 溶 血 葡 萄 球 菌 (ref|YP_254367) ； 血 链 球 菌 (ref|YP_001035187) ； 格氏 链 球 菌 (ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ；变 形 链 球 菌 (ref|NP_721592) ；嗜 热 链 球 菌 (ref|YP_141373 、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP _001321391) ； 肉 毒 梭 菌 (ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ； 类芽孢杆菌属 (ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克劳氏芽孢杆 菌 (ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解纤维梭菌 (ref|ZP_01574143) ； 以及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个如同在 本申请优先权日通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽可具有与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包 括其间所有值和范围。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽、 结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： Emp 和 / 或 Eap 及其它 葡萄球菌抗原例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽和 / 或结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： AdsA 及其它葡萄 球菌抗原例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     这些多肽包含来自葡萄球菌属细菌的蛋白质的氨基酸序列。 所述序列可来自特定 的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 也可以来自特定的菌株 ( 例如 Newman 株 )。
     分选酶底物多肽包括但不限于下列氨基酸序列 ： 来自葡萄球菌属细菌的 SdrC、 SdrD、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC 或 SasF 蛋 白 质。 分 选 酶 底 物 多 肽序列可来自特定的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 可来自特定的菌株 ( 例 如 Newman 株 )。在某些实施方案中， SdrD 序列来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373773.1(gi|15926240) 获得， 其通过引用并入本文。在另一些实施方案中， SdrE 序列 来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373774.1(gi|15926241) 获得， 其通过引用并入 本文。在另一些实施方案中， IsdA 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1130( 其与 Newman 株具有 相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371654.1(gi|15924120) 获得， 其通过引用 并入本文。在另一些实施方案中， IsdB 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1129( 其与 Newman 株 具有相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371653.1(gi|15924119) 获得， 其通过 引用并入本文。在另一些实施方案中， 可使用通过 Ess 途径转运或通过分选酶加工的其它 多肽， 本领域技术人员可使用数据库和国际互联网可获取的资源来确定其序列。
     可通过分析细菌基因组的数据库提交来鉴定可用于本发明中的多种蛋白质实例， 其包括但不限于登录号 NC_002951(GI ： 57650036 和 GenBank CP000046)、 NC_002758(GI ： 57634611 和 GenBank BA000017)、 NC_002745(GI ： 29165615 和 GenBank BA000018)、 NC_003923(GI ： 21281729 和 GenBank BA000033)、 NC_002952(GI ： 49482253 和 GenBank BX571856)、 NC_002953(GI ： 49484912 和 GenBank BX571857)、 NC_007793(GI ： 87125858 和 GenBank CP000255)、 NC_007795(GI ： 87201381 和 GenBank CP000253)， 其每个均通过引用并 入本文。
     本文所用的 “蛋白质” 或 “多肽” 是指含有至少十个氨基酸残基的分子。在一些实 施方案中， 使用蛋白质或多肽的野生型形式， 但是在本发明的许多实施方案中， 使用经修饰 的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可互换使用。 “经修饰的蛋白质” 或 “经修饰的 多肽” 是指其化学结构 ( 特别是其氨基酸序列 ) 与野生型蛋白质或多肽相比发生改变的蛋 白质或多肽。在一些实施方案中， 经修饰的蛋白质或多肽具有至少一种改变的活性或功能 ( 认为蛋白质或多肽可具有多种活性或功能 )。本发明特别涉及的是， 可针对某一活性或功 能来改变被修饰的蛋白质或多肽， 而在其它方面保留野生型活性或功能 ( 如免疫原性 )。
     在某些实施方案中， 蛋白质或多肽 ( 野生型或经修饰的 ) 的大小可以包括但不局 限于 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 450、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 625、 650、 675、 700、 725、 750、 775、 800、 825、 850、 875、 900、 925、 950、 975、 1000、 1100、 1200、 1300、 1400、 1500、 1750、 2000、 2250、 2500 个氨基分子或更多、 以及其中可得出的任何范围， 或者本文所述或所引用的对应氨基酸序列的衍生物。本发明还 涉及的是， 可通过截短 ( 使其短于相应的野生型形式 ) 来突变多肽， 也可通过融合或缀合具 有特定功能 ( 例如用于靶向或定位、 用于增强免疫原性、 用于纯化目的等 ) 的异源蛋白质序 列来改变多肽。
     本文使用的 “氨基分子” 是指本领域所知的任何氨基酸、 氨基酸衍生物或氨基酸模 拟物。 在某些实施方案中， 蛋白质性分子的残基是连续的， 没有任何非氨基分子间插氨基分 子残基的序列。在另一些实施方案中， 所述序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在一 些具体实施方案中， 蛋白质性分子的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分所间插。
     因此， 术语 “蛋白质性组合物” 包括氨基分子序列， 所述序列含有天然合成蛋白质 中 20 种常见氨基酸的至少一种或者至少一种经修饰的或非常见氨基酸。
     可采用本领域技术人员所知的任何技术来制造蛋白质性组合物， 所述技术包括 (i) 通过标准分子生物学技术表达蛋白质、 多肽或肽， (ii) 从天然来源中分离蛋白质性化 合物， 或 (iii) 化学合成蛋白质性材料。先前已经公开了多种基因的核苷酸及蛋白质、 多肽 和肽的序列， 还可以在公认的计算机化数据库中找到上述序列。其中一个数据库是国立生 物技术信息中心的 Genbank 和 GenPept 数据库 ( 网址为 ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文 公开的或为本领域普通技术人员所知的技术来扩增和 / 或表达这些基因的编码区。
     Emp 或 Eap 或 AdsA 以及下列本发明其它多肽的氨基酸序列变体可以是替换、 插入 或缺失变体 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。与野生型相比， 本发明 多肽的修饰可影响所述多肽的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500 或更多非连续或连续氨基 酸。
     本发明的抗原可包含本文所述抗原 (AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白 ) 的区段或片段， 其包含所述抗原的第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多 ( 包含其间所有值和范围 ) 位氨基酸至第 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多位氨基酸 ( 包含其间所有值和范 围 )， 包括其中所有区段和片段。 本发明的某些方面涉及结合上文所述一个或多个片段或区 段的抗体。
     缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质中的一个或多个残基。可以缺失单个残 基， 或者可以缺失多个连续的氨基酸。可将终止密码子 ( 通过替换或插入 ) 引入编码的核 酸序列中， 以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽非末端位点处加入物质。这 可包括插入一个或多个残基。还可产生末端添加， 称作 “融合蛋白” 。
     替换变体通常包含在蛋白质一个或多个位点处将一种氨基酸替换为另一种， 并可 被设计成调节多肽的一个或多个特性， 同时丢失或不丢失其它功能或特性。替换可以是保 守性的， 即将一种氨基酸替换成形状和电荷相似的氨基酸。 保守性替换为本领域所熟知， 包 括例如以下改变 ： 丙氨酸变为丝氨酸 ； 精氨酸变为赖氨酸 ； 天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨 酸； 天冬氨酸变为谷氨酸 ； 半胱氨酸变为丝氨酸 ； 谷氨酰胺变为天冬酰胺 ； 谷氨酸变为天冬 氨酸 ； 甘氨酸变为脯氨酸 ； 组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺 ； 异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨 酸； 亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸 ； 赖氨酸变为精氨酸 ； 甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸 ； 苯丙氨酸变为酪氨酸、 亮氨酸或甲硫氨酸 ； 丝氨酸变为苏氨酸 ； 苏氨酸变为丝氨酸 ； 色氨酸 变为酪氨酸 ； 酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸 ； 缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者， 替换可 以是非保守的， 从而影响多肽的功能或活性。非保守性改变通常包括将残基替换成化学性 质上不相似的残基， 如极性或带电氨基酸替换非极性或不带电氨基酸， 反之亦然。
     表 1. 金黄色葡萄球菌菌株的示例性表面蛋白质。
    39SAV# SpA FnBPA FnBPB ClfA ClfB Can SdrC SdrD SdrE Pls SasA SasB SasC SasD 241 2186 686 2481 213 241 2275 2271 2271 2481 2186 241 1141 1141 1141 1347 1385 1385 955 953 953 947 1315 1166 1183 907 877 877 913 873 1183 906 1137 1351 2222 2189 221 946 935 989 933 1029 943 961 961 965 1015 1038 1038 1015 957 928 905 1183 492 450 450 516 492SA#表面MW2Mu50N315NewmanMRSA252*MSSA476*SAV0111SA0107102333540 A CN 102333554SAV2503SA2291SAV2502SA2290SAV0811SA0742SAV2630SA2423Npnp说SAV0561SA0519957 1365 1141 2275 685 2186 241明40SAV0562SA0520书SAV0563SA0521NpnpSAV2654SA2447SAV2160SA1964SA1577SAV0134SA012929/86 页102333540 A CN 102333554说明书30/86 页
    SAV1130 41SA0977SasE/IsdA350350350354350
     SasF SasG SasH SasI SasJ/IsdB SasK SasL IsdC 227 227 232 227 198 211 211 645 645 645 895 891 891 772 772 1371 525 927 786 534 652 227 635 635 635 627 635 1371 786 895 645 197 227102333540 A CN 102333554SAV2646SA2439SAV2496SAV0023SA0022说SAV1731SA1552明本发明的蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者， 可以从细菌中分离出非重组 或重组的蛋白质。 还考虑可将含有上述变体的细菌应用于本发明的组合物和方法中。 因此， 不需要分离蛋白质。42SAV1129SA0976书SA2381NpSAV1131SA097831/86 页102333540 A CN 102333554
    说明书32/86 页本文中使用的术语 “功能等价密码子” 是指编码同一氨基酸的密码子 ( 如精氨酸 或丝氨酸的六个密码子 )， 也指编码生物学上等价之氨基酸的密码子 ( 见下面的表 2)。
     表 2 密码子表
    还应当理解， 氨基酸和核酸序列可包含额外的残基， 如分别为额外的 N 端或 C 端氨 基酸、 或 5′或 3′序列， 但仍然基本如本文公开的序列之一所示， 只要该序列满足上文设 定的标准 ( 包括保持与蛋白质表达相关的蛋白质生物活性 ) 即可。末端序列的添加特别适 用于核酸序列 ( 例如， 其可包含位于编码区 5′或 3′部分之侧翼的不同非编码序列 )。
     下文是基于改变蛋白质的氨基酸来产生等价或改进的第二代分子的讨论。例如， 蛋白质结构中的某些氨基酸可以替换为其它氨基酸， 而没有相互结合能力 ( 与例如抗体的 抗原结合区或底物分子上的结合位点之结构结合 ) 的明显损失。由于蛋白质的相互作用能 力和性质决定了蛋白质的生物学功能活性， 因此可在蛋白质序列 ( 及其 DNA 编码序列 ) 中 进行某些氨基酸替换， 而仍产生具有相似特性的蛋白质。因而， 本发明人考虑可在基因的 DNA 序列中进行多种改变， 而不导致其生物学应用和活性 ( 例如免疫原性 ) 的明显损失。
     进行这种改变时， 可考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质 以相互作用生物学功能中的重要性已为本领域所广泛了解 (Kyte 和 Doolittle、 1982)。为 人们所接受的是， 氨基酸的相对亲水性决定了产物蛋白质的二级结构， 其二级结构进而决 定了该蛋白质与其它分子 ( 例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等 ) 的相互作用。
     还为本领域所了解的是， 可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的替换。通过引 用并入本文的美国专利 4,554,101 陈述了蛋白质的最大局部平均亲水性 ( 由其邻近氨基酸 亲水性所决定 ) 与蛋白质的生物学特性相关。应理解的是， 氨基酸可以被替换为具有相似 亲水性值的其它氨基酸， 而仍产生生物学等价的或免疫学等价的蛋白质。
     如上所述， 氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性， 例如它们的
     疏水性、 亲水性、 电荷、 大小等。将前述多种特征考虑在内的示例性替换是众所周知的， 包 括： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 以及缬氨 酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
     本发明涉及的是， 在每 ml 本发明组合物中有约 0.001mg 至约 10mg 的总多肽、 肽和 / 或蛋白质。因此， 组合物中的蛋白质浓度可以是约、 至少约或至多约 0.001、 0.010、 0.050、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 9.5、 10.0μg 或 mg/ml 或更高 ( 或其中可得出的任何范 围 )。在其中， 约、 至少约或至多约 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100％可以是 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 并且可与本文所述其它多肽序列联用。
     本发明还公开了葡萄球菌抗原的组合， 当组合时， 其导致产生有效治疗或预防葡 萄球菌感染的免疫原性组合物。葡萄球菌感染经历几个不同阶段。例如， 葡萄球菌的生活 周期包含共生定殖， 通过进入邻近组织或血流起始感染， 在血液中厌氧性扩增， 金黄色葡萄 球菌毒力决定簇与宿主防御机制相互作用， 以及诱导并发症包括心内膜炎、 转移性脓肿形 成和败血症综合征。细菌表面上的不同分子参与了感染周期的不同阶段。某些抗原的组合 可引发免疫应答， 其针对葡萄球菌感染的多个阶段进行保护。可在动物模型测定中和 / 或 使用调理吞噬测定来测量免疫应答的效力。
     多肽和多肽产生
     本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、 肽和蛋白质及其免疫原性片段。 例如， 对特定多肽进行测定或用于引发免疫应答。 在一些具体实施方案中， 也可根据常规技 术在溶液中或在固体支持物上合成本发明蛋白质的全部或部分。 多种自动合成仪是可购得 的， 且可以根据已知的方案加以使用。参见例如 Stewart 和 Young(1984)、 Tam 等 (1983)、 Merrifield(1986)、 Barany 和 Merrifield(1979)， 其均通过引用并入本文。或者， 可使用重 组 DNA 技术， 其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体中， 转化或转染入合适的宿 主细胞并在适于表达的条件下培养细胞。
     本发明的一个实施方案包括利用转移至细胞 ( 包括微生物 ) 中的基因来产生和 / 或呈现蛋白质。可将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中， 接着在合适条件下培养 细胞。 可使用编码几乎任何多肽的核酸。 本文讨论了重组表达载体的产生及其包含的元件。 或者， 要生产的蛋白质可以是由用于蛋白质生产的细胞所正常合成的内源蛋白质。
     本发明的另一实施方案使用了自体 B 淋巴细胞细胞系， 所述细胞系转染有表达免 疫原产物 ( 更具体地为具有免疫原活性的蛋白质 ) 的病毒载体。哺乳动物宿主细胞系的其 它实例包括但不局限于 Vero 和 HeLa 细胞、 其它 B 和 T 细胞系 ( 如 CEM、 721.221、 H9、 Jurkat、 Raji)、 以及中国仓鼠卵巢细胞系、 W138、 BHK、 COS-7、 293、 HepG2、 3T3、 RIN 和 MDCK 细胞。此 外， 可选择调节插入序列表达的或以期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质 产物的这种修饰 ( 例如糖基化 ) 和加工 ( 例如切割 ) 可以对蛋白质功能是重要的。不同宿 主细胞在蛋白质的翻译后加工和修饰方面具有特征性的和特定的机制。 可选择合适的细胞 系或宿主系统来确保所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。可使用多种选择系统， 包括但不局限于分别位于 tk、 hgprt 或 aprt 细胞中的 HSV 胸苷激酶、 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、 腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外， 还可使 用抗代谢物抗性作为选择基础 ： dhfr 赋予对甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性 ； gpt 赋予对 霉酚酸的抗性 ； neo 赋予对氨基糖苷 G418 的抗性 ； hygro 赋予对潮霉素的抗性。
     动物细胞可以两种方式在体外增殖 ： 非锚着依赖性细胞， 其在整个培养物体积中 悬浮培养， 或者锚着依赖性细胞， 其需要附着在固体基底上进行增殖 ( 即单层类型的细胞 培养 )。
     来源于连续的已建立细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养物是大规模生产细胞和 细胞产物的最常用方法。 但是， 悬浮培养的细胞具有局限性， 例如致瘤潜力和低于附着细胞 的蛋白质产量。
     当本文具体提及蛋白质时， 优选表示天然或重组蛋白质， 或者任选地已去除任何 信号序列的蛋白质。所述蛋白质可直接从葡萄球菌菌株分离出来或者通过重组 DNA 技术产 生。蛋白质的免疫原性片段可并入本发明的免疫原性组合物中。它们是包含连续取自蛋白 质氨基酸序列的至少 10 个氨基酸、 20 个氨基酸、 30 个氨基酸、 40 个氨基酸、 50 个氨基酸或 100 个氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 的片段。另外， 此类免疫原性片段与针对葡萄球 菌蛋白产生的抗体或者与用葡萄球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体具有免疫反应性。 免疫 原性片段还包括当以有效剂量施用时 ( 单独地或作为结合运载体的半抗原 ) 引发针对葡萄 球菌感染之保护性免疫应答的片段， 在某些方面， 其具有针对金黄色葡萄球菌和 / 或表皮 葡萄球菌感染的保护作用。这些免疫原性片段可包含例如缺少 N 端前导序列和 / 或跨膜结 构域和 / 或 C 端锚定结构域的蛋白质。在一个优选方面中， 本发明的免疫原性片段包含与 片段序列长度上所选序列有至少 85％同一性、 至少 90％同一性、 至少 95％同一性或者至少 97-99％同一性 ( 包括其间所有值和范围 ) 的蛋白质的基本上全部的细胞外结构域。
     本发明的免疫原性组合物还包含由葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白免疫原性片段 组成的融合蛋白。这些融合蛋白可以通过重组产生， 可包含至少 2、 3、 4、 5 或 6 种葡萄球菌 蛋白的一部分。或者， 融合蛋白可包含至少 1、 2、 3、 4 或 5 种葡萄球菌蛋白的多个部分。它 们可在同一蛋白质中组合不同的葡萄球菌蛋白和 / 或多个相同的蛋白质或蛋白质片段或 者其免疫原性片段。 或者， 本发明还包括葡萄球菌蛋白或其免疫原性片段的各个融合蛋白， 所述融合蛋白具有异源序列， 例如提供 T- 细胞表位或纯化标签 ( 例如 ： β- 半乳糖苷酶、 谷 胱甘肽 -S- 转移酶、 绿色荧光蛋白 (GFP))、 表位标签 ( 例如 FLAG、 myc 标签、 多组氨酸 ) 或 者病毒表面蛋白质 ( 例如流感病毒血细胞凝集素 ) 或细菌蛋白质 ( 例如破伤风类毒素、 白 喉类毒素和 CRM197)。
     治疗方法
     使用疫苗进行主动免疫和使用免疫球蛋白进行被动免疫是替代经典小分子 ( 例 如抗生素 ) 治疗的具有前景的方案。曾经造成大范围疾病、 残疾和死亡的一些细菌性疾病 如今可以通过使用疫苗进行预防。疫苗是基于削弱 ( 减毒 ) 或死亡的细菌、 细菌表面的组 分或失活的毒素。疫苗产生的免疫应答主要涉及免疫原性结构 ； 由免疫系统主动加工的细 菌上有限数目的蛋白质或糖结构。
     本发明的方法包括治疗由细菌性病原体 ( 例如葡萄球菌或芽胞杆菌 ) 引起或与其 有关的疾病或病症。免疫原性多肽和 / 或与其结合的抗体可用于在感染细菌或怀疑暴露于细菌的人中诱导或提供治疗性应答。 该方法可用于经测试为暴露于葡萄球菌或芽胞杆菌呈 阳性的个体， 或者用于根据可能的暴露被认定为具有感染风险的个体。
     本发明涵盖了葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的治疗方法。特别 地， 本发明涵盖了细菌感染 ( 特别是菌血症 ) 的治疗方法。本发明的治疗性组合物和疫苗 对于非紧急手术 (elective surgery) 来说是特别有利的。这些患者预先知晓手术的日期， 因此可预先进行接种或治疗。本发明的免疫原性组合物和疫苗对于接种医疗工作者、 第一 急救者 (first responder) 等也是有利的。
     在一些实施方案中， 所述治疗在佐剂或运载体或其它葡萄球菌抗原存在下施用。 此外， 在某些实例中， 治疗包括施用常用于抗细菌感染的其它药剂， 例如一种或多种抗生 素。
     A. 疫苗
     本发明包括预防或减轻葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的方法。 因此， 本发明涉及在主动和被动免疫的实施方案中使用的疫苗。被认为适合用作疫苗的免 疫原性组合物可以从免疫原性 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽 ( 例如全长的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原或其免疫原性片段 ) 制备。在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与其 它分泌型毒力蛋白、 表面蛋白或其免疫原性片段联合使用， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白或者本领域技术人员已知的其它葡萄球菌抗原、 肽或蛋白质 )。优选地， 将抗原性 材料充分透析以去除不需要的小分子量分子， 和 / 或冻干以更容易配制进期望的运载体。
     对基于蛋白质 / 肽的疫苗而言其它可行且重要的替代方案包括引入编码抗原的 核酸作为 DNA 疫苗。就这一点而言， 近期的报道描述了构建重组痘苗病毒， 并成功使用此类 构建体免疫小鼠， 用于引发保护性免疫应答， 所述重组痘苗病毒表达 10 个连续最小 CTL 表 位 (Thomson， 1996) 或者来自几种微生物的 B 细胞、 细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 和 T 辅助细胞 (Th) 表位的组合 (An， 1997)。因此， 对成功利用肽、 肽冲击 (peptide-pulsed) 抗原呈递细 胞 (APC) 和编码肽之构建体在体内有效引发保护性免疫应答已在文献中有充分的证据。美 国专利 5,958,895 和 5,620,896 中示例了使用核酸序列作为疫苗， 其每个通过引用以整体 并入本文。
     包含多肽或肽序列作为活性成分的疫苗的制备一般为本领域所充分理解， 如美国 专利 4,608,251、 4,601,903、 4,599,231、 4,599,230、 4,596,792 和 4,578,770 所示例， 所述 专利都通过引用并入本文。 这种疫苗通常以注射剂 ( 作为液体溶液或混悬液 ) 的形式制备 ； 还可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂也可以被乳化。活性免疫原性成分通常与可药用并与活性成分相容的赋形剂相混合。合适的赋形剂为例如水、 盐 溶液、 右旋糖、 甘油、 乙醇等， 及其组合。此外， 如有需要， 疫苗可含有一定量的辅助性物质， 如润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲剂或者增强疫苗效力的佐剂。 在一些具体实施方案中， 疫苗与多 种物质的组合一起进行配制， 如通过引用并入本文的美国专利 6,793,923 和 6,733,754 中 所述的。
     疫苗可常规地通过吸入和 / 或胃肠外注射 ( 例如皮下注射或肌内注射 ) 来施用。 适用于其它施用方式的另外制剂包括栓剂， 以及在某些情况下的口服制剂。 对于栓剂， 传统 粘合剂和运载体可包括例如聚亚烷基二醇 (polyalkalene glycol) 或甘油三脂 ； 这些栓剂 可由含有活性成分 ( 范围为约 0.5％至约 10％， 优选约 1％至约 2％ ) 的混合物形成。口服 制剂包含常用的赋形剂， 例如药用级的甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 纤维素、 碳酸 镁等。 这些组合物采用溶液、 混悬液、 片剂、 丸剂、 胶囊、 持续释放制剂或粉末剂的形式， 包含 约 10％至约 95％ ( 优选约 25％至约 70％ ) 的活性成分。
     多肽、 肽和编码肽之 DNA 构建体可以配制成中性或盐形式的疫苗。可药用的盐包 括酸加成盐 ( 由肽的游离氨基形成 ) 和与无机酸 ( 例如盐酸或磷酸 ) 或有机酸 ( 例如乙 酸、 草酸、 酒石酸、 杏仁酸等 ) 形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱 ( 例如氢氧 化钠、 氢氧化钾、 氢氧化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 和有机碱 ( 例如异丙胺、 三甲胺、 2- 乙胺 基乙醇、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     疫苗一般以与药剂剂型相匹配的方式、 以能够有效治疗和产生免疫的量来施用。 施用量取决于待治疗的对象， 包括个体免疫系统合成抗体的能力和所需的保护程度。需要 施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。但是， 合适的剂量范围为每次免疫几百微克 活性成分的数量级。初次施用和加强免疫的合适方案也是可变的， 但一般为初次施用之后 再进行后续接种或其它施用。
     应用的方式可以是多种多样的。疫苗施用的任何常规方法都是可应用的。这些方 法应包括利用生理学可接受的固体基质口服应用， 或者作为生理学可接受的分散体系以肠 胃外、 通过注射等来施用。 疫苗的剂量取决于施用途径， 且根据对象的体形和健康状况而变 化。
     在许多情形中， 需要多次施用疫苗， 通常至多、 至少或不超过六次疫苗接种， 更通 常四次疫苗接种， 通常一次或多次、 经常至少约三次疫苗接种。 疫苗接种一般间隔 1、 2、 3、 4、 5、 6 至 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 至 12 周， 包括其间所有值和范围， 更通常为间隔 3 至 5 周。通常， 间隔 1 ～ 5 年 ( 通常为 3 年 ) 进行定期加强免疫可维持保护性抗体的水平。在免疫过程之 后可测定针对该抗原的抗体， 如上文所述， 美国专利 3,791,932、 4,174,384 和 3,949,064 是 这些类型测定的示例。
     用于免疫之肽的使用通常需要所述肽与免疫原性运载体蛋白 ( 例如乙型肝炎表 面抗原、 匙孔槭血蓝蛋白或牛血清白蛋白 ) 或佐剂相缀合。实施此缀合的方法是本领域公 知的。
     1. 运载体
     给定的组合物的免疫原性可能有所不同。因此往往有必要加强宿主的免疫系统， 这可通过将肽或多肽偶联至运载体来实现。运载体包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白 (KLH) 和 牛血清白蛋白 (BSA)。其它白蛋白如卵白蛋白、 小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作运载体。 将多肽缀合到运载体蛋白的手段为本领域所熟知， 包括戊二醛、 间马来酰亚胺苯甲 酰 -N- 羟基琥珀酰亚胺酯、 碳二亚胺和双重氮联苯胺。
     2. 佐剂
     可通过使用免疫应答的非特异性刺激剂 ( 称为佐剂 ) 来增强多肽或肽组合物的免 疫原性。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物， 如细胞因子、 毒素或合成组合物。
     多种佐剂可用于增强抗体针对 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 肽或本文所述任何其它抗原 的应答。在另一些方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 肽 或蛋白质联用。佐剂可 (1) 滞留体内的抗原使其缓慢释放 ； (2) 将参与免疫应答的细胞吸 引到施用部位 ； (3) 诱导免疫系统细胞的增殖或活化 ； 或 (4) 促进抗原在对象整个身体中的 扩散。
     佐剂包括但不局限于水包油乳剂、 油包水乳剂、 矿物盐、 多核苷酸和天然物质。可 使用的具体佐剂包括 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-7、 IL-12、 γ- 干扰素、 GMCSP、 BCG、 铝盐 ( 例如氢 氧化铝或其它铝化合物 )、 MDP 化合物 ( 如 thur-MDP 和 nor-MDP)、 CGP(MTP-PE)、 脂质 A 和 单磷酰脂质 A(MPL)。也可使用 RIBI， 其包含在 2％角鲨烯 / 吐温 80 乳剂中的三种从细菌中 提取的组分——MPL、 海藻糖二分枝酸酯 (trehalose dimycolate， TDM) 和细胞壁骨架 (cell wall skeleton， CWS)。还可使用 MHC 抗原。其它佐剂或方法示例于美国专利 6,814,971、 5,084,269、 6,656,462， 其均通过引用并入本文。
     对疫苗实现佐剂效应的多种方法包括使用制剂如氢氧化铝或磷酸铝 ( 明矾 )， 通常以磷酸盐缓冲液中约 0.05 ％至约 0.1 ％的溶液使用， 其与以约 0.25 ％溶液使用的合 成多聚糖 (Carbopol ) 混合， 通过以约 70 ℃至约 101 ℃的温度分别热处理 30 秒至 2 分 钟来聚集疫苗中的蛋白质。还可采用以下方法来产生佐剂效应 ： 通过用胃蛋白酶处理的 (Fab) 白蛋白抗体的再次活化进行聚集 ； 与革兰氏阴性菌的细菌细胞 ( 例如短小棒状杆 菌 (C.parvum))、 内毒素或脂多糖组分混合 ； 在生理学可接受的油介质 ( 例如二缩甘露醇 一油酸 (Aracel A)) 中乳化 ； 或用作为封闭替代物 (block substitute) 的 20％全氟化碳 (Fluosol-DA ) 溶液乳化。
     常见佐剂包括弗氏完全佐剂 ( 包含灭活的结核分枝杆菌的免疫应答非特异性刺 激物 )、 弗氏不完全佐剂和氢氧化铝。
     在一些方面中， 优选地选择佐剂为 Th1 或 Th2 型应答的优先诱导物。高水平 Th1 型细胞因子倾向于偏好诱导针对给定抗原的细胞介导之免疫应答， 而高水平 Th2 型细胞因 子则倾向于偏好诱导针对抗原的体液免疫应答。
     Th1 和 Th2 型免疫应答的区别不是绝对的。实际上， 个体支持称为主要 Th1 或主 要 Th2 的免疫应答。但是， 常常方便地以 Mosmann 和 Coffman 在鼠 CD4+T 细胞克隆中所述 的形式定义细胞因子家族 (Mosmann 和 Coffman， 1989)。传统上， Th1 型应答与 T 淋巴细胞 产生 INF-γ 和 IL-2 细胞因子有关。经常直接与 Th1 型免疫应答诱导相关的其它细胞因子 ( 例如 IL-12) 不由 T 细胞产生。相比之下， Th2 型应答与 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10 的分泌 有关。
     除 了 佐 剂 之 外， 还 可 能 需 要 共 施 用 生 物 应 答 调 节 剂 (biologic response modifier， BRM) 来增强免疫应答。BRM 已显示能够上调 T 细胞免疫或下调细胞活性抑制剂。这些 BRM 包括但不局限于西咪替丁 (CIM ； 1200mg/ 天 )(Smith/Kline， PA) 或低剂量的环磷 2 酰胺 (CYP ； 300mg/m )(Johnson/Mead， NJ) 和细胞因子如 γ- 干扰素、 IL-2 或 IL-12， 或编码 参与免疫辅助功能之蛋白质 ( 如 B-7) 的基因。
     B. 抗体和被动免疫
     直接施用治疗性免疫球蛋白 ( 也称为 “被动免疫” ) 不需要来自患者的免疫应答， 因此给予即时的保护。另外， 被动免疫可针对并非免疫原性以及对于生物体来说特异性较 低的细菌结构。针对致病生物的被动免疫已基于来源于人或非人供体血清的免疫球蛋白。
     本发明的一个方面是制备用于预防或治疗葡萄球菌感染之免疫球蛋白的方法， 其 包括用本发明的疫苗免疫接受者以及从接受者分离免疫球蛋白或抗体的步骤。 此方法制备 的免疫球蛋白是本发明的另一个方面。 包含本发明免疫球蛋白和可药用运载体的药物组合 物是本发明又一个方面， 其可用于制备治疗或预防葡萄球菌疾病的药物。治疗或预防葡萄 球菌感染的方法是本发明的另一个方面， 其包括向患者施用有效量之本发明药物制剂的步 骤。
     用于产生多克隆抗体的接种物通常通过在生理耐受稀释剂 ( 例如盐水或其它适 于人使用的佐剂 ) 中分散抗原组合物以形成水性组合物来制备。向哺乳动物施用免疫激 活量的接种物， 然后使被接种的哺乳动物维持足以使得抗原组合物诱导出保护性抗体的时 间。可通过公知技术 ( 例如亲和色谱 ) 将抗体分离到所需的程度 (Harlow 和 Lane， 1988)。
     抗体可包括来自多种常用动物 ( 例如山羊、 灵长类动物、 驴、 猪、 马、 豚鼠、 大鼠或 人 ) 的抗血清制备物。对动物取血并回收血清。
     根据本发明产生的免疫球蛋白可包括完整抗体、 抗体片段或子片段。抗体可以是 完整的免疫球蛋白、 针对本发明两种或更多种抗原具有双特异性的嵌合抗体或杂合抗体。 它们也可以是片段， 例如 F(ab′ )2、 F(ab′ )、 Fab、 Fv 等， 包括杂合片段。免疫球蛋白还包 括天然、 合成或经遗传改造的蛋白质， 其通过结合特异性抗原形成复合物而如抗体一样起 作用。本文使用的术语 “免疫球蛋白” 包括本领域已知的所有免疫球蛋白类型和亚型， 包括 IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 及其亚型 ( 同种型 )， 例如 IgA1、 IgA2、 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgG4。 优选地， 本发明的免疫球蛋白是人免疫球蛋白。 另外， 还包括包含免疫球蛋白片段的抗原结 合结构与和 / 或可变结构域。抗原结合片段包括 Fab、 F(ab′ )、 F(ab′ )2、 Fv、 dAb、 Fd、 互 补决定区 (CDR) 片段、 单链抗体 (scFv)、 二价单链抗体、 单链噬菌体抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 含有至少足以赋予该 ( 多 ) 肽以特异性抗原结合之免疫球蛋白片段的 ( 多 ) 肽， 等 等。
     本发明抗原之组合物或疫苗可施用给接受者， 其随后作为应答于来自特异性疫苗 之攻击而产生的免疫球蛋白的来源。因此， 所治疗的对象可捐赠血浆， 从其中可通过常规 血浆分级分离方法获得超免疫球蛋白。可将超免疫球蛋白施用给另一个对象， 以赋予针对 葡萄球菌感染的抗性或者对其进行治疗。 本发明的超免疫球蛋白特别可用于治疗或预防婴 儿、 免疫缺陷个体的葡萄球菌疾病， 或者在需要治疗但没有时间让个体应答于疫苗接种而 产生抗体的情况下用于治疗或预防葡萄球菌疾病。
     本发明的另一个方面是包含一种或多种单克隆抗体 ( 或其片段 ； 优选人的或人源 化的 ) 的药物组合物， 所述抗体与本发明免疫原性组合物的成分具有反应性， 所述药物组 合物可用于治疗或预防革兰氏阳性细菌 ( 优选葡萄球菌， 更优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌 ) 的感染。这些药物组合物包含单克隆抗体， 其可以是与本发明抗原具有特异性的 任何类型的完整免疫球蛋白， 例如 IgG、 IgM、 IgA、 IgD 或 IgE、 嵌合抗体或杂合抗体。它们也 可以是片段， 例如 F(ab′ )2、 Fab′、 Fab、 Fv 等， 包括杂合片段。
     制备单克隆抗体的方法是本领域公知的， 可包括将脾细胞与骨髓瘤细胞的融合 (Kohler 和 Milstein， 1975 ； Harlow 和 Lane， 1988)。或者， 可通过筛选合适的噬菌体展示文 库获得单克隆 Fv 片段 (Vaughan 等， 1998)。单克隆抗体可以是人的、 通过已知方法人源化 的或部分人源化的。
     C. 联合治疗
     本发明的组合物和相关方法 ( 特别是向患者 / 对象施用葡萄球菌抗原 ) 也可 与传统治疗的施用联合使用， 所述葡萄球菌抗原包括 Emp、 AdsA 和 / 或 Eap 的多肽或肽 以及下列一种或多种肽或蛋白质 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。这些包括但 不限于 ： 抗生素的施用， 例如链霉素、 环丙沙星、 强力霉素、 庆大霉素、 氯霉素、 三甲氧苄二氨 嘧啶、 磺胺甲恶唑、 氨苄青霉素、 四环素或不同抗生素组合。 在一个方面中， 设想多肽疫苗和 / 或治疗与小分子或非肽类 AdsA 活性抑制剂联合使用。
     在一方面中， 本发明涉及的是， 多肽疫苗和 / 或疗法与抗菌治疗联合使用。或者， 所述疗法可在其它制剂治疗之前或之后， 间隔数分钟至数周。在单独施用其它制剂和 / 或 蛋白质或多核苷酸的实施方案中， 一般应确保每次递送之间的时间不会过长， 以便所述制 剂和抗原组合物仍能对对象发挥有利的组合疗效。 在这些情形中， 本发明涉及的是， 可在约 12-24 小时之内 ( 更优选地在约 6 ～ 12 小时之内 ) 施用两种疗法。然而， 在一些情况下， 可 能期望显著延长施用的时间， 这时在各次施用之间间隔几天 (2、 3、 4、 5、 6 或 7) 到几周 (1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8)。
     可采用不同组合， 例如抗生素疗法为 “A” ， 作为免疫疗法方案一部分给予的免疫原 性分子或抗体 ( 如抗原或 AdsA 调节剂 ) 为 “B” ：
     A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
     B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
     B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
     向患者 / 对象施用本发明免疫原性组合物应遵从施用这些化合物的一般方案， 其中考虑 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 组合物或本文所述任何其它抗原组合物或抗原组合的毒 性 ( 如果有的话 )。预计可根据需要重复治疗周期。还涉及的是， 多种标准疗法如水疗 (hydration) 可与所述疗法组合应用。III. 药物组合物
     在一些实施方案中， 向对象施用药物组合物。本发明的不同方面包括向对象施用 有效量的组合物。在本发明的一些实施方案中， 可向患者施用 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原并 与 Ess 途径成员 ( 包括 Esa 或 Esx 类的多肽或肽 ) 和 / 或分选酶底物成员和 / 或分泌型毒 力因子和或多糖联用， 以保护其免受一种或多种葡萄球菌病原体的感染或者进行治疗。或 者， 可将编码一种或多种这种多肽或肽的表达载体给予患者， 作为预防性治疗。此外， 这些 化合物可与抗生素联用。这些组合物一般可溶解或分散在可药用的运载体或含水介质中。
     本文使用的术语 “可药用” 是指在安全的医学判断范围内适于接触人体和动物组 织并且没有过度毒性、 刺激性、 变态反应或其它问题并发症且具有合理之益处 / 风险比的 化合物、 物质、 组合物和 / 或剂型。术语 “可药用运载体” 表示参与携带或运送化学物质的可 药用的材料、 组合物或介质， 例如液体或固体填充剂、 稀释剂、 赋形剂、 溶剂或包封材料。可 药用运载体包括任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延 迟剂等。这些针对药物活性物质的介质和制剂的用途为本领域所熟知。考虑在免疫原性和 治疗性组合物中使用任何常规介质或制剂， 除非其与活性成分不相容。还可将补充性活性 成分 ( 如其它抗菌剂 ) 掺入组合物中。
     除了配制成肠胃外施用的化合物 ( 如用于静脉内注射或肌内注射的那些 )， 其它 可药用的形式包括例如用于口服施用的片剂或其它固体 ； 缓释胶囊 ； 以及目前所用的其它 任何形式， 包括霜剂、 洗剂、 漱口剂、 吸入剂等。
     可将本发明的活性化合物配制成用于肠胃外施用， 例如配制成用于静脉内、 肌内、 皮下或腹膜内途径的注射。
     可在与表面活性剂 ( 如羟丙基纤维素 ) 适当混合的水中， 制备以游离碱或可药用 盐的形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、 液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制 备分散体系。在普通的储藏和使用条件下， 这些制备物含有防止微生物生长的防腐剂。
     适于注射使用的药用形式包括无菌水溶液或分散体系 ； 包括芝麻油、 花生油或含 水丙二醇的制剂 ； 用于即时制备无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末剂。 在所有情况下， 剂 型必须是无菌的， 而且必须达到可容易注射的流动程度。它还应当在加工和储藏条件下是 稳定的， 而且应当免受微生物 ( 如细菌和真菌 ) 的污染作用。
     可将蛋白质性组合物配制成中性或盐形式。可药用的盐包括酸加成盐 ( 由蛋白质 的游离氨基形成 ) 和由无机酸 ( 例如盐酸或磷酸 ) 或有机酸 ( 例如乙酸、 草酸、 酒石酸、 扁 桃酸等 ) 形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱 ( 例如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧 化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 和有机碱 ( 例如异丙胺、 三甲胺、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     运载体也可以是溶剂或分散介质， 其含有例如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如甘油、 丙二 醇和液体聚乙二醇等 )、 其合适的混合物以及植物油。可通过例如使用包衣 ( 如卵磷脂 )、 通过维持所需的粒径 ( 对于分散体系的情况 ) 以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动 性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂 ( 例如对羟苯甲酸酯类、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸、 硫柳汞 等 ) 来实现对微生物作用的预防。在许多情况下， 可优选包括等渗剂， 例如糖或氯化钠。可 通过在组合物中使用延迟吸收剂 ( 例如单硬脂酸铝和明胶 ) 来实现对注射组合物的延长吸 收。
     通过将所需量的活性化合物掺入具有上面所列举的多种成分的合适溶剂中来制备无菌注射溶液， 根据需要再进行过滤除菌。 一般地， 通过将多种无菌活性成分掺入无菌运 载体 ( 其含有基本分散介质和所需的其它上面所列举的成分 ) 来制备分散体系。对用于制 备无菌注射液的无菌粉末剂而言， 优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术， 由预先经 过滤除菌的溶液产生活性成分和所有其它所需成分的粉末剂。
     本发明组合物的施用通常可经由任何常见的途径。这包括但不局限于口服、 经鼻 或含服施用。或者， 可通过原位、 皮内、 皮下、 肌内、 腹膜内、 鼻内或静脉内施用来施用。在 某些实施方案中， 可吸入疫苗组合物 ( 例如美国专利 6,651,655， 其通过引用具体并入本文 中 )。 这些组合物通常作为可药用的组合物 ( 含有生理学可接受的运载体、 缓冲剂或其它赋 形剂 ) 来施用。
     就水溶液的肠胃外施用而言， 例如， 必要时可适当地缓冲溶液， 而且液体稀释剂应 首先用足量的盐水或葡萄糖进行等渗处理。 这些特定的水溶液特别适于静脉内、 肌内、 皮下 和腹膜内施用。 在这一点上， 根据本公开内容， 可采用的无菌含水介质为本领域技术人员所 知。例如， 可将一剂药物溶于等渗 NaCl 溶液中， 并且加入到皮下输液中或注射到建议的输 注位点 ( 参见例如， Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 1990)。根据对象的身体状 况， 剂量有必要发生一些改变。不管怎样， 负责施用的人会决定个体对象的合适剂量。
     治疗性或预防性组合物的有效量基于预期目标来确定。 术语 “单位剂量” 或 “剂量” 是指适于对象中使用的物理上分离的单位， 每个单位包含为产生上述与其施用 ( 即适当途 径和方案 ) 相关的预期应答而计算得出的组合物预定量。所要施用的量 ( 根据治疗次数和 单位剂量 ) 取决于期望的保护作用。
     组合物的精确剂量也取决于医生的判断， 且为特定针对每个个体的。影响给药的 因素包括对象的身体和临床状态、 施用途径、 治疗的预期目标 ( 减轻症状还是治愈 ) 以及特 定组合物的效力、 稳定性和毒性。
     制备后， 将以与给药剂型相匹配的方式、 以有效治疗或预防的量来施用溶液。 可容 易地以多种剂型 ( 如上文所述的注射液类型 ) 来施用制剂。
     体外、 离体或体内施用
     本文所用的术语 “体外施用” 是指对从动物中取出的或在动物体外的细胞 ( 包括 但不局限于培养中的细胞 ) 进行操作。术语 “离体施用” 是指将已在体外进行了操作的细 胞随后施用于活的动物。术语 “体内施用” 包括在动物体内进行的所有操作。
     在本发明的某些方面中， 可通过体外、 离体或体内施用组合物。在某些体外实施 方案中， 将自体 B 淋巴细胞细胞系与本发明的病毒载体孵育 24 ～ 48 小时， 或与 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 和 / 或 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 vWa、 Coa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白 ( 或其任何组合 ) 一起孵 育。经转导的细胞接着可用于体外分析， 或用于离体施用。
     通过引用并入本文的美国专利 4,690,915 和 5,199,942 公开了离体操作血液单核 细胞和骨髓细胞用于治疗性应用的方法。
     脂质组分和部分
     在某些实施方案中， 本发明涉及包含一种或多种与核酸或多肽 / 肽结合之脂质的 组合物。脂质是不溶于水且可用有机溶剂萃取的物质。本领域技术人员了解除了本文具体 描述的那些之外的脂质化合物， 并且其涵盖在本发明的组合物和方法中。脂质组分和非脂 质可以共价或非共价地彼此相连。
     脂质可以是天然脂质或合成脂质。但是， 脂质通常是生物物质。生物脂质是本领 域中公知的， 包括例如中性脂、 磷脂、 磷酸甘油酯、 类固醇、 萜烯、 溶血脂类、 鞘糖脂、 糖脂、 硫 酸酯、 具有醚和酯连接之脂肪酸的脂类以及多聚化脂质， 及其组合。
     与脂质相结合的核酸分子或多肽 / 肽可分散在含有脂质的溶液中， 溶于脂质中， 被脂质乳化， 与脂质混合， 与脂质化合， 与脂质共价键合， 作为悬浮物包含在脂质中或者以 其它方式与脂质相关联。本发明的脂质相关组合物不限于任何特定结构。例如， 它们还可 简单地散布于溶液中， 可能形成大小或形状都不均一的聚集体。在另一实例中， 它们可以 双层结构存在、 以胶束形式存在或者具有 “瓦解的” 结构。在另一非限制性实例中， 还考虑 lipofectamine(Gibco BRL) 或 Superfect(Qiagen) 复合物。
     在某些实施方案中， 组合物可包含约 1％、 约 2％、 约 3％、 约 4％、 约 5％、 约 6％、 约 7％、 约 8％、 约 9％、 约 10％、 约 11％、 约 12％、 约 13％、 约 14％、 约 15％、 约 16％、 约 17％、 约 18 ％、 约 19 ％、 约 20 ％、 约 21 ％、 约 22 ％、 约 23 ％、 约 24 ％、 约 25 ％、 约 26 ％、 约 27 ％、 约 28 ％、 约 29 ％、 约 30 ％、 约 31 ％、 约 32 ％、 约 33 ％、 约 34 ％、 约 35 ％、 约 36 ％、 约 37 ％、 约 38 ％、 约 39 ％、 约 40 ％、 约 41 ％、 约 42 ％、 约 43 ％、 约 44 ％、 约 45 ％、 约 46 ％、 约 47 ％、 约 48 ％、 约 49 ％、 约 50 ％、 约 51 ％、 约 52 ％、 约 53 ％、 约 54 ％、 约 55 ％、 约 56 ％、 约 57 ％、 约 58 ％、 约 59 ％、 约 60 ％、 约 61 ％、 约 62 ％、 约 63 ％、 约 64 ％、 约 65 ％、 约 66 ％、 约 67 ％、 约 68 ％、 约 69 ％、 约 70 ％、 约 71 ％、 约 72 ％、 约 73 ％、 约 74 ％、 约 75 ％、 约 76 ％、 约 77 ％、 约 78 ％、 约 79 ％、 约 80 ％、 约 81 ％、 约 82 ％、 约 83 ％、 约 84 ％、 约 85 ％、 约 86 ％、 约 87 ％、 约 88％、 约 89％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或其间任何范围的特定脂质、 脂质类型或者非脂质组分 ( 例如佐剂、 抗原、 肽、 多肽、 糖、 核酸或者本文公开的或本领域技术人员已知的其它物质 )。在一个非限制性实例 中， 组合物可包含约 10％至约 20％的中性酯， 以及约 33％至约 34％的脑苷脂和约 1％的胆 固醇。在另一非限制性实例中， 脂质体可包含约 4％至约 12％的萜烯， 其中约 1％的胶束具 体地是番茄红素， 剩余约 3％至约 11％的脂质体包含其它萜烯 ； 以及约 10％至约 35％的磷 脂酰胆碱， 和约 1％的非脂质组分。因此， 设想本发明的组合物可包含任何组合或百分比范 围的任何脂质、 脂质类型或其它组分。
     IV. 多糖
     本发明的免疫原性组合物还可包含荚膜多糖， 包括下列一种或多种 ： PIA( 也称为 PNAG) 和 / 或金黄色葡萄球菌 V 型和 / 或 VIII 型荚膜多糖和 / 或表皮葡萄球菌 I 型和 / 或 II 型和 / 或 III 型荚膜多糖。A.PIA(PNAG)
     现在知道， 鉴定为 PS/A、 PIA 和 SAA 的多种形式葡萄球菌表面多糖是同一化学实 体—— PNAG(Maira-Litran 等， 2004)。因此， 术语 PIA 或 PNAG 涵盖所有这些多糖或衍生自 它们的寡糖。
     PIA 是 多 糖 细 胞 间 粘 附 素， 其 由 N- 乙 酰 基 和 O- 琥 珀 酰 基 成 分 取 代 的 β-(1 → 6)- 连接葡糖胺组成。 此多糖在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都存在， 并可从 任一来源中分离出来 (Joyce 等， 2003 ； Maira-Litran 等， 2002)。例如， PNAG 可分离自金黄 色葡萄球菌 MN8m 株 (WO04/43407)。分离自表皮葡萄球菌的 PIA 是生物膜的整合成分。它 负责介导细胞 - 细胞粘附， 可能也发挥为生长的群落屏蔽宿主免疫应答的功能。
     先前称为聚 -N- 琥珀酰 -β-(1 → 6)- 葡糖胺 (PNSG) 的多糖最近显示出不具有预 期的结构， 这是因为对 N- 琥珀酰基化的鉴定是不正确的 (Maira-Litran 等， 2002)。因此， 之前称为 PNSG 现在被称为 PNAG 的多糖也涵盖在术语 PIA 中。PIA( 或 PNAG) 可具有不同的 大小， 从超过 400kDa 到 75 ～ 400kDa 到 10 ～ 75kDa 到最多由 30 个重复单位 (N- 乙酰基和 O- 琥珀酰基组分取代的 β-(1 → 6)- 连接的葡糖胺 ) 组成的寡糖不等。任何大小的 PIA 多 糖或寡糖都可用于本发明的免疫原性组合物中， 但是优选超过 40kDa 的大小。可通过本领 域已知的任何方法实现大小的调整， 例如微流化 (microfluidization)、 超声照射或化学切 割 (WO 03/53462、 EP497524、 EP497525)。PIA(PNAG) 的优选大小范围是 40 ～ 400kDa、 40 ～ 300kDa、 50 ～ 350kDa、 60 ～ 300kDa、 50 ～ 250kDa 和 60 ～ 200kDa。
     由于乙酸酯对氨基的取代， PIA(PNAG) 可具有不同程度的乙酰化。体外产生的 PIA 在氨基上几乎完全被取代 (95 ～ 100 ％ )。或者， 可使用具有少于 60 ％、 优选少于 50 ％、 40％、 30％、 20％、 10％乙酰化的脱乙酰化 PIA(PNAG)。脱乙酰化 PIA(PNAG) 的使用是优选 的， 因为 PNAG 的非乙酰化表位在介导调理素杀伤革兰氏阳性细菌 ( 优选金黄色葡萄球菌和 / 或表皮葡萄球菌 ) 方面是高效的。最优选地， PIA(PNAG) 具有 40kDa 至 300kDa 的大小， 并 且是脱乙酰化的， 从而少于 60％、 50％、 40％、 30％或 20％的氨基是乙酰化的。 术语 “脱乙酰 化 PNAG(dPNAG)” 是指 PNAG 多糖或寡糖， 其中少于 60％、 50％、 40％、 30％、 20％或 10％的氨 基是乙酰化的。
     在一个实施方案中， 通过化学处理天然多糖使得 PNAG 脱乙酰化形成 dPNAG。 例如， 用碱溶液处理天然 PNAG， 使得 pH 升高至 10 以上。例如， 用 0.1 ～ 5M、 0.2 ～ 4M、 0.3 ～ 3M、 0.5 ～ 2M、 0.75 ～ 1.5M 或 1M 的 NaOH、 KOH 或 NH4OH 处理 PNAG。在 20 ～ 100、 25 ～ 80、 30 ～ 60 或 30 ～ 50 或 35 ～ 45℃下处理至少 10 ～ 30 分钟， 或者 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15 或 20 个小时。 dPNAG 可如 WO 04/43405 所述制备。
     本发明免疫原性组合物中包含的多糖优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非 缀合的。
     B. 来自葡萄球菌的 5 型和 8 型多糖
     大多数在人体中造成感染的金黄色葡萄球菌含有 5 型或 8 型多糖。约 60％的人 菌株是 8 型， 约 30 ％的是 5 型。5 型和 8 型荚膜多糖抗原的结构由 Moreau 等 (1990) 和 Fournier 等 (1984) 所描述。两者都在重复单元中具有 FucNAcp 以及可用于引入巯基的 ManNAcA。据报道， 其结构为 ：
     5 型 → 4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1 → 4)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
    8 型 → 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNA 最近 (Jones， 2005)， NMR 谱将结构修正为 ： 5 型 → 4)-β-D-ManNAcA-(1 → 4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
    
    c-(1 → 8 型→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-α-D-FucNAc(1 →
     可使用已知方法 ( 美国专利 6,294,177) 从合适的金黄色葡萄球菌菌株提取多糖。 ATCC 12902 是 5 型金黄色葡萄球菌菌株， ATCC 12605 是 8 型金黄色葡萄球菌菌株。
     多糖具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学处理改变其大小。 本发明 免疫原性组合物中包含的 5 型和 8 型多糖优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非缀合 的。或者， 本发明的免疫原性组合物含有 5 型或 8 型多糖。
     C. 金黄色葡萄球菌 336 抗原
     在一个实施方案中， 本发明免疫原性组合物包含美国专利 6,294,177 中所述的金 黄色葡萄球菌 336 抗原。所述 336 抗原包含 β- 连接己糖胺， 其不含 O- 乙酰基， 并特异性 结合针对金黄色葡萄球菌 336 型 ( 以 ATCC 55804 保藏 ) 的抗体。在一个实施方案中， 所述 336 抗原是多糖， 其具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学处理改变其大小。 本 发明还涵盖了来源于 336 抗原的寡糖。当包含在本发明免疫原性组合物中时， 所述 336 抗 原优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非缀合的。
     D. 来自表皮葡萄球菌的 I、 II 和 III 型多糖
     表皮葡萄球菌的 ATCC-31432、 SE-360 和 SE-10 菌株的特征分别是三种不同的荚膜 类型—— I、 II 和 III 型 (Ichiman 和 Yoshida， 1981)。提取自每种表皮葡萄球菌血清型的 荚膜多糖构成 I、 II 和 III 型多糖。可通过一些方法提取多糖， 包括美国专利 4,197,290 中 所述的或者 Ichiman 等， 1991 所述的方法。
     在本发明的一个实施方案中， 免疫原性组合物包含来自表皮葡萄球菌的 I 和 / 或 II 和 / 或 III 型多糖或寡糖。
     多糖具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学切割改变其大小。 本发明 还涵盖提取自表皮葡萄球菌菌株的寡糖。这些多糖是非缀合的， 或者优选地如下所述进行 缀合。
     E. 多糖的缀合
     在与免疫接种中使用多糖有关的问题中， 事实是多糖本身是弱的免疫原。 优选地， 本发明中所用的多糖与蛋白质运载体相连以改善免疫原性。 此类可缀合多糖免疫原的运载 体的实例包括白喉和破伤风类毒素 ( 分别为 DT、 DT CRM197 和 TT)、 匙孔槭血蓝蛋白 (KLH) 和纯化的结核菌素蛋白衍生物 (PPD)、 绿脓假单胞菌外蛋白 A(rEPA)、 来自流感嗜血杆菌的 蛋白 D、 肺炎球菌溶血素或者上述任一的片段。适用的片段包括含有 T 辅助细胞表位的片 段。特别地， 来自流感嗜血杆菌的蛋白 D 片段优选含有所述蛋白 N 端 1/3。蛋白 D 是来自流 感嗜血杆菌的 IgD 结合蛋白 (EP 0 594 610 B1)， 其为潜在的免疫原。另外， 葡萄球菌蛋白 / 抗原可用作本发明多糖缀合物中的运载蛋白。
     特别有利地用于葡萄球菌疫苗背景中的运载蛋白是葡萄球菌 α 类毒素。其天然
     形式可与多糖缀合， 因为缀合的加工过程减少了毒性。优选地， 由于残存毒性较低， 所以经 遗传改造解毒的 α 毒素 ( 例如 His35Leu 或 His35Arg 变体 ) 用作运载体。或者， 通过用交 联剂甲醛或戊二醛处理对 α 毒素进行化学解毒。
     可以通过任何已知方法 ( 例如美国专利 4,372,945、 4,474,757 和 4,356,170) 将 多糖与运载蛋白相连。
     优选地， 进行 CDAP 缀合化学方法 ( 参见 WO95/08348)。在 CDAP 中， 优选使用氰基 化剂 1- 氰基 - 二甲基氨基吡啶四氟硼酸 (CDAP) 合成多糖 - 蛋白质缀合物。氰基化反应可 在相对温和条件下进行， 其避免了碱敏感多糖的水解。该合成允许直接偶联运载体蛋白。
     所述多糖溶于水或盐溶液。CDAP 溶于乙腈， 并立刻添加至多糖溶液。CDAP 与多糖 的羟基反应形成氰酸酯。在活化步骤之后， 添加运载体蛋白。赖氨酸的氨基与活化的多糖 反应形成异脲共价连接。 在偶联反应后， 添加大量过剩的甘氨酸以淬灭残余的活化官能团。 然后， 使产物通过凝胶渗透柱， 以除去未反应的运载体蛋白和残余的试剂。
     缀合优选包括在运载体蛋白和多糖之间产生直接连接。任选地， 可在运载体蛋白 和多糖之间引入间隔物 ( 例如二氢己二酸 (adipic dihydride， ADH))。
     V. 免疫应答和测定
     如上文所述， 本发明涉及引发或诱导对象中针对 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的免疫 应答。 在另一些实施方案中， 可引发或诱导针对其它肽或抗原的免疫应答， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡萄球菌肽或蛋白。在一个实施方案中， 免疫应答可 保护或治疗患有、 怀疑患有发生感染或相关疾病 ( 特别是与葡萄球菌有关的那些 ) 或具有 此种风险的对象 ( 例如限制脓肿持续存在 )。本发明的免疫原性组合物的一种用途是通过 在住院治疗前接种或治疗对象来预防医源性感染。
     A. 免疫测定
     本发明包括实施血清学测定以评价 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 以及本文所述的任何其 它多肽或肽物质是否诱导或引发免疫应答。有许多类型的免疫测定可以实施。本发明所涵 盖的免疫测定包括但不限于美国专利 4,367,110( 双单克隆抗体夹心法测定 ) 和美国专利 4,452,901(western 印迹 ) 所述的那些。其它测定包括体外和体内的带标记配体的免疫沉 淀和免疫细胞化学。
     免疫测定一般是结合测定。 某些优选免疫测定是本领域已知的多种类型的酶联免 疫吸附测定 (ELISA) 和放射免疫测定 (RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别 有用的。在一个实例中， 将抗体或抗原固定在所选表面 ( 例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔、量尺或柱支持物 ) 上。然后， 将怀疑含有目标抗原或抗体的测试组合物 ( 例如临床样品 ) 添加到孔中。在结合以及清洗以除去非特异性结合之免疫复合物之后， 可检测所结合的抗 原或抗体。 检测一般通过添加另一种与可检出标记相连的特异性针对目标抗原或抗体的抗 体来实现。此类 ELISA 被称为 “夹心法 ELISA” 。检测也可通过下述步骤实现 ： 添加特异性 针对目标抗原的第二抗体， 然后添加对第二抗体有结合亲和力的第三抗体， 第三抗体连接 有可检出标记。
     对 ELISA 技术的改动是本领域技术人员已知的。在一种此类改动中， 将怀疑含有 靶抗原或抗体的样品固定于孔表面上， 然后与本发明的抗体或抗原相接触。在结合以及适 当清洗之后， 检测所结合的免疫复合物。 当最初的抗原特异性抗体与可检出标记相连时， 可 直接检测免疫复合物。另外， 也可使用对第一抗原特异抗体有结合亲和力的第二抗体检测 免疫复合物， 第二抗体连接有可检出标记。
     也可以实施竞争性 ELISA， 其中测试样品竞争性结合已知量的经标记抗原或抗体。 通过在与经包被的孔一起孵育之前或其间， 将样品与已知经标记物质混合来确定未知样品 中反应性物质的量。样品中反应性物质的存在减少了可用于结合孔的经标记物质的量， 因 此减少了最终的信号。
     不论所使用的形式如何， ELISA 都具有某些共同的特征， 例如包被、 孵育或结合， 清 洗以除去非特异性结合的物质， 以及检测所结合的免疫复合物。
     在 ELISA 中， 更常见的是使用第二或第三检测手段， 而不是直接检测。因此， 在抗 原或抗体与孔结合、 用非反应性物质进行包被以降低背景以及清洗以除去未结合物质之 后， 将固定化的表面在有效允许免疫复合物 ( 抗原 / 抗体 ) 形成的条件下与待测试的临床 或生物学样品相接触。 然后， 免疫复合物的检测需要经标记的第二结合配体或抗体， 或者与 经标记之第三抗体或第三结合配体连接的第二结合配体或抗体。
     进行所有 ELISA 孵育步骤之后， 清洗接触面以除去未复合的物质。清洗常包括用 PBS/ 吐温溶液或者硼酸盐缓冲液清洗。 在测试样品和最初结合物质之间形成特异性免疫复 合物之后， 进行清洗， 可测定甚至微小量的免疫复合体的存在。
     为了提供检测手段， 第二或第三抗体可具有相连的标记用以检测。 在某些方面中， 该标记是酶， 其在与合适显色底物一起孵育之后会显色。因此， 例如， 期望在利于其它免疫 复合物形成的条件下将第一或第二免疫复合物与经尿素酶、 葡萄糖氧化酶、 碱性磷酸酶或 过氧化氢酶缀合的抗体相接触并孵育一段时间， 例如在含有 PBS 的溶液 ( 如 PBS 吐温 ) 中 于室温下孵育 2 小时。
     与经标记之抗体一起孵育后， 清洗以除去未结合的物质， 继而对标记物的量进行 定量， 例如， 对于过氧化物酶作为酶标记的情况， 通过与显色底物 ( 例如尿素和溴甲酚紫或 者 2， 2′ - 叠氮 - 二 (3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸 [ABTS] 和 H2O2) 一起孵育。然后， 通过测 量产生颜色的程度实现定量， 例如使用可见光谱分光光度计。 或者， 所述标记物可以是化学 发光标记物 ( 参见美国专利 5,310,687、 5,238,808 和 5,221,605)。
     B. 细菌感染的诊断
     除了如上所述使用蛋白质、 多肽和 / 或肽， 以及结合这些多肽、 蛋白质和 / 或肽的 抗体来治疗或预防感染之外， 本发明还考虑到以多种方式使用这些多肽、 蛋白质、 肽和 / 或 抗体， 包括检测葡萄球菌的存在以及诊断感染， 不论是在患者中还是在也可被污染的医疗器械上。根据本发明， 检测感染存在的优选方法包括下列步骤 ： 获得怀疑被一种或多种葡 萄球菌物种或菌株感染的样品， 例如取自个体的样品 ( 例如来自其血液、 唾液、 组织、 骨、 肌 肉、 软骨或皮肤 )。分离出样品之后， 可利用本发明多肽、 蛋白质、 肽和 / 或抗体进行诊断测 定， 以检测葡萄球菌的存在， 并且确定样品中此类存在的这种测定技术是本领域技术人员 公知的， 包括例如放射性免疫测定、 western 印迹分析和 ELISA 测定的方法。一般说来， 根 据本发明， 设想了下述诊断感染的方法， 其中将怀疑感染葡萄球菌的样品加入到本发明的 多肽、 蛋白质、 肽、 抗体或单克隆抗体中， 通过与所述多肽、 蛋白质和 / 或肽结合的抗体或者 与样品中所述抗体结合的多肽、 蛋白质和 / 或肽来指示葡萄球菌。
     因此， 本发明的抗体可用于预防葡萄球菌的感染， 用于治疗进行中的感染， 或者用 作研究工具。本文使用的术语 “抗体” 包括单克隆抗体、 多克隆抗体、 嵌合抗体、 单链抗体、 双特异性抗体、 人抗体、 猿源化抗体和人源化抗体或者灵长动物源化抗体以及 Fab 片段， 例 如保持所述抗体结合特异性的片段， 包括 Fab 免疫球蛋白表达文库的产物。因此， 本发明 设想了使用单链抗体， 例如抗体可变重链和轻链。任意这些类型抗体或抗体片段的产生 是本领域技术人员公知的。产生针对细菌蛋白质之抗体的具体实例可见于美国专利公开 20030153022， 其通过引用以整体并入本文。
     可直接用可检出标记对任意上述多肽、 蛋白质、 肽和 / 或抗体进行标记， 用以鉴定 和定量葡萄球菌。 用于免疫测定的标记物是本领域技术人员一般所知的， 包括酶、 放射性同 位素以及荧光、 发光和显色物质， 包括有色颗粒 ( 例如胶体金或乳胶珠 )。合适的免疫测定 包括 ELISA。
     C. 保护性免疫
     在本发明的一些实施方案中， 蛋白质性组合物向对象提供了保护性免疫。 “保护性 免疫” 是指机体建立特异性免疫应答的能力， 其保护对象免于发生某种病原体参与的特定 疾病或病症， 其中所述病原体会引发免疫应答。 免疫原性有效量能够赋予对象保护性免疫。
     本文说明书和后附权利要求书中使用的术语 “多肽” 和 “肽” 是指通过肽键彼此共 价相连的一段氨基酸。根据本发明， 不同的多肽具有不同的功能。根据一个方面， 多肽源自 为诱导接受者中的主动免疫应答而设计的免疫原， 根据本发明的另一方面， 多肽源自在例 如动物中引发主动免疫应答后产生的、 且可用于诱导接受者中的被动免疫应答的抗体。但 是， 在这两种情况下， 多肽均可根据任何可能的密码子使用由多核苷酸编码。
     本文使用的短语 “免疫应答” 是指在接受患者中产生针对本发明蛋白质、 肽、 碳水 化合物或多肽的体液应答 ( 由抗体介导 )、 细胞应答 ( 由抗原特异性 T 细胞或其分泌产物介 导 ) 或其两者兼有。这些应答可以是由施用免疫原诱导的主动应答， 或者是由施用抗体、 含 抗体之物质或预致敏 T 细胞诱导的被动应答。
     呈递与 I 类或 II 类 MHC 分子相结合的多肽抗原或表位引发细胞免疫应答， 从而活 化了抗原特异性 CD4(+)T 辅助细胞和 / 或 CD8(+) 细胞毒 T 细胞。所述应答也可包括单核 细胞、 巨噬细胞、 NK 细胞、 嗜碱细胞、 树突状细胞、 星形细胞、 小胶质细胞、 嗜酸性粒细胞或固 有免疫其它组分的活化。
     本文使用的 “主动免疫” 是指通过施用抗原赋予对象的任何免疫力。
     本文使用的 “被动免疫” 是指不向对象施用抗原而赋予对象的任何免疫力。因此 “被动免疫” 包括但不限于 ： 施用活化的免疫效应物 ( 其包括免疫应答的细胞介导物或蛋白质介导物， 例如单克隆和 / 或多克隆抗体 )。
     单克隆或多克隆抗体组合物可用于被动免疫， 用以预防或治疗生物体的感染， 所 述生物体携带或可暴露于被所述抗体识别的抗原。 抗体组合物可包含与不同抗原结合的抗 体， 所述抗体可与不同生物相关。所述抗体组分可以是多克隆抗血清。在某些方面中， 从已 用抗原攻击的动物或第二对象亲和纯化抗体。或者， 可使用抗体混合物， 其是针对同一、 相 关或不同微生物或生物体 ( 例如革兰氏阳性细菌、 革兰氏阴性细菌， 包括但不限于葡萄球 菌 ) 中存在之抗原的单克隆和 / 或多克隆抗体的混合物。
     可通过向患者施用免疫球蛋白 (Ig) 和 / 或其它免疫因子向患者或对象给予被动 免疫， 所述免疫球蛋白和 / 或其它免疫因子获得自供体或其它具有已知免疫反应性的非患 者来源。 在另一些方面中， 可向作为球蛋白来源或供体之对象施用本发明的抗原组合物， 所 述球蛋白响应于抗原组合物的攻击而产生， 其含有针对葡萄球菌或其它生物体的抗体 ( “超 免疫球蛋白” )。因此， 如此处理的对象贡献出血浆， 然后通过常规血浆分级分离方法从中 获得超免疫球蛋白， 并施用给另一对象从而赋予其对葡萄球菌感染的抗性或者治疗。根据 本发明， 超免疫球蛋白特别可用于免疫受损的个体、 接受了介入性方法的个体或者时间不 允许个体响应于疫苗接种而产生自身抗体的情况。 对于涉及被动免疫的示例性方法和组合 物， 参见美国专利 6,936,258、 6,770,278、 6,756,361、 5,548,066、 5,512,282、 4,338,298 和 4,748,018， 其每篇均通过引用以整体并入本文。
     在某些方面中， 方法包括通过向有此需要的对象施用所述抗体组合物 ( 例如结合 上述抗原的抗体 ) 治疗或预防感染。治疗和预防感染的靶标患者群体包括感染了细菌性病 原体或者具有感染其之风险的哺乳动物， 例如人。 在一个实施方案中， 待治疗或预防的感染 是金黄色葡萄球菌感染， 包括甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或产生 α- 毒素的金黄色葡 萄球菌的感染， 或者表皮葡萄球菌感染。
     根据一个实施方案， 本发明提供了治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法， 其使 用包含下列一项或多项的组合物 ： 金黄色葡萄球菌 AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 vWa、 Coa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白抗体， 以及可药用运载体。金黄色葡萄球菌抗体可结合上述任何抗原。在一个实 施方案中， 所述抗体组合物是抗体组合物或超免疫组合物。 在另一实施方案中， 所述抗体是 重组抗体、 人抗体或人源化抗体。在又一实施方案中， 所述抗体是单克隆抗体或其片段。
     可通过本领域常规方法确定所述抗体组合物的治疗或预防有效量。 本领域技术人 员应了解， 所述量可根据所述组合物中特定抗体、 所述组合物中抗体的浓度、 施用频率、 待 治疗或预防之感染的严重程度以及对象的具体状况 ( 例如年龄、 体重和免疫状态 ) 而有所变化。在一些实施方案中， 所述剂量是每千克体重至少 1、 5、 10、 25、 50 或 100μg 或 mg 抗体 组合物 (mg/kg)， 包括至少 100mg/kg、 至少 150mg/kg、 至少 200mg/kg、 至少 250mg/kg、 至少 500mg/kg、 至少 750mg/kg 和至少 1000mg/kg。 单克隆抗体组合物的剂量通常可以较低， 例如 抗体组合物剂量的 1/10， 例如至少约 1、 5、 10、 25 或 50μg/kg 或 mg/kg， 至少约 10mg/kg、 至 少约 15mg/kg、 至少约 20mg/kg 或者至少约 25mg/kg。施用途径可以是适于被动免疫的任何 途径。因此， 涵盖了静脉内、 皮下、 肌内、 腹膜内、 吸入及其它施用途径。如上所述， 抗体的治 疗或预防有效量是足以实现治疗或预防有益作用的量。
     保护性抗体组合物可中和和 / 或预防感染。保护性抗体组合物可包含一定量 的 AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白的抗体， 其在单独使用时 不具有保护性， 而当组合时其产生保护性抗体组合物。
     所述抗体组合物可在联合治疗中与抗感染剂、 抗生素药剂和 / 或抗微生物剂联合 施用。抗感染剂包括但不限于万古霉素和溶葡萄菌素。抗生素药剂和抗微生物剂包括但不 限于青霉素酶抗性青霉素、 先锋霉素和碳青霉烯类 (carbapenems)， 包括万古霉素、 溶葡萄 菌素、 青霉素 G、 氨苄西林、 苯唑西林、 萘夫西林、 氯唑西林、 双氯西林、 头孢噻吩、 头孢唑林、 头孢氨苄、 环己烯胺头孢菌素、 头孢孟多、 头孢西丁、 亚胺培南、 美罗培南、 庆大霉素、 替考拉 宁、 林可霉素和克林霉素。这些抗生素的剂量是本领域公知的。参见， 例如 Merck Manual Of Diagnosis And Therapy， §13， 157 章， 第 100 版 (Beers & Berkow 编， 2004)。可以在 本文所述主动或被动免疫疗法施用之前、 施用同时或施用之后联合抗感染、 抗生素和 / 或 抗微生物剂使用。
     在一些实施方案中， 施用相对少给药次数的抗体组合物， 例如一次或两次给药， 以 及应用常规抗生素疗法， 其通常包括在数天或数星期内多次给药。 因此， 所述抗生素可以在 一段时期内 ( 例如至少 5 天、 10 天或甚至 14 或更多天 ) 每天一次、 两次或三次或更多次， 而 所述抗体组合物通常仅施用一次或两次。 但是， 可选择抗体组合物和抗生素的不同剂量、 给 药时间和相对量， 并且可由本领域技术人员来作出判断。
     出于本说明书和权利要求的目的， 术语 “表位” 和 “抗原决定簇” 可互换地用于表示 抗原上 B 和 / 或 T 细胞应答或识别的部位。B 细胞表位可由连续氨基酸形成， 或者由通过蛋 白质三级折叠而靠近的非连续氨基酸形成。 由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶 剂后仍保留， 而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理之后丢失。表位通常包括独 特空间构象中至少 3 个、 更常见至少 5 个或 8 ～ 10 个氨基酸。确定表位空间构象的方法包 括例如 X- 射线晶体衍射和二维核磁共振。参见例如 Epitope Mapping Protocols(1996)。可在简单的免疫测定中鉴定出识别相同表位的抗体， 所述免疫测定显示一种抗体阻断另一 种抗体与靶抗原结合的能力。对于 CD8 细胞， T 细胞识别约 9 个氨基酸的连续表位， 而对于 CD4 细胞， 为约 13 ～ 15 个氨基酸。可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定鉴定出识别所 述表位的 T 细胞， 如下所述进行 ： 测定预致敏 T 细胞响应于表位的 3H- 胸苷掺入 (Bruke 等， 1994)、 测定抗原依赖性杀伤 (cytotoxic T lymphocyte assay， Tigges 等， 1996) 或者测定 细胞因子分泌。
     可通过增殖测定 (CD4(+)T 细胞 ) 或 CTL( 细胞毒 T 细胞 ) 测定来确定细胞介导免 疫应答的存在。 体液应答和细胞应答对免疫原的保护性或治疗性作用的相对贡献可通过以 下方式进行区分 ： 从经免疫的同基因动物中单独分离 IgG 和 T 细胞， 在第二对象中测量保护 性或治疗性作用。
     本文和权利要求中使用的术语 “抗体” 或 “免疫球蛋白” 可互换地使用， 并表示作 为动物或接受者免疫应答的一部分发挥作用的几类结构上相关蛋白质中的任意种， 所述蛋 白质包括 IgG、 IgD、 IgE、 IgA、 IgM 和相关蛋白。
     在正常生理条件下， 抗体存在于血浆及其它体液中以及某些细胞的膜中， 其由称 为 B 细胞的淋巴细胞类型或者其功能等同物产生。IgG 类别的抗体由通过二硫键连接的四 条多肽链组成。完整 IgG 分子的四条链是两条相同的重链 ( 称为 H 链 ) 和两条相同的轻链 ( 称为 L 链 )。
     为了产生多克隆抗体， 用抗原或抗原片段 ( 通常与佐剂一起， 必要时， 与运载体偶 连 ) 免疫宿主例如兔、 山羊、 绵羊或人。随后从宿主的血清中收集针对所述抗原的抗体。可 针对所述抗原亲和纯化多克隆抗体， 使其成为单特异性的。
     为了产生单克隆抗体， 用所述抗原对合适供体 ( 通常为小鼠 ) 进行超免疫。然后， 分离产生抗体的脾细胞。将这些细胞与具有永生化特征的细胞 ( 例如骨髓瘤细胞 ) 融合， 以提供融合细胞杂交体 ( 杂交瘤 )， 其可在培养物中维持并分泌所需单克隆抗体。然后， 大 量培养所述细胞， 从培养基中收获单克隆抗体备用。 根据定义， 单克隆抗体对单个表位具有 特异性。为此， 对于类似的抗原， 单克隆抗体往往具有比多克隆抗体更低的亲和常数。
     也可通过使用脾细胞或来源于脾的细胞系的原代培养物产生单克隆抗体 (Anavi， 1998)。 为 产 生 重 组 抗 体 ( 一 般 性 参 见 Huston 等， 1991 ； Johnson 等， 1991 ； Mernaugh 等， 1995)， 将来自产生抗体之 B 淋巴细胞的动物或杂交瘤的信使 RNA 逆转录得到互补 DNA(cDNA)。 扩增抗体 cDNA( 可以是全长或部分长度 )， 并克隆进噬菌体或质粒中。 所述 cDNA 可以是重链和轻链 cDNA 的部分长度， 其为间隔的或者通过接头相连。使用合适表达系统表 达所述抗体或抗体片段， 得到重组抗体。也可通过筛选相关表达文库获得抗体 cDNA。
     如本领域公知地， 所述抗体可以与固体支持物基底结合， 或者与可检出部分缀合， 或者两者皆有。与荧光部分或酶部分缀合的一般性讨论参见 Johnstone 等 (1982)。抗体与 固体支持物基底的结合也是本领域公知的 (Harlow 等， 1988 ； Borrebaeck， 1992)。
     本文及权利要求中所用的短语 “抗体的免疫部分” 包括抗体的 Fab 片段、 抗体的 Fv 片段、 抗体的重链、 抗体的轻链、 抗体的重链和轻链非连接混合物、 由抗体的重链和轻链组 成的异二聚体、 抗体重链的催化结构域、 抗体轻链的催化结构域、 抗体轻链的可变片段、 抗 体重链的可变片段以及抗体的单链变体 ( 也称为 scFv)。另外， 该术语包括嵌合免疫球蛋 白， 其是来源于不同物种之融合基因的表达产物。 所述物种之一可以是人， 此时嵌合免疫球蛋白称为人源化的。通常， 抗体的免疫部分与其所来源的完整抗体竞争特异性结合抗原。
     任选地， 抗体 ( 或优选地， 抗体的免疫部分 ) 可以与其它蛋白质化学缀合或者表达 为融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求的目的， 所有此类融合蛋白均包含在抗体或抗 体免疫部分的定义中。
     本文使用的术语 “免疫原性物质” 或 “免疫原” 或 “抗原” 可互换地用于表示在施用 给接受者后 ( 单独地、 与佐剂一起或者呈现于展示载体上 ) 能够诱导针对其自身的免疫应 答的分子。
     VI. 核酸
     在某些实施方案中， 本发明涉及编码本发明蛋白质、 多肽和肽的重组多核苷酸。 包 括针对 Emp、 Eap 或 AdsA 以及其它细菌蛋白质 ( 包括但不限于 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 Coa、 vWa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基 葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白 ) 的核酸序列。
     本申请使用的术语 “多核苷酸” 是指重组的或者已分离出的不含总基因组核酸的 核酸分子。术语 “多核苷酸” 是寡核苷酸 ( 长度为 100 个残基或更少的核酸 )、 重组载体 ( 其 包括例如质粒、 粘粒、 噬菌体、 病毒等 )。在某些方面中， 多核苷酸包含调节序列， 其基本上 与其天然基因或蛋白质编码序列相分隔。多核苷酸可以是单链 ( 编码链或反义链 ) 或双链 的， 其可以是 RNA、 DNA( 基因组、 cDNA 或合成的 )、 其类似物或其组合。另外的编码或非编码 序列可以存在于多核苷酸中， 但这不是必需的。
     在这方面， 术语 “基因” 、 “多核苷酸” 或 “核酸” 用于表示编码蛋白质、 多肽或肽的 核酸 ( 包含正确转录、 翻译后修饰或定位所需的任何序列 )。如本领域技术人员所了解地， 此术语涵盖基因组序列、 表达盒、 cDNA 序列、 mRNA 序列和较小的经改造核酸区段， 其表达或 可适于表达蛋白质、 多肽、 结构域、 肽、 融合蛋白和突变体。 编码多肽之全部或部分的核酸可 含有编码该多肽之全部或部分的连续核酸序列， 其长度为 ： 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 260、 270、 280、 290、 300、 310、 320、 330、 340、 350、 360、 370、 380、 390、 400、 410、 420、 430、 440、 441、 450、 460、 470、 480、 490、 500、 510、 520、 530、 540、 550、 560、 570、 580、 590、 600、 610、 620、 630、 640、 650、 660、 670、 680、 690、 700、 710、 720、 730、 740、 750、 760、 770、 780、 790、 800、 810、 820、 830、 840、 850、 860、 870、 880、 890、 900、 910、 920、 930、 940、 950、 960、 970、 980、 990、 1000、 1010、 1020、 1030、 1040、 1050、 1060、 1070、 1080、 1090、 1095、 1100、 1500、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 9000、 10000 个或更多的本发明多肽的核苷 酸、 核苷或碱基对。还考虑到， 特定多肽可由含有变化的核酸所编码， 所述核酸具有稍有不同的核酸序列， 但是尽管如此仍编码相同或基本上相似的蛋白质 ( 参见上文表 2)。
     在一些特定实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 的核酸序列， 其还可与下列相组合 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻 连蛋白结合蛋白。因此， 分离的核酸区段或含有核酸区段的载体可编码例如具有免疫原 性的 ： Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 和 / 或 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。术语 “重组” 可与 “多肽” 或具体的多肽名称联用， 其一般是指由已经过体外操作的核酸分子或者这些分 子之复制产物的核酸分子所产生的多肽。
     在另一些实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其包含编码用于 在对象中产生免疫应答之肽或多肽的核酸序列。在多个实施方案中， 本发明的核酸可用于 基因疫苗。
     本发明中所用的核酸区段， 不管其编码序列长度如何， 可以与其它核酸序列 ( 例 如启动子、 多聚腺苷酸化信号、 额外的限制性酶切位点、 多克隆位点、 其它编码区段等 ) 相 组合， 从而使它们的全长可变化很大。因此， 考虑到可使用几乎任何长度的核酸片段， 其总 长度优选受到制备简便性和在预定重组核酸方案中用途的限制。在某些情况下， 核酸序列 可编码具有额外异源编码序列的多肽序列， 例如以允许纯化所述多肽、 转运、 分泌、 翻译后 修饰或者为了治疗益处 ( 例如靶向或效力 )。 如上所述， 可将标签或其它异源多肽添加到所 修饰的多肽编码序列， 其中 “异源” 表示与所修饰多肽不同的多肽。
     在另一些实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其在序列中包含 来自下列的连续核酸序列 ： SEQ ID NO ： 1(Emp)、 SEQ ID NO ： 3(Eap)、 SEQ ID NO ： 5(EsxA)、 SEQ ID NO ： 7(EsxB)、 SEQ ID NO ： 9(SdrD)、 SEQ ID NO ： 11(SdrE)、 SEQ ID NO ： 13(IsdA)、 SEQ ID NO ： 15(IsdB)、 SEQ ID NO ： 17(SpA)、 SEQ ID NO ： 19(ClfB)、 SEQ ID NO ： 21(IsdC)、 SEQ IDNO ： 23(SasF)、 SEQ ID NO ： 25(SdrC)、 SEQ ID NO ： 27(ClfA)， SEQ ID NO ： 29(EsaB)、 SEQ ID NO ： 31(EsaC)、 SEQ ID NO ： 33(SasB) 或 SEQ ID NO ： 35(Sas) 或者编码分泌型毒力因子和 / 或表面蛋白的任何其它核酸序列。
     在某些实施方案中， 本发明提供了与本文公开的序列具有显著同一性的多核苷酸 变体， 使用本文所述方法 ( 例如使用标准参数的 BLSAT 分析 )， 它们与本发明的多核苷酸序 列相比它们包含至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％或更高序 列同一性 ( 包括其间的所有值和范围 )。在某些方面中， 本发明的分离多核苷酸包含编码 如下多肽的核苷酸序列， 所述多肽与本发明的氨基酸序列在所述序列整个长度上具有至少 90％、 优选 95％及更高的同一性 ； 或者包含与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
     本发明还考虑使用与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸。
     本发明还提供了本发明多核苷酸片段的用途， 其在施用给对象时具有与多核苷酸 相同的免疫原性。
     本发明还提供了编码如上所述本发明蛋白质免疫片段的多核苷酸的用途。
     A. 载体
     本发明的多肽可由载体中包含的核酸分子编码。 所使用的术语 “载体” 是指运载体 核酸分子， 异源核酸序列可插入其中用以引入到其可复制和表达的细胞中。核酸序列可以 是 “异源的” ， 在上下文中其表示对于所述载体待引入其中的细胞或者待掺入其中的核酸而 言是外源的， 其包含与所述细胞或核酸中之序列同源的序列， 但是其是在宿主细胞或核酸 中其通常不存在的位置。载体包括 DNA、 RNA、 质粒、 粘粒、 病毒 ( 噬菌体、 动物病毒和植物病 毒 ) 和人工染色体 ( 例如 YAC)。本领域技术人员能够通过标准重组技术 ( 例如 Sambrook 等， 2001 ； Ausubel 等， 1996， 其两者通过引用并入本文 ) 容易地构建载体。除了编码 Emp、 Eap 或 AdsA 多肽之外， 载体还可编码 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡 萄球菌肽或蛋白质， 载体可编码多肽序列 ( 例如标签或免疫原性增强肽 )。 编码这些融合蛋 白的可用载体包括 pIN 载体 (Inouye 等， 1985)、 编码一段组氨酸的载体和用于产生谷胱甘 肽 S- 转移酶 (GST) 可溶性融合蛋白的 pGEX 载体， 以用于后期纯化和分离或切割。
     本发明的载体可用于宿主细胞中产生 Emp 或 Eap 或 AdsA 多肽。在某些方面中， 所述载体还可产生 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡萄球菌肽或 蛋白质， 其随后可纯化用于施用给对象， 或者所述载体可纯化用以直接施用给对象， 从而在 对象中表达所述蛋白质。
     术语 “表达载体” 是指含有编码能够转录的基因产物之至少一部分的核酸序列的 载体。在一些情况下， RNA 分子随后翻译成蛋白质、 多肽或肽。表达载体可含有多种 “控制 序列” ， 其表示有效连接的编码序列在特定宿主生物体内转录和可能的翻译所需的核酸序 列。除了调节转录和翻译的控制序列之外， 载体和表达载体还可含有用作其它功能的核酸 序列， 其在本文中有所描述。
     1. 启动子和增强子
     “启动子” 是控制序列。启动子通常是控制转录起始和速率的核酸序列区域。它可 含有可在此结合调节性蛋白和分子 ( 例如 RNA 聚合酶及其它转录因子 ) 的遗传元件。短语 “有效位于” 、 “有效连接” 、 “控制之下” 和 “处于转录控制之下” 表示启动子相对于核酸序列 处于正确功能的位置和 / 或方向， 以控制该序列的转录起始和表达。 启动子可以或不与 “增 强子” 配合使用， 所述增强子是指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。
     启动子可以是与基因或序列天然相连的启动子， 如可通过将位于编码区段或外显 子上游的 5′非编码序列分离而获得。这样的启动子可称为 “内源的” 。类似地， 增强子可 以是与核酸序列天然相连的增强子， 其位于该序列的下游或上游。 或者， 将编码核酸区段置 于重组或异源启动子控制下会获得某些优势， 所述启动子是指在其自然环境中通常不与核 酸序列相连的启动子。重组或异源增强子还指在其自然状态下通常不与核酸序列相连的 增强子。这些启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子， 以及分离自任何其它原 核、 病毒或真核细胞的启动子或增强子， 以及非 “天然” 的启动子或增强子， 即含有不同转录 调节区域的不同元件和 / 或改变其表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列 之外， 可使用重组克隆和 / 或核酸扩增技术 ( 包括 PCRTM) 以及本文公开的组合物产生序列 ( 参见美国专利 4,683,202、 美国专利 5,928,906， 其各自通过引用并入本文 )。
     自然地， 利用在选择用于表达的细胞类型或生物体中有效指导 DNA 区段表达的启 动子和 / 或增强子可以是重要的。分子生物学领域技术人员一般知晓启动子、 增强子和细 胞类型的组合用于蛋白质表达的用途 ( 参见 Sambrook 等， 2001， 通过引用并入本文 )。 可用 的启动子可以是组成型、 组织特异性或可诱导的， 在某些实施方案中， 在特定条件下 ( 例如 大规模生产重组蛋白质或肽 ) 可指导引入的 DNA 区段高水平表达。
     在本发明的背景下， 可利用多个元件 / 启动子来调节基因的表达。作为可响应于 特定刺激而活化的核酸序列区域的这些可诱导元件的实例包括但不限于 ： 免疫球蛋白重 链 (Banerji 等， 1983 ； Gilles 等， 1983 ； Grosschedl 等， 1985 ； Atchinson 等， 1986， 1987 ； Imler 等， 1987 ； Weinberger 等， 1984 ； Kiledjian 等， 1988 ； Porton 等 ； 1990)、 免疫球蛋白 轻 链 (Queen 等， 1983 ； Picard 等， 1984)、 T 细 胞 受 体 (Luria 等， 1987 ； Winoto 等， 1989 ；Redondo 等 ； 1990)、 HLA DQα 和 / 或 DQ β(Sullivan 等， 1987)、 β 干扰素 (Goodbourn 等， 1986 ； Fujita 等， 1987 ； Goodbourn 等， 1988)、 白介素 -2(Greene 等， 1989)、 白介素 -2 受体 (Greene 等， 1989 ； Lin 等， 1990)、 MHC II 类 5(Koch 等， 1989)、 MHC II 类 HLA-DRα(Sherman 等， 1989)、 β- 肌动蛋白 (Kawamoto 等， 1988 ； Ng 等 ； 1989)、 肌肉肌酸激酶 (MCK)(Jaynes 等， 1988 ； Horlick 等， 1989 ； Johnson 等， 1989)、 前白蛋白 ( 转甲状腺素 )(Costa 等， 1988)、 弹性蛋白酶 I(Ornitz 等， 1987)、 金属硫蛋白 (MTII)(Karin 等， 1987 ； Culotta 等， 1989)、 胶原酶 (Pinkert 等， 1987 ； Angel 等， 1987)、 白蛋白 (Pinkert 等， 1987 ； Tronche 等， 1989， 1990)、 α- 甲 胎 蛋 白 (Godbout 等， 1988 ； Campere 等， 1989)、 γ- 珠 蛋 白 (Bodine 等， 1987 ； Perez-Stable 等， 1990)、 β- 珠 蛋 白 (Trudel 等， 1987)、 c-fos(Cohen 等， 1987)、 c-Ha-Ras(Triesman， 1986 ； Deschamps 等， 1985)、 胰 岛 素 (Edlund 等， 1985)、 神经细胞粘 附分子 (NCAM)(Hirsh 等， 1990)、 α1- 抗胰蛋白酶 (Latimer 等， 1990)、 H2B(TH2B) 组蛋白 (Hwang 等， 1990)、 小鼠和 / 或 I 型胶原 (Ripe 等， 1989)、 葡萄糖调节蛋白 (GRP94 和 GRP78) (Chang 等， 1989)、 大 鼠 生 长 素 (Larsen 等， 1986)、 人 血 清 淀 粉 样 蛋 白 A(SAA)(Edbrooke 等， 1989)、 肌 钙 蛋 白 I(TN I)(Yutzey 等， 1989)、 血 小 板 来 源 生 长 因 子 (PDGF)(Pech 等， 1989)、 杜 氏 肌 营 养 不 良 (Klamut 等， 1990)、 SV40(Banerji 等， 1981 ； Moreau 等， 1981 ； Sleigh 等， 1985 ； Firak 等， 1986 ； Herr 等， 1986 ； Imbra 等， 1986 ； Kadesch 等， 1986 ； Wang 等， 1986 ； Ondek 等， 1987 ； Kuhl 等， 1987 ； Schaffner 等， 1988)、多 形 瘤 (Swartzendruber 等， 1975 ； Vasseur 等， 1980 ； Katinka 等， 1980， 1981 ； Tyndell 等， 1981 ； Dandolo 等， 1983 ； de Villiers 等， 1984 ； Hen 等， 1986 ； Satake 等， 1988 ； Campbell 等， 1988)、 逆转录病毒 (Kriegler 等， 1982， 1983 ； Levinson 等， 1982 ； Kriegler 等， 1983， 1984a， b， 1988 ； Bosze 等， 1986 ； Miksicek 等， 1986 ； Celander 等， 1987 ； Thiesen 等， 1988 ； Celander 等， 1988 ； Choi 等， 1988 ； Reisman 等， 1989)、 乳 头 状 瘤 病 毒 (Campo 等， 1983 ； Lusky 等， 1983 ； Spandidos 和 Wilkie， 1983 ； Spalholz 等， 1985 ； Lusky 等， 1986 ； Cripe 等， 1987 ； Gloss 等， 1987 ； Hirochika 等， 1987 ； Stephens 等， 1987)、 乙肝病毒 (Bulla 等， 1986 ； Jameel 等， 1986 ； Shaul 等， 1987 ； Spandau 等， 1988 ； Vannice 等， 1988)、 人免疫缺陷病毒 (Muesing 等， 1987 ； Hauber 等， 1988 ； Jakobovits 等， 1988 ； Feng 等， 1988 ； Takebe 等， 1988 ； Rosen 等， 1988 ； Berkhout 等， 1989 ； Laspia 等， 1989 ； Sharp 等， 1989 ； Braddock 等， 1989)、 巨细胞病毒 (CMV)IE(Weber 等， 1984 ； Boshart 等， 1985 ； Foecking 等， 1986)、 长臂猿类人猿白血病病毒 (Holbrook 等， 1987 ； Quinn 等， 1989)。
     可诱导元件包括但不限于 ： MT II- 佛波酯 (TFA)/ 重金属 (Palmiter 等， 1982 ； Haslinger 等， 1985 ； Searle 等， 1985 ； Stuart 等， 1985 ； Imagawa 等， 1987 ； Karin 等， 1987 ； Angel 等， 1987b ； McNeall 等， 1989) ； MMTV( 小鼠乳腺瘤病毒 )- 糖皮质激素 (Huang 等， 1981 ； Lee 等， 1981 ； Majors 等， 1983 ； Chandler 等， 1983 ； Lee 等， 1984 ； Ponta 等， 1985 ； Sakai 等， 1988) ； β- 干扰素 - 聚 (rI)x/ 聚 (rc)(Tavernier 等， 1983) ； 腺病毒 5E2-ElA(Imperiale 等， 1984) ； 胶原酶 - 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987a) ； 基质裂解素 - 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987b) ； SV40- 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987b) ； 鼠 MX 基因 - 干扰素， 新城疫病毒 (Hug 等， 1988) ； GRP78 基 因 -A23187(Resendez 等， 1988) ； α-2- 巨 球 蛋 白 -IL-6(Kunz 等， 1989) ； 中间丝蛋白 - 血清 (Rittling 等， 1989) ； MHC I 类基因 H-2κb- 干扰素 (Blanar 等， 1989) ； HSP70-ElA/SV40 大 T 抗 原 (Taylor 等， 1989， 1990a， 1990b) ； 增殖蛋白 - 佛波酯 /TPA(Mordacq 等， 1989) ； 肿瘤坏死因子 -PMA(Hensel 等， 1989) ； 以及甲状腺刺激激素 α 基 因 - 甲状腺素 (Chatterjee 等， 1989)。
     认为可用于控制编码本发明多核苷酸的肽或蛋白质表达的特定启动子不是关键 性的， 只要其能够在靶细胞 ( 优选细菌细胞 ) 中表达所述多核苷酸即可。当靶向人细胞时， 优选使得多核苷酸编码区域位于邻近能够在人细胞中表达的启动子并且处于其控制之下。 一般而言， 此类启动子可包括细菌、 人或病毒启动子。
     在多个实施方案中， 人巨细胞病毒 (CMV) 立即早期基因启动子、 SV40 早期启动子 或者劳氏肉瘤病毒长末端重复可用于获得 Emp、 AdsA 和 / 或 Eap 多核苷酸的高水平表达。 在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可用于与下列相组合地表达 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 vWa、 Coa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自 溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受 体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化 蛋 白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它细菌多肽。使用本领域中公知的其它病毒或哺乳动物 细胞或细菌噬菌体启动子来实现多核苷酸的表达也在考虑之中。
     在向对象施用载体以表达蛋白质的实施方案中， 考虑用于所述载体的理想的启动 子是不受细胞因子下调的启动子， 或者是足够强到即使下调也能产生引发免疫应答的有效 量的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的启动子。这样的非限制性实例有 CMV IE 和 RSV LTR。在 另一些实施方案中， 使用在细胞因子存在下被上调的启动子。MHC I 启动子在 IFN-γ 存在 下增强表达。
     可使用组织特异性启动子， 特别是如果表达是在希望表达抗原的细胞 ( 例如树突 状细胞或巨噬细胞 ) 中进行的话。哺乳动物 MHC I 和 MHC II 启动子是此类组织特异性启 动子的实例。
     2. 起始信号和内部核糖体结合位点 (IRES)
     特异性起始信号也可以是编码序列有效翻译所需的。这些信号包括 ATG 起始密码 子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号， 包括 ATG 起始密码子。本领域技术人员 能够容易地确定这一点并提供必要的信号。公知的是， 起始密码子必须与所需编码序列是 “同框的” ， 以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合 成的， 并且可以是在细菌或哺乳动物细胞中有效的。可通过包含合适的转录增强子元件来 提高表达效率。
     在本发明的某些实施方案中， 使用内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 元件产生多基因或多顺反子 mRNA。IRES 元件能够绕过 5′ - 甲基化帽 依赖性翻译的核糖体扫描模型， 并在内部位点开始翻译 (Pelletier 和 Sonenberg， 1988)。 已记载了来自微小 RNA 病毒科两个成员 ( 骨髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒 ) 的 IRES 元件 (Pelletier 和 Sonenberg， 1988)， 以及来自哺乳动物 mRNA 的 IRES(Macejak 和 Sarnow， 1991)。IRES 元件可与异源开放读码框相连。多个开放读码框可一起转录， 其各自被 IRES 隔开， 形成多顺反子 mRNA。借助于 IRES 元件， 每个开放读码框能够接近核糖体从而有效翻 译。可使用单个启动子 / 增强子有效地表达多个基因， 从而转录单个 mRNA( 参见美国专利 5,925,565 和 5,935,819， 其通过引用并入本文 )。
     3. 多克隆位点
     载体可包含多克隆位点 (MCS)， 其是含有多个限制性酶切位点的核酸区域， 任意所 述位点可与标准重组技术结合使用来消化载体 ( 参见 Carbonelli 等， 1999， Levenson 等， 1998 以及 Cocea， 1997， 通过引用并入本文 )。通常， 使用限制性酶使载体线性化或片段化， 所述限制性酶在 MCS 内切割以使得外源序列连接至所述载体。涉及限制性酶和连接反应的 技术是重组技术领域技术人员公知的。
     4. 剪接位点
     大多数经转录的真核 RNA 分子要经历 RNA 剪接， 以从原始转录本中除去内含子。 含 有基因组真核序列的载体可需要供体和 / 或接受体剪接位点， 以确保正确加工转录本用于 蛋白质表达。( 参见 Chandler 等， 1997， 通过引用并入本文。)
     5. 终止信号
     本发明的载体或构建物通常包含至少一个终止信号。 “终止信号” 或 “终止子” 由 参与特异性终止 RNA 聚合酶进行的 RNA 转录的 DNA 序列构成。因此， 在某些实施方案中， 考 虑了结束 RNA 转录本产生的终止信号。在体内终止子可能是实现期望之 mRNA 水平所必需 的。
     在真核系统中， 终止子区域还可包含允许位点特异性切割新转录本的特异性 DNA 序列， 使得暴露多腺苷酸化位点。该信号使得专门的内源聚合酶加入一段约 200 个 A 残基 ( 多聚 A) 至转录本的 3′端。此多聚 A 尾修饰的 RNA 分子似乎更稳定的， 并且更有效地翻 译。因此， 在涉及真核生物的另一些实施方案中， 优选终止子包含用于切割 RNA 的信号， 更 优选终止子信号促进 mRNA 的多腺苷酸化。
     考虑用于本发明中的终止子包括本文所述的或者本领域技术人员已知的任何已 知转录终止子， 包括但不限于例如牛生长素终止子或病毒终止序列 ( 例如 SV40 终止子 )。 在某些实施方案中， 终止信号可缺少可转录或可翻译序列， 例如由于序列截短所致。
     6. 多腺苷酸化信号
     在表达中， 尤其是真核表达中， 通常包括多腺苷酸化信号， 以实现合适的转录本多 腺苷酸化。认为多腺苷酸化信号的性质对于本发明成功实施来说不是关键性的， 和 / 或可 使用任何这样的序列。优选实施方案包括 SV40 多腺苷酸化信号和 / 或牛生长素多腺苷酸 化信号， 其在多种靶细胞中是方便的和 / 或已知很好地发挥功能。多腺苷酸化可增加转录 本的稳定性或可利于细胞质转运。
     7. 复制起点
     为了在宿主细胞中扩增载体， 其可含有一个或多个复制起点 ( 常称为 “ori” )， 其是起始复制的特定核酸序列。或者， 如果宿主细胞是酵母的话， 则可使用自主复制序列 (autonomously replicating sequence， ARS)。
     8. 选择和筛选标记在本发明的某些实施方案中， 可通过在表达载体中编码筛选或选择标记从而在体 外或体内鉴定含有本发明核酸构建物的细胞。当转录和翻译时， 标记物赋予细胞可鉴定的 改变， 其使得容易鉴定含有所述表达载体的细胞。 通常， 选择标记是赋予允许进行选择之性 质的标记物。阳性选择标记是指标记物的存在允许其进行选择的标记物， 而阴性选择标记 是指其存在阻碍其进行选择的标记物。阳性选择标记的实例有抗药性标记物。
     通常， 包含药物选择标记有助于克隆和鉴定转化体， 例如， 赋予了新霉素、 嘌呤霉 素、 潮霉素、 DHFR、 GPT、 zeocin 或组氨醇抗性的标记物是可用的选择标记。除了赋予基于 条件来区分转化体之表型的标记物之外， 其它类型标记物包括筛选标记， 例如用于显色分 析的 GFP。或者， 可利用可筛选的酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶 (tk) 或氯霉素乙酰转移酶 (CAT)。本领域技术人员也了解如何利用免疫标记物， 其可与 FACS 分析结合使用。认为所 用的标记物不是关键性的， 只要其能够与编码本发明蛋白质的核酸同时表达即可。选择标 记和筛选标记的其它实例是本领域技术人员公知的。
     B. 宿主细胞
     本文使用的术语 “细胞” 、 “细胞系” 和 “细胞培养物” 可互换地使用。所有这些术 语还包括其后代 ( 其为任意和所有的后代 )。应了解， 由于人为或偶然的突变， 可能并非所 有后代都是相同的。在表达异源核酸序列的情形下， “宿主细胞” 是指原核或真核细胞， 其 包括任何可进行转化的、 能够复制载体或表达由载体编码之异源基因的生物体。宿主细胞 可以并且已用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以被 “转染” 或 “转化” ， 其表示外源核酸 ( 例如重组的蛋白质编码序列 ) 转移或引入宿主细胞的过程。经转化细胞包括原代对象细 胞及其后代。
     宿主细胞可来源于原核生物或真核生物， 包括细菌、 酵母细胞、 昆虫细胞和哺乳动 物细胞， 用以复制载体或者表达核酸序列的部分或全部。许多细胞系和培养物可用作宿主 细胞， 并且它们可通过美国典型培养物保藏中心 (ATCC)( 其为作为活培养物和遗传物质存 档的机构 (www.atcc.org)) 获得。本领域技术人员根据载体主链和所期望结果可确定合适 的宿主。例如， 可将质粒或粘粒引入原核生物宿主细胞， 用以复制多种载体或表达所编码 蛋白质。用作宿主细胞进行载体复制和 / 或表达的细菌细胞包括葡萄球菌属菌株、 DH5a、 TM JM109 和 KC8， 以及多种市售细菌宿主 ( 例如 SURE 感受态细胞和 SOLOPACK Gold 细胞 (STRATAGENE La Jolla， CA)。或者， 细菌细胞 ( 例如大肠杆菌 LE392) 可用作噬菌体病 毒的宿主细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 裂殖酵母 (Saccharomyces pombe) 和毕赤酵母 (Pichia pastoris)。 用于载体复制和 / 或表达的真核宿主细胞的实例包括 HeLa、 NIH3T3、 Jurkat、 293、 Cos、 CHO、 Saos 和 PC12。可获得来自多种细胞类型和生物体的多种宿主细胞， 并且为本领域 技术人员所知。类似地， 病毒载体可与真核或原核宿主细胞 ( 特别是允许所述载体复制或 表达的那些 ) 结合使用。
     一些载体可使用控制序列， 所述控制序列允许载体在原核和真核细胞中均能复制 和 / 或表达。本领域技术人员还应了解， 孵育所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复 制的条件。还应了解且已知的是允许大规模生产载体的技术和条件， 以及产生载体所编码 之核酸及其相关多肽、 蛋白质或肽的技术和条件。
     C. 表达系统
     存在多种表达系统， 其包括上述组合物的至少一部分或全部。基于原核生物和 / 或真核生物的系统可用于本发明， 以产生核酸序列或其相关多肽、 蛋白质和肽。 许多这样的 系统是可购得的并且易于得到。
     昆虫细胞 / 杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白质表达， 例如美国 专利 5,871,986、 4,879,236 中所述 ( 其两者均通过引用并入本文 )， 并且其可例如以商品名 TM MAXBAC 2.0 购自 INVITROGEN 以及以 BACPACK BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM 购自 CLONTECH
     除 了 公 开 的 本 发 明 表 达 系 统 之 外， 其 它 表 达 系 统 实 例 包 括 STRATAGENE 的 TM COMPLETE CONTROL 可诱导哺乳动物表达系统， 其涉及合成的蜕皮素诱导受体， 或者其 pET 表达系统 ( 一种大肠杆菌表达系统 )。 可诱导表达系统的另一个例子可得自 INVITROGEN TM 其具有 T-REX ( 四环素调节表达 ) 系统——一种使用全长 CMV 启动子的可诱导哺乳动物表 达系统。INVITROGEN 还提供了酵母表达系统， 称为甲醇毕赤酵母 (Pichia methanolica) 表达系统， 其设计成在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白质。本领域技 术人员了解如何表达载体 ( 例如表达构建物 )， 以产生核酸序列或其相关多肽、 蛋白质或 肽。
     D. 核酸的扩增
     可根据标准方法 (Sambrook 等， 2001) 从细胞、 组织或其它样品中分离用作扩增模 板的核酸。在某些实施方案中， 对基本上没有纯化模板核酸的样品进行分析。核酸可以是 基因组 DNA。当使用 RNA 时， 首先将 RNA 转化为互补 DNA 可能是理想的。
     本文使用的术语 “引物” 意在涵盖任何能够在模板依赖性方法中引发新生核酸合 成的任何核酸。通常， 引物是十至二十和 / 或三十个碱基对长的寡核苷酸， 但是可使用更长 的序列。引物可以双链和 / 或单链形式提供， 尽管优选单链形式。
     将设计用于与对应于本文所鉴定基因之序列的核酸选择性杂交的引物对在允许 选择性杂交的条件下与模板核酸相接触。 取决于期望的应用， 可选择高严格杂交条件， 所述 条件仅会使得与引物完全互补的序列进行杂交。在另一些实施方案中， 杂交可在低严格条 件下发生， 以允许用引物序列扩增出含有一个或多个错配的核酸。一旦杂交， 模板 - 引物复 合物与一种或多种利于模板依赖性核酸合成的酶相接触。进行多轮扩增 ( 也称为 “多个循 环” ) 直至产生足够量的扩增产物。
     有许多模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的寡核苷酸序列。 最广为 TM 人知的扩增方法之一是聚合酶链式反应 ( 称为 PCR )， 其在美国专利 4,683,195、 4,683,202 和 4,800,159 以及 Innis 等 (1988) 中有详述， 其每篇均通过引用以整体并入本文。
     可用于实施本发明的扩增靶标核酸序列的替代性方法公开于美国专利 5,843,650 、 5,846,709 、 5,846,783 、 5,849,546 、 5,849,497 、 5,849,547 、 5,858,652 、 5,866,366 、 5,916,776 、 5,922,574 、 5,928,905 、 5,928,906 、 5,932,451 、 5,935,825 、 5,939,291 和 5,942,391、 GB 申请 No.2 202 328 和 PCT 申请 No.PCT/US89/01025， 其每篇均 通过引用以整体并入本文。
     E. 基因转移的方法
     认为适于核酸递送从而有效表达本发明组合物的方法包括几乎任何可将核酸 ( 例如 DNA， 包括病毒和非病毒载体 ) 引入细胞、 组织或生物体的方法， 如本文所述或者本领域普通技术人员已知的。这些方法包括但不限于 DNA 直接递送， 例如通过注射 ( 美国 专 利 5,994,624、 5,981,274、 5,945,100、 5,780,448、 5,736,524、 5,702,932、 5,656,610、 5,589,466 和 5,580,859， 其 每 篇 均 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 包 括 显 微 注 射 (Harland 和 Weintraub， 1985 ； 美国专利 5,789,215， 其通过引用并入本文 ) ； 通过电穿孔 ( 美国专利 No.5,384,253， 其通过引用并入本文 ) ； 通过磷酸钙沉淀 (Graham 和 Van Der Eb， 1973 ； Chen 和 Okayama， 1987 ； Rippe 等， 1990) ； 通过使用 DEAE 葡聚糖然后使用聚乙二醇 (Gopal， 1985) ； 通过直接音速加载 (sonic loading)(Fechheimer 等， 1987) ； 通过脂质体介导的转 染 (Nicolau 和 Sene， 1982 ； Fraley 等， 1979 ； Nicolau 等， 1987 ； Wong 等， 1980 ； Kaneda 等， 1989 ； Kato 等， 1991) ； 或者通过微粒轰击 (PCT 申请 No.WO 94/09699 和 95/06128 ； 美国专 利 5,610,042、 5,322,783、 5,563,055、 5,550,318、 5,538,877 和 5,538,880， 其每篇均通过 引用并入本文 )。通过应用例如这些技术， 可稳定地或瞬时转化细胞器、 细胞、 组织或生物 体。
     VII. 实施例
     给出以下实施例以举例说明本发明的多个实施方案， 但不意在以任何方式限制本 发明。本领域技术人员会了解本发明很好地适于实现目的， 以及获得所提及的目标和优势 以及本文中固有的目的、 目标和优势。现有的实施例以及本文所述的方法是优选实施方案 的代表， 其为示例性的， 并且不意在限制本发明的范围。 本领域技术人员会了解权利要求范 围所限定的在本发明宗旨之内涵盖的变动及其它用途。
     实施例 1
     与脓肿形成相关的包膜蛋白质以及疫苗保护
     A. 结果
     本发明人试图研究葡萄球菌脓肿形成的发病机理， 并鉴定出使得葡萄球菌在此病 变内存活和增殖的细菌因子。该研究使用了鼠肾脓肿模型， 其中用半致死量的金黄色葡萄 球菌感染小鼠以产生持续的感染 (Burts 等， 2005)。在感染后第 5 天杀死小鼠， 切除它们 的肾脏， 进行薄切片苏木精伊红染色组织的组织病理学研究， 或者通过将组织匀浆铺板来 统计葡萄球菌负荷的集落形成单位 (CFU)。与野生型临床分离的金黄色葡萄球菌 Newman 株相比 (Baba 等， 2008)， 在分选酶 A 的结构基因中具有转座子插入物的同基因型变体不形 成脓肿 ( 图 1B、 1D 和 1F)。分选酶 A 将许多种具有 LPXTG 基序分选信号的表面蛋白质与细 胞壁包膜锚定， 其负责许多不同毒力因子的表面展示 (Mazmanian 等， 2000 ； Mazmanian 等， 1999)。为了对脓肿形成定量， 目测检查肾脏， 对每个器官给予 1( 存在表面脓肿 ) 或 0( 不 存在 ) 的得分。最终的加和除以肾脏总数得到一个分数值。另外， 将三个随机选择的右侧 肾脏置于 10％福尔马林中过夜， 包埋， 切片， 并用苏木精和伊红染色。 对于每个肾脏， 用显微 镜观察间隔 200μM 的四个箭头状切片。如果病变在检查的任意平面均能观察到， 则将该器 7 官判断为脓肿形成阳性。用 3×10 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌 Newman 株感染的小鼠显示在 16/20 肾脏上有可见病变 (80％表面脓肿 )， 并且在组织病理学检查的 3/3 肾脏中呈脓肿形 成阳性 ( 表 3)。相反， 用 ΔsrtA 突变体感染的小鼠显示 0％的表面脓肿， 以及 0/3 组织学 病变 ( 表 3)。
     表 3. 回收的 CFU( 含标准差 )， 相对于 Newman 株的 log 减少， P 值 (student′ s t 检验 )， 所观察到的表面脓肿百分比， 所观察到的组织学脓肿数。
    用集落形成单位 (CFU) 表示的葡萄球菌负荷平均值， 计算为针对每种攻击菌株使 用十五只一组的 BALB/c 小鼠感染 5 天后匀浆肾组织中的 log10CFU g-1， 显示为平均值的标 准差 (±SEM)。 b
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录为 P 值。 c -1
     细菌负荷的减少， 计算为 log10CFU g 。 c
     通过目测观察 ( 阳性百分比 ) 以及对来自三只动物的苏木精 - 伊红染色薄切片 组织进行的组织病理学测量感染五天后肾组织中的脓肿形成， 由此记录阳性组织的分数值 (3/n)。
     回收的 CFU( 含标准差 )， 相对于 Newman 株的 log 减少， P 值 (student ′ s t 检 验 )， 所观察到的表面脓肿百分比， 所观察到的组织学脓肿数。
     使用扫描电子显微镜来检查感染组织。将肾脏切片、 固定、 在六甲基二硅氮烷 (HMDS) 中脱水， 用 80％铂 /20％钯喷射涂覆， 然后观察。感染了金黄色葡萄球菌 Newman 株 的肾组织在脓肿中心区域内具有细菌。 在紧密连结的菌苔中发现野生型葡萄球菌 ( 图 1G)， 其包含在较大的纤维蛋白荚膜内的纤维结构。这些葡萄球菌巢 (nest) 中没有白细胞， 并且 似乎被粘附性细胞外基质所包埋。感染了 srtA 突变体的肾组织也具有葡萄球菌， 但是， 该72
    
    a102333540 A CN 102333554说明书62/86 页细菌分散在整个健康肾组织中， 并且其数量比野生型显著减少 ( 图 1H)。
     为了鉴定负责脓肿形成的特异性分选酶 A 底物， 本发明人将含有 bursa aurealis 插入物 (Bae 等， 2004) 的 17 个分选酶底物基因转导进金黄色葡萄球菌 Newman 株中， 并筛 选毒力缺陷的变体。sdrD、 isdB、 clfB、 isdA、 sasB 和 sasD 中的突变造成细菌负荷显著降 低 (P ＜ 0.05)( 图 2)。另外， 在用目测和显微技术分析时， sdrD、 isdB 和 isdA 中的突变显 示较少的脓肿 ( 表 3)。本发明人认为， 表面脓肿＜ 30％以及组织学得分＜ 1/3 的突变显示 出脓肿形成的显著缺陷。表面组织学得分不匹配的突变体不记为缺陷的 ； 而将其归为筛选 误差。令人感兴趣地， clfB 和 sasB 中的突变显示葡萄球菌负荷的缺陷， 但是在脓肿形成方 面不显示缺陷， 而蛋白 A 中的突变显示负荷增加， 同时还显示脓肿形成的缺陷。本发明人想 要知道肾组织中脓肿形成和存活的缺陷是否是由这些突变体无法形成功能性生物膜所致。 换句话说， 脓肿形成的缺陷是否归咎于体外生物膜生长的缺陷？为了研究这一问题， 本发 明人在 96 孔测定板中或盖玻片上培养葡萄球菌， 通过 405nm 的吸光度测量番红精染色的生 物膜。在实验室液体培养基中， 金黄色葡萄球菌 Newman 株不形成生物膜， 但是 Morrissey 及其同事报道了在铁耗尽的 RPMI 中以及 5％大气 CO2 下的生物膜生长 (Johnson 等， 2008)。 使用这些条件， 这里测试的所有突变体菌株均同样良好地生长 ( 数据未显示 )， 但是 srtA、 isdB、 sdrD 或 isdA 中的突变则显示生物膜形成的显著缺陷 (P ＜ 0.05)。这些结果由扫描 电子显微镜实验证实 ( 图 3B、 3C、 3D、 3E、 3F、 3G 和表 4)， 其中金黄色葡萄球菌 Newman 株以 包埋在颗粒状细胞外基质中的多细胞复合物的形式生长 ( 图 3B)。在具有 srtA、 isdB 或 sdrD 突变的葡萄球菌中， 多细胞复合物减少， 细胞外基质减少， 同样的突变也在小鼠中减少 了脓肿形成。因此， 体外生物膜形成可能的确与葡萄球菌形成脓肿的能力相关。本发明人 还测试了消除葡萄球菌中其它包膜因子合成的基因 ( 包括聚 -N- 乙酰葡糖胺 (PNAG/PIA， 其 由 ica 基因的产物合成 )(Heilmann 等， 1996 ； Gotz， 2002) 以及细胞壁相关蛋白 Eap(Scriba 等， 2008 ； Xie 等， 2006) 和 Emp(Hussain 等， 2001)) 中的突变。还测试了葡萄球菌毒力的调 节因子 ： saeR(Novick 和 Jiang， 2003)、 sarA(Cheung 等， 1992)、 mgrA(Chen 等， 2006)、 agrC 和 agrA(Novick， 2003)。emp 中的突变显示最显著的生物膜形成缺陷， 其中番红精吸光度减 少 86％， 扫描 EM 显示无多细胞复合物， 该结果与 Johnson 等 (2008) 的类似研究一致。相 反， Eap 突变体显示轻微但明显的生物膜形成缺陷 ( 图 3A， 表 4)。Emp 和 Eap 是包膜粘附 素， 其介导葡萄球菌和宿主细胞外基质蛋白质纤连蛋白、 玻连蛋白和胶原之间的相互作用 (Scriba 等， 2008 ； Xie 等， 2006 ； Hussain 等， 2001)。所有经测序的金黄色葡萄球菌菌株均 具有这两种蛋白质的基因， 其受两组分系统 SaeRS 以及通用转录因子 SarA 的正调控， 其中 的突变也影响生物膜的形成 (Harraghy 等， 2005)( 图 3A， 表 4)。
     表 4. 体外生物膜测定的 96 孔板。 450nm 下的平均吸光度 ( 含标准差 )， 相比 Newman 株的吸光度降低分数， P 值 (student′ s t 检验 )
    为了研究 Emp 是否是脓肿形成必需的， 用 emp 突变体葡萄球菌攻击小鼠， 在感染后 五天分析肾脏。emp 突变体葡萄球菌分离自肾脏组织， 其与野生型亲本具有相似丰度 ( 图 4A)， 但是这些突变体不能形成脓肿， 而是在整个肾脏组织中保持分散 ( 图 4B)。这些结果 表明， Emp 是体外和体内脓肿和生物膜形成特别必需的包膜因子。注意到， 介导 PNAG 合成 (Heilmann 等， 1997) 之 ica 基因的突变 (icaABCDR) 仅显示生物膜形成的略微减少。尽管 不能产生外多糖， ica 突变体能够产生可通过电子显微镜检测的细胞外基质。另外， ica 突 变体未在体外显示出脓肿形成或细菌负荷的缺陷 ( 图 6A、 6B、 表 5)。因此这些数据表明， 金 黄色葡萄球菌 Newman 株生物膜的细胞外基质不包含 PNAG。Emp 和 Eap 是细胞壁相关表面 蛋白， 其产生可通过葡萄球菌的 SDS 提取以及考马斯染色的 PAGE 分离来检测 ( 图 5A)。使 用此测定， 观察到金黄色葡萄球菌 Newman 株产生大量 Eap 和 Emp。srtA 或 isdB 中的突变 不影响 Emp 和 Eap 的产生或者与细胞壁的结合， 这与以下推测相一致， 即观察到的 srtA 和 isdB 突变体在脓肿和生物膜形成中的缺陷不是由于 Eap 和 Emp 继发作用所导致的。 值得注 意的是， emp 中的突变影响 Eap 的丰度， 推测 Emp 的包膜沉积可能影响 Eap 的表面展示。
     表 5.Ica 毒力。回收的 CFU 平均值， 相比 Newman 株的 log 减少， P 值 (student′ s t 检验 )， 观察到的表面脓肿百分比， 组织学脓肿数。
    
    因为两种蛋白质主要展示在葡萄球菌表面上， 本发明人设想 Emp 和 Eap 用作合适 的疫苗抗原来预防葡萄球菌疾病。将每个蛋白质的结构基因克隆进 pET15b， 在变性条件下 通过借助 N 端 His-6 标签的亲和色谱纯化重组产物。纯化后， Eap 可被折叠， 并在复性缓冲 液中通过第二轮 Ni-NTA 色谱纯化可溶性产物。纯化的 Emp 不能再折叠， 随后保存在 8M 尿 素中 ( 图 5B)。用完全弗氏佐剂 (CFA) 乳化的 PBS、 Eap 或 Emp 免疫小鼠， 用 3×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击小鼠。图 5C 显示， 用 Emp 或 Eap 免疫赋予了对葡萄球菌感染的 有效保护 (P ＜ 0.05)。经 Eap 免疫的小鼠显示葡萄球菌负荷降低 2log， 而经 Emp 免疫的小 鼠显示降低 2.5log。用 Eap(1 ∶ 24000) 或 Emp( ＞ 64000) 免疫的小鼠产生高效价的反应 性 IgG( 图 5D)。如预期地， 用 PBS 模拟免疫的动物产生 70％的表面脓肿和 4/5 的组织学脓 肿。相反， 用 Eap 和 Emp 免疫的小鼠表现出＜ 20％的表面脓肿和 1/5 的组织病变 ( 图 5E)。 因此， 用 Eap 或 Emp 免疫产生针对葡萄球菌感染的特异性体液免疫应答和保护性免疫。
     研究表明， 在受感染宿主组织中葡萄球菌生物膜生长和形成脓肿能力之间的相关 性。 先前的工作证实， 生物膜是植入式医疗器械的定殖和持续感染所必需的， 并且带来针对 抗生素、 抗体和吞噬细胞的保护。本文给出的证据表明， 生物膜是葡萄球菌在器官组织中 有效定殖 (seeding) 和持续增殖所必需的。鉴定到三个分选酶底物基因—— sdrD、 isdB 和 isdA， 其显示在受感染组织中脓肿形成、 葡萄球菌负荷以及体外生物膜生长方面的组合缺 陷。 值得注意地， 在葡萄球菌分选酶锚定表面蛋白质的比较性评价中， 这些表面蛋白质基因 的产物也被鉴定为首选的候选疫苗 (Stranger-Jones 等， 2006)。这些特征现在也可扩展到 两种细胞壁相关因子 Emp 和 Eap。至少 emp 是脓肿形成和生物膜生长所需的， 用 Emp 产物进 行免疫提供了针对葡萄球菌疾病的保护性免疫。因此， 这些研究扩展到预防金黄色葡萄球 菌对人的感染的合适候选疫苗列表， 从而选择细胞壁锚定和细胞壁相关蛋白， 其组合制剂 应提供针对所有葡萄球菌菌株的强保护性免疫。
     葡萄球菌脓肿形成和持续感染的动物模型。 为了表征金黄色葡萄球菌脓肿形成的 发病机理， 对肾脓肿模型进行了修饰 (Albus 等， 1991)， 其中用 1×107CFU 的人临床分离物 金黄色葡萄球菌 Newman 株通过静脉内注射感染 BALB/c 小鼠 (Baba 等， 2007)。在感染后 的 6 个小时内， 99.999％的葡萄球菌从血流中消失， 通过脉管系统分布 ( 图 7A)。葡萄球菌快速扩散到外周组织， 因为肾脏及其它外周器官组织中的细菌负荷在最初三个小时内达到 5 -1 1×10 CFU g ( 图 7B)。肾脏组织中葡萄球菌负荷在 24 小时内增加了 1.5log CFU( 图 7B)。 感染 48 小时后， 小鼠在多个器官中产生分散的脓肿， 这可由对苏木精伊红染色的薄切片肾 脏组织进行光学显微镜观察而检出 ( 图 7D-K)。初始脓肿直径为 524μM(±65μM) ； 病变 最初的特征是多形核白细胞 (PMN) 流入， 并且没有可辨别的葡萄球菌组织， 其大部分似乎 位于 PMN 内 ( 图 8A-C)。感染第 5 天， 脓肿的大小增加， 并且包裹了葡萄球菌的中心群体， 其由嗜伊红的无定形物质的层和一条大的 PMN 带所围绕 ( 图 8D-F)。组织病理学显示， 在 脓肿病变的中心与葡萄球菌病灶接近处有大量 PMN 坏死， 以及健康吞噬细胞的覆盖层 ( 图 8D-F)。还观察到， 脓肿病变周围的坏死 PMN 边界将健康肾组织和受感染病变分隔开的边缘 的嗜伊红无定形物质 ( 图 8D-F)。在第 15 天或第 36 天， 脓肿最终达到≥ 1,524μM 的直径 4 ( 图 7K)。在较晚的时间间隔， 葡萄球菌负荷增加到 10 -106CFU g-1， 生长的脓肿病变朝器官 被膜迁移 ( 图 7J-K)。 外周病变易于破裂， 从而释放坏死的物质和葡萄球菌进入腹膜腔或腹 膜后隙。这些事件导致菌血症以及第二波脓肿， 最终造成这些感染的致死结局 ( 数据未显 示 )。
     葡萄球菌脓肿群落由假荚膜所包裹。为了对肾组织中葡萄球菌负荷进行统计， 将 动物杀死， 切除其肾脏， 将组织匀浆散布到琼脂培养基上进行集落形成。在感染第 5 天， 观 6 -1 察到金黄色葡萄球菌 Newman 株平均 1×x10 CFU g 肾组织 ( 图 9P)。为了对脓肿形成定 量， 目测检查肾脏， 对每个器官给予 1( 图 9A) 或 0( 图 9F) 的得分。将最终的加和除以肾脏 总数， 计算出表面脓肿百分比 ( 表 6)。 另外， 将随机选择的肾脏在福尔马林中固定， 包埋， 薄 切片， 并用苏木精和伊红染色。对于每个肾脏， 通过显微镜观察 200μM 间隔的四个箭头状 切片 ( 图 9)。对每个切片的病变数计数， 求平均值以定量肾脏内的脓肿数目。金黄色葡萄 球菌 Newman 株导致每个肾脏 4.364±0.889 个脓肿， 在 20 个肾脏中的 14 个上观察到表面 脓肿 (70％ )( 表 6)。
     对肾脏切片， 固定， 脱水并用铂 / 钯喷射涂覆进行扫描电子显微镜观察。图 10A 显 示脓肿中心紧密连结的菌苔中的金黄色葡萄球菌 Newman 株。葡萄球菌包含在无定形假荚 膜中 ( 白色箭头， 图 10A)， 所述假荚膜将细菌与脓肿白细胞的带分隔开。在这些葡萄球菌 中心巢中未观察到免疫细胞， 但是偶然有红细胞位于细菌中 (R， 图 10A)。脓肿中心的细菌 群落 ( 称为葡萄球菌脓肿群落 (SAC)) 显示为均一的， 并且由高电子密度的颗粒状物质所包 覆。出现感染病变的动力学以及金黄色葡萄球菌 Newman 株形成的脓肿的形态学特征类似 于用金黄色葡萄球菌 USA300(LAC) 感染小鼠后所观察到的， 所述金黄色葡萄球菌 USA300 是 在美国目前流行群落获得的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (CA-MRSA) 克隆 (Diep 等， 2006) ( 图 9K-O 和 10C)。
     表 6. 小鼠中金黄色葡萄球菌 Newman 株脓肿形成的基因需求。
    葡萄球菌负荷平均值计算为针对每种攻击菌株使用十五只一组的 BALB/c 小鼠感 染 5 天后匀浆肾组织中的 log10CFU g-1， 显示为平均值的标准差 (±SEM)。 b
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录为 P 值 ： P 值＜ 0.05 认为具有显 著性。 c
     细菌负荷的减少， 计算为 log10CFU g-1。 d
     通过目测观察测量感染五天后肾组织中脓肿形成 ( 阳性百分比 ) e
     来自 8 至 10 只动物的苏木精 - 伊红染色薄切片组织的组织病理学 ： 记录每个肾 脏的平均脓肿数， 再次平均获得最终的平均值 (±SEM)。 f
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录 P 值 ： P 值＜ 0.05 认为具有显著 性。
     分选酶突变体不导致脓肿病变并且无法持续存在。分选酶 A 是一种转肽酶， 其使 金黄色葡萄球菌 Newman 株包膜中的 19 种表面蛋白质固定 (Mazmanian 等， 1999 ； Mazmanian 等， 2000)。早期工作在多个动物模型系统中将分选酶 A 鉴定为毒力因子， 但是该酶对脓肿 形成或持续存在的贡献以及其锚定的表面蛋白质尚未阐明 (Jonsson 等， 2002 ； Weiss 等， 2004)。相比于野生型亲本 (Baba 等， 2007)， 在第 2、 5 或 15 天的目测或组织病理学检查中 同基因型 srtA 变体 (ΔsrtA) 不形成脓肿病变 ( 图 9F-J 和表 6)。在用 strA 突变体感染
     77a102333540 A CN 102333554说明书67/86 页的小鼠中， 在感染第 5 天仅从肾组织回收到 1×104CFU g-1， 其相比于野生型亲本菌株减少了 -1 -6 2.046log10 CFU g 的减少 (P ＝ 6.73×10 )( 图 9P)。MRSA 菌株 USA300 的 srtA 突变体也 观察到类似缺陷 ( 数据未显示 )。扫描电子显微镜显示， srtA 突变体 ( 箭头 ) 是高度分散 的， 并且在否则是健康的肾组织中经常与白细胞相结合 ( 图 10B)。在感染后第 15 天， srtA -1 突变体从肾组织中被清除， 相比于野生型减少了≥ 3.5log10CFU g ( 图 9P)。因此， 锚定表 面蛋白质的分选酶 A 使得在宿主组织中脓肿病变得以形成以及细菌持续存在， 其中葡萄球 菌以群落的形式复制， 所述群落包埋在细胞外基质中并且无定形假荚膜屏蔽了周围的白细 胞。
     葡萄球菌表面蛋白质的基因需求。分选酶 A 将许多种具有 LPXTG 基序分选信号 的蛋白质与细胞壁包膜锚定， 从而提供了许多毒力因子的表面展示 (Mazmanian 等， 2002)。 为了鉴定葡萄球菌脓肿形成所需的表面蛋白质， 将 bursa aurealis 插入物引入编码具有 LPXTG 基序蛋白质之多肽的基因 5′编码序列中 (Bae 等， 2004) 并将这些突变转导进金黄 色葡萄球菌 Newman 株中。静脉内感染小鼠并通过肾脓肿模型进行分析之后， 对所观察到的 -1 毒力缺陷严重程度分级为平均葡萄球菌 CFU g 的 log10 减少 ( 图 11 和表 6)。sdrD、 isdB、 clfB、 isdA、 clfA 和 isdC 中的突变导致细菌负荷减少 ( 表 6)。本发明人认为＜ 30％或更 少的表面脓肿以及组织学脓肿平均值 P ＜ 0.05 的突变体为显著性脓肿形成缺陷， 其包括具 有 sdrD、 isdB 和 isdA 中突变的变体 ( 表 6)。令人感兴趣地是， clfA 和 clfB 中的突变显示 葡萄球菌负荷的缺陷， 但是不显示脓肿形成的缺陷 ( 图 11)。 这些毒力因子的发现与之前的 研究相一致， 后者表明聚集因子蛋白介导纤维蛋白原结合以及对细菌吞噬清除的抗性， 而 这正是血液中病原体存活和扩散所需的特征 (McDevitt 等， 1994 ； Ni Eidhin 等， 1998)。蛋 白 A 通过与免疫球蛋白的 Fc 组分结合而阻碍噬菌作用 (Uhlen 等， 1984 ； Jensen 等， 1958)， 通过血管性血友病因子 (von Willebrand factor) 活化血小板凝集 (Hartleib 等， 2000)， 通过捕获带有 VH3 的 IgM 的 Fab 区域用作 B 细胞超级抗原 (Roben 等， 1995) 以及通过其对 TNFR1 的活化可引发葡萄球菌肺炎 (Gomez 等， 2004)。蛋白 A 突变体 (spa) 显示葡萄球菌负 荷少量减少 ( 第 5 天 )， 但是， 与野生型、 clfA 和 clfB 菌株不同， spa 变体形成脓肿的能力 降低 ( 图 11 和表 6)。
     葡萄球菌的碳水化合物和包膜相关蛋白。 金黄色葡萄球菌显示两种碳水化合物结 构——荚膜多糖 (CPS)(Jones 2005) 和聚 -N- 乙酰葡糖胺 (PNAG)(Gotz 2002)。金黄色葡 萄球菌 Newman 株和 USA300 合成 5 型 CPS， 其由重复三糖亚单位 [ → 4)-β-D-ManAcA-(1 → 4) -α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 → ] 构成 (Baba 等， 2007)。 cap5 基因簇的核 苷酸序列包含 16 基因的操纵子 (capA-P) 及其产物中的两个——CapP 和 CapO， 它们在合成 UDP-N- 乙酰基氨基甘露醇醛酸 (UDP-N-acetylmannosaminuronic acid， UDP-ManNAcA) 中 作为差向异构酶和脱氢酶来起作用 (O’ Riordan 和 Lee， 2004 ； Sau 等， 1997)。 如预期地， capO 中 bursa aurealis 插入消除了 CPS5 的合成 ( 数据未显示 )。PNAG( 或 PIA)——一种线性 β(1-6)- 连接葡糖胺聚糖——由 2- 脱氧 -2- 氨基 -D- 吡喃葡萄糖基残基构成， 其 80-85％ 是 N9 乙酰基化的 (Mack 等， 1996) ； 剩余的葡糖胺残基带正电， 并促进多糖与细菌包膜的结 合 (Vuong 等， 2004)。PNAG 由细胞内粘附素基因座 (icaADBC) 的产物所合成 (Heilmann 等， 1996 ； Cramton 等， 1999)。金黄色葡萄球菌两种碳水化合物结构并非动物感染致病性必需 的， 因为 capO 以及 icaADBC 中的突变或者调节子 icaR 不影响第 5 天的细菌负荷、 葡萄球菌群落的建立或者肾脓肿形成 ( 表 6)。还研究了包膜相关蛋白对葡萄球菌脓肿形成的贡献。 包膜相关蛋白的标志是它们可通过在热 SDS 中煮沸来提取。此方法用于检测两种此类蛋白 质 Eap 和 Emp 在金黄色葡萄球菌 Newman 株包膜中的沉积。除了宿主组织中脓肿形成和细 菌持续存在的显著缺陷之外， 在 emp 中具有 bursa aurealis 插入的突变体显示在感染第 5 天肾组织中细菌负荷降低 ( 图 12， 表 6)。对于 eap 突变体未观察到脓肿形成的减少， 而第 5 天和 15 天葡萄球菌负荷的减少表明宿主组织中细菌持续存在的缺陷 ( 图 12， 表 6)。使用 免疫荧光实验测定感染期间 Emp 和 Eap 的表达 ( 图 12J-K)。在假荚膜中发现 Eap 沉积， 而 在葡萄球菌脓肿群落中检测到 Emp。 这些结果支持了以下模型， 其中 Emp 对葡萄球菌群落的 形成有贡献， 其引发了脓肿病变， 而假荚膜中 Eap 沉积促进宿主组织中细菌的持续存在。
     作为疫苗抗原的包膜相关蛋白质。之前的工作试图通过研究纯化的分选酶 A 底物引发针对葡萄球菌疾病的保护性免疫的能力来表征金黄色葡萄球菌疫苗抗原 (Stranger-Jones 等， 2006)。 当用作单个亚单位疫苗抗原时， 表面蛋白质产生不同程度的保 护； 用 SdrD、 IsdA、 IsdB、 SdrE、 SpA ClfA 和 ClfB 进行免疫显著减少了细菌负荷， 但是这些 疫苗中均不提供完全的保护。相反， 四种抗原的组合产生强得多的针对脓肿形成或几种不 同金黄色葡萄球菌菌株致死攻击的疫苗保护 (Stranger-Jones 等， 2006)。重组 Eap 和 Emp 纯化自大肠杆菌， 使用这些蛋白质免疫 BALB/c 小鼠， 以应对随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株的攻击 ( 图 13)。免疫后， 小鼠产生对两种包膜相关蛋白的体液免疫应答 ( 图 13A)。用 Emp 免疫导致肾组织中葡萄球菌负荷少量的降低 0.959log10CFU g-1(P ＝ 0.5114)， 而用 Eap -1 实现了显著水平的保护 ( 细菌负荷降低 1.939log10 CFU g ， P ＝ 0.0079)( 图 13B)。为了 检测 Emp 或 Eap 特异性抗体是否提供对葡萄球菌攻击的保护， 免疫兔子， 并通过亲和色谱纯 化 Emp 特异性抗体和 Eap 特异性抗体。
    将 5mg kg-1(85μg/ 动物 ) 纯化的抗体被动免疫接种到幼稚BALB/c 小鼠的腹腔中， 在转移后 24 小时导致虽低但是可检出水平的血清 IgG( 对于 Eap 抗体效价为 1,000±110， 对于 Emp 为 1,124±236， 图 13C)。平行地， 通过静脉内接种注射金黄色葡萄 球菌 Newman 株攻击经被动免疫的动物， 在与模拟对照比较时， 其导致对于经 Eap 免疫的动 -1 物 (n ＝ 10) 在第 4 天葡萄球菌负荷减少 1.36log10 CFU g (P ＝ 0.0085)， 以及脓肿形成数 目减少 ( 经模拟处理的为 4.64±1.09 脓肿 / 肾脏， 相比于经 Eap 免疫的 1.40±0.48， P＝ 0.028， n ＝ 14 和 10， 图 13D-E)。
     接受 Emp 特异性抗体的动物 (n ＝ 9) 显示在第 4 天葡萄球菌负荷减少 1.20log10 -1 CFU g (P ＝ 0.0132)， 但是脓肿形成数量仅略微减少 (2.0±0.98， P ＝ 0.1362， 图 13D-E)。 总之， 与分选酶锚定表面蛋白相似， 针对包膜相关因子的抗体可在小鼠中产生对葡萄球菌 感染的保护。
     B. 材料和方法
     细菌菌株和培养。 葡萄球菌培养于 37℃的胰酶大豆琼脂或液体培养基中。 大肠杆 菌菌株 DH5α 和 BL21(DE3) 培养于 37℃的 Luria 琼脂或液体培养基中。分别使用氨苄西林 (100μg/ml) 和红霉素 (10μg/ml) 进行质粒和转座子突变体选择。
     转座子诱变。将来自 Phoenix 文库的插入突变转导进人临床分离物金黄色葡萄球 菌 Newman 株。每个突变体带有转座子 bursa aurealis， 其在目的基因中含有红霉素抗性 盒。如之前所述验证突变 (Bae 等， 2004)。简言之， 提取染色体 DNA(Promega Wizard Kit)，用 AciI(NEB) 消化， 用 T4 连接酶 (Promega) 重新连接形成单个质粒， 使用转座子 bursa aurealis 特异性的引物进行 PCR 扩增。对这些产物测序， 以验证靶基因中的转座子插入。
     克隆、 纯化和抗体产生。使用金黄色葡萄球菌 Newman 株模板 DNA 通过 PCR 扩增 Eap 和 Emp 的编码序列 (Baba 等， 2007)。将 PCR 产物克隆进 pET15b， 以表达具有 N 端 His6 标签融合物的重组蛋白。在弗式压碎器 (French press) 中破碎细菌， 通过超速离心沉淀膜 和不溶成分。通过亲和色谱纯化天然状态的带有 His 标签的 Emp。将含有 Eap 的提取物在 室温下溶于 8M 尿素、 50mM Tris-HCl(pH 8.0)4 ～ 5 小时， 然后以 10,000×g 离心。将含有 变性蛋白的上清进行镍 - 次氨基三乙酸 (Ni-NTA) 亲和色谱 (Promega)。 在含有逐渐增高浓 度 (100-500mM) 的咪唑的 PBS-8M 尿素中洗脱蛋白质。合并 Eap 阳性的洗脱级分， 在 PBS-1M Urea 中稀释， 使其通过第二 Ni-NTA 柱。用含有咪唑的 PBS 缓冲液洗脱重折叠的 Eap。通 过 280nm 的吸光度确定蛋白质浓度。在第 24 天和 48 天用 CFA(Difco)( 初次免疫 ) 以及 IFA( 加强免疫 ) 乳化的 500μg 蛋白质免疫兔子 (6 月龄新西兰白兔， 雌性， Charles River Laboratories)。在第 60 天， 从兔子取血， 回收血清用于免疫印迹、 免疫荧光显微术或者被 动转移实验。
     扫描电子显微镜。将感染的肾脏 ( 右侧 ) 在 8％戊二酸醛中 4℃下固定 24-48 小 时， 切成 2-5mm 的片， 以暴露内部组织或脓肿。 然后， 通过依次在 25、 50、 75、 90、 100％乙醇中 孵育， 然后在 100％ HMDS 中孵育， 使样品脱水。 脱水后， 装载样品， 用 80％铂 /20％钯喷射涂 覆至 8nm， 然后在 Fei NovaNano SEM200 扫描电子显微镜下观察。对于生物膜测定， 葡萄球 菌培养于 5％ CO2 中盖玻片上除去铁的 RPMI 中， 并在 PBS 中清洗 3 遍。通过在乙醇和 HMDS 中孵育将盖玻片依次脱水， 装载并喷射涂覆， 然后在扫描电子显微镜下观察。
     生物膜形成。 金黄色葡萄球菌菌株培养于用添加了 10％ RPMI1640 和 1％ Casamino acids(Difco) 的 RPMI 1640(Gibco) 处理的 Chelex(Sigma) 中。将过夜培养物培养于 37℃ 下 6％ CO2 中， 然后以 1 ∶ 10 一式四份接种于含有新鲜培养基的 96 孔平底培养板 (Costar) 中。这些平板静置孵育于 37℃下 6％ CO2 中 24 小时。用 1×PBS 将孔清洗三遍， 在 37℃下 干燥 2 小时， 用 1％番红染色。测量 450nm 的吸光度以定量生物膜形成。在至少 3 个独立实 验中测试每个菌株， 使用双尾 student’ s t 检验比较突变体与野生型。
     肾脏脓肿。将金黄色葡萄球菌 Newman 株过夜培养物以 1 ∶ 100 接种于新鲜胰酶 大豆液体培养基， 在 37℃下培养 2 小时。沉淀葡萄球菌， 用 1x PBS 清洗， 悬浮于一定体积 8 的 PBS 中， 使得产生 0.6 的 A600(3×10 CFU/ml)。通过铺板和菌落计数验证接种物。通 过腹膜内注射每千克体重 100mg/ml 的氯胺酮和 2mg/ml 的赛拉嗪麻醉小鼠。用 100μl 细菌悬浮物 (3×107CFU) 通过眶后注射感染 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠 (Charles River Laboratories)。每个葡萄球菌菌株感染 10 或 20 只小鼠的组。感染后第 5 天， 通过吸入 CO2 处死小鼠， 解剖， 切除肾脏， 在 0.01％ Triton X-100 中使用超声仪进行匀浆。依次稀释 等分试样 (20μl)， 铺板用以确定 CFU。将来自每组小鼠的三至四个右侧肾脏固定于室温下 10％甲福尔马林 24 小时。将组织包埋于石蜡中， 薄切片， 用苏木精伊红染色， 进行显微镜检 查。使用 3-4 周龄雌性 BALB/c 小鼠进行持续存在研究。
     免疫。通过将纯化的蛋白质肌内注射到后腿中免疫 BALB/c 小鼠 (24 天龄雌性， 每 组 8 ～ 10 只小鼠， Charles River Laboratories， Wilmington， MA)。 在第 0 天 ( 用完全弗氏 佐剂 1 ∶ 1 乳化 ) 和第 11 天 ( 用不完全弗氏佐剂 1 ∶ 1 乳化 ) 施用抗原 ( 每只动物 25μg纯化蛋白质 )。在第 20 天对小鼠进行眶周取血， 然后第 21 天在另一只眼睛处用 107CFU/ml 细菌进行眶后攻击。在第 25 天处死小鼠， 根据肾脏脓肿模型进行处理。
     免疫荧光显微镜。解剖受感染动物的肾脏， 将其置于冰上 1×PBS 中， 然后速冻于 冷冻模具 (cryomold) 中的 Tissue Tek OCT Compound 中。将样品进行薄切片 (4μm 厚 )， 装载于载玻片上， 保存于 -80℃。 染色前， 将载玻片升至室温， 保持 30 分钟， 固定于冰冷的丙 酮中 10 分钟， 用冰冷的 PBS 清洗两遍。 在室温下用 3％ BSA、 1 ∶ 20 人 IgG(Sigma)、 1×PBS、 0.1％ Tween-80 将载玻片振摇封闭 1 小时。 将特异性兔抗体 (1 ∶ 2,000) 添加到混合物中， 使载玻片再孵育 1 小时。 弃去溶液， 用 PBS 将玻璃载玻片清洗 3 遍， 每次孵育 10 分钟。 将载玻 片置于 3％ BSA、 1×PBS、 0.1％ Tween-80、 1 ∶ 200AlexaFluor-647 小鼠抗兔第二抗体中， 使 之在室温下避光振摇孵育。弃去溶液， 用 PBS 清洗载玻片 3 遍， 置于含有 1 ∶ 1,000Hoechst 染料 (Invitrogen) 以及 1μg/ml BODIPY- 万古霉素的 PBS 中， 使之避光振摇孵育 5 分钟。 用 PBS 再将载玻片清洗一遍， 装载于 Npropylgallate 中， 在 Leica SP5 AOBS 光谱双光子共 聚焦显微镜下观察。
     主动和被动免疫。用纯化的 Eap 或 Emp 或 PBS 在第 0、 11 天免疫 BALB/c 小鼠 (n ＝ 15)。 在免疫后第 20 天， 对 5 只小鼠取血， 获得血清以确定抗体效价， 在第 21 天， 用 1×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击所有小鼠。感染后第 5 天， 在尸检中取出肾脏， 分析肾组织 的葡萄球菌负荷或组织病理学。
     通过亲和色谱 ( 与 sepharose 共价连接的纯化 Eap 或 Emp) 纯化兔 Eap 或 Emp 抗体， 通过腹膜内注射转移到小鼠中。 24 小时后通过眶后注射 1×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击经被动免疫的动物。通过 ELISA 分析主动或被动免疫动物的血清 IgG 效价。感染后 第 4 天， 在尸检中取出肾脏， 分析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。
     实施例 2
     金黄色葡萄球菌合成腺苷以逃脱宿主免疫应答
     A. 结果
     AdsA 是葡萄球菌在血液中存活必需的。为了鉴定逃脱固有免疫应答所需的葡萄 球菌基因， 通过菌落在琼脂培养基上的形成以一定时间间隔记录细菌负荷， 从而研究金黄 色葡萄球菌 Newman 株在 BLAB/c 小鼠或 Sprague-Dawley 大鼠全血中存活的能力 ( 图 15)。 如预期地， 缺少葡萄球菌特异性抗体的幼稚小鼠和大鼠血液中的免疫细胞 ( 数据未显示 ) 无法吞噬并杀死金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 图 15A 和 15D)。与野生型菌株相反， 缺少分 选酶 A 结构基因 (srtA) 的变体显示葡萄球菌逃脱吞噬杀伤的缺陷 (P ＜ 0.05)( 图 15A 和 15D)。分选酶 A 锚定葡萄球菌包膜中多种不同的多肽， 其使用转肽机制和表面蛋白质 C 端 的 LPXTG 基序分选信号来实现 (Mazmanian 等， 2002)。为了研究这些表面蛋白质对葡萄球 菌逃脱吞噬杀伤的贡献， 本发明人将含有 bursa aurealis 插入 (Bae 等， 2004) 的表面蛋白 质基因转导进野生型菌株金黄色葡萄球菌 Newman 株， 测定葡萄球菌变体在血液中的存活 ( 图 15B 和 15E)。clfA 和 sasH(Staphylococcus aureus surface protein， 金黄色葡萄球 菌表面蛋白质 ) 中的突变 ( 下文称为 adsA) 显示一致的存活缺陷。clfA 突变体的表型显 示预期的结果， 因为所编码的凝聚因子 A(ClfA) 产物已知沉淀血纤蛋白并干扰巨噬细胞和 中性粒细胞的吞噬 (Palmqvist 等， 2004 ； Higgins 等， 2006)。AdsA 对致病性的贡献尚不清 楚。AdsA 具有 5’ - 核苷酸酶结构域， 其具有两个特征序列 ILHTnDiHGrL(124-134 位残基 )和 YdamaVGNHEFD(189-201 位残基 )， 表明该蛋白质可催化从 5’ -AMP 合成腺苷。 为了进一步 研究 adsA 在葡萄球菌毒力中的重要性， 本发明人通过将完整的 adsA 基因和上游启动子序 列克隆进表达载体 pOS1， 产生 padsA 来补偿 adsA 基因。用 padsA 转化 adsA 突变体葡萄球 菌恢复了其在小鼠或大鼠血液中存活的能力， 表明所观察到的毒力缺陷确实是由 adsA 表 达缺少造成的 ( 图 15C 和 15F， 以及图 20)。还研究了金黄色葡萄球菌在人志愿者血液中的 存活。如使用鼠血液一样， 相比于野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株， adsA 突变体葡萄球菌 的数目减少， 中性粒细胞的葡萄球菌吞噬增加 ( 图 15G 和 15H)。
     AdsA 是葡萄球菌毒力和脓肿形成所必需的。为了研究 adsA 在侵入性葡萄球菌疾 病中的贡献， 通过静脉内接种 107 菌落形成单位 (CFU) 的野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 或其同基因 asdA 变体感染 BALB/c 小鼠。感染后第 5 天杀死动物， 取出双侧肾脏。将右侧 肾脏匀浆， 通过在琼脂上铺板和菌落形成对葡萄球菌负荷计数 ( 图 16A)。用戊二醛酸固定 左侧肾脏， 在石蜡中包埋， 薄切片并通过组织学进行分析 ( 图 16B)。如预期地， 野生型金黄 7 色葡萄球菌 Newman 株在肾组织中形成脓肿， 平均细菌负荷为每克器官组织 10 CFU。相反， 与野生型相比， adsA 突变体葡萄球菌不能形成脓肿， 并显示减少十倍以上的细菌负荷 ( 图 16A)。
     通过脉冲场凝胶电泳和 DNA 测序表征了从美国社区中获得的 MRSA 菌株 (CA-MRSA) 的感染。目前， 主要的 CA-MRSA 克隆是 USA300(McDougal 等， 2003)， 其是皮肤和软组织感染 以及菌血症的主要原因 (Carleton 等， 2004)。 为了评估 adsA 对 USA300 毒力的贡献， 使用噬 菌体转导和金黄色葡萄球菌 LAC 菌株 (USA300) 分离同基因型 adsA 突变体 (Bae 等， 2004)。 通过将葡萄球菌眼眶后注射进血流感染 BALB/c 小鼠。攻击后第 5 天， 在匀浆肾组织中对葡 萄球菌计数， 在该器官的苏木精 - 伊红染色的薄切片中观察脓肿的组织病理学 ( 图 16C)。 类似于金黄色葡萄球菌 Newman 株， 本发明人观察到用金黄色葡萄球菌 USA300 的 adsA 突变 体感染动物的肾脏回收的 CFU 减少了 1log。 另外， 在 adsA 变体感染的小鼠肾脏中观察到较 少的脓肿和较小的病变 ( 图 16D 和图 21)。这些结果一起说明了 adsA 对于两种临床分离 物——金黄色葡萄球菌 Newman 株和 USA300 毒力的必要性。
     受感染小鼠肾脏中脓肿形成和 CFU 回收的差异可能由于血流中细菌清除的增强 所致， 其导致较少的细菌到达外周器官组织。或者， adsA 可在脓肿和感染病灶的形成中起 直接的作用。为了明确这些可能性， 通过眼眶后接种感染 BALB/c 小鼠， 以一定时间间隔通 过心脏穿刺对外周血取样。与 adsA 突变体葡萄球菌的清除增强的体外结果相一致地， 与野 生型亲本菌株金黄色葡萄球菌 Newman 株相比， 感染后 90 分钟获取的 adsA 突变体葡萄球菌 CFU 显著较少。另外， 用 padsA 转化 adsA 突变体菌株恢复了静脉内攻击后其在血液中存活 的能力 ( 图 16E)。 尽管我们不能排除 adsA 也特异性地贡献于脓肿形成的可能性， 但是这些 数据表明， adsA 突变体葡萄球菌毒力的降低是由于其在血液中存活的减少所致。
     AdsA 介导的腺苷合成与葡萄球菌在血液中的存活相关。由于 AdsA 具有 5’ 核苷酸 酶特征序列， 产生了 AdsA 是否可从 AMP 合成腺苷的疑问。用溶葡萄球菌素降解金黄色葡萄 球菌野生型、 adsA 和 isdB(iron surface determinant B， 铁表面决定因子 B， 不对 AMP 水 解起作用的基因 )(Mazmanian 等， 2003) 突变体菌株以及 adsA:padsA 菌株的细胞壁肽聚糖 (Schindler 和 Schuhardt， 1964)， 将细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育。通 过薄层色谱 (TLC) 监测腺苷的产生。 adsA 突变体葡萄球菌的溶葡萄球菌素提取物显示显著降低的腺苷合酶活性 ( 约为野生型的 25％ )。当用 padsA 转化 adsA 突变体时腺苷合酶活 性恢复到野生型水平 ( 图 17A)。相反地， isdB 的破坏不影响金黄色葡萄球菌生成腺苷。
     为了表征 AdsA 的酶活性， 我们表达并纯化了来自大肠杆菌的可溶性重组形式的 14 AdsA。纯化的 AdsA 切割 [ C]AMP 从而产生腺苷， 在 5mM MgCl2 或 5mM MnCl2 存在时观察到 最大活性 (KM ＝ 44nM)， 这类似于其它腺苷合酶对金属的需求 (Zimmermann， 1992)。另一方 14 面， 在添加 [ C]AMP 之前， 将 AdsA 与 5mM ZnCl2 或 5mM CuSO4 一起孵育， 完全抑制腺苷合酶 活性 ( 图 17B， 泳道 6 和 7)。当添加 EDTA( 一种二价金属离子螯合剂 ) 至 AdsA 时观察到类 似的抑制作用， 表明在体外 AdsA 需要二价阳离子用于腺苷合酶活性。
     设想葡萄球菌通过合成腺苷来逃脱吞噬清除。 adsA 突变体葡萄球菌在血液中的存 活缺陷可通过外源添加腺苷来挽救。 对此进行测试， 显示在添加 1 ～ 100μM 腺苷后 adsA 突 变体葡萄球菌存活的剂量依赖性增加 ( 图 17F)。在生理条件下， 细胞外环境中 AMP 的浓度 估计为纳摩尔范围。但是， 免疫损害或组织损伤导致 AMP 释放， 其浓度可增加到 100μM。因 此， 似乎可解释为， 在葡萄球菌感染过程中这些 AMP 储藏可转变为腺苷。为了评估葡萄球菌 感染过程中腺苷的相对丰度， 用金黄色葡萄球菌感染小鼠血液 60 分钟。获取血浆， 除去蛋 白质， 对样品进行反相高效液相色谱 (rpHPLC)。为了校准， 通过 rpHPLC 分离市售纯化的腺 苷， 并在洗脱液中确定其分子量 ( 图 18A)。 未感染血液的色谱显示腺苷吸收峰， 通过质谱确 定其身份 ( 图 18A)。用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染后， 血液中腺苷峰增加了 10 倍 ( 图 18C)， 而用同基因型 adsA 突变体的感染产生少于 2 倍的腺苷增加 ( 图 18D)。值得注意的 是， 细胞外腺苷通过血细胞快速输入 ( 半衰期＜ 1 分钟 )(Thiel 等， 2003)。考虑到这一点， 金黄色葡萄球菌感染过程中观察到的血液中腺苷增加 10 倍表示此信号分子的大量积累以 及葡萄球菌借此用于对抗宿主免疫力的重要毒力策略。
     炭疽芽孢杆菌在血液中存活并合成腺苷。为了研究其它致病细菌是否可利用腺 苷合酶来促进逃脱吞噬清除， 检索细菌基因组序列中带有 AdsA 腺苷合酶结构域的产物， 并 鉴定到几个不同的基因 ( 表 3)。炭疽芽孢杆菌的基因组编码 BasA(Bacillus anthracis surface protein， 炭疽芽孢杆菌表面蛋白质， NCBI 基因座标签 BAS4031)， 其具有 5’ - 核苷 酸酶特征序列 (YdvisLGNHEFN， 131-142 位残基 ) 和 C 端 LPXTG 分选信号， 表明此表面蛋白 质也由分选酶 A 沉积至细胞壁包膜中 (Gaspar 等， 2005)。为了确定 BasA 是否用作腺苷合 酶并且贡献于逃脱固有免疫应答， 我们通过等位基因替换构建了 basA 的缺失突变体 ( 图 19)。变溶菌素 (mutanolysin) 是一种切割肽聚糖中 N- 乙酰基胞壁酰基 -(β1 → 4)-N- 乙 酰基葡糖胺的胞壁质水解酶， 其用来产生细胞壁裂解物 (Yokigawa 等， 1974)。来自野生型 芽孢杆菌的细胞壁提取物具有腺苷合酶活性， 但是来自 basA 突变体芽孢杆菌的提取物显 示此活性降低 ( 图 19A)。结构基因 basA 的缺失在炭疽芽孢杆菌中消除了 BasA 的表达 ( 图 19B) 和表面展示 ( 图 19C)， 并降低了芽孢杆菌合成腺苷的能力 ( 图 19A)。AMP 水解的残余 量可来自于其它磷酸酶 ( 例如碱性磷酸酶 ) 的贡献。本发明人表达并亲和纯化了来自大肠 杆菌的带标签的 BasA。与金黄色葡萄球菌 AdsA 类似， 在 5mM MnCl2(KM ＝ 2.01nM) 存在时 观察到最优的 BasA 腺苷合酶活性， 而 5mM MgCl2 则显示活性降低 ( 图 19D)。当接种进小鼠 血液中时， 与野生型亲本炭疽芽孢杆菌 Sterne 株相比， 观察到 basA 突变体的吞噬清除增加 ( 图 19E)。这些实验共同表明， 与葡萄球菌类似， 炭疽芽孢杆菌也利用 AdsA 合成腺苷并逃 脱固有免疫应答。表 7. 具有推定 5’ - 核苷酸酶的其它微生物具有推定 5’ - 核苷酸酶的其它微生物代表了公知的病原体 ( 表 7)， 我们尝试分析 其合成腺苷的能力。类似于来自金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌的细胞壁提取物， 粪肠球 菌和表皮葡萄球菌都从 AMP 合成腺苷， 而非致病的微生物枯草芽孢杆菌则不然 ( 数据未显 示 )。 本发明人得出如下结论， 细菌病原体合成腺苷并将此免疫抑制化合物释放进宿主组织 的能力可能代表了普遍的毒力策略。
     B. 材料和方法
     细菌菌株。金黄色葡萄球菌菌株在 37℃下培养于 TSB 中。金黄色葡萄球菌菌株 USA300 通过 Network on Antimicrobial Resistance in S.aureus(NARSA， NIAID) 获得。 本研究中所用的所有突变体均获得自 Phoenix(ΦNΞ) 文库 (Bae 等， 2004)。如所示， 每种 Phoenix 分离物均是临床分离物 Newman 株 (Duthie 和 Lorenz， 1952) 或 USA300(Carleton
     等， 2004) 的衍生物。所有 bursa aurealis 插入均通过使用噬菌体转导进野生型金黄色葡萄球菌 Newman 或 USA300， 并通过 PCR 分析进行验证。 使用 10mg l-1 的氯霉素进行具 有 padsA 的质粒和等位基因的选择。使用 10mg l-1 的红霉素进行金黄色葡萄球菌 Newman 株中等位基因的选择， 使用 50mg l-1 进行 USA300 中的等位基因的选择。使用含有热敏感复 制起点的 pLM4 产生炭疽芽孢杆菌 Sterne 株的突变体。将突变每一侧有 1kb DNA 序列的质 粒转化进炭疽芽孢杆菌， 在 LB 液体培养基 (20μg ml-1 卡那霉素 ) 中 30℃ ( 允许温度 ) 下 培养转化子。以 1 ∶ 100 稀释培养物， 铺板于 LB 琼脂 (20μg ml-1 卡那霉素 ) 上， 在 43℃ 下 ( 限制性温度 ) 过夜。将单菌落接种进不含抗生素的 LB 液体培养基， 在 30℃下过夜培 养。为了确保基于 pLM4 的质粒的丢失， 将这些培养物在无抗生素压力的新鲜 LB 液体培养 基中稀释四次， 在 30℃下增殖。稀释培养物， 铺板于 LB 琼脂上， 检查菌落的卡那霉素抗性。 通过 PCR 分析来自卡那霉素敏感性菌落的 DNA 中突变体等位基因的存在与否。
     质粒。利用下列引物进行 PCR 扩增反应 ： P55(5’ -TTTCCCGGGACGATCCAGCTCTAATCG CTG-3′ )(SEQ ID NO ： 42)， P56(5’ -TTTGAGCTCAAAGCAAATAGATAATCGAGAAATATAAAAAG-3′ ) (SEQ ID NO ： 43)， P57(5’ -TTTGAGCTCAGTTGCTCCAGCCAGCAT T-3′ )(SEQ ID NO ： 44)， P58(5 ’ -TTTGAATTCAAACGGATTCATTCCAGCC-3′ )(SEQ ID NO ： 45)， FP10(5’ -TACGAATTCGACTTGGCAG )(SEQ GCAATTGAAAA-3’ )(SEQ ID NO ： 46)， RP10(5’ -TGTGAATTCTTAGCTAGCTTTTCTACGTCG-3’ ID NO ： 47)， FP3C(5’ -TCGGGATCCGCTGAGCAGCATACACCAATG-3’ )(SEQ ID NO ： 48)， RPB(5’ -T GTGGATCCTTATTGATTAATTTGTTCAGCTAATGC-3’ )(SEQ ID NO ： 49)。将 FP10/RP10(adsA+ 起始 位点上游 700bp)PCR 产物连接进 pOS1(EcoRI) 产生 padsA。将 P55/P56(basA 1kb5’ 侧翼序 列 ) 和 P57/P58(basA 1kb 3’ 侧翼序列 )PCR 产物插入到 pLM4(EcoRI、 SacI 和 XmaI 位点 ) 中产生 pJK34。使用此质粒来缺失 basA 编码序列。将连接产物转化进大肠杆菌 DH5α， 将 质粒 DNA 转化进大肠杆菌 K1077(dam ， dcm ) 以及按照之前成熟的方案 (Gaspar 等， 2005) 将 纯化的 ( 非甲基化 ) 质粒 DNA 转化进炭疽芽孢杆菌。将 FP3C/RPB( 起始自信号肽后 5’ 的 adsA 的 1.2kb 截短 )PCR 产物连接进 pGEX-2T(GE Healthcare) 产生 adsA 表达载体 pVT1， 将此质粒转化进大肠杆菌 BL21。
     动物实验。 所有实验方案均经过芝加哥大学学术生物安全委员会 (Institutional Biosafety Committee， IBC) 和学术生物管理及使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee， IACUC) 的审查、 批准并在其规定下实施。BALB/c 小鼠购自 Charles River Laboratories， Sprague-Dawley 大鼠购自 Harlan。金黄色葡萄球菌菌株的过夜培 养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 清洗两遍， 在 8 -1 PBS 中稀释得到 0.5 的 OD600 值 (1×10 CFU ml )。通过胰酶大豆琼脂平板上菌落形成对活 的葡萄球菌进行计数， 从而对感染量进行定量。通过腹膜内注射每千克体重 80-120mg 氯胺 酮和 3-6mg 赛拉嗪麻醉小鼠。通过眼眶后注射将一百微升细菌悬液 (1×107CFU) 静脉内施 用到 BALB/c 小鼠 (6 周龄雌性 )。在第 5 天， 通过压缩 CO2 吸入杀死小鼠。取出肾脏， 在含 有 1％ Triton X-100 的 PBS 中匀浆。稀释匀浆液的等分试样， 在琼脂培养基上铺板以用于 一式三份地确定 CFU。使用 Prizm 软件进行 student’ s t 检验统计学分析。对于组织病理 学， 在室温下将肾脏组织在 10％福尔马林中孵育 24 小时。 将组织包埋于石蜡中， 薄切片， 用 苏木精 - 伊红染色， 并进行显微镜检查。
     为了测定葡萄球菌在血液中的存活， 用 1×107CFU 葡萄球菌通过眼眶后注射感染 6周龄雌性 BALB/c 小鼠。在第 30 或 90 分钟， 通过压缩 CO2 吸入杀死小鼠， 通过使用 25 号针 的心脏穿刺收集血液。 将等分试样在冰上 0.5％皂苷 /PBS 终浓度下孵育 30 分钟， 以裂解宿 主真核细胞。将稀释物在 TSA 上铺板， 从而对两个不同时间点的存活 CFU 进行计数。
     化学物质。变溶菌素 (Sigma) 以 5,000 单位 ml-1 的浓度悬浮于含有 1mM PMSF 的 100mM 磷酸钠 (pH 6.0) 中， 保存于 -20C。 [14C]AMP 和 [14C] 腺苷购自 Moravek Biochemicals。 溶葡萄球菌素 (Lysostaphin) 购自 AMBI， 纯化的腺苷购自 Sigma。
     血液中的细菌存活。将金黄色葡萄球菌菌株过夜培养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37 ℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 清洗两遍并在 PBS 中稀释至 OD600 为 8 -1 0.5(1×10 CFU ml )。 通过对 Sprague-Dawley 大鼠或 BALB/c 小鼠进行心脏穿刺收集全血， -1 并立刻添加 5μg ml 的来匹卢定抗凝剂。将 100μl 的 105CFU ml-1 细菌与 900μl 大鼠或 小鼠血清相混合。对于人血研究， 将 100μl 的 108CFUml-1 细菌与 900μl 新鲜提取的人血 液相混合。 然后， 将试管在 37℃下以低转速孵育所示时间， 在所示时间点将等分试样在冰上 0.5％皂苷 /PBS 终浓度下孵育 30 分钟， 以裂解真核细胞。 将葡萄球菌稀释物在 TSA 上铺板， 以计数存活的 CFU。使用来自人志愿者的血液的实验包括了经过芝加哥大学学术评审会议 (Institutional Review Board， IRB) 的评审、 批准并在其规定下实施的方案。
     腺苷合酶活性。 将金黄色葡萄球菌菌株过夜培养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 用 PBS 清洗两遍。离心下来 3ml 的细胞， 将其在 100μL TSM 缓冲液 (50mM Tris-HCL(pH 7.5)， 10mM MgCl2 和 0.5M 蔗糖 ) 中重悬， 然后添加 2μl 的溶葡萄球菌素， 使之在 37℃下孵育 30 分钟。然后， 以 10k rpm 将溶液离心 5 分钟， 收集含有释放的细胞表面蛋白质的上清。 然后， 将 15μl 溶葡萄球菌素提取物与 3μCi[14C] AMP 在 37℃下一起孵育 30 分钟。随后， 将样品点样于硅平板上， 之后使用 (75 ∶ 25 异丙 醇∶ ddH2O)0.2M 碳酸氢铵溶剂通过 TLC 进行分离。对于用变溶菌素消化的金黄色葡萄球 菌、 粪肠球菌、 炭疽芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的细胞壁提取物， 用变溶菌素替代溶葡萄球菌 素， 并且根据制造商建议的条件使用。当用纯化的蛋白进行测定时， 在 TSM 缓冲液中所示金 属阳离子存在下， 将 2μM 纯化的 AdsA 或 BasA 在 15μl 终体积中与 3μCi[14C]AMP 一起孵 育。
     血液中腺苷浓度。如上所述进行葡萄球菌的全血杀死测定。如上所述进行血浆提 取 (Mo 和 Ballard， 2001)。简言之， 全血杀死测定的结束后， 将血液样本以 13k rpm 离心 5 分钟， 收集无细胞血浆。然后， 用 75μl 全氯酸 (1.5M) 和 1mM EDTA 萃取 600μl 血浆。以 13k rpm 离心 5 分钟后， 吸取上清 (500μl)， 用 29μl 4M KOH 中和。用冰冷却 10 分钟后， 将样品再次以 13k rpm 离心 5 分钟。最终将上清的 pH 调节至 6-7， 用 PBS 以 1 ∶ 4 稀释， 用 0.22μm 注射器滤器过滤， 然后进行反相高效液相色谱 (rpHPLC)。
     HPLC 和质谱。通过 rpHPLC 确定腺苷的产生。将样品利用 250mm×3mm 柱 (BDS Hypersil C18， 5μm 粒径， Thermoscientific) 进行色谱。流动相由溶液 A(dH2O ∶ 0.1％三 氟乙酸 ) 和溶液 B( 乙腈∶ 0.1％三氟乙酸 ) 组成。用 1 ～ 100％的溶剂 B 梯度洗脱腺苷， 从 5 分钟运行到 50 分钟。溶剂流速为 0.5ml/ 分钟。通过 280nm 的 UV 吸收检测峰。通过 将其驻留时间与用作标准样品的纯化腺苷 (Sigma) 的驻留时间进行比较鉴定 HPLC 色谱图 中腺苷的峰。然后， 将含有腺苷的级分与基质 (α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 ) 共同点样， 在具 有反射器的条件 (reflector positive condition) 下进行 MALDI-MS。参考文献
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     发明概述
     在住院或健康个体中， 金黄色葡萄球菌是唯一最常见的菌血症和软组织感染的原 因， 死亡率的显著提高归因于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌株的传播， 该菌株常 常对抗生素治疗不敏感 (Klevens 等， 2007 ； Klevens 等， 2006)。具有特征性纤维蛋白沉积 和大量免疫细胞浸润的脓肿代表了葡萄球菌感染的病理基质 (Lowy， 1998)。使用扫描电子 显微镜观察葡萄球菌脓肿中心的生物膜样结构。遗传分析显示， 体外生物膜形成与葡萄球 菌形成脓肿的能力有关， 本发明人鉴定了对于这两个过程来说必需的包膜蛋白质。当纯化 并用于免疫小鼠时， Emp 和 Eap 对葡萄球菌感染产生了保护性免疫。使用结合 Eap 之抗体 或结合 Emp 之抗体的被动免疫也证明了治疗作用。
     本申请在一个实施方案中描述了 Emp 和 / 或 Eap 或者结合 Emp 或 Eap 之全部或部 分的抗体在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。本申请还提供了 包含 Emp 和 / 或 Eap 抗原或者其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可 用于治疗 ( 例如在对象中限制葡萄球菌脓肿形成和 / 或持续存在 ) 或预防细菌感染的方法 和组合物。 在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或抗原之全部或部分以及 ( 在某些方面中 ) 其它细菌蛋白质的有效量的组合物。其它 细菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子， 和 / 或 (iii) 多糖， 等等。
     在另一些方面中， 可向对象施用 Emp 和 / 或 Eap 调节剂， 例如结合 Emp 和 / 或 Eap 的抗体 ( 例如多克隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 )。Emp 和 / 或 Eap 调节剂可直接结合 Emp 和 / 或 Eap。Emp 和 / 或 Eap 调节剂可以是结合 Emp 和 / 或 Eap 的抗体或细胞。抗体可 以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， Emp 和 / 或 Eap 调 节剂通过向对象或来源对象 ( 例如供体 ) 中提供能够产生结合 Emp 和 / 或 Eap 之抗体的 Emp 和 / 或 Eap 肽而得到。Emp 和 / 或 Eap 调节剂通常配制成可药用组合物。Emp 和 / 或 Eap 调 节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结合此类分子 ( 例如 EsxA、 EsxB、 EsaB、 EsaC、 SdrC、 SdrD、 Hla、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasH(AdsA、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SasF) 的抗体。 可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂组合使用的另外的葡 萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素 氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。葡萄球菌抗原或抗体可以与 Emp 和 / 或 Eap 调节 剂同时施用。葡萄球菌抗原或抗体以及 Emp 和 / 或 Eap 调节剂可以在同一组合物中施用。一些实施方案涉及在可药用组合物中包含结合 Emp 和 / 或 Eap 抗原或者其片段 的分离抗体或其片段的治疗性组合物， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染。所述抗体可以是人或人源化抗体。在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗 体或单链抗体或者其片段。抗体组合物还可包含结合选自以下一种或多种抗原之至少一 种另外的分离抗体或其片段 ： ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SdrC、 SdrD、 SdrE 和 SpA 抗原 )。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂组合使用的葡萄球菌抗原的额外抗体包括但不限于针对 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     Emp 和 / 或 Eap 调节剂还可以是编码 Emp 和 / 或 Eap 肽的重组核酸分子。重组核 酸分子可编码 Emp 和 / 或 Eap 肽， 以及至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。 核酸可编码 或者多肽可包含多种抗原， 所述抗原包括以下抗原之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA 或其变体。核 酸可编码额外的葡萄球菌抗原， 其包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， 所述方法和组合物使用或包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽、 肽 或抗原之全部或部分， 以及与它们结合的抗体。 在另一些方面中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡 萄球菌因子或细菌因子联用， 例如以下的全部或部分 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA， 或者其免疫原性片段或其组合。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂联用的额外葡萄球菌抗原 包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNAIII 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些实施方案中， 可以从本发明的方法、 组合物或制剂中具 体排除或包含以下分子中的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 种或更多种 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。可明确排除的额外葡萄球菌抗原包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。 本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或编码其的核苷酸。 在又一些方面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽是多聚化的， 例如二聚化的。在本发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个分离 的细胞表面蛋白质或其区段的多聚体。在另一方面中， 其它多肽或肽可表达或包含在细菌 组合物中， 其包括但不限于 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其免疫原性片 段。可表达或包含在细菌组合物中的额外的葡萄球菌多肽包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白 结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结 合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋 白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。或者， 所述组合物可以是或包含经重组改造的葡萄球菌， 其以某种方式被改变， 包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行特定改变。例如， 所述细菌可被重组修饰为表达与 未修饰时相比更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     术语 “Emp 多肽” 或 “Eap 多肽” 是指包括从葡萄球菌中分离的野生型 Emp 或 Eap 蛋白的多肽， 以及刺激针对葡萄球菌 Emp 或 Eap 蛋白之免疫应答的变体和区段或片段。类 似地， 术语 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白是指包括从葡萄球菌分离的野生型 EsaB、
     EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA) 或 SpA 多肽的蛋白质， 以及刺激针对葡萄球菌 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白之免疫应答的变体、 区段或片段。此外， 术语 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白表示包括从 葡萄球菌分离的野生型 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨 基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 以及刺激针对葡萄球菌 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白之免疫应答的 变体、 区段或片段。免疫应答是指生物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。可通过包 括下列但不限于此的测定来检测免疫应答 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体 的存在或量的测定、 测量 T 细胞活化或增殖的测定和 / 或测量与一种或多种细胞因子之活 性或表达有关的调节的测定。
     本发明的一些实施方案包括在对象中引发针对葡萄球菌之免疫应答的方法， 其 包括向对象提供 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种有效量的抗原或其区段 / 片段。葡萄 球菌抗原包括但不限于 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其 区段、 片段或免疫原性片段。额外的葡萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 多肽或其免疫原性片段可与以下一种或多种 蛋白的一种或多种抗原或免疫原性片段相组合地提供 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdSA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。 也可使用以下额外抗原或免疫原性片段 ： 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     本发明的一些实施方案包括可包含与以下蛋白在 5、 10、 15、 20、 50、 100、 200 或 更多连续氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 上有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或相似性之多肽、 肽或蛋白质的组合物 ： Emp、 Eap EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在本发明的另一实施 方案中， 组合物可包含与 Emp 多肽 (SEQ ID NO ： 2， 50-53) 和 / 或 Eap 多肽 (SEQ ID NO ： 4) 或 Emp 核酸 (SEQ ID NO ： 1) 和 / 或 Eap 核酸 (SEQ ID NO ： 3) 有或有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或相似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面 中， Emp 多肽或 Eap 多肽将分别具有 (SEQ ID NO ： 2) 或 (SEQ ID NO ： 4) 的氨基酸序列。类 似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于鉴定蛋白质 ( 或 核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似性使用本领域 已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序列同一性算法，通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软件包中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设置 )， 或者通过肉 眼比较。 优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计算同一性百分比。
     术语 “AdsA 多肽” 是指包括分离的野生型细菌 AdsA 蛋白的多肽， 例如葡萄球菌 ( 金 黄色葡萄球菌 SEQ ID NO ： 36) 或芽孢杆菌 ( 炭疽芽孢杆菌 (B.anthracis)SEQ ID NO ： 41)， 以及 AdsA 蛋白的变体和区段或片段。在某些方面中， AdsA 多肽刺激针对细菌 AdsA 蛋白的 免疫应答。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 8 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrD 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrD 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 10 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrE 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrE 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 16 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SpA 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， SpA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 18 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 20 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 22 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasF 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasF 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 24 的氨基酸序列。在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 26 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 28 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 30 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 32 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 34 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasH(AdsA) 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋 白质。在某些方面中， SasH(AdsA) 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 的氨基酸序 列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Hla 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在 某些方面中， Hla 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 37 的氨基酸序列。在某些方面中， Hla 变体包括 D24C、 H35C、 H35K、 H35L、 R66C、 E70C 或 K110C 的氨基酸替换或者其任何组合 ( 氨基酸使用 单字母代码表示 )。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Ebh 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Ebh 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 38 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Coa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Coa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 39 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 vWa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， vWa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸序列。
     在某些方面中， 多肽或区段 / 片段可具有与参考多肽有至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％或至少 99％或更高同一性的氨基酸序列。术语 “相似性” 表示其序列具有 一定百分比的与参考多肽相同或构成与参考多肽的保守性替换的氨基酸的多肽。
     本文所述多肽或区段或片段可包含 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ：30、 SEQ ID NO ： 32、 SEQ ID NO ： 34、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 37、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 39、 SEQ ID NO ： 40、 SEQ ID NO ： 41 或 SEQ ID NO ： 41 的下列或至少或至多 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550 或更多个连续氨 基酸或其间任何可得出的范围。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码下列蛋白之 1、 2、 3、 4 或更多种的重组核 酸分子 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或 多糖任意组合或排列的 Emp 和 / 或 Eap 多肽。
     又一些实施方案包括包含如下可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 或者其区段或片段， 或者本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方 面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 Emp 和 / 或非 Eap 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是这样的可药用组合物， 所述组合物具有编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核 酸， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。 在某些实施方案中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选 地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向对象施用有效量的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其区段 / 片段之组合物， 其包含下 列一种或多种 ： (i)EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外 毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾 液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白多肽或者其区段 或片段， 或者 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 Emp 和 / 或 Eap 组合物， 其 含有不同组合的下列 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种蛋白 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在又一方面中， 本发明包括缺少 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或 EsaB 多肽的葡萄球 菌。此类细菌在长期或持续脓肿形成和 / 或生物膜形成方面是有限的或减弱的。此特征可 用于提供生产减毒细菌的菌株， 所述菌株用于制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或 治疗。在又一方面中， Emp 和 / 或 Eap 可在减毒细菌中过表达， 以进一步提高或补充免疫应 答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面中所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特 别地， 述及 Emp 和 / 或 Eap 肽或核酸时的任何实施方案可针对以下蛋白或核酸或结合它 们的抗体来实施 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 反之亦然。
     本发明人研究了金黄色葡萄球菌逃脱血液中噬菌细胞清除的能力， 并鉴定了作为 关键毒力因子的腺苷合酶 A(AdsA)—— 一种将一磷酸腺苷转化为腺苷的锚定于细胞壁的 酶。在血液中葡萄球菌的腺苷合成、 逃脱噬菌细胞的清除以及随后形成器官脓肿全都依赖 于 adsA， 并且可通过外源提供腺苷来挽救。在炭疽病原体中鉴定到 AdsA 同源物， 腺苷合成 也使得炭疽芽胞杆菌能够逃脱噬菌细胞清除。 总之， 这些结果表明， 葡萄球菌及其它细菌病 原体利用腺苷的免疫调节性质来逃脱宿主免疫应答。本发明的某些实施方案基于以下发 现： 信号传导分子腺苷的合成具有免疫抑制作用， 对其合成活性的调节可用于治疗目的。 本申请在一个实施方案中描述了 AdsA 或者与 AdsA 之全部或部分结合的抗体或者 AdsA 活性抑制剂在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。 本申请还 提供了包含 AdsA 抗原或其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可用于治 疗 ( 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取 ) 或预防细菌感染的方法和组合物。在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用有效量的包含或编码细菌 AdsA 多肽或抗原之全部或 部分的组合物， 在某些方面所述组合物还包含或编码其它细菌蛋白质和细菌多糖。其它细 菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或者 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子。
     在另一些方面中， 可向对象施用 AdsA 调节剂， 例如结合 AdsA 的抗体 ( 例如多克 隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 ) 或者抑制 AdsA 活性或稳定性的小分子。AdsA 调节剂 可直接与 AdsA 结合。AdsA 调节剂可以是结合 AdsA 的抗体或细胞。抗体可以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， 通过提供导致在对象中产生结合 AdsA 之抗体的 AdsA 肽或表达其的细菌来产生 AdsA 调节剂。AdsA 调节剂通常配制成可药 用组合物。AdsA 调节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结 合这些 ( 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SasB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 Spa、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 Coa、 Ebh、 vWa 或 SasF) 的抗体。葡萄球菌抗原或抗体可以与 AdsA 调节剂同时施用。抗原和 / 或抗体和 / 或抗生素以及 AdsA 调节剂可以在同一组合物中施 用。
     一些实施方案涉及这样治疗性组合物， 其在可药用组合物中包含结合 AdsA 蛋白 或抗原或其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染， 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述调节剂可以是小分子， 例如腺苷类似物。所述抗 体可以是人或人源化抗体。 在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体， 或者单链 抗体， 或其片段。
     抗体组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 该抗体结合选自以下的抗原或其 片段 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。重组核酸分子可编码 AdsA 肽和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种 抗原， 其包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。 重组核酸分子可编码 AdsA 肽 和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种抗原， 其 包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 AdsA 多肽或编码其的核酸。在又一些方面中， 分离的 AdsA 多肽是多聚化的， 例如二聚化。在本 发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个分离的细胞表面蛋白 或其区段的多聚体。 在另一方面中， 所述其它多肽或肽可表达或包含于细菌组合物中， 其包 括但不限于 ： AdsA、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 或其免疫原性片段。或者， 所述 组合物可以是或包含以某种方式改变的经重组改造的葡萄球菌， 所述改造包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行了特定改变。例如， 所述细菌可被重组改变成表达 比未经改变时更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     类似地， 术语 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 Coa、 Ebh、 vWa、 SasF 或 SpA 蛋白是指包括含从葡萄球菌分离的各 野生型多肽的蛋白质， 以及刺激针对其之免疫应答的变体、 区段或片段。免疫应答是指生 物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。免疫应答可通过以下测定来测量， 其包括但 不限于 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体存在或数量的测定， 测量 T 细胞活 化或增殖的测定和 / 或测量一种或多种细胞因子之活性或表达方面的调节的测定。细菌 AdsA 多肽包括但不限于下列细菌之氨基酸序列 ( 登记号 ) 的全部或部分 ： 金黄色葡萄球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261、 ref|NP_370547、 ref|YP_042156、 ref|NP_644838、 ref|YP_415541、 dbj|BAA82250) ；溶 血 葡 萄 球 菌 (Staphlyococcus hemolyticus)(ref|YP_254367) ； 血链球菌 (Streptococcus sanguinis) (ref|YP_001035187) ； 格 氏 链 球 菌 (Streptococcus gordonii)(ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)(ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (Streptococcus suis) (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ； 变 形 链 球 菌 (Streptococcus mutans)(ref|NP_721592) ； 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)(ref|YP_141373、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP_001321391) ； 肉 毒 梭 菌(Clostridium botulinum)(ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ；类 芽 孢 杆 菌 属 (Paenibacillus)(ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克 劳 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillus clausii)(ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (Bacillus halodurans)(ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)(ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解 纤 维 梭 菌 (Clostridium cellulolyticum)(ref|ZP_01574143) ； 以 及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个均通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽 可与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 具有至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包括其间的所有值和范围。
     在本发明的又一实施方案中， 组合物可包含与 AdsA 多肽 (SEQ ID NO ： 36) 或 AdsA 核酸 (SEQ ID NO ： 35) 有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质， 在某些方面中， AdsA 多肽具有 SEQ ID NO ： 36 的 氨基酸序列。类似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于 鉴定蛋白质 ( 或核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似 性使用本领域已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序 列同一性算法， 通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软 件 包 中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设 置 )， 或者通过肉眼比较。优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计 算同一性百分比。
     所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 葡萄球菌是金黄色 葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在另一方面中， 细菌是芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌。
     可使用本领域技术人员已知的方法以及本文所述方法评估作为 AdsA 抑制剂之化 合物的活性。筛选测定可包含用于校准和验证测定组分之正确操作的对照。通常包含含 有除了化学文库成员之外所有反应物的空白孔。作为另一实例， AdsA 的已知抑制剂 ( 或 活化剂 ) 可与一个测定样品一起孵育， 所得酶活性的降低 ( 或升高 ) 用作比较或对照。应 理解， 所述调节剂还可与酶活化剂或抑制剂相组合， 以发现抑制酶活化或阻遏的调节剂， 否则其由已知酶调节剂的存在造成。本文使用的术语 “高通量筛选 (high throughput screening)” 或 “HTS” 是指测试成千上万个分子 ( 或测试化合物 ) 对蛋白质功能的作用。 就基团转移反应酶来说， 可测试许多分子对其催化活性的作用。HTS 方法是本领域已知的， 它们通常在多孔板中借助自动液体操作和检测装置来进行 ； 但是， 设想本发明的方法可利 用微阵列或微流体系统来实施。本文使用的术语 “文库” 或 “药物文库” 是指具有作为 AdsA 调节剂潜力的多种化学分子 ( 测试化合物 )、 多种核酸、 多种肽或多种蛋白质及其组合。其 中通过高通量筛选技术进行筛选， 其中该技术利用多孔板或微流体系统。
     评估 AdsA 活性的测定 / 试剂盒的一个实例包括但不限于 Diazyme 酶反应试剂盒 ： 该试剂盒是 5′ - 核苷酸酶 (5′ -NT) 测定试剂盒， 其通常用于测定人血清样品中的 5′ -NT 活性。5′ -NT 测定是基于 5′ - 单磷酸酯 (5′ -IMP) 酶促水解形成肌苷， 后者通过嘌呤核 苷磷酸化酶 (PNP) 转化为次黄嘌呤。次黄嘌呤随后由黄嘌呤氧化酶 (XOD) 转化为尿酸和过氧化氢 (H2O2)。在过氧化物酶 (POD) 存在下， H2O2 进一步与 N- 乙基 -N-(2- 羟基 -3- 磺丙 基 )-3- 甲基苯胺 (EHSPT) 和 4- 氨基安替比林 (4-aminoantipyrine， 4-AA) 反应产生醌染 料， 而后对该染料进行动力学监测。该方法快速但是不如放射性测定灵敏。
     抑制剂和候选抑制剂包括但不限于下列试剂的衍生物或类似物 ： α， β- 亚甲基 腺苷 5′ - 二磷酸 (AOPCP)、 5′ - 外核苷酸酶 ( 细菌 AdsA 的人同源物 ) 的抑制剂， 此抑制 剂不抑制来自鸟毛滴虫 (Trichomonas gallinae) 滋养体的分泌型 5′ - 核苷酸酶 (Borges 等， 2007) ； 杀核酶菌素 (nucleoticidin) 和黑杀菌素 (melanocidin)A 和 B， 这些化合物 显示针对来自大鼠肝膜和蛇毒的 5′ - 核苷酸酶的有力抑制活性 (Uchino 等， 1986) ； 多酚 化合物， 这些化合物具有抗肿瘤活性， 以及抑制来自多种来源的 5′ - 核苷酸酶， 并且已从 槟榔 (Areca catechu) 以及葡萄的种子中分离得到 (Iwamoto 等， 1988 ； Uchino 等， 1988 ； Toukairin 等， 1991)。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 AdsA 多肽或其区段 / 片段的重组核酸分 子。通常， 编码 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文在例如 AdsA 多 肽中所述的一种或多种多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种革兰氏阳性细 菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免疫应答的其它 动物。在另一些方面中， 含有或表达 AdsA 多肽的葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。在另一些实 施方案中， 免疫应答是保护性和 / 或治疗性的免疫应答。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)AdsA 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 AdsA 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或多糖任意组合或排列 的 AdsA 多肽。
     又一些实施方案包括包含可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 AdsA 多 肽、 其区段或片段、 或者本文所述蛋白质或肽的任何其它组合或排列， 其中所述组合物能够 刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 AdsA 多肽和 / 或本文所述蛋白质、 肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方面中， 分离的 AdsA 多肽或者本文所述 蛋白质或肽的任何其它组合或排列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 AdsA 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或 非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是如下可药用组合物， 其具有编码 AdsA 多肽之 全部或部分和 / 或本文所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸， 其中所述组合 物能够刺激针对葡萄球菌或芽孢杆菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 AdsA 多肽 之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。在某些实施方案 中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     在另一些实施方案中， 疫苗组合物是可药用组合物， 其包含结合 AdsA 蛋白或抗原 或者其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中的葡萄球菌感染， 例如 调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述抗体可以是人抗体或人源化抗体。在某些方面中， 所述 抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或者单链抗体， 或其片段。
     疫苗组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 其结合选自以下的抗原 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Emp、 Eap、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原， 或其片段。
     另一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 包括向所述对象施用有效量的 AdsA 多肽或其区段 / 片段的组合物， 所述组合物包含下 列一种或多种 ： (i)Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Spa、 ClfA、 ClfB、 Coa、 Ebh、 vWa、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 多肽， 或者其区段或片 段； 或 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 AdsA 组合物， 其含有不同组合的下 列蛋白的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 Spa。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在另一方面中， 本发明包括缺少 AdsA 多肽的葡萄球菌。这样的细菌在逃避吞噬细 胞摄取和 / 或识别的能力上有限或减弱。此特征可用于提供生产减毒细菌的菌株， 其用于 制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或治疗。在又一方面中， AdsA 可在减毒细菌中过 表达， 以进一步提高或补充免疫应答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特别地， 述及 AdsA 肽或核酸时的任何实施方案可针对其它分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或 核酸或结合它们的抗体来实施， 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 Coa、 Ebh、 vWa、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 蛋白， 反之亦 然。
     术语 “提供” 或 “施用” 根据其常规含义使用， 表示 “供给或供应以使用” 。在一些实 施方案中， 通过施用蛋白质直接提供蛋白质， 而在另一些实施方案中， 通过施用编码蛋白质 的核酸来有效提供或施用该蛋白质。在某些方面中， 本发明涵盖包含抗体、 核酸、 抗原、 肽、 表位和 / 或多糖等之多种组合的组合物。
     对象通常患有 ( 例如诊断患有持续葡萄球菌感染 )、 怀疑患有葡萄球菌感染， 或者 具有发生葡萄球菌感染的风险。本发明的组合物包括免疫原性组合物， 其中以有效实现预 定目的 ( 例如治疗或预防感染 ) 的量包含所述抗原或表位。更具体地， “有效量” 表示刺激 或引发免疫应答或者提供针对感染的抗性、 减轻或缓和感染所需的活性成分的量。在更具 体地方面中， 有效量预防、 减轻或改善疾病或感染的症状， 或者延长所治疗对象的存活。确 定有效量在本领域技术人员的能力范围内， 尤其是在本文所提供的详细公开的教导下。对 于本发明方法使用的任何制备物， 有效量或剂量最初可从体外、 细胞培养和 / 或动物模型 测定来估计。例如， 可在动物模型中制定实现期望之免疫应答或循环抗体浓度或效价的剂 量。这些信息可用于更精确地确定人中的有用剂量。
     本文使用的术语 “调节” 涵盖了 “增强” 或 “抑制” 的含义。活性的 “调节” 可以是活性提高或降低。本文使用的术语 “调节剂” 是指实现某部分之功能的化合物， 包括上调、 诱导、 刺激、 增强、 抑制、 下调或阻抑蛋白质、 核酸、 基因、 生物体等。
     术语 “分离的” 可表示基本上不含其来源的细胞物质、 细菌物质、 病毒物质或培养 基 ( 当通过重组 DNA 技术产生或者从天然生物体中分离时 ) 或者化学前体或其它化学物质 ( 当化学合成时 ) 的核酸或多肽或肽。 此外， 分离的化合物是指可作为分离的化合物施用给 对象的化合物 ； 换句话说， 如果附着在柱子上或者嵌在琼脂糖凝胶中， 则所述化合物不可以 简单地认为是 “分离的” 。此外， “分离的核酸片段” 或 “分离的肽” 是非天然的和 / 或以片 段起作用和 / 或通常不是功能性状态的核酸或蛋白质片段。
     本发明的部分 ( 例如抗体、 多肽、 肽、 抗原或免疫原 ) 可以与其它部分 ( 例如佐剂、 蛋白质、 肽、 支持物、 荧光部分或标签 ) 共价或非共价地缀合或连接。术语 “缀合” 或 “免疫 缀合” 广义地用于定义一个部分与另一物质的有效结合， 其不旨在仅仅表示任何类型的有 效结合， 还特别地不限于化学 “缀合” 。特别地， 还考虑到重组融合蛋白。本发明的组合物还 可包含佐剂或可药用赋形剂。佐剂可以与本发明的多肽或肽共价或非共价偶联。在某些方 面中， 佐剂与蛋白质、 多肽或肽化学缀合。 在另一方面中， 佐剂是重组蛋白质的一部分， 其包 含在含有一种或多种目的抗原的融合蛋白中。 所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 所述葡萄球菌是金 黄色葡萄球菌。
     在本发明的另一些方面中， 可超过一次地将组合物施用给对象， 可以施用 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20 或更多次。所述组合物的施用包括但不限于经鼻、 经胸膜、 经口、 肠 胃外、 皮下、 肌内、 静脉内施用， 或其多种组合， 包括吸入或吸取。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽或其区段 / 片段 的重组核酸分子。通常， 编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文所述的一种或 多种多肽， 例如 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种 革兰氏阳性细菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免 疫应答的其它动物。在另一些方面中， 含有或表达 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的葡萄球菌是 金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中， 免疫应答是保护性免疫应答。
     本发明的组合物通常施用给人对象， 但是设想施用给能够引发对葡萄球菌之免疫 应答的其它动物， 特别是小鼠、 狗、 猫、 牛、 马、 山羊、 绵羊及其它家畜， 即哺乳动物， 包括转基 因动物 ( 例如， 经操作表达人抗体的动物 )。
     在另一些方面中， 本发明的方法和组合物可用于预防、 改善、 减少或治疗组织或腺 体 ( 例如乳腺 ) 的感染， 特别是乳腺炎及其它感染。其它方法包括但不限于， 在未表现感染 征兆的对象 ( 特别是怀疑靶细菌定殖或具有该风险的对象， 例如在医院停留、 治疗和 / 或恢 复期间具有或将具有感染风险或者对其易感的患者 ) 中预防性地减少细菌负荷。
     本文提供的任何列表可特别地排除或包含列表中的任何 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个成员。
     实施例章节中的实施方案应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施方案。
     尽管本公开内容支持仅择一选择以及 “和 / 或” 的定义， 但是权利要求中使用的术 语 “或” 表示 “和 / 或” ， 除非另外指明仅择一选择或者可选项是互相排斥的。还考虑到， 使 用术语 “或” 列出的任何项也可特别地排除。
     在本申请全文中， 术语 “约” 用于表示数值包括测定该值所用仪器或方法的标准误 差。
     遵循长期以来的专利法， 在权利要求或说明书中， 与 “包含” 联用时， 无数量词修饰 的名词表示一个或多个， 除非具体指明。
     通过下文的详细描述， 本发明的其它目标、 特征和优点将是很明显的。但是， 应当 理解的是， 仅仅通过举例说明的方式给出了详细描述和具体实例 ( 即本发明的具体实施方 案 )， 因为通过这一详细描述， 在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员 而言将是很明显。 附图说明为了使本发明的上述特征、 优点和目的以及其它方面更加清楚，
     并且使详述便于理解， 附图中举例说明了上文简述的本发明的更具体描述和某些 实施方案。这些附图构成说明书的一部分。但是， 应注意， 附图举例说明了本发明的某些实 施方案， 因此不应视为对其范围的限制。
     图 1A-1H 检测金黄色葡萄球菌形成的脓肿。( 图 1A)Newman 株感染的肾脏的照 片。( 图 1B)srtA 突变体感染的肾脏的照片。( 图 1C)Newman 株感染的肾脏的 H&E 组织切 片。( 图 1D)ΔSrtA 感染的肾脏的组织切片。( 图 1E)Newman 株感染的肾脏的特写。( 图 1F)ΔSrtA 感染的肾脏的特写。( 图 1G)Newman 株脓肿的扫描电子显微镜照片。( 图 1H) ΔSrtA 感染的肾脏的 SEM 照片。
     图 2 鼠肾脓肿筛选。从各个突变株感染的肾脏回收的集落形成单位 (CFU)。
     图 3A-3G 生物膜筛选。( 图 3A) 体外生物膜生长的 96 孔板测定。( 图 3B)Newman 株体外生物膜的 SEM 照片。( 图 3C)ΔsrtA 生物膜。( 图 3D)ΔEmp 生物膜。( 图 3E)ΔIcaA 生物膜。( 图 3F)ΔIsdB 生物膜。( 图 3G)ΔSdrD 生物膜。
     图 4A-4B Emp 毒力。( 图 4A)Newman、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSrtA、 ΔEap/ΔSrtA、 ΔEmp/ ΔSrtA 回收的 CFU。( 图 4B) 各菌株的组织病理学。
     图 5A-5E Eap、 Emp 免疫。( 图 5A)Newman、 ΔSrtA、 ΔIsdB、 ΔIcaA、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSaeR 的 SDS 提取。( 图 5B)Eap(70kDa) 和 Emp(45kDa) 的蛋白质纯化。( 图 5C) 从用 PBS、 Eap 或 Emp 免疫并且用 Newman 株攻击的小鼠中回收的 CFU。( 图 5D) 来自经免疫小鼠的 ELISA IgG 效价。( 图 5E) 来自经免疫小鼠的组织病理学。
     图 6A-6B Ica 毒力。( 图 6A) 从用 Newman、 DIcaA、 DIcaB、 DIcaC、 DIcaD、 DIcaR、 DIca:tet( 整个操纵子缺失 ) 感染的小鼠回收的 CFU。( 图 6B) 来自被感染小鼠的组织病理 学。
     图 7A-7K 静脉内感染小鼠后的葡萄球菌脓肿形成。(A) 用 1×107 集落形成单位 (CFU) 的金黄色葡萄球菌 Newman 株通过眼眶后注射感染 BALB/c 小鼠。以一定的时间间 隔， 通过心脏穿刺检查一组五只小鼠的血液中细菌负荷 ； 将样品等分试样涂覆于琼脂培养
     基上， 对每毫升血液中的 CFU 进行统计。这些结果的平均值以黑色棒表示。(B) 以一定时间 间隔， 测量小鼠 ( 一组十只动物 ) 肾脏中金黄色葡萄球菌 Newman 株向外周器官组织的播散 以及病原体的复制， 对肾脏匀浆并涂覆于琼脂培养基上， 统计 CFU。(C) 以一定时间间隔， 在 受感染肾脏的苏木精 - 伊红染色组织薄切片中测量脓肿病变的直径。(D-K) 以一定时间间 隔， 在苏木精 - 伊红染色组织薄切片中分析受感染肾脏的图像。箭头指向脓肿病变。
     图 8A-8F 葡萄球菌脓肿群落的组织病理学。通过眼眶后注射用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染 BALB/c 小鼠。通过光学显微镜分析感染后第 2 天 (ABC) 和第 5 天 (DEF) 的 受感染肾脏的薄切片苏木精伊红染色的组织， 并获得图像。在第 2 天， 带有偶见的胞内葡萄 球菌 (C 中黄色箭头 ) 的多形核粒细胞 (PMN) 的大量浸润 (A 中蓝色箭头 ) 是感染病变早期 的特征。在第 5 天， 葡萄球菌脓肿群落形成中心病灶 (D， 黑色箭头 )。葡萄球菌由无定形的 嗜伊红假荚膜 ( 黑色框表示 ) 包覆， 周围是死的 PMN 的区域 ( 白色框表示 )、 看上去健康的 PMN 的区域 ( 红色框表示 ) 以及坏死 PMN 的边界 ( 绿色框表示 )， 其通过嗜伊红层与健康肾 组织隔开。
     图 9A-9P 分选酶 A 是宿主组织中脓肿形成和葡萄球菌持续存在所需的。在接种后 第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 的动物尸检过程中取出用金黄色葡萄球菌 Newman 株、 其同基 因型分选酶 A 突变体 (ΔsrtA) 或甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 USA300 感染的 BALB/c 小 鼠 ( 十只动物的组 ) 的肾脏。 肉眼检查肾脏的表面脓肿 (A、 F、 K)， 或者将其固定于福尔马林 中， 包埋， 切成薄片并用苏木精 - 伊红染色。用光学显微镜以 10×(B、 G、 L、 D、 I、 N) 或 100× 放大倍数 (C、 H、 M、 E、 J、 O) 获得组织病理学图像。(P) 在感染后第 5 和 15 天测量肾组织中 葡萄球菌复制和持续存在。 在尸检时从被感染的小鼠中取出肾脏， 将组织匀浆， 并铺板于琼 脂培养基上， 用以检测集落形成和统计数目。
     图 10A-10C 脓肿病变中心的葡萄球菌群落。对来自用金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 野生型 )、 其同基因型分选酶 A 突变株 (ΔsrtA) 或者用 MRSA 株 USA300 感染的小鼠的肾 组织切片， 固定， 脱水并用 80％铂 /20％钯喷射涂覆以进行扫描电子显微镜分析。(A) 在脓 肿的中心野生型病原体组织成紧密相连的菌苔——葡萄球菌脓肿群落 (SAC)， 其包含在无 定形假荚膜 ( 白色箭头 ) 中， 假荚膜将 SAC 与白细胞套隔开。红细胞位于葡萄球菌中 (R)。 (B) 分选酶突变株 (ΔsrtA， 箭头 ) 不形成 SAC， 在健康肾组织中发现分离的葡萄球菌。(C) 与金黄色葡萄球菌 Newman 株类似， MRSA 株 USA300 也形成包含在假荚膜中的 SAC( 白色箭 头 )。
     图 11A-11B 葡萄球菌脓肿群落的形成需要特定表面蛋白质。(A)BALB/c 小鼠 (20 只动物的组 ) 感染后五天， 研究了在表面蛋白质基因中具有 bursa aurealis 插入物的金 黄色葡萄球菌 Newman 变体在匀浆肾组织中的细菌负荷。(B) 通过光学显微镜研究了苏木 精 - 伊红染色的被感染肾脏的薄切片， 显示脓肿病变的 10× 倍放大 ( 白色箭头 )。
     图 12A-12L 葡萄球菌脓肿病变中的 Emp 和 Eap。在接种后第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 取出用在 emp 或 eap 中带有 bursa aurealis 插入物的金黄色葡萄球菌 Newman 变体 感染的 BALB/c 小鼠的肾脏。用苏木精 - 伊红对肾脏染色， 用光学显微镜以 10×(A、 C、 E、 H) 或 100× 放大倍数 (B、 D、 F、 I) 获得组织病理学图像。在为检测多形核白细胞核用 Hoechst 染料 ( 蓝色 ) 染色以及为显示葡萄球菌脓肿群落用 BODIPY- 万古霉素 ( 绿色 ) 染色的肾组 织中， 用兔抗 Emp 或抗 Eap 抗体以及第二 Alexafluor-647 标记的抗体 ( 红色 ) 检测野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株的脓肿病变中 Eap(J) 和 Emp(K) 表达。(L) 在静脉内接种后第 5 天、 15 天和 30 天测量肾组织中葡萄球菌复制和持续存在。从被感染的小鼠 (10 只动物的 组 ) 中取出肾脏， 将组织匀浆， 铺板于琼脂培养基上， 用以集落形成和统计数目。
     图 13A-13E 用 Eap 的主动和被动免疫产生对葡萄球菌攻击的保护。(A) 用纯化的 Eap 或 Emp 来免疫 BALB/c 小鼠或者仅用佐剂模拟处理， 通过 ELISA 分析血清 IgG 效价。(B) 免疫三周后， 通过静脉内接种葡萄球菌来攻击动物。感染后第 5 天， 在尸检时取出肾脏， 分 析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。 (C) 通过亲和色谱纯化针对 Eap 或 Emp 的兔抗体， 通过腹膜内注射被动转移进小鼠体内。24 小时后， 通过 ELISA 分析被动免疫之动物的血清 IgG 效价。(D) 随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击用抗 Eap 或 Emp 的纯化抗体被动免疫 的动物以及模拟免疫的动物， 在第 4 天对细菌负荷进行统计。 (E) 在苏木精 - 伊红染色的组 织薄切片中检测肾脏中脓肿形成。
     图 14 宿主组织中葡萄球菌脓肿形成和持续存在的工作模型。阶段 1- 静脉内接种 后， 金黄色葡萄球菌在血流中存活， 并通过脉管系统散播到外周器官组织。阶段 II- 在肾组 织中， 葡萄球菌吸引多形核白细胞以及其它免疫细胞的大量浸润。阶段 III- 脓肿成熟， 其 中心积累了病原体 ( 葡萄球菌脓肿群落 -SAC)， 由嗜伊红假荚膜所包覆。SAC 周围是死 PMN 的区域、 看上去健康的 PMN 以及最后具有嗜伊红物质边界的死 PMN 的外层区域。阶段 4- 脓 肿成熟， 在器官表面破裂， 从而释放葡萄球菌进入循环， 并引起新一轮的脓肿发生。葡萄球 菌脓肿发生特定阶段所需的细菌包膜组分的基因在这些基因发挥功能的相应阶段下以红 色显示。
     图 15A-15H AdsA 是在血液中存活所必需的细胞壁相关蛋白质。比较 BALB/c 小 鼠 ( 图 15A) 或 Sprague-Dawley 大鼠 ( 图 15D) 血液中野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 (WT) 和同基因型 srtA 变体的存活。数据是来自三个独立分析的平均值以及平均值的标准 差 (±SEM)。为了评估分选酶 A 锚定的细胞壁表面蛋白质对血液中葡萄球菌存活的相对贡 献， 将所示基因中具有转座子插入物的同基因型突变株在来自小鼠 ( 图 15B) 或大鼠 ( 图 15E) 血液中孵育 60 分钟。在来自小鼠 ( 图 15C)、 大鼠 ( 图 15F) 或人志愿者 ( 图 15G) 的 血液中， padsA 的表达挽救了 adsA 突变株的葡萄球菌存活。显示吉姆萨染色的人血液样本 中与吞噬细胞一起的 WT、 adsA 和 adsA(padsA) 葡萄球菌 ( 图 15H)。箭头指示细胞外的和 中性粒细胞相关的金黄色葡萄球菌。数据表示使用两个不同供体的两个独立分析。
     图 16A-16E AdsA 是在体内实现葡萄球菌复制和脓肿形成的毒力因子。 10 只 BALB/ c 小鼠的组被金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16A) 或 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16C) 感染后肾脏中的葡萄球菌负荷 ( 对于 Newman 和 USA300 感染， 均为 P ＜ 0.03， 不成对 t 检验 )。金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16B) 或金黄 色葡萄球菌 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16D) 感染的小鼠尸检后获得的苏木精 - 伊红 染色的肾组织在 10 倍 ( 上图 ) 和 100 倍放大 ( 下图 ) 下的显微镜照片。黑色箭头指示葡萄 球菌的中央浓度和 PMN 浸润。 数据是每种菌株 5 只动物的组的代表性样品和 2 个独立分析。 ( 图 16E) 细菌负荷测定为 30 或 90 分钟时从 BALB/c 小鼠获得的每 500 微升血液的 CFU， 所 述小鼠通过眼眶后注射感染野生型 (WT)、 adsA 或 adsA:padsA 金黄色葡萄球菌 Newman 株。 数据是每个时间点使用 10 只动物的组进行的两个独立分析的代表。使用不成对 t 检验进 行统计学分析。图 17A-17F AdsA 显示 5′ - 核苷酸酶活性并水解 AMP。将来自所示菌株的溶葡 萄菌素细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 测定 [14C] Ado( 腺苷 ) 产生。( 图 17A) 通过磷光成像仪 (PhosphorImager) 捕获 TLC 后的 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17B) 对来自 (a) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对金黄 色葡萄球菌 Newman 株的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行校准， 显示为百分比的量。 数据是三个 独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 WT 比 adsA， P ＜ 0.05)。( 图 17C) 在存在或不 存在纯化的 AdsA1-400(2μM) 以及存在或不存在 5mM 不同金属离子时孵育放射性标记的 [14C] AMP。用磷光成像仪捕获 TLC 后 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17D) 对来自 (c) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对氯化锰 (Mn2+) 存在时的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行 校准， 显示为百分比的量。显示的数据是 2 个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 +2 +2 +2 +2 Zn 比 Mn 和 Cu 比 Mn ， P ＜ 0.05)。( 图 17E) 从重组大肠杆菌纯化 GST-AdsA， 用凝血酶 切割产生 AdsA1-400， 通过考马斯染色的 SDS-PAGE 分析纯化的蛋白。( 图 17F) 在不同浓度腺 苷存在或不存在时， 大鼠血液中 adsA 葡萄球菌的存活。
     图 18A-18D 葡萄球菌 AdsA 在血液中合成腺苷。( 图 18A) 反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 定量腺苷 ( 左图， 100μM 腺苷 ) 并通过基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI-MS， 右图 ) 鉴定其单同位素离子。在没有 ( 图 18B) 或有金黄色葡萄球菌 Newman 野生型 (WT) ( 图 18C) 或其同基因型 adsA 变体 ( 图 18D) 存在下孵育小鼠血液一小时， 除去血浆中的蛋 白质， 过滤并进行 RP-HPLC， 以定量腺苷 ( 左图 )， 以及通过 MALDI-MS 鉴定其单同位素离子 ( 右图 )。 从纯化的腺苷对照外推计算得到的血液中腺苷丰度为 1.1μM(18B， 无葡萄球菌 )、 13.2μM(18C， WT 金黄色葡萄球菌 Newman 株 ) 和 2.1μM(18D， adsA 突变株葡萄球菌 )。
     图 19A-19E 5’ - 核苷酸酶活性增强炭疽芽孢杆菌的存活。 ( 图 19A) 来自炭疽芽孢 杆菌 Sterne 株 (WT， 野生型 ) 或 adsA(basA) 突变株芽孢杆菌的变溶菌素提取物与放射性标 14 记的 [ C]AMP 一起孵育， 通过 TLC 检测腺苷的产生。( 图 19B) 用针对不参与腺苷产生的对 照蛋白 BasA(αBasA) 或 BasC(αBasC) 的抗血清分析来自变溶菌素提取物的蛋白质。( 图 19C) 使用抗 BasA 抗血清 ( 上图 ) 或非反应性血清 (NRS) 以及 Cy3- 标记的第二抗体 ( 红 色 ) 染色的以及 Hoechst 对核酸染色 ( 蓝色 ) 的野生型 (WT) 炭疽芽孢杆菌 Sterne 株和其 同基因型 adsA 突变株的荧光显微照片。( 图 19D) 在 5mM 不同金属离子存在下放射性标记 的 [14C]AMP 与纯化的 BasA(2μM) 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 和磷光成像仪测量 [14C] Ado( 腺苷 ) 的产生。数据代表 3 个独立的分析。( 图 19E) 大鼠血液中野生型和 adsA/basA 突变株炭疽芽孢杆菌 Sterne 株随时间 ( 分钟 ) 的存活， 表示为琼脂板上的菌落形成单位。 数据是两个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。
     图 20 显示 adsA 破坏和 padsA 补偿。为了能够显示 AdsA， 我们使用蛋白 A 缺陷型 (Δspa) 金黄色葡萄球菌菌株 SEJ2， 因为蛋白 A 特异性结合抗体的 Fc 结构域并干扰免疫 印迹分析。通过 SDS-PAGE 分离来自转化有 padsA 的野生型 Δspa SEJ2( 泳道 1)、 Δspa、 adsA:ermB( 泳道 2) 或 Δspa、 adsA:ermB 细胞的细胞壁提取物， 用抗 GST-AdsA1-400 的抗血 清进行免疫印迹分析。* 表示非特异性反应物质。
     图 21 从感染 USA300 的小鼠分离的肾脏的组织学检查。 用金黄色葡萄球菌 USA300 野生型 ( 下图 ) 和 adsA 突变株 ( 上图 ) 感染 4 天的小鼠尸检后获得的肾组织苏木精 - 伊 红染色的 10× 显微照片。黑色箭头表示葡萄球菌的中央浓度和 PMN 浸润。数据是每种细菌菌株 5 只动物的组的代表性样品以及 2 个独立分析。
     发明详述
     生物膜是嵌入到分泌的细胞外基质中的微生物群落 (Hall-Stoodley 等， 2004 ； Kolter 和 Greenberg， 2006)。许多细菌物种能够从漂浮生长转换为形成生物膜， 从而显示 增强的抗生素抗性 (Drenkard 和 Ausubel， 2002)， 逃脱宿主免疫防御 (Singh 等， 2002)， 以及 更有利于在人中建立慢性感染 (Brady 等， 2008)。葡萄球菌物种的生物膜已经与许多疾病 包括心内膜炎 (Xiong 等， 2005)、 骨髓炎 (Brady 等， 2006) 以及多种植入物 ( 包括导尿管、 假体心脏瓣膜和人造关节 ) 介导的感染相关联 (Cassat 等， 2007)。这尤其适于表皮葡萄球 菌， 其是一种非常容易在体外和体内形成生物膜的机会致病菌 (Mack 等， 1996)。对于表皮 葡萄球菌来说， 形成生物膜的能力与毒力之间有明确的相关性， 该相关性此前未在金黄色 葡萄球菌中证实 (Cassat 等， 2007)。
     金黄色葡萄球菌是人皮肤和鼻孔的共生生物， 其是导致血流和皮肤 / 软组织感染 的主要原因 (Klevens 等， 2007)。葡萄球菌感染的致病是从细菌通过外伤、 手术创口或医疗 器械侵入皮肤或血流开始 (Lowy， 1998)。通过噬菌细胞的杀伤， 一些葡萄球菌从血流中被 清除， 但是逃脱了免疫防御的葡萄球菌将感染接种到器官组织， 并诱导促炎症应答， 其由来 自巨噬细胞、 中性粒细胞及其它吞噬细胞的细胞因子和趋化因子释放所介导 (Lowy， 1998)。 所导致的免疫细胞侵入感染部位伴随着中央液化性坏死以及形成外周纤维蛋白壁， 以试图 阻止微生物散布并允许除去坏死的组织碎片 (Lowy， 1998)。可通过显微镜观察到如下形式 的病变 ： 含有坏死组织、 白细胞和细菌中央病灶的多细胞区域。 器官脓肿在感染两天内发生 ( 未公开数据 )， 其代表了葡萄球菌疾病的标志。 I. 葡萄球菌抗原
     金黄色葡萄球菌 Ess 途径可视为配备了专门的转运组件 (Ess)、 辅助因子 (Esa) 和 同源分泌基质 (Esx) 的分泌模块。EssA、 EssB 和 EssC 是 EsxA 和 EsxB 分泌所必需的。因 为预计 EssA、 EssB 和 EssC 是跨膜蛋白质， 所以设想这些蛋白质形成分泌装置。ess 基因簇 中的某些蛋白质可主动转运分泌的底物 ( 作为马达 )， 而另一些可调节转运 ( 调节剂 )。调 节可通过分泌型多肽的转录或翻译后机制、 将特异性底物分选到限定的位置 ( 例如细胞外 基质或宿主细胞 )， 或者感染过程中分泌事件的时间安排来实现， 但不一定限于此。对于这 一点， 不清楚是否所有分泌的 Esx 蛋白质均起到毒素的作用或者间接导致发病。
     葡萄球菌依赖表面蛋白质介导的宿主细胞粘附或者组织侵入来作为逃脱免疫防 御的策略。此外， 在感染期间， 金黄色葡萄球菌利用表面蛋白质来螯合来自宿主的铁。大多 数参与葡萄球菌致病的表面蛋白质带有 C 端分选信号， 即它们通过分选酶与细胞壁包膜共 价连接。此外， 缺少表面蛋白质锚定所需基因 ( 即分选酶 A 和 B) 的葡萄球菌菌株在几种不 同的小鼠疾病模型中显示出毒力的显著缺陷。因此， 表面蛋白质抗原代表了有效的疫苗靶 标， 因为对应的基因是葡萄球菌疾病发生必需的， 并且可在本发明的多个实施方案中利用。 分选酶超家族是革兰氏阳性菌转肽酶， 其负责将表面蛋白质毒力因子锚定到肽聚糖细胞壁 层。已在金黄色葡萄球菌中鉴定出两种分选酶同工型—— SrtA 和 SrtB。这些酶已显示识 别底物蛋白中的 LPXTG 基序。SrtB 同工型似乎在血红素铁获得和铁动态平衡中非常重要， 而 SrtA 同工型则在革兰氏阳性细菌的致病中起关键作用 ( 其通过调节细菌粘附宿主组织 的能力而起作用， 所述粘附是通过粘附物和其它蛋白质与细胞壁肽聚糖的共价锚定来实现
     的 )。 本发明的实施方案包括但不限于涉及 Emp 和 / 或 Eap 的组合物和方法。在某些 实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡萄球菌蛋白 ( 例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 蛋白 ) 联用。Emp(SEQ ID NO ： 2) 或 Eap(SEQ ID NO ： 4) 是葡萄球菌多肽。 其它 Emp 和 / 或 Eap 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于登记号 ( 对于 Emp) YP_185731、 NP_371337、 NP_645584、 CAB75985、 YP_416239、 YP_040269 和 NM0758 以及 ( 对 于 Eap)YP_500650、 CAB94853、 YP_186825、 CAB51807、 NP_646697、 YP_041404、 NM1872， 其每 个均如同在本申请的优先权日通过引用并入本文。其它的葡萄球菌抗原包括 52kDa 玻连蛋 白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原 结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合 蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
    在哺乳动物中， 腺苷在调节固有和获得性免疫应答中起到关键性作用 (Thiel 等， 2003)。强的或过度的宿主炎性应答 ( 例如响应于细菌感染 ) 加剧了入侵病原体所致的组 织损伤 (Thiel 等， 2003)。因此， 成功的微生物免疫清除包括平衡促炎和抗炎介导物。细胞 因子 IL-4、 IL-10、 IL-13 和 TGF-β 限制了过度的炎症， 但是只有腺苷能够完全阻抑免疫应 答 (Nemeth 等， 2006)。腺苷的免疫调节特性由四个跨膜腺苷受体所介导—— A1、 A2A、 A2B 和 A3(Hasko 和 Pacher， 2008)。 T 淋巴细胞表达高亲和力 A2A 受体以及低亲和力 A2B 受体 (Thiel 等， 2003)。根据其活性状态， 巨噬细胞和中性粒细胞表达所有四种腺苷受体， 而 B 细胞仅 具有 A2A(Thiel 等， 2003)。A2A 的参与在单核细胞 (Khoa 等， 2001) 和树突状细胞 (Panther 等， 2001) 中抑制 IL-12 产生， 增加 IL-10， 以及在中性粒细胞中减少细胞毒性作用和趋化因 子产生 (McColl 等， 2006 ； Cronstein 等， 1986)。炎症、 缺氧、 器官损伤和外伤性休克部位产 生腺苷是先后由两种酶所介导的。胞外 -ATP 二磷酸水解酶 (CD39) 将循环中的三磷酸腺苷 (ATP) 和二磷酸腺苷 (ADP) 转化为 5′ - 一磷酸腺苷 (AMP)(Eltzshig 等， 2003)。内皮细胞 (Deussen 等， 1993) 和 T 细胞亚群 (Thompson 等， 1989 ； Thompson 等， 1987 ； Yang 等， 2005) 表面上表达的 CD73 随后将 5′ -AMP 转化为腺苷 (Zimmermann， 1992)。
     尽管细胞外腺苷对炎症抑制来说是必要的， 但是过量的腺苷积累也是有害的。 例如， 具有腺苷脱氨酶 (ADA) 缺陷的患者中的情形， 所述 ADA 是将腺苷转化为肌苷的 酶 (Giblett 等， 1972)。ADA 缺 陷 导 致 严 重 复 合 免 疫 缺 陷 综 合 征 (severe compromised immunodeficiency syndrome， SCID)， 其具有削弱的细胞免疫和显著减少的免疫球蛋白产 生 (Buckley 等， 1997)。因为细胞外腺苷的调节在维持免疫动态平衡中是关键的， 所以对腺 苷水平的扰动很可能影响感染期间的宿主免疫应答。本发明人在本文中描述了细菌 ( 例如 金黄色葡萄球菌和炭疽芽胞杆菌 ) 利用腺苷合成来逃脱宿主免疫应答， 并提供了利用这一 信息治疗和 / 或预防细菌感染 ( 例如菌血症 ) 的方法和组合物。
     本发明的某些实施方案涉及诱导免疫应答， 提供抗 AdsA 或抑制 AdsA 的抗体。 AdsA(SEQ ID NO ： 55) 是葡萄球菌多肽。其它 AdsA 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261 、 ref|NP_370547 、 ref|YP_042156 、 ref|NP_644838 、 ref|YP_415541 、 dbj|BAA82250) ； 溶 血 葡 萄 球 菌 (ref|YP_254367) ； 血 链 球 菌 (ref|YP_001035187) ； 格氏 链 球 菌 (ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ；变 形 链 球 菌 (ref|NP_721592) ；嗜 热 链 球 菌 (ref|YP_141373 、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP _001321391) ； 肉 毒 梭 菌 (ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ； 类芽孢杆菌属 (ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克劳氏芽孢杆 菌 (ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解纤维梭菌 (ref|ZP_01574143) ； 以及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个如同在 本申请优先权日通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽可具有与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包 括其间所有值和范围。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽、 结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： Emp 和 / 或 Eap 及其它 葡萄球菌抗原例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽和 / 或结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： AdsA 及其它葡萄 球菌抗原例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     这些多肽包含来自葡萄球菌属细菌的蛋白质的氨基酸序列。 所述序列可来自特定 的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 也可以来自特定的菌株 ( 例如 Newman 株 )。
     分选酶底物多肽包括但不限于下列氨基酸序列 ： 来自葡萄球菌属细菌的 SdrC、 SdrD、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC 或 SasF 蛋 白 质。 分 选 酶 底 物 多 肽序列可来自特定的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 可来自特定的菌株 ( 例 如 Newman 株 )。在某些实施方案中， SdrD 序列来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373773.1(gi|15926240) 获得， 其通过引用并入本文。在另一些实施方案中， SdrE 序列 来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373774.1(gi|15926241) 获得， 其通过引用并入 本文。在另一些实施方案中， IsdA 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1130( 其与 Newman 株具有 相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371654.1(gi|15924120) 获得， 其通过引用 并入本文。在另一些实施方案中， IsdB 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1129( 其与 Newman 株 具有相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371653.1(gi|15924119) 获得， 其通过 引用并入本文。在另一些实施方案中， 可使用通过 Ess 途径转运或通过分选酶加工的其它 多肽， 本领域技术人员可使用数据库和国际互联网可获取的资源来确定其序列。
     可通过分析细菌基因组的数据库提交来鉴定可用于本发明中的多种蛋白质实例， 其包括但不限于登录号 NC_002951(GI ： 57650036 和 GenBank CP000046)、 NC_002758(GI ： 57634611 和 GenBank BA000017)、 NC_002745(GI ： 29165615 和 GenBank BA000018)、 NC_003923(GI ： 21281729 和 GenBank BA000033)、 NC_002952(GI ： 49482253 和 GenBank BX571856)、 NC_002953(GI ： 49484912 和 GenBank BX571857)、 NC_007793(GI ： 87125858 和 GenBank CP000255)、 NC_007795(GI ： 87201381 和 GenBank CP000253)， 其每个均通过引用并 入本文。
     本文所用的 “蛋白质” 或 “多肽” 是指含有至少十个氨基酸残基的分子。在一些实 施方案中， 使用蛋白质或多肽的野生型形式， 但是在本发明的许多实施方案中， 使用经修饰 的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可互换使用。 “经修饰的蛋白质” 或 “经修饰的 多肽” 是指其化学结构 ( 特别是其氨基酸序列 ) 与野生型蛋白质或多肽相比发生改变的蛋 白质或多肽。在一些实施方案中， 经修饰的蛋白质或多肽具有至少一种改变的活性或功能 ( 认为蛋白质或多肽可具有多种活性或功能 )。本发明特别涉及的是， 可针对某一活性或功 能来改变被修饰的蛋白质或多肽， 而在其它方面保留野生型活性或功能 ( 如免疫原性 )。
     在某些实施方案中， 蛋白质或多肽 ( 野生型或经修饰的 ) 的大小可以包括但不局 限于 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 450、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 625、 650、 675、 700、 725、 750、 775、 800、 825、 850、 875、 900、 925、 950、 975、 1000、 1100、 1200、 1300、 1400、 1500、 1750、 2000、 2250、 2500 个氨基分子或更多、 以及其中可得出的任何范围， 或者本文所述或所引用的对应氨基酸序列的衍生物。本发明还 涉及的是， 可通过截短 ( 使其短于相应的野生型形式 ) 来突变多肽， 也可通过融合或缀合具 有特定功能 ( 例如用于靶向或定位、 用于增强免疫原性、 用于纯化目的等 ) 的异源蛋白质序 列来改变多肽。
     本文使用的 “氨基分子” 是指本领域所知的任何氨基酸、 氨基酸衍生物或氨基酸模 拟物。 在某些实施方案中， 蛋白质性分子的残基是连续的， 没有任何非氨基分子间插氨基分 子残基的序列。在另一些实施方案中， 所述序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在一 些具体实施方案中， 蛋白质性分子的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分所间插。
     因此， 术语 “蛋白质性组合物” 包括氨基分子序列， 所述序列含有天然合成蛋白质 中 20 种常见氨基酸的至少一种或者至少一种经修饰的或非常见氨基酸。
     可采用本领域技术人员所知的任何技术来制造蛋白质性组合物， 所述技术包括 (i) 通过标准分子生物学技术表达蛋白质、 多肽或肽， (ii) 从天然来源中分离蛋白质性化 合物， 或 (iii) 化学合成蛋白质性材料。先前已经公开了多种基因的核苷酸及蛋白质、 多肽 和肽的序列， 还可以在公认的计算机化数据库中找到上述序列。其中一个数据库是国立生 物技术信息中心的 Genbank 和 GenPept 数据库 ( 网址为 ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文 公开的或为本领域普通技术人员所知的技术来扩增和 / 或表达这些基因的编码区。
     Emp 或 Eap 或 AdsA 以及下列本发明其它多肽的氨基酸序列变体可以是替换、 插入 或缺失变体 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。与野生型相比， 本发明 多肽的修饰可影响所述多肽的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500 或更多非连续或连续氨基 酸。
     本发明的抗原可包含本文所述抗原 (AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白 ) 的区段或片段， 其包含所述抗原的第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多 ( 包含其间所有值和范围 ) 位氨基酸至第 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多位氨基酸 ( 包含其间所有值和范 围 )， 包括其中所有区段和片段。 本发明的某些方面涉及结合上文所述一个或多个片段或区 段的抗体。
     缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质中的一个或多个残基。可以缺失单个残 基， 或者可以缺失多个连续的氨基酸。可将终止密码子 ( 通过替换或插入 ) 引入编码的核 酸序列中， 以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽非末端位点处加入物质。这 可包括插入一个或多个残基。还可产生末端添加， 称作 “融合蛋白” 。
     替换变体通常包含在蛋白质一个或多个位点处将一种氨基酸替换为另一种， 并可 被设计成调节多肽的一个或多个特性， 同时丢失或不丢失其它功能或特性。替换可以是保 守性的， 即将一种氨基酸替换成形状和电荷相似的氨基酸。 保守性替换为本领域所熟知， 包 括例如以下改变 ： 丙氨酸变为丝氨酸 ； 精氨酸变为赖氨酸 ； 天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨 酸； 天冬氨酸变为谷氨酸 ； 半胱氨酸变为丝氨酸 ； 谷氨酰胺变为天冬酰胺 ； 谷氨酸变为天冬 氨酸 ； 甘氨酸变为脯氨酸 ； 组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺 ； 异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨 酸； 亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸 ； 赖氨酸变为精氨酸 ； 甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸 ； 苯丙氨酸变为酪氨酸、 亮氨酸或甲硫氨酸 ； 丝氨酸变为苏氨酸 ； 苏氨酸变为丝氨酸 ； 色氨酸 变为酪氨酸 ； 酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸 ； 缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者， 替换可 以是非保守的， 从而影响多肽的功能或活性。非保守性改变通常包括将残基替换成化学性 质上不相似的残基， 如极性或带电氨基酸替换非极性或不带电氨基酸， 反之亦然。
     表 1. 金黄色葡萄球菌菌株的示例性表面蛋白质。
    39SAV# SpA FnBPA FnBPB ClfA ClfB Can SdrC SdrD SdrE Pls SasA SasB SasC SasD 241 2186 686 2481 213 241 2275 2271 2271 2481 2186 241 1141 1141 1141 1347 1385 1385 955 953 953 947 1315 1166 1183 907 877 877 913 873 1183 906 1137 1351 2222 2189 221 946 935 989 933 1029 943 961 961 965 1015 1038 1038 1015 957 928 905 1183 492 450 450 516 492SA#表面MW2Mu50N315NewmanMRSA252*MSSA476*SAV0111SA0107102333540 A CN 102333554SAV2503SA2291SAV2502SA2290SAV0811SA0742SAV2630SA2423Npnp说SAV0561SA0519957 1365 1141 2275 685 2186 241明40SAV0562SA0520书SAV0563SA0521NpnpSAV2654SA2447SAV2160SA1964SA1577SAV0134SA012929/86 页102333540 A CN 102333554说明书30/86 页
    SAV1130 41SA0977SasE/IsdA350350350354350
     SasF SasG SasH SasI SasJ/IsdB SasK SasL IsdC 227 227 232 227 198 211 211 645 645 645 895 891 891 772 772 1371 525 927 786 534 652 227 635 635 635 627 635 1371 786 895 645 197 227102333540 A CN 102333554SAV2646SA2439SAV2496SAV0023SA0022说SAV1731SA1552明本发明的蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者， 可以从细菌中分离出非重组 或重组的蛋白质。 还考虑可将含有上述变体的细菌应用于本发明的组合物和方法中。 因此， 不需要分离蛋白质。42SAV1129SA0976书SA2381NpSAV1131SA097831/86 页102333540 A CN 102333554
    说明书32/86 页本文中使用的术语 “功能等价密码子” 是指编码同一氨基酸的密码子 ( 如精氨酸 或丝氨酸的六个密码子 )， 也指编码生物学上等价之氨基酸的密码子 ( 见下面的表 2)。
     表 2 密码子表
    还应当理解， 氨基酸和核酸序列可包含额外的残基， 如分别为额外的 N 端或 C 端氨 基酸、 或 5′或 3′序列， 但仍然基本如本文公开的序列之一所示， 只要该序列满足上文设 定的标准 ( 包括保持与蛋白质表达相关的蛋白质生物活性 ) 即可。末端序列的添加特别适 用于核酸序列 ( 例如， 其可包含位于编码区 5′或 3′部分之侧翼的不同非编码序列 )。
     下文是基于改变蛋白质的氨基酸来产生等价或改进的第二代分子的讨论。例如， 蛋白质结构中的某些氨基酸可以替换为其它氨基酸， 而没有相互结合能力 ( 与例如抗体的 抗原结合区或底物分子上的结合位点之结构结合 ) 的明显损失。由于蛋白质的相互作用能 力和性质决定了蛋白质的生物学功能活性， 因此可在蛋白质序列 ( 及其 DNA 编码序列 ) 中 进行某些氨基酸替换， 而仍产生具有相似特性的蛋白质。因而， 本发明人考虑可在基因的 DNA 序列中进行多种改变， 而不导致其生物学应用和活性 ( 例如免疫原性 ) 的明显损失。
     进行这种改变时， 可考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质 以相互作用生物学功能中的重要性已为本领域所广泛了解 (Kyte 和 Doolittle、 1982)。为 人们所接受的是， 氨基酸的相对亲水性决定了产物蛋白质的二级结构， 其二级结构进而决 定了该蛋白质与其它分子 ( 例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等 ) 的相互作用。
     还为本领域所了解的是， 可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的替换。通过引 用并入本文的美国专利 4,554,101 陈述了蛋白质的最大局部平均亲水性 ( 由其邻近氨基酸 亲水性所决定 ) 与蛋白质的生物学特性相关。应理解的是， 氨基酸可以被替换为具有相似 亲水性值的其它氨基酸， 而仍产生生物学等价的或免疫学等价的蛋白质。
     如上所述， 氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性， 例如它们的
     疏水性、 亲水性、 电荷、 大小等。将前述多种特征考虑在内的示例性替换是众所周知的， 包 括： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 以及缬氨 酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
     本发明涉及的是， 在每 ml 本发明组合物中有约 0.001mg 至约 10mg 的总多肽、 肽和 / 或蛋白质。因此， 组合物中的蛋白质浓度可以是约、 至少约或至多约 0.001、 0.010、 0.050、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 9.5、 10.0μg 或 mg/ml 或更高 ( 或其中可得出的任何范 围 )。在其中， 约、 至少约或至多约 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100％可以是 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 并且可与本文所述其它多肽序列联用。
     本发明还公开了葡萄球菌抗原的组合， 当组合时， 其导致产生有效治疗或预防葡 萄球菌感染的免疫原性组合物。葡萄球菌感染经历几个不同阶段。例如， 葡萄球菌的生活 周期包含共生定殖， 通过进入邻近组织或血流起始感染， 在血液中厌氧性扩增， 金黄色葡萄 球菌毒力决定簇与宿主防御机制相互作用， 以及诱导并发症包括心内膜炎、 转移性脓肿形 成和败血症综合征。细菌表面上的不同分子参与了感染周期的不同阶段。某些抗原的组合 可引发免疫应答， 其针对葡萄球菌感染的多个阶段进行保护。可在动物模型测定中和 / 或 使用调理吞噬测定来测量免疫应答的效力。
     多肽和多肽产生
     本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、 肽和蛋白质及其免疫原性片段。 例如， 对特定多肽进行测定或用于引发免疫应答。 在一些具体实施方案中， 也可根据常规技 术在溶液中或在固体支持物上合成本发明蛋白质的全部或部分。 多种自动合成仪是可购得 的， 且可以根据已知的方案加以使用。参见例如 Stewart 和 Young(1984)、 Tam 等 (1983)、 Merrifield(1986)、 Barany 和 Merrifield(1979)， 其均通过引用并入本文。或者， 可使用重 组 DNA 技术， 其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体中， 转化或转染入合适的宿 主细胞并在适于表达的条件下培养细胞。
     本发明的一个实施方案包括利用转移至细胞 ( 包括微生物 ) 中的基因来产生和 / 或呈现蛋白质。可将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中， 接着在合适条件下培养 细胞。 可使用编码几乎任何多肽的核酸。 本文讨论了重组表达载体的产生及其包含的元件。 或者， 要生产的蛋白质可以是由用于蛋白质生产的细胞所正常合成的内源蛋白质。
     本发明的另一实施方案使用了自体 B 淋巴细胞细胞系， 所述细胞系转染有表达免 疫原产物 ( 更具体地为具有免疫原活性的蛋白质 ) 的病毒载体。哺乳动物宿主细胞系的其 它实例包括但不局限于 Vero 和 HeLa 细胞、 其它 B 和 T 细胞系 ( 如 CEM、 721.221、 H9、 Jurkat、 Raji)、 以及中国仓鼠卵巢细胞系、 W138、 BHK、 COS-7、 293、 HepG2、 3T3、 RIN 和 MDCK 细胞。此 外， 可选择调节插入序列表达的或以期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质 产物的这种修饰 ( 例如糖基化 ) 和加工 ( 例如切割 ) 可以对蛋白质功能是重要的。不同宿 主细胞在蛋白质的翻译后加工和修饰方面具有特征性的和特定的机制。 可选择合适的细胞 系或宿主系统来确保所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。可使用多种选择系统， 包括但不局限于分别位于 tk、 hgprt 或 aprt 细胞中的 HSV 胸苷激酶、 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、 腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外， 还可使 用抗代谢物抗性作为选择基础 ： dhfr 赋予对甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性 ； gpt 赋予对 霉酚酸的抗性 ； neo 赋予对氨基糖苷 G418 的抗性 ； hygro 赋予对潮霉素的抗性。
     动物细胞可以两种方式在体外增殖 ： 非锚着依赖性细胞， 其在整个培养物体积中 悬浮培养， 或者锚着依赖性细胞， 其需要附着在固体基底上进行增殖 ( 即单层类型的细胞 培养 )。
     来源于连续的已建立细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养物是大规模生产细胞和 细胞产物的最常用方法。 但是， 悬浮培养的细胞具有局限性， 例如致瘤潜力和低于附着细胞 的蛋白质产量。
     当本文具体提及蛋白质时， 优选表示天然或重组蛋白质， 或者任选地已去除任何 信号序列的蛋白质。所述蛋白质可直接从葡萄球菌菌株分离出来或者通过重组 DNA 技术产 生。蛋白质的免疫原性片段可并入本发明的免疫原性组合物中。它们是包含连续取自蛋白 质氨基酸序列的至少 10 个氨基酸、 20 个氨基酸、 30 个氨基酸、 40 个氨基酸、 50 个氨基酸或 100 个氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 的片段。另外， 此类免疫原性片段与针对葡萄球 菌蛋白产生的抗体或者与用葡萄球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体具有免疫反应性。 免疫 原性片段还包括当以有效剂量施用时 ( 单独地或作为结合运载体的半抗原 ) 引发针对葡萄 球菌感染之保护性免疫应答的片段， 在某些方面， 其具有针对金黄色葡萄球菌和 / 或表皮 葡萄球菌感染的保护作用。这些免疫原性片段可包含例如缺少 N 端前导序列和 / 或跨膜结 构域和 / 或 C 端锚定结构域的蛋白质。在一个优选方面中， 本发明的免疫原性片段包含与 片段序列长度上所选序列有至少 85％同一性、 至少 90％同一性、 至少 95％同一性或者至少 97-99％同一性 ( 包括其间所有值和范围 ) 的蛋白质的基本上全部的细胞外结构域。
     本发明的免疫原性组合物还包含由葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白免疫原性片段 组成的融合蛋白。这些融合蛋白可以通过重组产生， 可包含至少 2、 3、 4、 5 或 6 种葡萄球菌 蛋白的一部分。或者， 融合蛋白可包含至少 1、 2、 3、 4 或 5 种葡萄球菌蛋白的多个部分。它 们可在同一蛋白质中组合不同的葡萄球菌蛋白和 / 或多个相同的蛋白质或蛋白质片段或 者其免疫原性片段。 或者， 本发明还包括葡萄球菌蛋白或其免疫原性片段的各个融合蛋白， 所述融合蛋白具有异源序列， 例如提供 T- 细胞表位或纯化标签 ( 例如 ： β- 半乳糖苷酶、 谷 胱甘肽 -S- 转移酶、 绿色荧光蛋白 (GFP))、 表位标签 ( 例如 FLAG、 myc 标签、 多组氨酸 ) 或 者病毒表面蛋白质 ( 例如流感病毒血细胞凝集素 ) 或细菌蛋白质 ( 例如破伤风类毒素、 白 喉类毒素和 CRM197)。
     治疗方法
     使用疫苗进行主动免疫和使用免疫球蛋白进行被动免疫是替代经典小分子 ( 例 如抗生素 ) 治疗的具有前景的方案。曾经造成大范围疾病、 残疾和死亡的一些细菌性疾病 如今可以通过使用疫苗进行预防。疫苗是基于削弱 ( 减毒 ) 或死亡的细菌、 细菌表面的组 分或失活的毒素。疫苗产生的免疫应答主要涉及免疫原性结构 ； 由免疫系统主动加工的细 菌上有限数目的蛋白质或糖结构。
     本发明的方法包括治疗由细菌性病原体 ( 例如葡萄球菌或芽胞杆菌 ) 引起或与其 有关的疾病或病症。免疫原性多肽和 / 或与其结合的抗体可用于在感染细菌或怀疑暴露于细菌的人中诱导或提供治疗性应答。 该方法可用于经测试为暴露于葡萄球菌或芽胞杆菌呈 阳性的个体， 或者用于根据可能的暴露被认定为具有感染风险的个体。
     本发明涵盖了葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的治疗方法。特别 地， 本发明涵盖了细菌感染 ( 特别是菌血症 ) 的治疗方法。本发明的治疗性组合物和疫苗 对于非紧急手术 (elective surgery) 来说是特别有利的。这些患者预先知晓手术的日期， 因此可预先进行接种或治疗。本发明的免疫原性组合物和疫苗对于接种医疗工作者、 第一 急救者 (first responder) 等也是有利的。
     在一些实施方案中， 所述治疗在佐剂或运载体或其它葡萄球菌抗原存在下施用。 此外， 在某些实例中， 治疗包括施用常用于抗细菌感染的其它药剂， 例如一种或多种抗生 素。
     A. 疫苗
     本发明包括预防或减轻葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的方法。 因此， 本发明涉及在主动和被动免疫的实施方案中使用的疫苗。被认为适合用作疫苗的免 疫原性组合物可以从免疫原性 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽 ( 例如全长的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原或其免疫原性片段 ) 制备。在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与其 它分泌型毒力蛋白、 表面蛋白或其免疫原性片段联合使用， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白或者本领域技术人员已知的其它葡萄球菌抗原、 肽或蛋白质 )。优选地， 将抗原性 材料充分透析以去除不需要的小分子量分子， 和 / 或冻干以更容易配制进期望的运载体。
     对基于蛋白质 / 肽的疫苗而言其它可行且重要的替代方案包括引入编码抗原的 核酸作为 DNA 疫苗。就这一点而言， 近期的报道描述了构建重组痘苗病毒， 并成功使用此类 构建体免疫小鼠， 用于引发保护性免疫应答， 所述重组痘苗病毒表达 10 个连续最小 CTL 表 位 (Thomson， 1996) 或者来自几种微生物的 B 细胞、 细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 和 T 辅助细胞 (Th) 表位的组合 (An， 1997)。因此， 对成功利用肽、 肽冲击 (peptide-pulsed) 抗原呈递细 胞 (APC) 和编码肽之构建体在体内有效引发保护性免疫应答已在文献中有充分的证据。美 国专利 5,958,895 和 5,620,896 中示例了使用核酸序列作为疫苗， 其每个通过引用以整体 并入本文。
     包含多肽或肽序列作为活性成分的疫苗的制备一般为本领域所充分理解， 如美国 专利 4,608,251、 4,601,903、 4,599,231、 4,599,230、 4,596,792 和 4,578,770 所示例， 所述 专利都通过引用并入本文。 这种疫苗通常以注射剂 ( 作为液体溶液或混悬液 ) 的形式制备 ； 还可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂也可以被乳化。活性免疫原性成分通常与可药用并与活性成分相容的赋形剂相混合。合适的赋形剂为例如水、 盐 溶液、 右旋糖、 甘油、 乙醇等， 及其组合。此外， 如有需要， 疫苗可含有一定量的辅助性物质， 如润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲剂或者增强疫苗效力的佐剂。 在一些具体实施方案中， 疫苗与多 种物质的组合一起进行配制， 如通过引用并入本文的美国专利 6,793,923 和 6,733,754 中 所述的。
     疫苗可常规地通过吸入和 / 或胃肠外注射 ( 例如皮下注射或肌内注射 ) 来施用。 适用于其它施用方式的另外制剂包括栓剂， 以及在某些情况下的口服制剂。 对于栓剂， 传统 粘合剂和运载体可包括例如聚亚烷基二醇 (polyalkalene glycol) 或甘油三脂 ； 这些栓剂 可由含有活性成分 ( 范围为约 0.5％至约 10％， 优选约 1％至约 2％ ) 的混合物形成。口服 制剂包含常用的赋形剂， 例如药用级的甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 纤维素、 碳酸 镁等。 这些组合物采用溶液、 混悬液、 片剂、 丸剂、 胶囊、 持续释放制剂或粉末剂的形式， 包含 约 10％至约 95％ ( 优选约 25％至约 70％ ) 的活性成分。
     多肽、 肽和编码肽之 DNA 构建体可以配制成中性或盐形式的疫苗。可药用的盐包 括酸加成盐 ( 由肽的游离氨基形成 ) 和与无机酸 ( 例如盐酸或磷酸 ) 或有机酸 ( 例如乙 酸、 草酸、 酒石酸、 杏仁酸等 ) 形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱 ( 例如氢氧 化钠、 氢氧化钾、 氢氧化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 和有机碱 ( 例如异丙胺、 三甲胺、 2- 乙胺 基乙醇、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     疫苗一般以与药剂剂型相匹配的方式、 以能够有效治疗和产生免疫的量来施用。 施用量取决于待治疗的对象， 包括个体免疫系统合成抗体的能力和所需的保护程度。需要 施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。但是， 合适的剂量范围为每次免疫几百微克 活性成分的数量级。初次施用和加强免疫的合适方案也是可变的， 但一般为初次施用之后 再进行后续接种或其它施用。
     应用的方式可以是多种多样的。疫苗施用的任何常规方法都是可应用的。这些方 法应包括利用生理学可接受的固体基质口服应用， 或者作为生理学可接受的分散体系以肠 胃外、 通过注射等来施用。 疫苗的剂量取决于施用途径， 且根据对象的体形和健康状况而变 化。
     在许多情形中， 需要多次施用疫苗， 通常至多、 至少或不超过六次疫苗接种， 更通 常四次疫苗接种， 通常一次或多次、 经常至少约三次疫苗接种。 疫苗接种一般间隔 1、 2、 3、 4、 5、 6 至 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 至 12 周， 包括其间所有值和范围， 更通常为间隔 3 至 5 周。通常， 间隔 1 ～ 5 年 ( 通常为 3 年 ) 进行定期加强免疫可维持保护性抗体的水平。在免疫过程之 后可测定针对该抗原的抗体， 如上文所述， 美国专利 3,791,932、 4,174,384 和 3,949,064 是 这些类型测定的示例。
     用于免疫之肽的使用通常需要所述肽与免疫原性运载体蛋白 ( 例如乙型肝炎表 面抗原、 匙孔槭血蓝蛋白或牛血清白蛋白 ) 或佐剂相缀合。实施此缀合的方法是本领域公 知的。
     1. 运载体
     给定的组合物的免疫原性可能有所不同。因此往往有必要加强宿主的免疫系统， 这可通过将肽或多肽偶联至运载体来实现。运载体包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白 (KLH) 和 牛血清白蛋白 (BSA)。其它白蛋白如卵白蛋白、 小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作运载体。 将多肽缀合到运载体蛋白的手段为本领域所熟知， 包括戊二醛、 间马来酰亚胺苯甲 酰 -N- 羟基琥珀酰亚胺酯、 碳二亚胺和双重氮联苯胺。
     2. 佐剂
     可通过使用免疫应答的非特异性刺激剂 ( 称为佐剂 ) 来增强多肽或肽组合物的免 疫原性。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物， 如细胞因子、 毒素或合成组合物。
     多种佐剂可用于增强抗体针对 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 肽或本文所述任何其它抗原 的应答。在另一些方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 肽 或蛋白质联用。佐剂可 (1) 滞留体内的抗原使其缓慢释放 ； (2) 将参与免疫应答的细胞吸 引到施用部位 ； (3) 诱导免疫系统细胞的增殖或活化 ； 或 (4) 促进抗原在对象整个身体中的 扩散。
     佐剂包括但不局限于水包油乳剂、 油包水乳剂、 矿物盐、 多核苷酸和天然物质。可 使用的具体佐剂包括 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-7、 IL-12、 γ- 干扰素、 GMCSP、 BCG、 铝盐 ( 例如氢 氧化铝或其它铝化合物 )、 MDP 化合物 ( 如 thur-MDP 和 nor-MDP)、 CGP(MTP-PE)、 脂质 A 和 单磷酰脂质 A(MPL)。也可使用 RIBI， 其包含在 2％角鲨烯 / 吐温 80 乳剂中的三种从细菌中 提取的组分——MPL、 海藻糖二分枝酸酯 (trehalose dimycolate， TDM) 和细胞壁骨架 (cell wall skeleton， CWS)。还可使用 MHC 抗原。其它佐剂或方法示例于美国专利 6,814,971、 5,084,269、 6,656,462， 其均通过引用并入本文。
     对疫苗实现佐剂效应的多种方法包括使用制剂如氢氧化铝或磷酸铝 ( 明矾 )， 通常以磷酸盐缓冲液中约 0.05 ％至约 0.1 ％的溶液使用， 其与以约 0.25 ％溶液使用的合 成多聚糖 (Carbopol ) 混合， 通过以约 70 ℃至约 101 ℃的温度分别热处理 30 秒至 2 分 钟来聚集疫苗中的蛋白质。还可采用以下方法来产生佐剂效应 ： 通过用胃蛋白酶处理的 (Fab) 白蛋白抗体的再次活化进行聚集 ； 与革兰氏阴性菌的细菌细胞 ( 例如短小棒状杆 菌 (C.parvum))、 内毒素或脂多糖组分混合 ； 在生理学可接受的油介质 ( 例如二缩甘露醇 一油酸 (Aracel A)) 中乳化 ； 或用作为封闭替代物 (block substitute) 的 20％全氟化碳 (Fluosol-DA ) 溶液乳化。
     常见佐剂包括弗氏完全佐剂 ( 包含灭活的结核分枝杆菌的免疫应答非特异性刺 激物 )、 弗氏不完全佐剂和氢氧化铝。
     在一些方面中， 优选地选择佐剂为 Th1 或 Th2 型应答的优先诱导物。高水平 Th1 型细胞因子倾向于偏好诱导针对给定抗原的细胞介导之免疫应答， 而高水平 Th2 型细胞因 子则倾向于偏好诱导针对抗原的体液免疫应答。
     Th1 和 Th2 型免疫应答的区别不是绝对的。实际上， 个体支持称为主要 Th1 或主 要 Th2 的免疫应答。但是， 常常方便地以 Mosmann 和 Coffman 在鼠 CD4+T 细胞克隆中所述 的形式定义细胞因子家族 (Mosmann 和 Coffman， 1989)。传统上， Th1 型应答与 T 淋巴细胞 产生 INF-γ 和 IL-2 细胞因子有关。经常直接与 Th1 型免疫应答诱导相关的其它细胞因子 ( 例如 IL-12) 不由 T 细胞产生。相比之下， Th2 型应答与 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10 的分泌 有关。
     除 了 佐 剂 之 外， 还 可 能 需 要 共 施 用 生 物 应 答 调 节 剂 (biologic response modifier， BRM) 来增强免疫应答。BRM 已显示能够上调 T 细胞免疫或下调细胞活性抑制剂。这些 BRM 包括但不局限于西咪替丁 (CIM ； 1200mg/ 天 )(Smith/Kline， PA) 或低剂量的环磷 2 酰胺 (CYP ； 300mg/m )(Johnson/Mead， NJ) 和细胞因子如 γ- 干扰素、 IL-2 或 IL-12， 或编码 参与免疫辅助功能之蛋白质 ( 如 B-7) 的基因。
     B. 抗体和被动免疫
     直接施用治疗性免疫球蛋白 ( 也称为 “被动免疫” ) 不需要来自患者的免疫应答， 因此给予即时的保护。另外， 被动免疫可针对并非免疫原性以及对于生物体来说特异性较 低的细菌结构。针对致病生物的被动免疫已基于来源于人或非人供体血清的免疫球蛋白。
     本发明的一个方面是制备用于预防或治疗葡萄球菌感染之免疫球蛋白的方法， 其 包括用本发明的疫苗免疫接受者以及从接受者分离免疫球蛋白或抗体的步骤。 此方法制备 的免疫球蛋白是本发明的另一个方面。 包含本发明免疫球蛋白和可药用运载体的药物组合 物是本发明又一个方面， 其可用于制备治疗或预防葡萄球菌疾病的药物。治疗或预防葡萄 球菌感染的方法是本发明的另一个方面， 其包括向患者施用有效量之本发明药物制剂的步 骤。
     用于产生多克隆抗体的接种物通常通过在生理耐受稀释剂 ( 例如盐水或其它适 于人使用的佐剂 ) 中分散抗原组合物以形成水性组合物来制备。向哺乳动物施用免疫激 活量的接种物， 然后使被接种的哺乳动物维持足以使得抗原组合物诱导出保护性抗体的时 间。可通过公知技术 ( 例如亲和色谱 ) 将抗体分离到所需的程度 (Harlow 和 Lane， 1988)。
     抗体可包括来自多种常用动物 ( 例如山羊、 灵长类动物、 驴、 猪、 马、 豚鼠、 大鼠或 人 ) 的抗血清制备物。对动物取血并回收血清。
     根据本发明产生的免疫球蛋白可包括完整抗体、 抗体片段或子片段。抗体可以是 完整的免疫球蛋白、 针对本发明两种或更多种抗原具有双特异性的嵌合抗体或杂合抗体。 它们也可以是片段， 例如 F(ab′ )2、 F(ab′ )、 Fab、 Fv 等， 包括杂合片段。免疫球蛋白还包 括天然、 合成或经遗传改造的蛋白质， 其通过结合特异性抗原形成复合物而如抗体一样起 作用。本文使用的术语 “免疫球蛋白” 包括本领域已知的所有免疫球蛋白类型和亚型， 包括 IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 及其亚型 ( 同种型 )， 例如 IgA1、 IgA2、 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgG4。 优选地， 本发明的免疫球蛋白是人免疫球蛋白。 另外， 还包括包含免疫球蛋白片段的抗原结 合结构与和 / 或可变结构域。抗原结合片段包括 Fab、 F(ab′ )、 F(ab′ )2、 Fv、 dAb、 Fd、 互 补决定区 (CDR) 片段、 单链抗体 (scFv)、 二价单链抗体、 单链噬菌体抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 含有至少足以赋予该 ( 多 ) 肽以特异性抗原结合之免疫球蛋白片段的 ( 多 ) 肽， 等 等。
     本发明抗原之组合物或疫苗可施用给接受者， 其随后作为应答于来自特异性疫苗 之攻击而产生的免疫球蛋白的来源。因此， 所治疗的对象可捐赠血浆， 从其中可通过常规 血浆分级分离方法获得超免疫球蛋白。可将超免疫球蛋白施用给另一个对象， 以赋予针对 葡萄球菌感染的抗性或者对其进行治疗。 本发明的超免疫球蛋白特别可用于治疗或预防婴 儿、 免疫缺陷个体的葡萄球菌疾病， 或者在需要治疗但没有时间让个体应答于疫苗接种而 产生抗体的情况下用于治疗或预防葡萄球菌疾病。
     本发明的另一个方面是包含一种或多种单克隆抗体 ( 或其片段 ； 优选人的或人源 化的 ) 的药物组合物， 所述抗体与本发明免疫原性组合物的成分具有反应性， 所述药物组 合物可用于治疗或预防革兰氏阳性细菌 ( 优选葡萄球菌， 更优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌 ) 的感染。这些药物组合物包含单克隆抗体， 其可以是与本发明抗原具有特异性的 任何类型的完整免疫球蛋白， 例如 IgG、 IgM、 IgA、 IgD 或 IgE、 嵌合抗体或杂合抗体。它们也 可以是片段， 例如 F(ab′ )2、 Fab′、 Fab、 Fv 等， 包括杂合片段。
     制备单克隆抗体的方法是本领域公知的， 可包括将脾细胞与骨髓瘤细胞的融合 (Kohler 和 Milstein， 1975 ； Harlow 和 Lane， 1988)。或者， 可通过筛选合适的噬菌体展示文 库获得单克隆 Fv 片段 (Vaughan 等， 1998)。单克隆抗体可以是人的、 通过已知方法人源化 的或部分人源化的。
     C. 联合治疗
     本发明的组合物和相关方法 ( 特别是向患者 / 对象施用葡萄球菌抗原 ) 也可 与传统治疗的施用联合使用， 所述葡萄球菌抗原包括 Emp、 AdsA 和 / 或 Eap 的多肽或肽 以及下列一种或多种肽或蛋白质 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。这些包括但 不限于 ： 抗生素的施用， 例如链霉素、 环丙沙星、 强力霉素、 庆大霉素、 氯霉素、 三甲氧苄二氨 嘧啶、 磺胺甲恶唑、 氨苄青霉素、 四环素或不同抗生素组合。 在一个方面中， 设想多肽疫苗和 / 或治疗与小分子或非肽类 AdsA 活性抑制剂联合使用。
     在一方面中， 本发明涉及的是， 多肽疫苗和 / 或疗法与抗菌治疗联合使用。或者， 所述疗法可在其它制剂治疗之前或之后， 间隔数分钟至数周。在单独施用其它制剂和 / 或 蛋白质或多核苷酸的实施方案中， 一般应确保每次递送之间的时间不会过长， 以便所述制 剂和抗原组合物仍能对对象发挥有利的组合疗效。 在这些情形中， 本发明涉及的是， 可在约 12-24 小时之内 ( 更优选地在约 6 ～ 12 小时之内 ) 施用两种疗法。然而， 在一些情况下， 可 能期望显著延长施用的时间， 这时在各次施用之间间隔几天 (2、 3、 4、 5、 6 或 7) 到几周 (1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8)。
     可采用不同组合， 例如抗生素疗法为 “A” ， 作为免疫疗法方案一部分给予的免疫原 性分子或抗体 ( 如抗原或 AdsA 调节剂 ) 为 “B” ：
     A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
     B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
     B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
     向患者 / 对象施用本发明免疫原性组合物应遵从施用这些化合物的一般方案， 其中考虑 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 组合物或本文所述任何其它抗原组合物或抗原组合的毒 性 ( 如果有的话 )。预计可根据需要重复治疗周期。还涉及的是， 多种标准疗法如水疗 (hydration) 可与所述疗法组合应用。III. 药物组合物
     在一些实施方案中， 向对象施用药物组合物。本发明的不同方面包括向对象施用 有效量的组合物。在本发明的一些实施方案中， 可向患者施用 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原并 与 Ess 途径成员 ( 包括 Esa 或 Esx 类的多肽或肽 ) 和 / 或分选酶底物成员和 / 或分泌型毒 力因子和或多糖联用， 以保护其免受一种或多种葡萄球菌病原体的感染或者进行治疗。或 者， 可将编码一种或多种这种多肽或肽的表达载体给予患者， 作为预防性治疗。此外， 这些 化合物可与抗生素联用。这些组合物一般可溶解或分散在可药用的运载体或含水介质中。
     本文使用的术语 “可药用” 是指在安全的医学判断范围内适于接触人体和动物组 织并且没有过度毒性、 刺激性、 变态反应或其它问题并发症且具有合理之益处 / 风险比的 化合物、 物质、 组合物和 / 或剂型。术语 “可药用运载体” 表示参与携带或运送化学物质的可 药用的材料、 组合物或介质， 例如液体或固体填充剂、 稀释剂、 赋形剂、 溶剂或包封材料。可 药用运载体包括任何和所有溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延 迟剂等。这些针对药物活性物质的介质和制剂的用途为本领域所熟知。考虑在免疫原性和 治疗性组合物中使用任何常规介质或制剂， 除非其与活性成分不相容。还可将补充性活性 成分 ( 如其它抗菌剂 ) 掺入组合物中。
     除了配制成肠胃外施用的化合物 ( 如用于静脉内注射或肌内注射的那些 )， 其它 可药用的形式包括例如用于口服施用的片剂或其它固体 ； 缓释胶囊 ； 以及目前所用的其它 任何形式， 包括霜剂、 洗剂、 漱口剂、 吸入剂等。
     可将本发明的活性化合物配制成用于肠胃外施用， 例如配制成用于静脉内、 肌内、 皮下或腹膜内途径的注射。
     可在与表面活性剂 ( 如羟丙基纤维素 ) 适当混合的水中， 制备以游离碱或可药用 盐的形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、 液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制 备分散体系。在普通的储藏和使用条件下， 这些制备物含有防止微生物生长的防腐剂。
     适于注射使用的药用形式包括无菌水溶液或分散体系 ； 包括芝麻油、 花生油或含 水丙二醇的制剂 ； 用于即时制备无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末剂。 在所有情况下， 剂 型必须是无菌的， 而且必须达到可容易注射的流动程度。它还应当在加工和储藏条件下是 稳定的， 而且应当免受微生物 ( 如细菌和真菌 ) 的污染作用。
     可将蛋白质性组合物配制成中性或盐形式。可药用的盐包括酸加成盐 ( 由蛋白质 的游离氨基形成 ) 和由无机酸 ( 例如盐酸或磷酸 ) 或有机酸 ( 例如乙酸、 草酸、 酒石酸、 扁 桃酸等 ) 形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱 ( 例如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧 化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 和有机碱 ( 例如异丙胺、 三甲胺、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     运载体也可以是溶剂或分散介质， 其含有例如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如甘油、 丙二 醇和液体聚乙二醇等 )、 其合适的混合物以及植物油。可通过例如使用包衣 ( 如卵磷脂 )、 通过维持所需的粒径 ( 对于分散体系的情况 ) 以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动 性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂 ( 例如对羟苯甲酸酯类、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸、 硫柳汞 等 ) 来实现对微生物作用的预防。在许多情况下， 可优选包括等渗剂， 例如糖或氯化钠。可 通过在组合物中使用延迟吸收剂 ( 例如单硬脂酸铝和明胶 ) 来实现对注射组合物的延长吸 收。
     通过将所需量的活性化合物掺入具有上面所列举的多种成分的合适溶剂中来制备无菌注射溶液， 根据需要再进行过滤除菌。 一般地， 通过将多种无菌活性成分掺入无菌运 载体 ( 其含有基本分散介质和所需的其它上面所列举的成分 ) 来制备分散体系。对用于制 备无菌注射液的无菌粉末剂而言， 优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术， 由预先经 过滤除菌的溶液产生活性成分和所有其它所需成分的粉末剂。
     本发明组合物的施用通常可经由任何常见的途径。这包括但不局限于口服、 经鼻 或含服施用。或者， 可通过原位、 皮内、 皮下、 肌内、 腹膜内、 鼻内或静脉内施用来施用。在 某些实施方案中， 可吸入疫苗组合物 ( 例如美国专利 6,651,655， 其通过引用具体并入本文 中 )。 这些组合物通常作为可药用的组合物 ( 含有生理学可接受的运载体、 缓冲剂或其它赋 形剂 ) 来施用。
     就水溶液的肠胃外施用而言， 例如， 必要时可适当地缓冲溶液， 而且液体稀释剂应 首先用足量的盐水或葡萄糖进行等渗处理。 这些特定的水溶液特别适于静脉内、 肌内、 皮下 和腹膜内施用。 在这一点上， 根据本公开内容， 可采用的无菌含水介质为本领域技术人员所 知。例如， 可将一剂药物溶于等渗 NaCl 溶液中， 并且加入到皮下输液中或注射到建议的输 注位点 ( 参见例如， Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 1990)。根据对象的身体状 况， 剂量有必要发生一些改变。不管怎样， 负责施用的人会决定个体对象的合适剂量。
     治疗性或预防性组合物的有效量基于预期目标来确定。 术语 “单位剂量” 或 “剂量” 是指适于对象中使用的物理上分离的单位， 每个单位包含为产生上述与其施用 ( 即适当途 径和方案 ) 相关的预期应答而计算得出的组合物预定量。所要施用的量 ( 根据治疗次数和 单位剂量 ) 取决于期望的保护作用。
     组合物的精确剂量也取决于医生的判断， 且为特定针对每个个体的。影响给药的 因素包括对象的身体和临床状态、 施用途径、 治疗的预期目标 ( 减轻症状还是治愈 ) 以及特 定组合物的效力、 稳定性和毒性。
     制备后， 将以与给药剂型相匹配的方式、 以有效治疗或预防的量来施用溶液。 可容 易地以多种剂型 ( 如上文所述的注射液类型 ) 来施用制剂。
     体外、 离体或体内施用
     本文所用的术语 “体外施用” 是指对从动物中取出的或在动物体外的细胞 ( 包括 但不局限于培养中的细胞 ) 进行操作。术语 “离体施用” 是指将已在体外进行了操作的细 胞随后施用于活的动物。术语 “体内施用” 包括在动物体内进行的所有操作。
     在本发明的某些方面中， 可通过体外、 离体或体内施用组合物。在某些体外实施 方案中， 将自体 B 淋巴细胞细胞系与本发明的病毒载体孵育 24 ～ 48 小时， 或与 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 和 / 或 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 vWa、 Coa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白 ( 或其任何组合 ) 一起孵 育。经转导的细胞接着可用于体外分析， 或用于离体施用。
     通过引用并入本文的美国专利 4,690,915 和 5,199,942 公开了离体操作血液单核 细胞和骨髓细胞用于治疗性应用的方法。
     脂质组分和部分
     在某些实施方案中， 本发明涉及包含一种或多种与核酸或多肽 / 肽结合之脂质的 组合物。脂质是不溶于水且可用有机溶剂萃取的物质。本领域技术人员了解除了本文具体 描述的那些之外的脂质化合物， 并且其涵盖在本发明的组合物和方法中。脂质组分和非脂 质可以共价或非共价地彼此相连。
     脂质可以是天然脂质或合成脂质。但是， 脂质通常是生物物质。生物脂质是本领 域中公知的， 包括例如中性脂、 磷脂、 磷酸甘油酯、 类固醇、 萜烯、 溶血脂类、 鞘糖脂、 糖脂、 硫 酸酯、 具有醚和酯连接之脂肪酸的脂类以及多聚化脂质， 及其组合。
     与脂质相结合的核酸分子或多肽 / 肽可分散在含有脂质的溶液中， 溶于脂质中， 被脂质乳化， 与脂质混合， 与脂质化合， 与脂质共价键合， 作为悬浮物包含在脂质中或者以 其它方式与脂质相关联。本发明的脂质相关组合物不限于任何特定结构。例如， 它们还可 简单地散布于溶液中， 可能形成大小或形状都不均一的聚集体。在另一实例中， 它们可以 双层结构存在、 以胶束形式存在或者具有 “瓦解的” 结构。在另一非限制性实例中， 还考虑 lipofectamine(Gibco BRL) 或 Superfect(Qiagen) 复合物。
     在某些实施方案中， 组合物可包含约 1％、 约 2％、 约 3％、 约 4％、 约 5％、 约 6％、 约 7％、 约 8％、 约 9％、 约 10％、 约 11％、 约 12％、 约 13％、 约 14％、 约 15％、 约 16％、 约 17％、 约 18 ％、 约 19 ％、 约 20 ％、 约 21 ％、 约 22 ％、 约 23 ％、 约 24 ％、 约 25 ％、 约 26 ％、 约 27 ％、 约 28 ％、 约 29 ％、 约 30 ％、 约 31 ％、 约 32 ％、 约 33 ％、 约 34 ％、 约 35 ％、 约 36 ％、 约 37 ％、 约 38 ％、 约 39 ％、 约 40 ％、 约 41 ％、 约 42 ％、 约 43 ％、 约 44 ％、 约 45 ％、 约 46 ％、 约 47 ％、 约 48 ％、 约 49 ％、 约 50 ％、 约 51 ％、 约 52 ％、 约 53 ％、 约 54 ％、 约 55 ％、 约 56 ％、 约 57 ％、 约 58 ％、 约 59 ％、 约 60 ％、 约 61 ％、 约 62 ％、 约 63 ％、 约 64 ％、 约 65 ％、 约 66 ％、 约 67 ％、 约 68 ％、 约 69 ％、 约 70 ％、 约 71 ％、 约 72 ％、 约 73 ％、 约 74 ％、 约 75 ％、 约 76 ％、 约 77 ％、 约 78 ％、 约 79 ％、 约 80 ％、 约 81 ％、 约 82 ％、 约 83 ％、 约 84 ％、 约 85 ％、 约 86 ％、 约 87 ％、 约 88％、 约 89％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或其间任何范围的特定脂质、 脂质类型或者非脂质组分 ( 例如佐剂、 抗原、 肽、 多肽、 糖、 核酸或者本文公开的或本领域技术人员已知的其它物质 )。在一个非限制性实例 中， 组合物可包含约 10％至约 20％的中性酯， 以及约 33％至约 34％的脑苷脂和约 1％的胆 固醇。在另一非限制性实例中， 脂质体可包含约 4％至约 12％的萜烯， 其中约 1％的胶束具 体地是番茄红素， 剩余约 3％至约 11％的脂质体包含其它萜烯 ； 以及约 10％至约 35％的磷 脂酰胆碱， 和约 1％的非脂质组分。因此， 设想本发明的组合物可包含任何组合或百分比范 围的任何脂质、 脂质类型或其它组分。
     IV. 多糖
     本发明的免疫原性组合物还可包含荚膜多糖， 包括下列一种或多种 ： PIA( 也称为 PNAG) 和 / 或金黄色葡萄球菌 V 型和 / 或 VIII 型荚膜多糖和 / 或表皮葡萄球菌 I 型和 / 或 II 型和 / 或 III 型荚膜多糖。A.PIA(PNAG)
     现在知道， 鉴定为 PS/A、 PIA 和 SAA 的多种形式葡萄球菌表面多糖是同一化学实 体—— PNAG(Maira-Litran 等， 2004)。因此， 术语 PIA 或 PNAG 涵盖所有这些多糖或衍生自 它们的寡糖。
     PIA 是 多 糖 细 胞 间 粘 附 素， 其 由 N- 乙 酰 基 和 O- 琥 珀 酰 基 成 分 取 代 的 β-(1 → 6)- 连接葡糖胺组成。 此多糖在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都存在， 并可从 任一来源中分离出来 (Joyce 等， 2003 ； Maira-Litran 等， 2002)。例如， PNAG 可分离自金黄 色葡萄球菌 MN8m 株 (WO04/43407)。分离自表皮葡萄球菌的 PIA 是生物膜的整合成分。它 负责介导细胞 - 细胞粘附， 可能也发挥为生长的群落屏蔽宿主免疫应答的功能。
     先前称为聚 -N- 琥珀酰 -β-(1 → 6)- 葡糖胺 (PNSG) 的多糖最近显示出不具有预 期的结构， 这是因为对 N- 琥珀酰基化的鉴定是不正确的 (Maira-Litran 等， 2002)。因此， 之前称为 PNSG 现在被称为 PNAG 的多糖也涵盖在术语 PIA 中。PIA( 或 PNAG) 可具有不同的 大小， 从超过 400kDa 到 75 ～ 400kDa 到 10 ～ 75kDa 到最多由 30 个重复单位 (N- 乙酰基和 O- 琥珀酰基组分取代的 β-(1 → 6)- 连接的葡糖胺 ) 组成的寡糖不等。任何大小的 PIA 多 糖或寡糖都可用于本发明的免疫原性组合物中， 但是优选超过 40kDa 的大小。可通过本领 域已知的任何方法实现大小的调整， 例如微流化 (microfluidization)、 超声照射或化学切 割 (WO 03/53462、 EP497524、 EP497525)。PIA(PNAG) 的优选大小范围是 40 ～ 400kDa、 40 ～ 300kDa、 50 ～ 350kDa、 60 ～ 300kDa、 50 ～ 250kDa 和 60 ～ 200kDa。
     由于乙酸酯对氨基的取代， PIA(PNAG) 可具有不同程度的乙酰化。体外产生的 PIA 在氨基上几乎完全被取代 (95 ～ 100 ％ )。或者， 可使用具有少于 60 ％、 优选少于 50 ％、 40％、 30％、 20％、 10％乙酰化的脱乙酰化 PIA(PNAG)。脱乙酰化 PIA(PNAG) 的使用是优选 的， 因为 PNAG 的非乙酰化表位在介导调理素杀伤革兰氏阳性细菌 ( 优选金黄色葡萄球菌和 / 或表皮葡萄球菌 ) 方面是高效的。最优选地， PIA(PNAG) 具有 40kDa 至 300kDa 的大小， 并 且是脱乙酰化的， 从而少于 60％、 50％、 40％、 30％或 20％的氨基是乙酰化的。 术语 “脱乙酰 化 PNAG(dPNAG)” 是指 PNAG 多糖或寡糖， 其中少于 60％、 50％、 40％、 30％、 20％或 10％的氨 基是乙酰化的。
     在一个实施方案中， 通过化学处理天然多糖使得 PNAG 脱乙酰化形成 dPNAG。 例如， 用碱溶液处理天然 PNAG， 使得 pH 升高至 10 以上。例如， 用 0.1 ～ 5M、 0.2 ～ 4M、 0.3 ～ 3M、 0.5 ～ 2M、 0.75 ～ 1.5M 或 1M 的 NaOH、 KOH 或 NH4OH 处理 PNAG。在 20 ～ 100、 25 ～ 80、 30 ～ 60 或 30 ～ 50 或 35 ～ 45℃下处理至少 10 ～ 30 分钟， 或者 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15 或 20 个小时。 dPNAG 可如 WO 04/43405 所述制备。
     本发明免疫原性组合物中包含的多糖优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非 缀合的。
     B. 来自葡萄球菌的 5 型和 8 型多糖
     大多数在人体中造成感染的金黄色葡萄球菌含有 5 型或 8 型多糖。约 60％的人 菌株是 8 型， 约 30 ％的是 5 型。5 型和 8 型荚膜多糖抗原的结构由 Moreau 等 (1990) 和 Fournier 等 (1984) 所描述。两者都在重复单元中具有 FucNAcp 以及可用于引入巯基的 ManNAcA。据报道， 其结构为 ：
     5 型 → 4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1 → 4)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
    8 型 → 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-β-D-FucNA 最近 (Jones， 2005)， NMR 谱将结构修正为 ： 5 型 → 4)-β-D-ManNAcA-(1 → 4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 →
    
    c-(1 → 8 型→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 → 3)-α-L-FucNAc(1 → 3)-α-D-FucNAc(1 →
     可使用已知方法 ( 美国专利 6,294,177) 从合适的金黄色葡萄球菌菌株提取多糖。 ATCC 12902 是 5 型金黄色葡萄球菌菌株， ATCC 12605 是 8 型金黄色葡萄球菌菌株。
     多糖具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学处理改变其大小。 本发明 免疫原性组合物中包含的 5 型和 8 型多糖优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非缀合 的。或者， 本发明的免疫原性组合物含有 5 型或 8 型多糖。
     C. 金黄色葡萄球菌 336 抗原
     在一个实施方案中， 本发明免疫原性组合物包含美国专利 6,294,177 中所述的金 黄色葡萄球菌 336 抗原。所述 336 抗原包含 β- 连接己糖胺， 其不含 O- 乙酰基， 并特异性 结合针对金黄色葡萄球菌 336 型 ( 以 ATCC 55804 保藏 ) 的抗体。在一个实施方案中， 所述 336 抗原是多糖， 其具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学处理改变其大小。 本 发明还涵盖了来源于 336 抗原的寡糖。当包含在本发明免疫原性组合物中时， 所述 336 抗 原优选如下所述与运载体蛋白缀合或者是非缀合的。
     D. 来自表皮葡萄球菌的 I、 II 和 III 型多糖
     表皮葡萄球菌的 ATCC-31432、 SE-360 和 SE-10 菌株的特征分别是三种不同的荚膜 类型—— I、 II 和 III 型 (Ichiman 和 Yoshida， 1981)。提取自每种表皮葡萄球菌血清型的 荚膜多糖构成 I、 II 和 III 型多糖。可通过一些方法提取多糖， 包括美国专利 4,197,290 中 所述的或者 Ichiman 等， 1991 所述的方法。
     在本发明的一个实施方案中， 免疫原性组合物包含来自表皮葡萄球菌的 I 和 / 或 II 和 / 或 III 型多糖或寡糖。
     多糖具有天然大小， 或者可通过微流化、 超声照射或化学切割改变其大小。 本发明 还涵盖提取自表皮葡萄球菌菌株的寡糖。这些多糖是非缀合的， 或者优选地如下所述进行 缀合。
     E. 多糖的缀合
     在与免疫接种中使用多糖有关的问题中， 事实是多糖本身是弱的免疫原。 优选地， 本发明中所用的多糖与蛋白质运载体相连以改善免疫原性。 此类可缀合多糖免疫原的运载 体的实例包括白喉和破伤风类毒素 ( 分别为 DT、 DT CRM197 和 TT)、 匙孔槭血蓝蛋白 (KLH) 和纯化的结核菌素蛋白衍生物 (PPD)、 绿脓假单胞菌外蛋白 A(rEPA)、 来自流感嗜血杆菌的 蛋白 D、 肺炎球菌溶血素或者上述任一的片段。适用的片段包括含有 T 辅助细胞表位的片 段。特别地， 来自流感嗜血杆菌的蛋白 D 片段优选含有所述蛋白 N 端 1/3。蛋白 D 是来自流 感嗜血杆菌的 IgD 结合蛋白 (EP 0 594 610 B1)， 其为潜在的免疫原。另外， 葡萄球菌蛋白 / 抗原可用作本发明多糖缀合物中的运载蛋白。
     特别有利地用于葡萄球菌疫苗背景中的运载蛋白是葡萄球菌 α 类毒素。其天然
     形式可与多糖缀合， 因为缀合的加工过程减少了毒性。优选地， 由于残存毒性较低， 所以经 遗传改造解毒的 α 毒素 ( 例如 His35Leu 或 His35Arg 变体 ) 用作运载体。或者， 通过用交 联剂甲醛或戊二醛处理对 α 毒素进行化学解毒。
     可以通过任何已知方法 ( 例如美国专利 4,372,945、 4,474,757 和 4,356,170) 将 多糖与运载蛋白相连。
     优选地， 进行 CDAP 缀合化学方法 ( 参见 WO95/08348)。在 CDAP 中， 优选使用氰基 化剂 1- 氰基 - 二甲基氨基吡啶四氟硼酸 (CDAP) 合成多糖 - 蛋白质缀合物。氰基化反应可 在相对温和条件下进行， 其避免了碱敏感多糖的水解。该合成允许直接偶联运载体蛋白。
     所述多糖溶于水或盐溶液。CDAP 溶于乙腈， 并立刻添加至多糖溶液。CDAP 与多糖 的羟基反应形成氰酸酯。在活化步骤之后， 添加运载体蛋白。赖氨酸的氨基与活化的多糖 反应形成异脲共价连接。 在偶联反应后， 添加大量过剩的甘氨酸以淬灭残余的活化官能团。 然后， 使产物通过凝胶渗透柱， 以除去未反应的运载体蛋白和残余的试剂。
     缀合优选包括在运载体蛋白和多糖之间产生直接连接。任选地， 可在运载体蛋白 和多糖之间引入间隔物 ( 例如二氢己二酸 (adipic dihydride， ADH))。
     V. 免疫应答和测定
     如上文所述， 本发明涉及引发或诱导对象中针对 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的免疫 应答。 在另一些实施方案中， 可引发或诱导针对其它肽或抗原的免疫应答， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡萄球菌肽或蛋白。在一个实施方案中， 免疫应答可 保护或治疗患有、 怀疑患有发生感染或相关疾病 ( 特别是与葡萄球菌有关的那些 ) 或具有 此种风险的对象 ( 例如限制脓肿持续存在 )。本发明的免疫原性组合物的一种用途是通过 在住院治疗前接种或治疗对象来预防医源性感染。
     A. 免疫测定
     本发明包括实施血清学测定以评价 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 以及本文所述的任何其 它多肽或肽物质是否诱导或引发免疫应答。有许多类型的免疫测定可以实施。本发明所涵 盖的免疫测定包括但不限于美国专利 4,367,110( 双单克隆抗体夹心法测定 ) 和美国专利 4,452,901(western 印迹 ) 所述的那些。其它测定包括体外和体内的带标记配体的免疫沉 淀和免疫细胞化学。
     免疫测定一般是结合测定。 某些优选免疫测定是本领域已知的多种类型的酶联免 疫吸附测定 (ELISA) 和放射免疫测定 (RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别 有用的。在一个实例中， 将抗体或抗原固定在所选表面 ( 例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔、量尺或柱支持物 ) 上。然后， 将怀疑含有目标抗原或抗体的测试组合物 ( 例如临床样品 ) 添加到孔中。在结合以及清洗以除去非特异性结合之免疫复合物之后， 可检测所结合的抗 原或抗体。 检测一般通过添加另一种与可检出标记相连的特异性针对目标抗原或抗体的抗 体来实现。此类 ELISA 被称为 “夹心法 ELISA” 。检测也可通过下述步骤实现 ： 添加特异性 针对目标抗原的第二抗体， 然后添加对第二抗体有结合亲和力的第三抗体， 第三抗体连接 有可检出标记。
     对 ELISA 技术的改动是本领域技术人员已知的。在一种此类改动中， 将怀疑含有 靶抗原或抗体的样品固定于孔表面上， 然后与本发明的抗体或抗原相接触。在结合以及适 当清洗之后， 检测所结合的免疫复合物。 当最初的抗原特异性抗体与可检出标记相连时， 可 直接检测免疫复合物。另外， 也可使用对第一抗原特异抗体有结合亲和力的第二抗体检测 免疫复合物， 第二抗体连接有可检出标记。
     也可以实施竞争性 ELISA， 其中测试样品竞争性结合已知量的经标记抗原或抗体。 通过在与经包被的孔一起孵育之前或其间， 将样品与已知经标记物质混合来确定未知样品 中反应性物质的量。样品中反应性物质的存在减少了可用于结合孔的经标记物质的量， 因 此减少了最终的信号。
     不论所使用的形式如何， ELISA 都具有某些共同的特征， 例如包被、 孵育或结合， 清 洗以除去非特异性结合的物质， 以及检测所结合的免疫复合物。
     在 ELISA 中， 更常见的是使用第二或第三检测手段， 而不是直接检测。因此， 在抗 原或抗体与孔结合、 用非反应性物质进行包被以降低背景以及清洗以除去未结合物质之 后， 将固定化的表面在有效允许免疫复合物 ( 抗原 / 抗体 ) 形成的条件下与待测试的临床 或生物学样品相接触。 然后， 免疫复合物的检测需要经标记的第二结合配体或抗体， 或者与 经标记之第三抗体或第三结合配体连接的第二结合配体或抗体。
     进行所有 ELISA 孵育步骤之后， 清洗接触面以除去未复合的物质。清洗常包括用 PBS/ 吐温溶液或者硼酸盐缓冲液清洗。 在测试样品和最初结合物质之间形成特异性免疫复 合物之后， 进行清洗， 可测定甚至微小量的免疫复合体的存在。
     为了提供检测手段， 第二或第三抗体可具有相连的标记用以检测。 在某些方面中， 该标记是酶， 其在与合适显色底物一起孵育之后会显色。因此， 例如， 期望在利于其它免疫 复合物形成的条件下将第一或第二免疫复合物与经尿素酶、 葡萄糖氧化酶、 碱性磷酸酶或 过氧化氢酶缀合的抗体相接触并孵育一段时间， 例如在含有 PBS 的溶液 ( 如 PBS 吐温 ) 中 于室温下孵育 2 小时。
     与经标记之抗体一起孵育后， 清洗以除去未结合的物质， 继而对标记物的量进行 定量， 例如， 对于过氧化物酶作为酶标记的情况， 通过与显色底物 ( 例如尿素和溴甲酚紫或 者 2， 2′ - 叠氮 - 二 (3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸 [ABTS] 和 H2O2) 一起孵育。然后， 通过测 量产生颜色的程度实现定量， 例如使用可见光谱分光光度计。 或者， 所述标记物可以是化学 发光标记物 ( 参见美国专利 5,310,687、 5,238,808 和 5,221,605)。
     B. 细菌感染的诊断
     除了如上所述使用蛋白质、 多肽和 / 或肽， 以及结合这些多肽、 蛋白质和 / 或肽的 抗体来治疗或预防感染之外， 本发明还考虑到以多种方式使用这些多肽、 蛋白质、 肽和 / 或 抗体， 包括检测葡萄球菌的存在以及诊断感染， 不论是在患者中还是在也可被污染的医疗器械上。根据本发明， 检测感染存在的优选方法包括下列步骤 ： 获得怀疑被一种或多种葡 萄球菌物种或菌株感染的样品， 例如取自个体的样品 ( 例如来自其血液、 唾液、 组织、 骨、 肌 肉、 软骨或皮肤 )。分离出样品之后， 可利用本发明多肽、 蛋白质、 肽和 / 或抗体进行诊断测 定， 以检测葡萄球菌的存在， 并且确定样品中此类存在的这种测定技术是本领域技术人员 公知的， 包括例如放射性免疫测定、 western 印迹分析和 ELISA 测定的方法。一般说来， 根 据本发明， 设想了下述诊断感染的方法， 其中将怀疑感染葡萄球菌的样品加入到本发明的 多肽、 蛋白质、 肽、 抗体或单克隆抗体中， 通过与所述多肽、 蛋白质和 / 或肽结合的抗体或者 与样品中所述抗体结合的多肽、 蛋白质和 / 或肽来指示葡萄球菌。
     因此， 本发明的抗体可用于预防葡萄球菌的感染， 用于治疗进行中的感染， 或者用 作研究工具。本文使用的术语 “抗体” 包括单克隆抗体、 多克隆抗体、 嵌合抗体、 单链抗体、 双特异性抗体、 人抗体、 猿源化抗体和人源化抗体或者灵长动物源化抗体以及 Fab 片段， 例 如保持所述抗体结合特异性的片段， 包括 Fab 免疫球蛋白表达文库的产物。因此， 本发明 设想了使用单链抗体， 例如抗体可变重链和轻链。任意这些类型抗体或抗体片段的产生 是本领域技术人员公知的。产生针对细菌蛋白质之抗体的具体实例可见于美国专利公开 20030153022， 其通过引用以整体并入本文。
     可直接用可检出标记对任意上述多肽、 蛋白质、 肽和 / 或抗体进行标记， 用以鉴定 和定量葡萄球菌。 用于免疫测定的标记物是本领域技术人员一般所知的， 包括酶、 放射性同 位素以及荧光、 发光和显色物质， 包括有色颗粒 ( 例如胶体金或乳胶珠 )。合适的免疫测定 包括 ELISA。
     C. 保护性免疫
     在本发明的一些实施方案中， 蛋白质性组合物向对象提供了保护性免疫。 “保护性 免疫” 是指机体建立特异性免疫应答的能力， 其保护对象免于发生某种病原体参与的特定 疾病或病症， 其中所述病原体会引发免疫应答。 免疫原性有效量能够赋予对象保护性免疫。
     本文说明书和后附权利要求书中使用的术语 “多肽” 和 “肽” 是指通过肽键彼此共 价相连的一段氨基酸。根据本发明， 不同的多肽具有不同的功能。根据一个方面， 多肽源自 为诱导接受者中的主动免疫应答而设计的免疫原， 根据本发明的另一方面， 多肽源自在例 如动物中引发主动免疫应答后产生的、 且可用于诱导接受者中的被动免疫应答的抗体。但 是， 在这两种情况下， 多肽均可根据任何可能的密码子使用由多核苷酸编码。
     本文使用的短语 “免疫应答” 是指在接受患者中产生针对本发明蛋白质、 肽、 碳水 化合物或多肽的体液应答 ( 由抗体介导 )、 细胞应答 ( 由抗原特异性 T 细胞或其分泌产物介 导 ) 或其两者兼有。这些应答可以是由施用免疫原诱导的主动应答， 或者是由施用抗体、 含 抗体之物质或预致敏 T 细胞诱导的被动应答。
     呈递与 I 类或 II 类 MHC 分子相结合的多肽抗原或表位引发细胞免疫应答， 从而活 化了抗原特异性 CD4(+)T 辅助细胞和 / 或 CD8(+) 细胞毒 T 细胞。所述应答也可包括单核 细胞、 巨噬细胞、 NK 细胞、 嗜碱细胞、 树突状细胞、 星形细胞、 小胶质细胞、 嗜酸性粒细胞或固 有免疫其它组分的活化。
     本文使用的 “主动免疫” 是指通过施用抗原赋予对象的任何免疫力。
     本文使用的 “被动免疫” 是指不向对象施用抗原而赋予对象的任何免疫力。因此 “被动免疫” 包括但不限于 ： 施用活化的免疫效应物 ( 其包括免疫应答的细胞介导物或蛋白质介导物， 例如单克隆和 / 或多克隆抗体 )。
     单克隆或多克隆抗体组合物可用于被动免疫， 用以预防或治疗生物体的感染， 所 述生物体携带或可暴露于被所述抗体识别的抗原。 抗体组合物可包含与不同抗原结合的抗 体， 所述抗体可与不同生物相关。所述抗体组分可以是多克隆抗血清。在某些方面中， 从已 用抗原攻击的动物或第二对象亲和纯化抗体。或者， 可使用抗体混合物， 其是针对同一、 相 关或不同微生物或生物体 ( 例如革兰氏阳性细菌、 革兰氏阴性细菌， 包括但不限于葡萄球 菌 ) 中存在之抗原的单克隆和 / 或多克隆抗体的混合物。
     可通过向患者施用免疫球蛋白 (Ig) 和 / 或其它免疫因子向患者或对象给予被动 免疫， 所述免疫球蛋白和 / 或其它免疫因子获得自供体或其它具有已知免疫反应性的非患 者来源。 在另一些方面中， 可向作为球蛋白来源或供体之对象施用本发明的抗原组合物， 所 述球蛋白响应于抗原组合物的攻击而产生， 其含有针对葡萄球菌或其它生物体的抗体 ( “超 免疫球蛋白” )。因此， 如此处理的对象贡献出血浆， 然后通过常规血浆分级分离方法从中 获得超免疫球蛋白， 并施用给另一对象从而赋予其对葡萄球菌感染的抗性或者治疗。根据 本发明， 超免疫球蛋白特别可用于免疫受损的个体、 接受了介入性方法的个体或者时间不 允许个体响应于疫苗接种而产生自身抗体的情况。 对于涉及被动免疫的示例性方法和组合 物， 参见美国专利 6,936,258、 6,770,278、 6,756,361、 5,548,066、 5,512,282、 4,338,298 和 4,748,018， 其每篇均通过引用以整体并入本文。
     在某些方面中， 方法包括通过向有此需要的对象施用所述抗体组合物 ( 例如结合 上述抗原的抗体 ) 治疗或预防感染。治疗和预防感染的靶标患者群体包括感染了细菌性病 原体或者具有感染其之风险的哺乳动物， 例如人。 在一个实施方案中， 待治疗或预防的感染 是金黄色葡萄球菌感染， 包括甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或产生 α- 毒素的金黄色葡 萄球菌的感染， 或者表皮葡萄球菌感染。
     根据一个实施方案， 本发明提供了治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法， 其使 用包含下列一项或多项的组合物 ： 金黄色葡萄球菌 AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 vWa、 Coa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白抗体， 以及可药用运载体。金黄色葡萄球菌抗体可结合上述任何抗原。在一个实 施方案中， 所述抗体组合物是抗体组合物或超免疫组合物。 在另一实施方案中， 所述抗体是 重组抗体、 人抗体或人源化抗体。在又一实施方案中， 所述抗体是单克隆抗体或其片段。
     可通过本领域常规方法确定所述抗体组合物的治疗或预防有效量。 本领域技术人 员应了解， 所述量可根据所述组合物中特定抗体、 所述组合物中抗体的浓度、 施用频率、 待 治疗或预防之感染的严重程度以及对象的具体状况 ( 例如年龄、 体重和免疫状态 ) 而有所变化。在一些实施方案中， 所述剂量是每千克体重至少 1、 5、 10、 25、 50 或 100μg 或 mg 抗体 组合物 (mg/kg)， 包括至少 100mg/kg、 至少 150mg/kg、 至少 200mg/kg、 至少 250mg/kg、 至少 500mg/kg、 至少 750mg/kg 和至少 1000mg/kg。 单克隆抗体组合物的剂量通常可以较低， 例如 抗体组合物剂量的 1/10， 例如至少约 1、 5、 10、 25 或 50μg/kg 或 mg/kg， 至少约 10mg/kg、 至 少约 15mg/kg、 至少约 20mg/kg 或者至少约 25mg/kg。施用途径可以是适于被动免疫的任何 途径。因此， 涵盖了静脉内、 皮下、 肌内、 腹膜内、 吸入及其它施用途径。如上所述， 抗体的治 疗或预防有效量是足以实现治疗或预防有益作用的量。
     保护性抗体组合物可中和和 / 或预防感染。保护性抗体组合物可包含一定量 的 AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白的抗体， 其在单独使用时 不具有保护性， 而当组合时其产生保护性抗体组合物。
     所述抗体组合物可在联合治疗中与抗感染剂、 抗生素药剂和 / 或抗微生物剂联合 施用。抗感染剂包括但不限于万古霉素和溶葡萄菌素。抗生素药剂和抗微生物剂包括但不 限于青霉素酶抗性青霉素、 先锋霉素和碳青霉烯类 (carbapenems)， 包括万古霉素、 溶葡萄 菌素、 青霉素 G、 氨苄西林、 苯唑西林、 萘夫西林、 氯唑西林、 双氯西林、 头孢噻吩、 头孢唑林、 头孢氨苄、 环己烯胺头孢菌素、 头孢孟多、 头孢西丁、 亚胺培南、 美罗培南、 庆大霉素、 替考拉 宁、 林可霉素和克林霉素。这些抗生素的剂量是本领域公知的。参见， 例如 Merck Manual Of Diagnosis And Therapy， §13， 157 章， 第 100 版 (Beers & Berkow 编， 2004)。可以在 本文所述主动或被动免疫疗法施用之前、 施用同时或施用之后联合抗感染、 抗生素和 / 或 抗微生物剂使用。
     在一些实施方案中， 施用相对少给药次数的抗体组合物， 例如一次或两次给药， 以 及应用常规抗生素疗法， 其通常包括在数天或数星期内多次给药。 因此， 所述抗生素可以在 一段时期内 ( 例如至少 5 天、 10 天或甚至 14 或更多天 ) 每天一次、 两次或三次或更多次， 而 所述抗体组合物通常仅施用一次或两次。 但是， 可选择抗体组合物和抗生素的不同剂量、 给 药时间和相对量， 并且可由本领域技术人员来作出判断。
     出于本说明书和权利要求的目的， 术语 “表位” 和 “抗原决定簇” 可互换地用于表示 抗原上 B 和 / 或 T 细胞应答或识别的部位。B 细胞表位可由连续氨基酸形成， 或者由通过蛋 白质三级折叠而靠近的非连续氨基酸形成。 由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶 剂后仍保留， 而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理之后丢失。表位通常包括独 特空间构象中至少 3 个、 更常见至少 5 个或 8 ～ 10 个氨基酸。确定表位空间构象的方法包 括例如 X- 射线晶体衍射和二维核磁共振。参见例如 Epitope Mapping Protocols(1996)。可在简单的免疫测定中鉴定出识别相同表位的抗体， 所述免疫测定显示一种抗体阻断另一 种抗体与靶抗原结合的能力。对于 CD8 细胞， T 细胞识别约 9 个氨基酸的连续表位， 而对于 CD4 细胞， 为约 13 ～ 15 个氨基酸。可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定鉴定出识别所 述表位的 T 细胞， 如下所述进行 ： 测定预致敏 T 细胞响应于表位的 3H- 胸苷掺入 (Bruke 等， 1994)、 测定抗原依赖性杀伤 (cytotoxic T lymphocyte assay， Tigges 等， 1996) 或者测定 细胞因子分泌。
     可通过增殖测定 (CD4(+)T 细胞 ) 或 CTL( 细胞毒 T 细胞 ) 测定来确定细胞介导免 疫应答的存在。 体液应答和细胞应答对免疫原的保护性或治疗性作用的相对贡献可通过以 下方式进行区分 ： 从经免疫的同基因动物中单独分离 IgG 和 T 细胞， 在第二对象中测量保护 性或治疗性作用。
     本文和权利要求中使用的术语 “抗体” 或 “免疫球蛋白” 可互换地使用， 并表示作 为动物或接受者免疫应答的一部分发挥作用的几类结构上相关蛋白质中的任意种， 所述蛋 白质包括 IgG、 IgD、 IgE、 IgA、 IgM 和相关蛋白。
     在正常生理条件下， 抗体存在于血浆及其它体液中以及某些细胞的膜中， 其由称 为 B 细胞的淋巴细胞类型或者其功能等同物产生。IgG 类别的抗体由通过二硫键连接的四 条多肽链组成。完整 IgG 分子的四条链是两条相同的重链 ( 称为 H 链 ) 和两条相同的轻链 ( 称为 L 链 )。
     为了产生多克隆抗体， 用抗原或抗原片段 ( 通常与佐剂一起， 必要时， 与运载体偶 连 ) 免疫宿主例如兔、 山羊、 绵羊或人。随后从宿主的血清中收集针对所述抗原的抗体。可 针对所述抗原亲和纯化多克隆抗体， 使其成为单特异性的。
     为了产生单克隆抗体， 用所述抗原对合适供体 ( 通常为小鼠 ) 进行超免疫。然后， 分离产生抗体的脾细胞。将这些细胞与具有永生化特征的细胞 ( 例如骨髓瘤细胞 ) 融合， 以提供融合细胞杂交体 ( 杂交瘤 )， 其可在培养物中维持并分泌所需单克隆抗体。然后， 大 量培养所述细胞， 从培养基中收获单克隆抗体备用。 根据定义， 单克隆抗体对单个表位具有 特异性。为此， 对于类似的抗原， 单克隆抗体往往具有比多克隆抗体更低的亲和常数。
     也可通过使用脾细胞或来源于脾的细胞系的原代培养物产生单克隆抗体 (Anavi， 1998)。 为 产 生 重 组 抗 体 ( 一 般 性 参 见 Huston 等， 1991 ； Johnson 等， 1991 ； Mernaugh 等， 1995)， 将来自产生抗体之 B 淋巴细胞的动物或杂交瘤的信使 RNA 逆转录得到互补 DNA(cDNA)。 扩增抗体 cDNA( 可以是全长或部分长度 )， 并克隆进噬菌体或质粒中。 所述 cDNA 可以是重链和轻链 cDNA 的部分长度， 其为间隔的或者通过接头相连。使用合适表达系统表 达所述抗体或抗体片段， 得到重组抗体。也可通过筛选相关表达文库获得抗体 cDNA。
     如本领域公知地， 所述抗体可以与固体支持物基底结合， 或者与可检出部分缀合， 或者两者皆有。与荧光部分或酶部分缀合的一般性讨论参见 Johnstone 等 (1982)。抗体与 固体支持物基底的结合也是本领域公知的 (Harlow 等， 1988 ； Borrebaeck， 1992)。
     本文及权利要求中所用的短语 “抗体的免疫部分” 包括抗体的 Fab 片段、 抗体的 Fv 片段、 抗体的重链、 抗体的轻链、 抗体的重链和轻链非连接混合物、 由抗体的重链和轻链组 成的异二聚体、 抗体重链的催化结构域、 抗体轻链的催化结构域、 抗体轻链的可变片段、 抗 体重链的可变片段以及抗体的单链变体 ( 也称为 scFv)。另外， 该术语包括嵌合免疫球蛋 白， 其是来源于不同物种之融合基因的表达产物。 所述物种之一可以是人， 此时嵌合免疫球蛋白称为人源化的。通常， 抗体的免疫部分与其所来源的完整抗体竞争特异性结合抗原。
     任选地， 抗体 ( 或优选地， 抗体的免疫部分 ) 可以与其它蛋白质化学缀合或者表达 为融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求的目的， 所有此类融合蛋白均包含在抗体或抗 体免疫部分的定义中。
     本文使用的术语 “免疫原性物质” 或 “免疫原” 或 “抗原” 可互换地用于表示在施用 给接受者后 ( 单独地、 与佐剂一起或者呈现于展示载体上 ) 能够诱导针对其自身的免疫应 答的分子。
     VI. 核酸
     在某些实施方案中， 本发明涉及编码本发明蛋白质、 多肽和肽的重组多核苷酸。 包 括针对 Emp、 Eap 或 AdsA 以及其它细菌蛋白质 ( 包括但不限于 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 Coa、 vWa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基 葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白 ) 的核酸序列。
     本申请使用的术语 “多核苷酸” 是指重组的或者已分离出的不含总基因组核酸的 核酸分子。术语 “多核苷酸” 是寡核苷酸 ( 长度为 100 个残基或更少的核酸 )、 重组载体 ( 其 包括例如质粒、 粘粒、 噬菌体、 病毒等 )。在某些方面中， 多核苷酸包含调节序列， 其基本上 与其天然基因或蛋白质编码序列相分隔。多核苷酸可以是单链 ( 编码链或反义链 ) 或双链 的， 其可以是 RNA、 DNA( 基因组、 cDNA 或合成的 )、 其类似物或其组合。另外的编码或非编码 序列可以存在于多核苷酸中， 但这不是必需的。
     在这方面， 术语 “基因” 、 “多核苷酸” 或 “核酸” 用于表示编码蛋白质、 多肽或肽的 核酸 ( 包含正确转录、 翻译后修饰或定位所需的任何序列 )。如本领域技术人员所了解地， 此术语涵盖基因组序列、 表达盒、 cDNA 序列、 mRNA 序列和较小的经改造核酸区段， 其表达或 可适于表达蛋白质、 多肽、 结构域、 肽、 融合蛋白和突变体。 编码多肽之全部或部分的核酸可 含有编码该多肽之全部或部分的连续核酸序列， 其长度为 ： 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 260、 270、 280、 290、 300、 310、 320、 330、 340、 350、 360、 370、 380、 390、 400、 410、 420、 430、 440、 441、 450、 460、 470、 480、 490、 500、 510、 520、 530、 540、 550、 560、 570、 580、 590、 600、 610、 620、 630、 640、 650、 660、 670、 680、 690、 700、 710、 720、 730、 740、 750、 760、 770、 780、 790、 800、 810、 820、 830、 840、 850、 860、 870、 880、 890、 900、 910、 920、 930、 940、 950、 960、 970、 980、 990、 1000、 1010、 1020、 1030、 1040、 1050、 1060、 1070、 1080、 1090、 1095、 1100、 1500、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 9000、 10000 个或更多的本发明多肽的核苷 酸、 核苷或碱基对。还考虑到， 特定多肽可由含有变化的核酸所编码， 所述核酸具有稍有不同的核酸序列， 但是尽管如此仍编码相同或基本上相似的蛋白质 ( 参见上文表 2)。
     在一些特定实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 的核酸序列， 其还可与下列相组合 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻 连蛋白结合蛋白。因此， 分离的核酸区段或含有核酸区段的载体可编码例如具有免疫原 性的 ： Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 和 / 或 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。术语 “重组” 可与 “多肽” 或具体的多肽名称联用， 其一般是指由已经过体外操作的核酸分子或者这些分 子之复制产物的核酸分子所产生的多肽。
     在另一些实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其包含编码用于 在对象中产生免疫应答之肽或多肽的核酸序列。在多个实施方案中， 本发明的核酸可用于 基因疫苗。
     本发明中所用的核酸区段， 不管其编码序列长度如何， 可以与其它核酸序列 ( 例 如启动子、 多聚腺苷酸化信号、 额外的限制性酶切位点、 多克隆位点、 其它编码区段等 ) 相 组合， 从而使它们的全长可变化很大。因此， 考虑到可使用几乎任何长度的核酸片段， 其总 长度优选受到制备简便性和在预定重组核酸方案中用途的限制。在某些情况下， 核酸序列 可编码具有额外异源编码序列的多肽序列， 例如以允许纯化所述多肽、 转运、 分泌、 翻译后 修饰或者为了治疗益处 ( 例如靶向或效力 )。 如上所述， 可将标签或其它异源多肽添加到所 修饰的多肽编码序列， 其中 “异源” 表示与所修饰多肽不同的多肽。
     在另一些实施方案中， 本发明涉及分离的核酸区段和重组载体， 其在序列中包含 来自下列的连续核酸序列 ： SEQ ID NO ： 1(Emp)、 SEQ ID NO ： 3(Eap)、 SEQ ID NO ： 5(EsxA)、 SEQ ID NO ： 7(EsxB)、 SEQ ID NO ： 9(SdrD)、 SEQ ID NO ： 11(SdrE)、 SEQ ID NO ： 13(IsdA)、 SEQ ID NO ： 15(IsdB)、 SEQ ID NO ： 17(SpA)、 SEQ ID NO ： 19(ClfB)、 SEQ ID NO ： 21(IsdC)、 SEQ IDNO ： 23(SasF)、 SEQ ID NO ： 25(SdrC)、 SEQ ID NO ： 27(ClfA)， SEQ ID NO ： 29(EsaB)、 SEQ ID NO ： 31(EsaC)、 SEQ ID NO ： 33(SasB) 或 SEQ ID NO ： 35(Sas) 或者编码分泌型毒力因子和 / 或表面蛋白的任何其它核酸序列。
     在某些实施方案中， 本发明提供了与本文公开的序列具有显著同一性的多核苷酸 变体， 使用本文所述方法 ( 例如使用标准参数的 BLSAT 分析 )， 它们与本发明的多核苷酸序 列相比它们包含至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％或更高序 列同一性 ( 包括其间的所有值和范围 )。在某些方面中， 本发明的分离多核苷酸包含编码 如下多肽的核苷酸序列， 所述多肽与本发明的氨基酸序列在所述序列整个长度上具有至少 90％、 优选 95％及更高的同一性 ； 或者包含与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
     本发明还考虑使用与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸。
     本发明还提供了本发明多核苷酸片段的用途， 其在施用给对象时具有与多核苷酸 相同的免疫原性。
     本发明还提供了编码如上所述本发明蛋白质免疫片段的多核苷酸的用途。
     A. 载体
     本发明的多肽可由载体中包含的核酸分子编码。 所使用的术语 “载体” 是指运载体 核酸分子， 异源核酸序列可插入其中用以引入到其可复制和表达的细胞中。核酸序列可以 是 “异源的” ， 在上下文中其表示对于所述载体待引入其中的细胞或者待掺入其中的核酸而 言是外源的， 其包含与所述细胞或核酸中之序列同源的序列， 但是其是在宿主细胞或核酸 中其通常不存在的位置。载体包括 DNA、 RNA、 质粒、 粘粒、 病毒 ( 噬菌体、 动物病毒和植物病 毒 ) 和人工染色体 ( 例如 YAC)。本领域技术人员能够通过标准重组技术 ( 例如 Sambrook 等， 2001 ； Ausubel 等， 1996， 其两者通过引用并入本文 ) 容易地构建载体。除了编码 Emp、 Eap 或 AdsA 多肽之外， 载体还可编码 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡 萄球菌肽或蛋白质， 载体可编码多肽序列 ( 例如标签或免疫原性增强肽 )。 编码这些融合蛋 白的可用载体包括 pIN 载体 (Inouye 等， 1985)、 编码一段组氨酸的载体和用于产生谷胱甘 肽 S- 转移酶 (GST) 可溶性融合蛋白的 pGEX 载体， 以用于后期纯化和分离或切割。
     本发明的载体可用于宿主细胞中产生 Emp 或 Eap 或 AdsA 多肽。在某些方面中， 所述载体还可产生 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它葡萄球菌肽或 蛋白质， 其随后可纯化用于施用给对象， 或者所述载体可纯化用以直接施用给对象， 从而在 对象中表达所述蛋白质。
     术语 “表达载体” 是指含有编码能够转录的基因产物之至少一部分的核酸序列的 载体。在一些情况下， RNA 分子随后翻译成蛋白质、 多肽或肽。表达载体可含有多种 “控制 序列” ， 其表示有效连接的编码序列在特定宿主生物体内转录和可能的翻译所需的核酸序 列。除了调节转录和翻译的控制序列之外， 载体和表达载体还可含有用作其它功能的核酸 序列， 其在本文中有所描述。
     1. 启动子和增强子
     “启动子” 是控制序列。启动子通常是控制转录起始和速率的核酸序列区域。它可 含有可在此结合调节性蛋白和分子 ( 例如 RNA 聚合酶及其它转录因子 ) 的遗传元件。短语 “有效位于” 、 “有效连接” 、 “控制之下” 和 “处于转录控制之下” 表示启动子相对于核酸序列 处于正确功能的位置和 / 或方向， 以控制该序列的转录起始和表达。 启动子可以或不与 “增 强子” 配合使用， 所述增强子是指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。
     启动子可以是与基因或序列天然相连的启动子， 如可通过将位于编码区段或外显 子上游的 5′非编码序列分离而获得。这样的启动子可称为 “内源的” 。类似地， 增强子可 以是与核酸序列天然相连的增强子， 其位于该序列的下游或上游。 或者， 将编码核酸区段置 于重组或异源启动子控制下会获得某些优势， 所述启动子是指在其自然环境中通常不与核 酸序列相连的启动子。重组或异源增强子还指在其自然状态下通常不与核酸序列相连的 增强子。这些启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子， 以及分离自任何其它原 核、 病毒或真核细胞的启动子或增强子， 以及非 “天然” 的启动子或增强子， 即含有不同转录 调节区域的不同元件和 / 或改变其表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列 之外， 可使用重组克隆和 / 或核酸扩增技术 ( 包括 PCRTM) 以及本文公开的组合物产生序列 ( 参见美国专利 4,683,202、 美国专利 5,928,906， 其各自通过引用并入本文 )。
     自然地， 利用在选择用于表达的细胞类型或生物体中有效指导 DNA 区段表达的启 动子和 / 或增强子可以是重要的。分子生物学领域技术人员一般知晓启动子、 增强子和细 胞类型的组合用于蛋白质表达的用途 ( 参见 Sambrook 等， 2001， 通过引用并入本文 )。 可用 的启动子可以是组成型、 组织特异性或可诱导的， 在某些实施方案中， 在特定条件下 ( 例如 大规模生产重组蛋白质或肽 ) 可指导引入的 DNA 区段高水平表达。
     在本发明的背景下， 可利用多个元件 / 启动子来调节基因的表达。作为可响应于 特定刺激而活化的核酸序列区域的这些可诱导元件的实例包括但不限于 ： 免疫球蛋白重 链 (Banerji 等， 1983 ； Gilles 等， 1983 ； Grosschedl 等， 1985 ； Atchinson 等， 1986， 1987 ； Imler 等， 1987 ； Weinberger 等， 1984 ； Kiledjian 等， 1988 ； Porton 等 ； 1990)、 免疫球蛋白 轻 链 (Queen 等， 1983 ； Picard 等， 1984)、 T 细 胞 受 体 (Luria 等， 1987 ； Winoto 等， 1989 ；Redondo 等 ； 1990)、 HLA DQα 和 / 或 DQ β(Sullivan 等， 1987)、 β 干扰素 (Goodbourn 等， 1986 ； Fujita 等， 1987 ； Goodbourn 等， 1988)、 白介素 -2(Greene 等， 1989)、 白介素 -2 受体 (Greene 等， 1989 ； Lin 等， 1990)、 MHC II 类 5(Koch 等， 1989)、 MHC II 类 HLA-DRα(Sherman 等， 1989)、 β- 肌动蛋白 (Kawamoto 等， 1988 ； Ng 等 ； 1989)、 肌肉肌酸激酶 (MCK)(Jaynes 等， 1988 ； Horlick 等， 1989 ； Johnson 等， 1989)、 前白蛋白 ( 转甲状腺素 )(Costa 等， 1988)、 弹性蛋白酶 I(Ornitz 等， 1987)、 金属硫蛋白 (MTII)(Karin 等， 1987 ； Culotta 等， 1989)、 胶原酶 (Pinkert 等， 1987 ； Angel 等， 1987)、 白蛋白 (Pinkert 等， 1987 ； Tronche 等， 1989， 1990)、 α- 甲 胎 蛋 白 (Godbout 等， 1988 ； Campere 等， 1989)、 γ- 珠 蛋 白 (Bodine 等， 1987 ； Perez-Stable 等， 1990)、 β- 珠 蛋 白 (Trudel 等， 1987)、 c-fos(Cohen 等， 1987)、 c-Ha-Ras(Triesman， 1986 ； Deschamps 等， 1985)、 胰 岛 素 (Edlund 等， 1985)、 神经细胞粘 附分子 (NCAM)(Hirsh 等， 1990)、 α1- 抗胰蛋白酶 (Latimer 等， 1990)、 H2B(TH2B) 组蛋白 (Hwang 等， 1990)、 小鼠和 / 或 I 型胶原 (Ripe 等， 1989)、 葡萄糖调节蛋白 (GRP94 和 GRP78) (Chang 等， 1989)、 大 鼠 生 长 素 (Larsen 等， 1986)、 人 血 清 淀 粉 样 蛋 白 A(SAA)(Edbrooke 等， 1989)、 肌 钙 蛋 白 I(TN I)(Yutzey 等， 1989)、 血 小 板 来 源 生 长 因 子 (PDGF)(Pech 等， 1989)、 杜 氏 肌 营 养 不 良 (Klamut 等， 1990)、 SV40(Banerji 等， 1981 ； Moreau 等， 1981 ； Sleigh 等， 1985 ； Firak 等， 1986 ； Herr 等， 1986 ； Imbra 等， 1986 ； Kadesch 等， 1986 ； Wang 等， 1986 ； Ondek 等， 1987 ； Kuhl 等， 1987 ； Schaffner 等， 1988)、多 形 瘤 (Swartzendruber 等， 1975 ； Vasseur 等， 1980 ； Katinka 等， 1980， 1981 ； Tyndell 等， 1981 ； Dandolo 等， 1983 ； de Villiers 等， 1984 ； Hen 等， 1986 ； Satake 等， 1988 ； Campbell 等， 1988)、 逆转录病毒 (Kriegler 等， 1982， 1983 ； Levinson 等， 1982 ； Kriegler 等， 1983， 1984a， b， 1988 ； Bosze 等， 1986 ； Miksicek 等， 1986 ； Celander 等， 1987 ； Thiesen 等， 1988 ； Celander 等， 1988 ； Choi 等， 1988 ； Reisman 等， 1989)、 乳 头 状 瘤 病 毒 (Campo 等， 1983 ； Lusky 等， 1983 ； Spandidos 和 Wilkie， 1983 ； Spalholz 等， 1985 ； Lusky 等， 1986 ； Cripe 等， 1987 ； Gloss 等， 1987 ； Hirochika 等， 1987 ； Stephens 等， 1987)、 乙肝病毒 (Bulla 等， 1986 ； Jameel 等， 1986 ； Shaul 等， 1987 ； Spandau 等， 1988 ； Vannice 等， 1988)、 人免疫缺陷病毒 (Muesing 等， 1987 ； Hauber 等， 1988 ； Jakobovits 等， 1988 ； Feng 等， 1988 ； Takebe 等， 1988 ； Rosen 等， 1988 ； Berkhout 等， 1989 ； Laspia 等， 1989 ； Sharp 等， 1989 ； Braddock 等， 1989)、 巨细胞病毒 (CMV)IE(Weber 等， 1984 ； Boshart 等， 1985 ； Foecking 等， 1986)、 长臂猿类人猿白血病病毒 (Holbrook 等， 1987 ； Quinn 等， 1989)。
     可诱导元件包括但不限于 ： MT II- 佛波酯 (TFA)/ 重金属 (Palmiter 等， 1982 ； Haslinger 等， 1985 ； Searle 等， 1985 ； Stuart 等， 1985 ； Imagawa 等， 1987 ； Karin 等， 1987 ； Angel 等， 1987b ； McNeall 等， 1989) ； MMTV( 小鼠乳腺瘤病毒 )- 糖皮质激素 (Huang 等， 1981 ； Lee 等， 1981 ； Majors 等， 1983 ； Chandler 等， 1983 ； Lee 等， 1984 ； Ponta 等， 1985 ； Sakai 等， 1988) ； β- 干扰素 - 聚 (rI)x/ 聚 (rc)(Tavernier 等， 1983) ； 腺病毒 5E2-ElA(Imperiale 等， 1984) ； 胶原酶 - 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987a) ； 基质裂解素 - 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987b) ； SV40- 佛波酯 (TPA)(Angel 等， 1987b) ； 鼠 MX 基因 - 干扰素， 新城疫病毒 (Hug 等， 1988) ； GRP78 基 因 -A23187(Resendez 等， 1988) ； α-2- 巨 球 蛋 白 -IL-6(Kunz 等， 1989) ； 中间丝蛋白 - 血清 (Rittling 等， 1989) ； MHC I 类基因 H-2κb- 干扰素 (Blanar 等， 1989) ； HSP70-ElA/SV40 大 T 抗 原 (Taylor 等， 1989， 1990a， 1990b) ； 增殖蛋白 - 佛波酯 /TPA(Mordacq 等， 1989) ； 肿瘤坏死因子 -PMA(Hensel 等， 1989) ； 以及甲状腺刺激激素 α 基 因 - 甲状腺素 (Chatterjee 等， 1989)。
     认为可用于控制编码本发明多核苷酸的肽或蛋白质表达的特定启动子不是关键 性的， 只要其能够在靶细胞 ( 优选细菌细胞 ) 中表达所述多核苷酸即可。当靶向人细胞时， 优选使得多核苷酸编码区域位于邻近能够在人细胞中表达的启动子并且处于其控制之下。 一般而言， 此类启动子可包括细菌、 人或病毒启动子。
     在多个实施方案中， 人巨细胞病毒 (CMV) 立即早期基因启动子、 SV40 早期启动子 或者劳氏肉瘤病毒长末端重复可用于获得 Emp、 AdsA 和 / 或 Eap 多核苷酸的高水平表达。 在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可用于与下列相组合地表达 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SpA、 vWa、 Coa、 Ebh、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自 溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受 体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化 蛋 白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或任何其它细菌多肽。使用本领域中公知的其它病毒或哺乳动物 细胞或细菌噬菌体启动子来实现多核苷酸的表达也在考虑之中。
     在向对象施用载体以表达蛋白质的实施方案中， 考虑用于所述载体的理想的启动 子是不受细胞因子下调的启动子， 或者是足够强到即使下调也能产生引发免疫应答的有效 量的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的启动子。这样的非限制性实例有 CMV IE 和 RSV LTR。在 另一些实施方案中， 使用在细胞因子存在下被上调的启动子。MHC I 启动子在 IFN-γ 存在 下增强表达。
     可使用组织特异性启动子， 特别是如果表达是在希望表达抗原的细胞 ( 例如树突 状细胞或巨噬细胞 ) 中进行的话。哺乳动物 MHC I 和 MHC II 启动子是此类组织特异性启 动子的实例。
     2. 起始信号和内部核糖体结合位点 (IRES)
     特异性起始信号也可以是编码序列有效翻译所需的。这些信号包括 ATG 起始密码 子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号， 包括 ATG 起始密码子。本领域技术人员 能够容易地确定这一点并提供必要的信号。公知的是， 起始密码子必须与所需编码序列是 “同框的” ， 以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合 成的， 并且可以是在细菌或哺乳动物细胞中有效的。可通过包含合适的转录增强子元件来 提高表达效率。
     在本发明的某些实施方案中， 使用内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 元件产生多基因或多顺反子 mRNA。IRES 元件能够绕过 5′ - 甲基化帽 依赖性翻译的核糖体扫描模型， 并在内部位点开始翻译 (Pelletier 和 Sonenberg， 1988)。 已记载了来自微小 RNA 病毒科两个成员 ( 骨髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒 ) 的 IRES 元件 (Pelletier 和 Sonenberg， 1988)， 以及来自哺乳动物 mRNA 的 IRES(Macejak 和 Sarnow， 1991)。IRES 元件可与异源开放读码框相连。多个开放读码框可一起转录， 其各自被 IRES 隔开， 形成多顺反子 mRNA。借助于 IRES 元件， 每个开放读码框能够接近核糖体从而有效翻 译。可使用单个启动子 / 增强子有效地表达多个基因， 从而转录单个 mRNA( 参见美国专利 5,925,565 和 5,935,819， 其通过引用并入本文 )。
     3. 多克隆位点
     载体可包含多克隆位点 (MCS)， 其是含有多个限制性酶切位点的核酸区域， 任意所 述位点可与标准重组技术结合使用来消化载体 ( 参见 Carbonelli 等， 1999， Levenson 等， 1998 以及 Cocea， 1997， 通过引用并入本文 )。通常， 使用限制性酶使载体线性化或片段化， 所述限制性酶在 MCS 内切割以使得外源序列连接至所述载体。涉及限制性酶和连接反应的 技术是重组技术领域技术人员公知的。
     4. 剪接位点
     大多数经转录的真核 RNA 分子要经历 RNA 剪接， 以从原始转录本中除去内含子。 含 有基因组真核序列的载体可需要供体和 / 或接受体剪接位点， 以确保正确加工转录本用于 蛋白质表达。( 参见 Chandler 等， 1997， 通过引用并入本文。)
     5. 终止信号
     本发明的载体或构建物通常包含至少一个终止信号。 “终止信号” 或 “终止子” 由 参与特异性终止 RNA 聚合酶进行的 RNA 转录的 DNA 序列构成。因此， 在某些实施方案中， 考 虑了结束 RNA 转录本产生的终止信号。在体内终止子可能是实现期望之 mRNA 水平所必需 的。
     在真核系统中， 终止子区域还可包含允许位点特异性切割新转录本的特异性 DNA 序列， 使得暴露多腺苷酸化位点。该信号使得专门的内源聚合酶加入一段约 200 个 A 残基 ( 多聚 A) 至转录本的 3′端。此多聚 A 尾修饰的 RNA 分子似乎更稳定的， 并且更有效地翻 译。因此， 在涉及真核生物的另一些实施方案中， 优选终止子包含用于切割 RNA 的信号， 更 优选终止子信号促进 mRNA 的多腺苷酸化。
     考虑用于本发明中的终止子包括本文所述的或者本领域技术人员已知的任何已 知转录终止子， 包括但不限于例如牛生长素终止子或病毒终止序列 ( 例如 SV40 终止子 )。 在某些实施方案中， 终止信号可缺少可转录或可翻译序列， 例如由于序列截短所致。
     6. 多腺苷酸化信号
     在表达中， 尤其是真核表达中， 通常包括多腺苷酸化信号， 以实现合适的转录本多 腺苷酸化。认为多腺苷酸化信号的性质对于本发明成功实施来说不是关键性的， 和 / 或可 使用任何这样的序列。优选实施方案包括 SV40 多腺苷酸化信号和 / 或牛生长素多腺苷酸 化信号， 其在多种靶细胞中是方便的和 / 或已知很好地发挥功能。多腺苷酸化可增加转录 本的稳定性或可利于细胞质转运。
     7. 复制起点
     为了在宿主细胞中扩增载体， 其可含有一个或多个复制起点 ( 常称为 “ori” )， 其是起始复制的特定核酸序列。或者， 如果宿主细胞是酵母的话， 则可使用自主复制序列 (autonomously replicating sequence， ARS)。
     8. 选择和筛选标记在本发明的某些实施方案中， 可通过在表达载体中编码筛选或选择标记从而在体 外或体内鉴定含有本发明核酸构建物的细胞。当转录和翻译时， 标记物赋予细胞可鉴定的 改变， 其使得容易鉴定含有所述表达载体的细胞。 通常， 选择标记是赋予允许进行选择之性 质的标记物。阳性选择标记是指标记物的存在允许其进行选择的标记物， 而阴性选择标记 是指其存在阻碍其进行选择的标记物。阳性选择标记的实例有抗药性标记物。
     通常， 包含药物选择标记有助于克隆和鉴定转化体， 例如， 赋予了新霉素、 嘌呤霉 素、 潮霉素、 DHFR、 GPT、 zeocin 或组氨醇抗性的标记物是可用的选择标记。除了赋予基于 条件来区分转化体之表型的标记物之外， 其它类型标记物包括筛选标记， 例如用于显色分 析的 GFP。或者， 可利用可筛选的酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶 (tk) 或氯霉素乙酰转移酶 (CAT)。本领域技术人员也了解如何利用免疫标记物， 其可与 FACS 分析结合使用。认为所 用的标记物不是关键性的， 只要其能够与编码本发明蛋白质的核酸同时表达即可。选择标 记和筛选标记的其它实例是本领域技术人员公知的。
     B. 宿主细胞
     本文使用的术语 “细胞” 、 “细胞系” 和 “细胞培养物” 可互换地使用。所有这些术 语还包括其后代 ( 其为任意和所有的后代 )。应了解， 由于人为或偶然的突变， 可能并非所 有后代都是相同的。在表达异源核酸序列的情形下， “宿主细胞” 是指原核或真核细胞， 其 包括任何可进行转化的、 能够复制载体或表达由载体编码之异源基因的生物体。宿主细胞 可以并且已用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以被 “转染” 或 “转化” ， 其表示外源核酸 ( 例如重组的蛋白质编码序列 ) 转移或引入宿主细胞的过程。经转化细胞包括原代对象细 胞及其后代。
     宿主细胞可来源于原核生物或真核生物， 包括细菌、 酵母细胞、 昆虫细胞和哺乳动 物细胞， 用以复制载体或者表达核酸序列的部分或全部。许多细胞系和培养物可用作宿主 细胞， 并且它们可通过美国典型培养物保藏中心 (ATCC)( 其为作为活培养物和遗传物质存 档的机构 (www.atcc.org)) 获得。本领域技术人员根据载体主链和所期望结果可确定合适 的宿主。例如， 可将质粒或粘粒引入原核生物宿主细胞， 用以复制多种载体或表达所编码 蛋白质。用作宿主细胞进行载体复制和 / 或表达的细菌细胞包括葡萄球菌属菌株、 DH5a、 TM JM109 和 KC8， 以及多种市售细菌宿主 ( 例如 SURE 感受态细胞和 SOLOPACK Gold 细胞 (STRATAGENE La Jolla， CA)。或者， 细菌细胞 ( 例如大肠杆菌 LE392) 可用作噬菌体病 毒的宿主细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 裂殖酵母 (Saccharomyces pombe) 和毕赤酵母 (Pichia pastoris)。 用于载体复制和 / 或表达的真核宿主细胞的实例包括 HeLa、 NIH3T3、 Jurkat、 293、 Cos、 CHO、 Saos 和 PC12。可获得来自多种细胞类型和生物体的多种宿主细胞， 并且为本领域 技术人员所知。类似地， 病毒载体可与真核或原核宿主细胞 ( 特别是允许所述载体复制或 表达的那些 ) 结合使用。
     一些载体可使用控制序列， 所述控制序列允许载体在原核和真核细胞中均能复制 和 / 或表达。本领域技术人员还应了解， 孵育所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复 制的条件。还应了解且已知的是允许大规模生产载体的技术和条件， 以及产生载体所编码 之核酸及其相关多肽、 蛋白质或肽的技术和条件。
     C. 表达系统
     存在多种表达系统， 其包括上述组合物的至少一部分或全部。基于原核生物和 / 或真核生物的系统可用于本发明， 以产生核酸序列或其相关多肽、 蛋白质和肽。 许多这样的 系统是可购得的并且易于得到。
     昆虫细胞 / 杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白质表达， 例如美国 专利 5,871,986、 4,879,236 中所述 ( 其两者均通过引用并入本文 )， 并且其可例如以商品名 TM MAXBAC 2.0 购自 INVITROGEN 以及以 BACPACK BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM 购自 CLONTECH
     除 了 公 开 的 本 发 明 表 达 系 统 之 外， 其 它 表 达 系 统 实 例 包 括 STRATAGENE 的 TM COMPLETE CONTROL 可诱导哺乳动物表达系统， 其涉及合成的蜕皮素诱导受体， 或者其 pET 表达系统 ( 一种大肠杆菌表达系统 )。 可诱导表达系统的另一个例子可得自 INVITROGEN TM 其具有 T-REX ( 四环素调节表达 ) 系统——一种使用全长 CMV 启动子的可诱导哺乳动物表 达系统。INVITROGEN 还提供了酵母表达系统， 称为甲醇毕赤酵母 (Pichia methanolica) 表达系统， 其设计成在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白质。本领域技 术人员了解如何表达载体 ( 例如表达构建物 )， 以产生核酸序列或其相关多肽、 蛋白质或 肽。
     D. 核酸的扩增
     可根据标准方法 (Sambrook 等， 2001) 从细胞、 组织或其它样品中分离用作扩增模 板的核酸。在某些实施方案中， 对基本上没有纯化模板核酸的样品进行分析。核酸可以是 基因组 DNA。当使用 RNA 时， 首先将 RNA 转化为互补 DNA 可能是理想的。
     本文使用的术语 “引物” 意在涵盖任何能够在模板依赖性方法中引发新生核酸合 成的任何核酸。通常， 引物是十至二十和 / 或三十个碱基对长的寡核苷酸， 但是可使用更长 的序列。引物可以双链和 / 或单链形式提供， 尽管优选单链形式。
     将设计用于与对应于本文所鉴定基因之序列的核酸选择性杂交的引物对在允许 选择性杂交的条件下与模板核酸相接触。 取决于期望的应用， 可选择高严格杂交条件， 所述 条件仅会使得与引物完全互补的序列进行杂交。在另一些实施方案中， 杂交可在低严格条 件下发生， 以允许用引物序列扩增出含有一个或多个错配的核酸。一旦杂交， 模板 - 引物复 合物与一种或多种利于模板依赖性核酸合成的酶相接触。进行多轮扩增 ( 也称为 “多个循 环” ) 直至产生足够量的扩增产物。
     有许多模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的寡核苷酸序列。 最广为 TM 人知的扩增方法之一是聚合酶链式反应 ( 称为 PCR )， 其在美国专利 4,683,195、 4,683,202 和 4,800,159 以及 Innis 等 (1988) 中有详述， 其每篇均通过引用以整体并入本文。
     可用于实施本发明的扩增靶标核酸序列的替代性方法公开于美国专利 5,843,650 、 5,846,709 、 5,846,783 、 5,849,546 、 5,849,497 、 5,849,547 、 5,858,652 、 5,866,366 、 5,916,776 、 5,922,574 、 5,928,905 、 5,928,906 、 5,932,451 、 5,935,825 、 5,939,291 和 5,942,391、 GB 申请 No.2 202 328 和 PCT 申请 No.PCT/US89/01025， 其每篇均 通过引用以整体并入本文。
     E. 基因转移的方法
     认为适于核酸递送从而有效表达本发明组合物的方法包括几乎任何可将核酸 ( 例如 DNA， 包括病毒和非病毒载体 ) 引入细胞、 组织或生物体的方法， 如本文所述或者本领域普通技术人员已知的。这些方法包括但不限于 DNA 直接递送， 例如通过注射 ( 美国 专 利 5,994,624、 5,981,274、 5,945,100、 5,780,448、 5,736,524、 5,702,932、 5,656,610、 5,589,466 和 5,580,859， 其 每 篇 均 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 包 括 显 微 注 射 (Harland 和 Weintraub， 1985 ； 美国专利 5,789,215， 其通过引用并入本文 ) ； 通过电穿孔 ( 美国专利 No.5,384,253， 其通过引用并入本文 ) ； 通过磷酸钙沉淀 (Graham 和 Van Der Eb， 1973 ； Chen 和 Okayama， 1987 ； Rippe 等， 1990) ； 通过使用 DEAE 葡聚糖然后使用聚乙二醇 (Gopal， 1985) ； 通过直接音速加载 (sonic loading)(Fechheimer 等， 1987) ； 通过脂质体介导的转 染 (Nicolau 和 Sene， 1982 ； Fraley 等， 1979 ； Nicolau 等， 1987 ； Wong 等， 1980 ； Kaneda 等， 1989 ； Kato 等， 1991) ； 或者通过微粒轰击 (PCT 申请 No.WO 94/09699 和 95/06128 ； 美国专 利 5,610,042、 5,322,783、 5,563,055、 5,550,318、 5,538,877 和 5,538,880， 其每篇均通过 引用并入本文 )。通过应用例如这些技术， 可稳定地或瞬时转化细胞器、 细胞、 组织或生物 体。
     VII. 实施例
     给出以下实施例以举例说明本发明的多个实施方案， 但不意在以任何方式限制本 发明。本领域技术人员会了解本发明很好地适于实现目的， 以及获得所提及的目标和优势 以及本文中固有的目的、 目标和优势。现有的实施例以及本文所述的方法是优选实施方案 的代表， 其为示例性的， 并且不意在限制本发明的范围。 本领域技术人员会了解权利要求范 围所限定的在本发明宗旨之内涵盖的变动及其它用途。
     实施例 1
     与脓肿形成相关的包膜蛋白质以及疫苗保护
     A. 结果
     本发明人试图研究葡萄球菌脓肿形成的发病机理， 并鉴定出使得葡萄球菌在此病 变内存活和增殖的细菌因子。该研究使用了鼠肾脓肿模型， 其中用半致死量的金黄色葡萄 球菌感染小鼠以产生持续的感染 (Burts 等， 2005)。在感染后第 5 天杀死小鼠， 切除它们 的肾脏， 进行薄切片苏木精伊红染色组织的组织病理学研究， 或者通过将组织匀浆铺板来 统计葡萄球菌负荷的集落形成单位 (CFU)。与野生型临床分离的金黄色葡萄球菌 Newman 株相比 (Baba 等， 2008)， 在分选酶 A 的结构基因中具有转座子插入物的同基因型变体不形 成脓肿 ( 图 1B、 1D 和 1F)。分选酶 A 将许多种具有 LPXTG 基序分选信号的表面蛋白质与细 胞壁包膜锚定， 其负责许多不同毒力因子的表面展示 (Mazmanian 等， 2000 ； Mazmanian 等， 1999)。为了对脓肿形成定量， 目测检查肾脏， 对每个器官给予 1( 存在表面脓肿 ) 或 0( 不 存在 ) 的得分。最终的加和除以肾脏总数得到一个分数值。另外， 将三个随机选择的右侧 肾脏置于 10％福尔马林中过夜， 包埋， 切片， 并用苏木精和伊红染色。 对于每个肾脏， 用显微 镜观察间隔 200μM 的四个箭头状切片。如果病变在检查的任意平面均能观察到， 则将该器 7 官判断为脓肿形成阳性。用 3×10 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌 Newman 株感染的小鼠显示在 16/20 肾脏上有可见病变 (80％表面脓肿 )， 并且在组织病理学检查的 3/3 肾脏中呈脓肿形 成阳性 ( 表 3)。相反， 用 ΔsrtA 突变体感染的小鼠显示 0％的表面脓肿， 以及 0/3 组织学 病变 ( 表 3)。
     表 3. 回收的 CFU( 含标准差 )， 相对于 Newman 株的 log 减少， P 值 (student′ s t 检验 )， 所观察到的表面脓肿百分比， 所观察到的组织学脓肿数。
    用集落形成单位 (CFU) 表示的葡萄球菌负荷平均值， 计算为针对每种攻击菌株使 用十五只一组的 BALB/c 小鼠感染 5 天后匀浆肾组织中的 log10CFU g-1， 显示为平均值的标 准差 (±SEM)。 b
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录为 P 值。 c -1
     细菌负荷的减少， 计算为 log10CFU g 。 c
     通过目测观察 ( 阳性百分比 ) 以及对来自三只动物的苏木精 - 伊红染色薄切片 组织进行的组织病理学测量感染五天后肾组织中的脓肿形成， 由此记录阳性组织的分数值 (3/n)。
     回收的 CFU( 含标准差 )， 相对于 Newman 株的 log 减少， P 值 (student ′ s t 检 验 )， 所观察到的表面脓肿百分比， 所观察到的组织学脓肿数。
     使用扫描电子显微镜来检查感染组织。将肾脏切片、 固定、 在六甲基二硅氮烷 (HMDS) 中脱水， 用 80％铂 /20％钯喷射涂覆， 然后观察。感染了金黄色葡萄球菌 Newman 株 的肾组织在脓肿中心区域内具有细菌。 在紧密连结的菌苔中发现野生型葡萄球菌 ( 图 1G)， 其包含在较大的纤维蛋白荚膜内的纤维结构。这些葡萄球菌巢 (nest) 中没有白细胞， 并且 似乎被粘附性细胞外基质所包埋。感染了 srtA 突变体的肾组织也具有葡萄球菌， 但是， 该72
    
    a102333540 A CN 102333554说明书62/86 页细菌分散在整个健康肾组织中， 并且其数量比野生型显著减少 ( 图 1H)。
     为了鉴定负责脓肿形成的特异性分选酶 A 底物， 本发明人将含有 bursa aurealis 插入物 (Bae 等， 2004) 的 17 个分选酶底物基因转导进金黄色葡萄球菌 Newman 株中， 并筛 选毒力缺陷的变体。sdrD、 isdB、 clfB、 isdA、 sasB 和 sasD 中的突变造成细菌负荷显著降 低 (P ＜ 0.05)( 图 2)。另外， 在用目测和显微技术分析时， sdrD、 isdB 和 isdA 中的突变显 示较少的脓肿 ( 表 3)。本发明人认为， 表面脓肿＜ 30％以及组织学得分＜ 1/3 的突变显示 出脓肿形成的显著缺陷。表面组织学得分不匹配的突变体不记为缺陷的 ； 而将其归为筛选 误差。令人感兴趣地， clfB 和 sasB 中的突变显示葡萄球菌负荷的缺陷， 但是在脓肿形成方 面不显示缺陷， 而蛋白 A 中的突变显示负荷增加， 同时还显示脓肿形成的缺陷。本发明人想 要知道肾组织中脓肿形成和存活的缺陷是否是由这些突变体无法形成功能性生物膜所致。 换句话说， 脓肿形成的缺陷是否归咎于体外生物膜生长的缺陷？为了研究这一问题， 本发 明人在 96 孔测定板中或盖玻片上培养葡萄球菌， 通过 405nm 的吸光度测量番红精染色的生 物膜。在实验室液体培养基中， 金黄色葡萄球菌 Newman 株不形成生物膜， 但是 Morrissey 及其同事报道了在铁耗尽的 RPMI 中以及 5％大气 CO2 下的生物膜生长 (Johnson 等， 2008)。 使用这些条件， 这里测试的所有突变体菌株均同样良好地生长 ( 数据未显示 )， 但是 srtA、 isdB、 sdrD 或 isdA 中的突变则显示生物膜形成的显著缺陷 (P ＜ 0.05)。这些结果由扫描 电子显微镜实验证实 ( 图 3B、 3C、 3D、 3E、 3F、 3G 和表 4)， 其中金黄色葡萄球菌 Newman 株以 包埋在颗粒状细胞外基质中的多细胞复合物的形式生长 ( 图 3B)。在具有 srtA、 isdB 或 sdrD 突变的葡萄球菌中， 多细胞复合物减少， 细胞外基质减少， 同样的突变也在小鼠中减少 了脓肿形成。因此， 体外生物膜形成可能的确与葡萄球菌形成脓肿的能力相关。本发明人 还测试了消除葡萄球菌中其它包膜因子合成的基因 ( 包括聚 -N- 乙酰葡糖胺 (PNAG/PIA， 其 由 ica 基因的产物合成 )(Heilmann 等， 1996 ； Gotz， 2002) 以及细胞壁相关蛋白 Eap(Scriba 等， 2008 ； Xie 等， 2006) 和 Emp(Hussain 等， 2001)) 中的突变。还测试了葡萄球菌毒力的调 节因子 ： saeR(Novick 和 Jiang， 2003)、 sarA(Cheung 等， 1992)、 mgrA(Chen 等， 2006)、 agrC 和 agrA(Novick， 2003)。emp 中的突变显示最显著的生物膜形成缺陷， 其中番红精吸光度减 少 86％， 扫描 EM 显示无多细胞复合物， 该结果与 Johnson 等 (2008) 的类似研究一致。相 反， Eap 突变体显示轻微但明显的生物膜形成缺陷 ( 图 3A， 表 4)。Emp 和 Eap 是包膜粘附 素， 其介导葡萄球菌和宿主细胞外基质蛋白质纤连蛋白、 玻连蛋白和胶原之间的相互作用 (Scriba 等， 2008 ； Xie 等， 2006 ； Hussain 等， 2001)。所有经测序的金黄色葡萄球菌菌株均 具有这两种蛋白质的基因， 其受两组分系统 SaeRS 以及通用转录因子 SarA 的正调控， 其中 的突变也影响生物膜的形成 (Harraghy 等， 2005)( 图 3A， 表 4)。
     表 4. 体外生物膜测定的 96 孔板。 450nm 下的平均吸光度 ( 含标准差 )， 相比 Newman 株的吸光度降低分数， P 值 (student′ s t 检验 )
    为了研究 Emp 是否是脓肿形成必需的， 用 emp 突变体葡萄球菌攻击小鼠， 在感染后 五天分析肾脏。emp 突变体葡萄球菌分离自肾脏组织， 其与野生型亲本具有相似丰度 ( 图 4A)， 但是这些突变体不能形成脓肿， 而是在整个肾脏组织中保持分散 ( 图 4B)。这些结果 表明， Emp 是体外和体内脓肿和生物膜形成特别必需的包膜因子。注意到， 介导 PNAG 合成 (Heilmann 等， 1997) 之 ica 基因的突变 (icaABCDR) 仅显示生物膜形成的略微减少。尽管 不能产生外多糖， ica 突变体能够产生可通过电子显微镜检测的细胞外基质。另外， ica 突 变体未在体外显示出脓肿形成或细菌负荷的缺陷 ( 图 6A、 6B、 表 5)。因此这些数据表明， 金 黄色葡萄球菌 Newman 株生物膜的细胞外基质不包含 PNAG。Emp 和 Eap 是细胞壁相关表面 蛋白， 其产生可通过葡萄球菌的 SDS 提取以及考马斯染色的 PAGE 分离来检测 ( 图 5A)。使 用此测定， 观察到金黄色葡萄球菌 Newman 株产生大量 Eap 和 Emp。srtA 或 isdB 中的突变 不影响 Emp 和 Eap 的产生或者与细胞壁的结合， 这与以下推测相一致， 即观察到的 srtA 和 isdB 突变体在脓肿和生物膜形成中的缺陷不是由于 Eap 和 Emp 继发作用所导致的。 值得注 意的是， emp 中的突变影响 Eap 的丰度， 推测 Emp 的包膜沉积可能影响 Eap 的表面展示。
     表 5.Ica 毒力。回收的 CFU 平均值， 相比 Newman 株的 log 减少， P 值 (student′ s t 检验 )， 观察到的表面脓肿百分比， 组织学脓肿数。
    
    因为两种蛋白质主要展示在葡萄球菌表面上， 本发明人设想 Emp 和 Eap 用作合适 的疫苗抗原来预防葡萄球菌疾病。将每个蛋白质的结构基因克隆进 pET15b， 在变性条件下 通过借助 N 端 His-6 标签的亲和色谱纯化重组产物。纯化后， Eap 可被折叠， 并在复性缓冲 液中通过第二轮 Ni-NTA 色谱纯化可溶性产物。纯化的 Emp 不能再折叠， 随后保存在 8M 尿 素中 ( 图 5B)。用完全弗氏佐剂 (CFA) 乳化的 PBS、 Eap 或 Emp 免疫小鼠， 用 3×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击小鼠。图 5C 显示， 用 Emp 或 Eap 免疫赋予了对葡萄球菌感染的 有效保护 (P ＜ 0.05)。经 Eap 免疫的小鼠显示葡萄球菌负荷降低 2log， 而经 Emp 免疫的小 鼠显示降低 2.5log。用 Eap(1 ∶ 24000) 或 Emp( ＞ 64000) 免疫的小鼠产生高效价的反应 性 IgG( 图 5D)。如预期地， 用 PBS 模拟免疫的动物产生 70％的表面脓肿和 4/5 的组织学脓 肿。相反， 用 Eap 和 Emp 免疫的小鼠表现出＜ 20％的表面脓肿和 1/5 的组织病变 ( 图 5E)。 因此， 用 Eap 或 Emp 免疫产生针对葡萄球菌感染的特异性体液免疫应答和保护性免疫。
     研究表明， 在受感染宿主组织中葡萄球菌生物膜生长和形成脓肿能力之间的相关 性。 先前的工作证实， 生物膜是植入式医疗器械的定殖和持续感染所必需的， 并且带来针对 抗生素、 抗体和吞噬细胞的保护。本文给出的证据表明， 生物膜是葡萄球菌在器官组织中 有效定殖 (seeding) 和持续增殖所必需的。鉴定到三个分选酶底物基因—— sdrD、 isdB 和 isdA， 其显示在受感染组织中脓肿形成、 葡萄球菌负荷以及体外生物膜生长方面的组合缺 陷。 值得注意地， 在葡萄球菌分选酶锚定表面蛋白质的比较性评价中， 这些表面蛋白质基因 的产物也被鉴定为首选的候选疫苗 (Stranger-Jones 等， 2006)。这些特征现在也可扩展到 两种细胞壁相关因子 Emp 和 Eap。至少 emp 是脓肿形成和生物膜生长所需的， 用 Emp 产物进 行免疫提供了针对葡萄球菌疾病的保护性免疫。因此， 这些研究扩展到预防金黄色葡萄球 菌对人的感染的合适候选疫苗列表， 从而选择细胞壁锚定和细胞壁相关蛋白， 其组合制剂 应提供针对所有葡萄球菌菌株的强保护性免疫。
     葡萄球菌脓肿形成和持续感染的动物模型。 为了表征金黄色葡萄球菌脓肿形成的 发病机理， 对肾脓肿模型进行了修饰 (Albus 等， 1991)， 其中用 1×107CFU 的人临床分离物 金黄色葡萄球菌 Newman 株通过静脉内注射感染 BALB/c 小鼠 (Baba 等， 2007)。在感染后 的 6 个小时内， 99.999％的葡萄球菌从血流中消失， 通过脉管系统分布 ( 图 7A)。葡萄球菌快速扩散到外周组织， 因为肾脏及其它外周器官组织中的细菌负荷在最初三个小时内达到 5 -1 1×10 CFU g ( 图 7B)。肾脏组织中葡萄球菌负荷在 24 小时内增加了 1.5log CFU( 图 7B)。 感染 48 小时后， 小鼠在多个器官中产生分散的脓肿， 这可由对苏木精伊红染色的薄切片肾 脏组织进行光学显微镜观察而检出 ( 图 7D-K)。初始脓肿直径为 524μM(±65μM) ； 病变 最初的特征是多形核白细胞 (PMN) 流入， 并且没有可辨别的葡萄球菌组织， 其大部分似乎 位于 PMN 内 ( 图 8A-C)。感染第 5 天， 脓肿的大小增加， 并且包裹了葡萄球菌的中心群体， 其由嗜伊红的无定形物质的层和一条大的 PMN 带所围绕 ( 图 8D-F)。组织病理学显示， 在 脓肿病变的中心与葡萄球菌病灶接近处有大量 PMN 坏死， 以及健康吞噬细胞的覆盖层 ( 图 8D-F)。还观察到， 脓肿病变周围的坏死 PMN 边界将健康肾组织和受感染病变分隔开的边缘 的嗜伊红无定形物质 ( 图 8D-F)。在第 15 天或第 36 天， 脓肿最终达到≥ 1,524μM 的直径 4 ( 图 7K)。在较晚的时间间隔， 葡萄球菌负荷增加到 10 -106CFU g-1， 生长的脓肿病变朝器官 被膜迁移 ( 图 7J-K)。 外周病变易于破裂， 从而释放坏死的物质和葡萄球菌进入腹膜腔或腹 膜后隙。这些事件导致菌血症以及第二波脓肿， 最终造成这些感染的致死结局 ( 数据未显 示 )。
     葡萄球菌脓肿群落由假荚膜所包裹。为了对肾组织中葡萄球菌负荷进行统计， 将 动物杀死， 切除其肾脏， 将组织匀浆散布到琼脂培养基上进行集落形成。在感染第 5 天， 观 6 -1 察到金黄色葡萄球菌 Newman 株平均 1×x10 CFU g 肾组织 ( 图 9P)。为了对脓肿形成定 量， 目测检查肾脏， 对每个器官给予 1( 图 9A) 或 0( 图 9F) 的得分。将最终的加和除以肾脏 总数， 计算出表面脓肿百分比 ( 表 6)。 另外， 将随机选择的肾脏在福尔马林中固定， 包埋， 薄 切片， 并用苏木精和伊红染色。对于每个肾脏， 通过显微镜观察 200μM 间隔的四个箭头状 切片 ( 图 9)。对每个切片的病变数计数， 求平均值以定量肾脏内的脓肿数目。金黄色葡萄 球菌 Newman 株导致每个肾脏 4.364±0.889 个脓肿， 在 20 个肾脏中的 14 个上观察到表面 脓肿 (70％ )( 表 6)。
     对肾脏切片， 固定， 脱水并用铂 / 钯喷射涂覆进行扫描电子显微镜观察。图 10A 显 示脓肿中心紧密连结的菌苔中的金黄色葡萄球菌 Newman 株。葡萄球菌包含在无定形假荚 膜中 ( 白色箭头， 图 10A)， 所述假荚膜将细菌与脓肿白细胞的带分隔开。在这些葡萄球菌 中心巢中未观察到免疫细胞， 但是偶然有红细胞位于细菌中 (R， 图 10A)。脓肿中心的细菌 群落 ( 称为葡萄球菌脓肿群落 (SAC)) 显示为均一的， 并且由高电子密度的颗粒状物质所包 覆。出现感染病变的动力学以及金黄色葡萄球菌 Newman 株形成的脓肿的形态学特征类似 于用金黄色葡萄球菌 USA300(LAC) 感染小鼠后所观察到的， 所述金黄色葡萄球菌 USA300 是 在美国目前流行群落获得的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (CA-MRSA) 克隆 (Diep 等， 2006) ( 图 9K-O 和 10C)。
     表 6. 小鼠中金黄色葡萄球菌 Newman 株脓肿形成的基因需求。
    葡萄球菌负荷平均值计算为针对每种攻击菌株使用十五只一组的 BALB/c 小鼠感 染 5 天后匀浆肾组织中的 log10CFU g-1， 显示为平均值的标准差 (±SEM)。 b
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录为 P 值 ： P 值＜ 0.05 认为具有显 著性。 c
     细菌负荷的减少， 计算为 log10CFU g-1。 d
     通过目测观察测量感染五天后肾组织中脓肿形成 ( 阳性百分比 ) e
     来自 8 至 10 只动物的苏木精 - 伊红染色薄切片组织的组织病理学 ： 记录每个肾 脏的平均脓肿数， 再次平均获得最终的平均值 (±SEM)。 f
     用 student′ s t 检验计算统计学显著性， 记录 P 值 ： P 值＜ 0.05 认为具有显著 性。
     分选酶突变体不导致脓肿病变并且无法持续存在。分选酶 A 是一种转肽酶， 其使 金黄色葡萄球菌 Newman 株包膜中的 19 种表面蛋白质固定 (Mazmanian 等， 1999 ； Mazmanian 等， 2000)。早期工作在多个动物模型系统中将分选酶 A 鉴定为毒力因子， 但是该酶对脓肿 形成或持续存在的贡献以及其锚定的表面蛋白质尚未阐明 (Jonsson 等， 2002 ； Weiss 等， 2004)。相比于野生型亲本 (Baba 等， 2007)， 在第 2、 5 或 15 天的目测或组织病理学检查中 同基因型 srtA 变体 (ΔsrtA) 不形成脓肿病变 ( 图 9F-J 和表 6)。在用 strA 突变体感染
     77a102333540 A CN 102333554说明书67/86 页的小鼠中， 在感染第 5 天仅从肾组织回收到 1×104CFU g-1， 其相比于野生型亲本菌株减少了 -1 -6 2.046log10 CFU g 的减少 (P ＝ 6.73×10 )( 图 9P)。MRSA 菌株 USA300 的 srtA 突变体也 观察到类似缺陷 ( 数据未显示 )。扫描电子显微镜显示， srtA 突变体 ( 箭头 ) 是高度分散 的， 并且在否则是健康的肾组织中经常与白细胞相结合 ( 图 10B)。在感染后第 15 天， srtA -1 突变体从肾组织中被清除， 相比于野生型减少了≥ 3.5log10CFU g ( 图 9P)。因此， 锚定表 面蛋白质的分选酶 A 使得在宿主组织中脓肿病变得以形成以及细菌持续存在， 其中葡萄球 菌以群落的形式复制， 所述群落包埋在细胞外基质中并且无定形假荚膜屏蔽了周围的白细 胞。
     葡萄球菌表面蛋白质的基因需求。分选酶 A 将许多种具有 LPXTG 基序分选信号 的蛋白质与细胞壁包膜锚定， 从而提供了许多毒力因子的表面展示 (Mazmanian 等， 2002)。 为了鉴定葡萄球菌脓肿形成所需的表面蛋白质， 将 bursa aurealis 插入物引入编码具有 LPXTG 基序蛋白质之多肽的基因 5′编码序列中 (Bae 等， 2004) 并将这些突变转导进金黄 色葡萄球菌 Newman 株中。静脉内感染小鼠并通过肾脓肿模型进行分析之后， 对所观察到的 -1 毒力缺陷严重程度分级为平均葡萄球菌 CFU g 的 log10 减少 ( 图 11 和表 6)。sdrD、 isdB、 clfB、 isdA、 clfA 和 isdC 中的突变导致细菌负荷减少 ( 表 6)。本发明人认为＜ 30％或更 少的表面脓肿以及组织学脓肿平均值 P ＜ 0.05 的突变体为显著性脓肿形成缺陷， 其包括具 有 sdrD、 isdB 和 isdA 中突变的变体 ( 表 6)。令人感兴趣地是， clfA 和 clfB 中的突变显示 葡萄球菌负荷的缺陷， 但是不显示脓肿形成的缺陷 ( 图 11)。 这些毒力因子的发现与之前的 研究相一致， 后者表明聚集因子蛋白介导纤维蛋白原结合以及对细菌吞噬清除的抗性， 而 这正是血液中病原体存活和扩散所需的特征 (McDevitt 等， 1994 ； Ni Eidhin 等， 1998)。蛋 白 A 通过与免疫球蛋白的 Fc 组分结合而阻碍噬菌作用 (Uhlen 等， 1984 ； Jensen 等， 1958)， 通过血管性血友病因子 (von Willebrand factor) 活化血小板凝集 (Hartleib 等， 2000)， 通过捕获带有 VH3 的 IgM 的 Fab 区域用作 B 细胞超级抗原 (Roben 等， 1995) 以及通过其对 TNFR1 的活化可引发葡萄球菌肺炎 (Gomez 等， 2004)。蛋白 A 突变体 (spa) 显示葡萄球菌负 荷少量减少 ( 第 5 天 )， 但是， 与野生型、 clfA 和 clfB 菌株不同， spa 变体形成脓肿的能力 降低 ( 图 11 和表 6)。
     葡萄球菌的碳水化合物和包膜相关蛋白。 金黄色葡萄球菌显示两种碳水化合物结 构——荚膜多糖 (CPS)(Jones 2005) 和聚 -N- 乙酰葡糖胺 (PNAG)(Gotz 2002)。金黄色葡 萄球菌 Newman 株和 USA300 合成 5 型 CPS， 其由重复三糖亚单位 [ → 4)-β-D-ManAcA-(1 → 4) -α-L-FucNAc(3OAc)-(1 → 3)-β-D-FucNAc-(1 → ] 构成 (Baba 等， 2007)。 cap5 基因簇的核 苷酸序列包含 16 基因的操纵子 (capA-P) 及其产物中的两个——CapP 和 CapO， 它们在合成 UDP-N- 乙酰基氨基甘露醇醛酸 (UDP-N-acetylmannosaminuronic acid， UDP-ManNAcA) 中 作为差向异构酶和脱氢酶来起作用 (O’ Riordan 和 Lee， 2004 ； Sau 等， 1997)。 如预期地， capO 中 bursa aurealis 插入消除了 CPS5 的合成 ( 数据未显示 )。PNAG( 或 PIA)——一种线性 β(1-6)- 连接葡糖胺聚糖——由 2- 脱氧 -2- 氨基 -D- 吡喃葡萄糖基残基构成， 其 80-85％ 是 N9 乙酰基化的 (Mack 等， 1996) ； 剩余的葡糖胺残基带正电， 并促进多糖与细菌包膜的结 合 (Vuong 等， 2004)。PNAG 由细胞内粘附素基因座 (icaADBC) 的产物所合成 (Heilmann 等， 1996 ； Cramton 等， 1999)。金黄色葡萄球菌两种碳水化合物结构并非动物感染致病性必需 的， 因为 capO 以及 icaADBC 中的突变或者调节子 icaR 不影响第 5 天的细菌负荷、 葡萄球菌群落的建立或者肾脓肿形成 ( 表 6)。还研究了包膜相关蛋白对葡萄球菌脓肿形成的贡献。 包膜相关蛋白的标志是它们可通过在热 SDS 中煮沸来提取。此方法用于检测两种此类蛋白 质 Eap 和 Emp 在金黄色葡萄球菌 Newman 株包膜中的沉积。除了宿主组织中脓肿形成和细 菌持续存在的显著缺陷之外， 在 emp 中具有 bursa aurealis 插入的突变体显示在感染第 5 天肾组织中细菌负荷降低 ( 图 12， 表 6)。对于 eap 突变体未观察到脓肿形成的减少， 而第 5 天和 15 天葡萄球菌负荷的减少表明宿主组织中细菌持续存在的缺陷 ( 图 12， 表 6)。使用 免疫荧光实验测定感染期间 Emp 和 Eap 的表达 ( 图 12J-K)。在假荚膜中发现 Eap 沉积， 而 在葡萄球菌脓肿群落中检测到 Emp。 这些结果支持了以下模型， 其中 Emp 对葡萄球菌群落的 形成有贡献， 其引发了脓肿病变， 而假荚膜中 Eap 沉积促进宿主组织中细菌的持续存在。
     作为疫苗抗原的包膜相关蛋白质。之前的工作试图通过研究纯化的分选酶 A 底物引发针对葡萄球菌疾病的保护性免疫的能力来表征金黄色葡萄球菌疫苗抗原 (Stranger-Jones 等， 2006)。 当用作单个亚单位疫苗抗原时， 表面蛋白质产生不同程度的保 护； 用 SdrD、 IsdA、 IsdB、 SdrE、 SpA ClfA 和 ClfB 进行免疫显著减少了细菌负荷， 但是这些 疫苗中均不提供完全的保护。相反， 四种抗原的组合产生强得多的针对脓肿形成或几种不 同金黄色葡萄球菌菌株致死攻击的疫苗保护 (Stranger-Jones 等， 2006)。重组 Eap 和 Emp 纯化自大肠杆菌， 使用这些蛋白质免疫 BALB/c 小鼠， 以应对随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株的攻击 ( 图 13)。免疫后， 小鼠产生对两种包膜相关蛋白的体液免疫应答 ( 图 13A)。用 Emp 免疫导致肾组织中葡萄球菌负荷少量的降低 0.959log10CFU g-1(P ＝ 0.5114)， 而用 Eap -1 实现了显著水平的保护 ( 细菌负荷降低 1.939log10 CFU g ， P ＝ 0.0079)( 图 13B)。为了 检测 Emp 或 Eap 特异性抗体是否提供对葡萄球菌攻击的保护， 免疫兔子， 并通过亲和色谱纯 化 Emp 特异性抗体和 Eap 特异性抗体。
    将 5mg kg-1(85μg/ 动物 ) 纯化的抗体被动免疫接种到幼稚BALB/c 小鼠的腹腔中， 在转移后 24 小时导致虽低但是可检出水平的血清 IgG( 对于 Eap 抗体效价为 1,000±110， 对于 Emp 为 1,124±236， 图 13C)。平行地， 通过静脉内接种注射金黄色葡萄 球菌 Newman 株攻击经被动免疫的动物， 在与模拟对照比较时， 其导致对于经 Eap 免疫的动 -1 物 (n ＝ 10) 在第 4 天葡萄球菌负荷减少 1.36log10 CFU g (P ＝ 0.0085)， 以及脓肿形成数 目减少 ( 经模拟处理的为 4.64±1.09 脓肿 / 肾脏， 相比于经 Eap 免疫的 1.40±0.48， P＝ 0.028， n ＝ 14 和 10， 图 13D-E)。
     接受 Emp 特异性抗体的动物 (n ＝ 9) 显示在第 4 天葡萄球菌负荷减少 1.20log10 -1 CFU g (P ＝ 0.0132)， 但是脓肿形成数量仅略微减少 (2.0±0.98， P ＝ 0.1362， 图 13D-E)。 总之， 与分选酶锚定表面蛋白相似， 针对包膜相关因子的抗体可在小鼠中产生对葡萄球菌 感染的保护。
     B. 材料和方法
     细菌菌株和培养。 葡萄球菌培养于 37℃的胰酶大豆琼脂或液体培养基中。 大肠杆 菌菌株 DH5α 和 BL21(DE3) 培养于 37℃的 Luria 琼脂或液体培养基中。分别使用氨苄西林 (100μg/ml) 和红霉素 (10μg/ml) 进行质粒和转座子突变体选择。
     转座子诱变。将来自 Phoenix 文库的插入突变转导进人临床分离物金黄色葡萄球 菌 Newman 株。每个突变体带有转座子 bursa aurealis， 其在目的基因中含有红霉素抗性 盒。如之前所述验证突变 (Bae 等， 2004)。简言之， 提取染色体 DNA(Promega Wizard Kit)，用 AciI(NEB) 消化， 用 T4 连接酶 (Promega) 重新连接形成单个质粒， 使用转座子 bursa aurealis 特异性的引物进行 PCR 扩增。对这些产物测序， 以验证靶基因中的转座子插入。
     克隆、 纯化和抗体产生。使用金黄色葡萄球菌 Newman 株模板 DNA 通过 PCR 扩增 Eap 和 Emp 的编码序列 (Baba 等， 2007)。将 PCR 产物克隆进 pET15b， 以表达具有 N 端 His6 标签融合物的重组蛋白。在弗式压碎器 (French press) 中破碎细菌， 通过超速离心沉淀膜 和不溶成分。通过亲和色谱纯化天然状态的带有 His 标签的 Emp。将含有 Eap 的提取物在 室温下溶于 8M 尿素、 50mM Tris-HCl(pH 8.0)4 ～ 5 小时， 然后以 10,000×g 离心。将含有 变性蛋白的上清进行镍 - 次氨基三乙酸 (Ni-NTA) 亲和色谱 (Promega)。 在含有逐渐增高浓 度 (100-500mM) 的咪唑的 PBS-8M 尿素中洗脱蛋白质。合并 Eap 阳性的洗脱级分， 在 PBS-1M Urea 中稀释， 使其通过第二 Ni-NTA 柱。用含有咪唑的 PBS 缓冲液洗脱重折叠的 Eap。通 过 280nm 的吸光度确定蛋白质浓度。在第 24 天和 48 天用 CFA(Difco)( 初次免疫 ) 以及 IFA( 加强免疫 ) 乳化的 500μg 蛋白质免疫兔子 (6 月龄新西兰白兔， 雌性， Charles River Laboratories)。在第 60 天， 从兔子取血， 回收血清用于免疫印迹、 免疫荧光显微术或者被 动转移实验。
     扫描电子显微镜。将感染的肾脏 ( 右侧 ) 在 8％戊二酸醛中 4℃下固定 24-48 小 时， 切成 2-5mm 的片， 以暴露内部组织或脓肿。 然后， 通过依次在 25、 50、 75、 90、 100％乙醇中 孵育， 然后在 100％ HMDS 中孵育， 使样品脱水。 脱水后， 装载样品， 用 80％铂 /20％钯喷射涂 覆至 8nm， 然后在 Fei NovaNano SEM200 扫描电子显微镜下观察。对于生物膜测定， 葡萄球 菌培养于 5％ CO2 中盖玻片上除去铁的 RPMI 中， 并在 PBS 中清洗 3 遍。通过在乙醇和 HMDS 中孵育将盖玻片依次脱水， 装载并喷射涂覆， 然后在扫描电子显微镜下观察。
     生物膜形成。 金黄色葡萄球菌菌株培养于用添加了 10％ RPMI1640 和 1％ Casamino acids(Difco) 的 RPMI 1640(Gibco) 处理的 Chelex(Sigma) 中。将过夜培养物培养于 37℃ 下 6％ CO2 中， 然后以 1 ∶ 10 一式四份接种于含有新鲜培养基的 96 孔平底培养板 (Costar) 中。这些平板静置孵育于 37℃下 6％ CO2 中 24 小时。用 1×PBS 将孔清洗三遍， 在 37℃下 干燥 2 小时， 用 1％番红染色。测量 450nm 的吸光度以定量生物膜形成。在至少 3 个独立实 验中测试每个菌株， 使用双尾 student’ s t 检验比较突变体与野生型。
     肾脏脓肿。将金黄色葡萄球菌 Newman 株过夜培养物以 1 ∶ 100 接种于新鲜胰酶 大豆液体培养基， 在 37℃下培养 2 小时。沉淀葡萄球菌， 用 1x PBS 清洗， 悬浮于一定体积 8 的 PBS 中， 使得产生 0.6 的 A600(3×10 CFU/ml)。通过铺板和菌落计数验证接种物。通 过腹膜内注射每千克体重 100mg/ml 的氯胺酮和 2mg/ml 的赛拉嗪麻醉小鼠。用 100μl 细菌悬浮物 (3×107CFU) 通过眶后注射感染 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠 (Charles River Laboratories)。每个葡萄球菌菌株感染 10 或 20 只小鼠的组。感染后第 5 天， 通过吸入 CO2 处死小鼠， 解剖， 切除肾脏， 在 0.01％ Triton X-100 中使用超声仪进行匀浆。依次稀释 等分试样 (20μl)， 铺板用以确定 CFU。将来自每组小鼠的三至四个右侧肾脏固定于室温下 10％甲福尔马林 24 小时。将组织包埋于石蜡中， 薄切片， 用苏木精伊红染色， 进行显微镜检 查。使用 3-4 周龄雌性 BALB/c 小鼠进行持续存在研究。
     免疫。通过将纯化的蛋白质肌内注射到后腿中免疫 BALB/c 小鼠 (24 天龄雌性， 每 组 8 ～ 10 只小鼠， Charles River Laboratories， Wilmington， MA)。 在第 0 天 ( 用完全弗氏 佐剂 1 ∶ 1 乳化 ) 和第 11 天 ( 用不完全弗氏佐剂 1 ∶ 1 乳化 ) 施用抗原 ( 每只动物 25μg纯化蛋白质 )。在第 20 天对小鼠进行眶周取血， 然后第 21 天在另一只眼睛处用 107CFU/ml 细菌进行眶后攻击。在第 25 天处死小鼠， 根据肾脏脓肿模型进行处理。
     免疫荧光显微镜。解剖受感染动物的肾脏， 将其置于冰上 1×PBS 中， 然后速冻于 冷冻模具 (cryomold) 中的 Tissue Tek OCT Compound 中。将样品进行薄切片 (4μm 厚 )， 装载于载玻片上， 保存于 -80℃。 染色前， 将载玻片升至室温， 保持 30 分钟， 固定于冰冷的丙 酮中 10 分钟， 用冰冷的 PBS 清洗两遍。 在室温下用 3％ BSA、 1 ∶ 20 人 IgG(Sigma)、 1×PBS、 0.1％ Tween-80 将载玻片振摇封闭 1 小时。 将特异性兔抗体 (1 ∶ 2,000) 添加到混合物中， 使载玻片再孵育 1 小时。 弃去溶液， 用 PBS 将玻璃载玻片清洗 3 遍， 每次孵育 10 分钟。 将载玻 片置于 3％ BSA、 1×PBS、 0.1％ Tween-80、 1 ∶ 200AlexaFluor-647 小鼠抗兔第二抗体中， 使 之在室温下避光振摇孵育。弃去溶液， 用 PBS 清洗载玻片 3 遍， 置于含有 1 ∶ 1,000Hoechst 染料 (Invitrogen) 以及 1μg/ml BODIPY- 万古霉素的 PBS 中， 使之避光振摇孵育 5 分钟。 用 PBS 再将载玻片清洗一遍， 装载于 Npropylgallate 中， 在 Leica SP5 AOBS 光谱双光子共 聚焦显微镜下观察。
     主动和被动免疫。用纯化的 Eap 或 Emp 或 PBS 在第 0、 11 天免疫 BALB/c 小鼠 (n ＝ 15)。 在免疫后第 20 天， 对 5 只小鼠取血， 获得血清以确定抗体效价， 在第 21 天， 用 1×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击所有小鼠。感染后第 5 天， 在尸检中取出肾脏， 分析肾组织 的葡萄球菌负荷或组织病理学。
     通过亲和色谱 ( 与 sepharose 共价连接的纯化 Eap 或 Emp) 纯化兔 Eap 或 Emp 抗体， 通过腹膜内注射转移到小鼠中。 24 小时后通过眶后注射 1×107CFU 金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击经被动免疫的动物。通过 ELISA 分析主动或被动免疫动物的血清 IgG 效价。感染后 第 4 天， 在尸检中取出肾脏， 分析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。
     实施例 2
     金黄色葡萄球菌合成腺苷以逃脱宿主免疫应答
     A. 结果
     AdsA 是葡萄球菌在血液中存活必需的。为了鉴定逃脱固有免疫应答所需的葡萄 球菌基因， 通过菌落在琼脂培养基上的形成以一定时间间隔记录细菌负荷， 从而研究金黄 色葡萄球菌 Newman 株在 BLAB/c 小鼠或 Sprague-Dawley 大鼠全血中存活的能力 ( 图 15)。 如预期地， 缺少葡萄球菌特异性抗体的幼稚小鼠和大鼠血液中的免疫细胞 ( 数据未显示 ) 无法吞噬并杀死金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 图 15A 和 15D)。与野生型菌株相反， 缺少分 选酶 A 结构基因 (srtA) 的变体显示葡萄球菌逃脱吞噬杀伤的缺陷 (P ＜ 0.05)( 图 15A 和 15D)。分选酶 A 锚定葡萄球菌包膜中多种不同的多肽， 其使用转肽机制和表面蛋白质 C 端 的 LPXTG 基序分选信号来实现 (Mazmanian 等， 2002)。为了研究这些表面蛋白质对葡萄球 菌逃脱吞噬杀伤的贡献， 本发明人将含有 bursa aurealis 插入 (Bae 等， 2004) 的表面蛋白 质基因转导进野生型菌株金黄色葡萄球菌 Newman 株， 测定葡萄球菌变体在血液中的存活 ( 图 15B 和 15E)。clfA 和 sasH(Staphylococcus aureus surface protein， 金黄色葡萄球 菌表面蛋白质 ) 中的突变 ( 下文称为 adsA) 显示一致的存活缺陷。clfA 突变体的表型显 示预期的结果， 因为所编码的凝聚因子 A(ClfA) 产物已知沉淀血纤蛋白并干扰巨噬细胞和 中性粒细胞的吞噬 (Palmqvist 等， 2004 ； Higgins 等， 2006)。AdsA 对致病性的贡献尚不清 楚。AdsA 具有 5’ - 核苷酸酶结构域， 其具有两个特征序列 ILHTnDiHGrL(124-134 位残基 )和 YdamaVGNHEFD(189-201 位残基 )， 表明该蛋白质可催化从 5’ -AMP 合成腺苷。 为了进一步 研究 adsA 在葡萄球菌毒力中的重要性， 本发明人通过将完整的 adsA 基因和上游启动子序 列克隆进表达载体 pOS1， 产生 padsA 来补偿 adsA 基因。用 padsA 转化 adsA 突变体葡萄球 菌恢复了其在小鼠或大鼠血液中存活的能力， 表明所观察到的毒力缺陷确实是由 adsA 表 达缺少造成的 ( 图 15C 和 15F， 以及图 20)。还研究了金黄色葡萄球菌在人志愿者血液中的 存活。如使用鼠血液一样， 相比于野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株， adsA 突变体葡萄球菌 的数目减少， 中性粒细胞的葡萄球菌吞噬增加 ( 图 15G 和 15H)。
     AdsA 是葡萄球菌毒力和脓肿形成所必需的。为了研究 adsA 在侵入性葡萄球菌疾 病中的贡献， 通过静脉内接种 107 菌落形成单位 (CFU) 的野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 或其同基因 asdA 变体感染 BALB/c 小鼠。感染后第 5 天杀死动物， 取出双侧肾脏。将右侧 肾脏匀浆， 通过在琼脂上铺板和菌落形成对葡萄球菌负荷计数 ( 图 16A)。用戊二醛酸固定 左侧肾脏， 在石蜡中包埋， 薄切片并通过组织学进行分析 ( 图 16B)。如预期地， 野生型金黄 7 色葡萄球菌 Newman 株在肾组织中形成脓肿， 平均细菌负荷为每克器官组织 10 CFU。相反， 与野生型相比， adsA 突变体葡萄球菌不能形成脓肿， 并显示减少十倍以上的细菌负荷 ( 图 16A)。
     通过脉冲场凝胶电泳和 DNA 测序表征了从美国社区中获得的 MRSA 菌株 (CA-MRSA) 的感染。目前， 主要的 CA-MRSA 克隆是 USA300(McDougal 等， 2003)， 其是皮肤和软组织感染 以及菌血症的主要原因 (Carleton 等， 2004)。 为了评估 adsA 对 USA300 毒力的贡献， 使用噬 菌体转导和金黄色葡萄球菌 LAC 菌株 (USA300) 分离同基因型 adsA 突变体 (Bae 等， 2004)。 通过将葡萄球菌眼眶后注射进血流感染 BALB/c 小鼠。攻击后第 5 天， 在匀浆肾组织中对葡 萄球菌计数， 在该器官的苏木精 - 伊红染色的薄切片中观察脓肿的组织病理学 ( 图 16C)。 类似于金黄色葡萄球菌 Newman 株， 本发明人观察到用金黄色葡萄球菌 USA300 的 adsA 突变 体感染动物的肾脏回收的 CFU 减少了 1log。 另外， 在 adsA 变体感染的小鼠肾脏中观察到较 少的脓肿和较小的病变 ( 图 16D 和图 21)。这些结果一起说明了 adsA 对于两种临床分离 物——金黄色葡萄球菌 Newman 株和 USA300 毒力的必要性。
     受感染小鼠肾脏中脓肿形成和 CFU 回收的差异可能由于血流中细菌清除的增强 所致， 其导致较少的细菌到达外周器官组织。或者， adsA 可在脓肿和感染病灶的形成中起 直接的作用。为了明确这些可能性， 通过眼眶后接种感染 BALB/c 小鼠， 以一定时间间隔通 过心脏穿刺对外周血取样。与 adsA 突变体葡萄球菌的清除增强的体外结果相一致地， 与野 生型亲本菌株金黄色葡萄球菌 Newman 株相比， 感染后 90 分钟获取的 adsA 突变体葡萄球菌 CFU 显著较少。另外， 用 padsA 转化 adsA 突变体菌株恢复了静脉内攻击后其在血液中存活 的能力 ( 图 16E)。 尽管我们不能排除 adsA 也特异性地贡献于脓肿形成的可能性， 但是这些 数据表明， adsA 突变体葡萄球菌毒力的降低是由于其在血液中存活的减少所致。
     AdsA 介导的腺苷合成与葡萄球菌在血液中的存活相关。由于 AdsA 具有 5’ 核苷酸 酶特征序列， 产生了 AdsA 是否可从 AMP 合成腺苷的疑问。用溶葡萄球菌素降解金黄色葡萄 球菌野生型、 adsA 和 isdB(iron surface determinant B， 铁表面决定因子 B， 不对 AMP 水 解起作用的基因 )(Mazmanian 等， 2003) 突变体菌株以及 adsA:padsA 菌株的细胞壁肽聚糖 (Schindler 和 Schuhardt， 1964)， 将细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育。通 过薄层色谱 (TLC) 监测腺苷的产生。 adsA 突变体葡萄球菌的溶葡萄球菌素提取物显示显著降低的腺苷合酶活性 ( 约为野生型的 25％ )。当用 padsA 转化 adsA 突变体时腺苷合酶活 性恢复到野生型水平 ( 图 17A)。相反地， isdB 的破坏不影响金黄色葡萄球菌生成腺苷。
     为了表征 AdsA 的酶活性， 我们表达并纯化了来自大肠杆菌的可溶性重组形式的 14 AdsA。纯化的 AdsA 切割 [ C]AMP 从而产生腺苷， 在 5mM MgCl2 或 5mM MnCl2 存在时观察到 最大活性 (KM ＝ 44nM)， 这类似于其它腺苷合酶对金属的需求 (Zimmermann， 1992)。另一方 14 面， 在添加 [ C]AMP 之前， 将 AdsA 与 5mM ZnCl2 或 5mM CuSO4 一起孵育， 完全抑制腺苷合酶 活性 ( 图 17B， 泳道 6 和 7)。当添加 EDTA( 一种二价金属离子螯合剂 ) 至 AdsA 时观察到类 似的抑制作用， 表明在体外 AdsA 需要二价阳离子用于腺苷合酶活性。
     设想葡萄球菌通过合成腺苷来逃脱吞噬清除。 adsA 突变体葡萄球菌在血液中的存 活缺陷可通过外源添加腺苷来挽救。 对此进行测试， 显示在添加 1 ～ 100μM 腺苷后 adsA 突 变体葡萄球菌存活的剂量依赖性增加 ( 图 17F)。在生理条件下， 细胞外环境中 AMP 的浓度 估计为纳摩尔范围。但是， 免疫损害或组织损伤导致 AMP 释放， 其浓度可增加到 100μM。因 此， 似乎可解释为， 在葡萄球菌感染过程中这些 AMP 储藏可转变为腺苷。为了评估葡萄球菌 感染过程中腺苷的相对丰度， 用金黄色葡萄球菌感染小鼠血液 60 分钟。获取血浆， 除去蛋 白质， 对样品进行反相高效液相色谱 (rpHPLC)。为了校准， 通过 rpHPLC 分离市售纯化的腺 苷， 并在洗脱液中确定其分子量 ( 图 18A)。 未感染血液的色谱显示腺苷吸收峰， 通过质谱确 定其身份 ( 图 18A)。用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染后， 血液中腺苷峰增加了 10 倍 ( 图 18C)， 而用同基因型 adsA 突变体的感染产生少于 2 倍的腺苷增加 ( 图 18D)。值得注意的 是， 细胞外腺苷通过血细胞快速输入 ( 半衰期＜ 1 分钟 )(Thiel 等， 2003)。考虑到这一点， 金黄色葡萄球菌感染过程中观察到的血液中腺苷增加 10 倍表示此信号分子的大量积累以 及葡萄球菌借此用于对抗宿主免疫力的重要毒力策略。
     炭疽芽孢杆菌在血液中存活并合成腺苷。为了研究其它致病细菌是否可利用腺 苷合酶来促进逃脱吞噬清除， 检索细菌基因组序列中带有 AdsA 腺苷合酶结构域的产物， 并 鉴定到几个不同的基因 ( 表 3)。炭疽芽孢杆菌的基因组编码 BasA(Bacillus anthracis surface protein， 炭疽芽孢杆菌表面蛋白质， NCBI 基因座标签 BAS4031)， 其具有 5’ - 核苷 酸酶特征序列 (YdvisLGNHEFN， 131-142 位残基 ) 和 C 端 LPXTG 分选信号， 表明此表面蛋白 质也由分选酶 A 沉积至细胞壁包膜中 (Gaspar 等， 2005)。为了确定 BasA 是否用作腺苷合 酶并且贡献于逃脱固有免疫应答， 我们通过等位基因替换构建了 basA 的缺失突变体 ( 图 19)。变溶菌素 (mutanolysin) 是一种切割肽聚糖中 N- 乙酰基胞壁酰基 -(β1 → 4)-N- 乙 酰基葡糖胺的胞壁质水解酶， 其用来产生细胞壁裂解物 (Yokigawa 等， 1974)。来自野生型 芽孢杆菌的细胞壁提取物具有腺苷合酶活性， 但是来自 basA 突变体芽孢杆菌的提取物显 示此活性降低 ( 图 19A)。结构基因 basA 的缺失在炭疽芽孢杆菌中消除了 BasA 的表达 ( 图 19B) 和表面展示 ( 图 19C)， 并降低了芽孢杆菌合成腺苷的能力 ( 图 19A)。AMP 水解的残余 量可来自于其它磷酸酶 ( 例如碱性磷酸酶 ) 的贡献。本发明人表达并亲和纯化了来自大肠 杆菌的带标签的 BasA。与金黄色葡萄球菌 AdsA 类似， 在 5mM MnCl2(KM ＝ 2.01nM) 存在时 观察到最优的 BasA 腺苷合酶活性， 而 5mM MgCl2 则显示活性降低 ( 图 19D)。当接种进小鼠 血液中时， 与野生型亲本炭疽芽孢杆菌 Sterne 株相比， 观察到 basA 突变体的吞噬清除增加 ( 图 19E)。这些实验共同表明， 与葡萄球菌类似， 炭疽芽孢杆菌也利用 AdsA 合成腺苷并逃 脱固有免疫应答。表 7. 具有推定 5’ - 核苷酸酶的其它微生物具有推定 5’ - 核苷酸酶的其它微生物代表了公知的病原体 ( 表 7)， 我们尝试分析 其合成腺苷的能力。类似于来自金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌的细胞壁提取物， 粪肠球 菌和表皮葡萄球菌都从 AMP 合成腺苷， 而非致病的微生物枯草芽孢杆菌则不然 ( 数据未显 示 )。 本发明人得出如下结论， 细菌病原体合成腺苷并将此免疫抑制化合物释放进宿主组织 的能力可能代表了普遍的毒力策略。
     B. 材料和方法
     细菌菌株。金黄色葡萄球菌菌株在 37℃下培养于 TSB 中。金黄色葡萄球菌菌株 USA300 通过 Network on Antimicrobial Resistance in S.aureus(NARSA， NIAID) 获得。 本研究中所用的所有突变体均获得自 Phoenix(ΦNΞ) 文库 (Bae 等， 2004)。如所示， 每种 Phoenix 分离物均是临床分离物 Newman 株 (Duthie 和 Lorenz， 1952) 或 USA300(Carleton
     等， 2004) 的衍生物。所有 bursa aurealis 插入均通过使用噬菌体转导进野生型金黄色葡萄球菌 Newman 或 USA300， 并通过 PCR 分析进行验证。 使用 10mg l-1 的氯霉素进行具 有 padsA 的质粒和等位基因的选择。使用 10mg l-1 的红霉素进行金黄色葡萄球菌 Newman 株中等位基因的选择， 使用 50mg l-1 进行 USA300 中的等位基因的选择。使用含有热敏感复 制起点的 pLM4 产生炭疽芽孢杆菌 Sterne 株的突变体。将突变每一侧有 1kb DNA 序列的质 粒转化进炭疽芽孢杆菌， 在 LB 液体培养基 (20μg ml-1 卡那霉素 ) 中 30℃ ( 允许温度 ) 下 培养转化子。以 1 ∶ 100 稀释培养物， 铺板于 LB 琼脂 (20μg ml-1 卡那霉素 ) 上， 在 43℃ 下 ( 限制性温度 ) 过夜。将单菌落接种进不含抗生素的 LB 液体培养基， 在 30℃下过夜培 养。为了确保基于 pLM4 的质粒的丢失， 将这些培养物在无抗生素压力的新鲜 LB 液体培养 基中稀释四次， 在 30℃下增殖。稀释培养物， 铺板于 LB 琼脂上， 检查菌落的卡那霉素抗性。 通过 PCR 分析来自卡那霉素敏感性菌落的 DNA 中突变体等位基因的存在与否。
     质粒。利用下列引物进行 PCR 扩增反应 ： P55(5’ -TTTCCCGGGACGATCCAGCTCTAATCG CTG-3′ )(SEQ ID NO ： 42)， P56(5’ -TTTGAGCTCAAAGCAAATAGATAATCGAGAAATATAAAAAG-3′ ) (SEQ ID NO ： 43)， P57(5’ -TTTGAGCTCAGTTGCTCCAGCCAGCAT T-3′ )(SEQ ID NO ： 44)， P58(5 ’ -TTTGAATTCAAACGGATTCATTCCAGCC-3′ )(SEQ ID NO ： 45)， FP10(5’ -TACGAATTCGACTTGGCAG )(SEQ GCAATTGAAAA-3’ )(SEQ ID NO ： 46)， RP10(5’ -TGTGAATTCTTAGCTAGCTTTTCTACGTCG-3’ ID NO ： 47)， FP3C(5’ -TCGGGATCCGCTGAGCAGCATACACCAATG-3’ )(SEQ ID NO ： 48)， RPB(5’ -T GTGGATCCTTATTGATTAATTTGTTCAGCTAATGC-3’ )(SEQ ID NO ： 49)。将 FP10/RP10(adsA+ 起始 位点上游 700bp)PCR 产物连接进 pOS1(EcoRI) 产生 padsA。将 P55/P56(basA 1kb5’ 侧翼序 列 ) 和 P57/P58(basA 1kb 3’ 侧翼序列 )PCR 产物插入到 pLM4(EcoRI、 SacI 和 XmaI 位点 ) 中产生 pJK34。使用此质粒来缺失 basA 编码序列。将连接产物转化进大肠杆菌 DH5α， 将 质粒 DNA 转化进大肠杆菌 K1077(dam ， dcm ) 以及按照之前成熟的方案 (Gaspar 等， 2005) 将 纯化的 ( 非甲基化 ) 质粒 DNA 转化进炭疽芽孢杆菌。将 FP3C/RPB( 起始自信号肽后 5’ 的 adsA 的 1.2kb 截短 )PCR 产物连接进 pGEX-2T(GE Healthcare) 产生 adsA 表达载体 pVT1， 将此质粒转化进大肠杆菌 BL21。
     动物实验。 所有实验方案均经过芝加哥大学学术生物安全委员会 (Institutional Biosafety Committee， IBC) 和学术生物管理及使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee， IACUC) 的审查、 批准并在其规定下实施。BALB/c 小鼠购自 Charles River Laboratories， Sprague-Dawley 大鼠购自 Harlan。金黄色葡萄球菌菌株的过夜培 养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 清洗两遍， 在 8 -1 PBS 中稀释得到 0.5 的 OD600 值 (1×10 CFU ml )。通过胰酶大豆琼脂平板上菌落形成对活 的葡萄球菌进行计数， 从而对感染量进行定量。通过腹膜内注射每千克体重 80-120mg 氯胺 酮和 3-6mg 赛拉嗪麻醉小鼠。通过眼眶后注射将一百微升细菌悬液 (1×107CFU) 静脉内施 用到 BALB/c 小鼠 (6 周龄雌性 )。在第 5 天， 通过压缩 CO2 吸入杀死小鼠。取出肾脏， 在含 有 1％ Triton X-100 的 PBS 中匀浆。稀释匀浆液的等分试样， 在琼脂培养基上铺板以用于 一式三份地确定 CFU。使用 Prizm 软件进行 student’ s t 检验统计学分析。对于组织病理 学， 在室温下将肾脏组织在 10％福尔马林中孵育 24 小时。 将组织包埋于石蜡中， 薄切片， 用 苏木精 - 伊红染色， 并进行显微镜检查。
     为了测定葡萄球菌在血液中的存活， 用 1×107CFU 葡萄球菌通过眼眶后注射感染 6周龄雌性 BALB/c 小鼠。在第 30 或 90 分钟， 通过压缩 CO2 吸入杀死小鼠， 通过使用 25 号针 的心脏穿刺收集血液。 将等分试样在冰上 0.5％皂苷 /PBS 终浓度下孵育 30 分钟， 以裂解宿 主真核细胞。将稀释物在 TSA 上铺板， 从而对两个不同时间点的存活 CFU 进行计数。
     化学物质。变溶菌素 (Sigma) 以 5,000 单位 ml-1 的浓度悬浮于含有 1mM PMSF 的 100mM 磷酸钠 (pH 6.0) 中， 保存于 -20C。 [14C]AMP 和 [14C] 腺苷购自 Moravek Biochemicals。 溶葡萄球菌素 (Lysostaphin) 购自 AMBI， 纯化的腺苷购自 Sigma。
     血液中的细菌存活。将金黄色葡萄球菌菌株过夜培养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37 ℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 清洗两遍并在 PBS 中稀释至 OD600 为 8 -1 0.5(1×10 CFU ml )。 通过对 Sprague-Dawley 大鼠或 BALB/c 小鼠进行心脏穿刺收集全血， -1 并立刻添加 5μg ml 的来匹卢定抗凝剂。将 100μl 的 105CFU ml-1 细菌与 900μl 大鼠或 小鼠血清相混合。对于人血研究， 将 100μl 的 108CFUml-1 细菌与 900μl 新鲜提取的人血 液相混合。 然后， 将试管在 37℃下以低转速孵育所示时间， 在所示时间点将等分试样在冰上 0.5％皂苷 /PBS 终浓度下孵育 30 分钟， 以裂解真核细胞。 将葡萄球菌稀释物在 TSA 上铺板， 以计数存活的 CFU。使用来自人志愿者的血液的实验包括了经过芝加哥大学学术评审会议 (Institutional Review Board， IRB) 的评审、 批准并在其规定下实施的方案。
     腺苷合酶活性。 将金黄色葡萄球菌菌株过夜培养物以 1 ∶ 100 在新鲜 TSB 中稀释， 在 37℃下培养 3 小时。将葡萄球菌离心， 用 PBS 清洗两遍。离心下来 3ml 的细胞， 将其在 100μL TSM 缓冲液 (50mM Tris-HCL(pH 7.5)， 10mM MgCl2 和 0.5M 蔗糖 ) 中重悬， 然后添加 2μl 的溶葡萄球菌素， 使之在 37℃下孵育 30 分钟。然后， 以 10k rpm 将溶液离心 5 分钟， 收集含有释放的细胞表面蛋白质的上清。 然后， 将 15μl 溶葡萄球菌素提取物与 3μCi[14C] AMP 在 37℃下一起孵育 30 分钟。随后， 将样品点样于硅平板上， 之后使用 (75 ∶ 25 异丙 醇∶ ddH2O)0.2M 碳酸氢铵溶剂通过 TLC 进行分离。对于用变溶菌素消化的金黄色葡萄球 菌、 粪肠球菌、 炭疽芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的细胞壁提取物， 用变溶菌素替代溶葡萄球菌 素， 并且根据制造商建议的条件使用。当用纯化的蛋白进行测定时， 在 TSM 缓冲液中所示金 属阳离子存在下， 将 2μM 纯化的 AdsA 或 BasA 在 15μl 终体积中与 3μCi[14C]AMP 一起孵 育。
     血液中腺苷浓度。如上所述进行葡萄球菌的全血杀死测定。如上所述进行血浆提 取 (Mo 和 Ballard， 2001)。简言之， 全血杀死测定的结束后， 将血液样本以 13k rpm 离心 5 分钟， 收集无细胞血浆。然后， 用 75μl 全氯酸 (1.5M) 和 1mM EDTA 萃取 600μl 血浆。以 13k rpm 离心 5 分钟后， 吸取上清 (500μl)， 用 29μl 4M KOH 中和。用冰冷却 10 分钟后， 将样品再次以 13k rpm 离心 5 分钟。最终将上清的 pH 调节至 6-7， 用 PBS 以 1 ∶ 4 稀释， 用 0.22μm 注射器滤器过滤， 然后进行反相高效液相色谱 (rpHPLC)。
     HPLC 和质谱。通过 rpHPLC 确定腺苷的产生。将样品利用 250mm×3mm 柱 (BDS Hypersil C18， 5μm 粒径， Thermoscientific) 进行色谱。流动相由溶液 A(dH2O ∶ 0.1％三 氟乙酸 ) 和溶液 B( 乙腈∶ 0.1％三氟乙酸 ) 组成。用 1 ～ 100％的溶剂 B 梯度洗脱腺苷， 从 5 分钟运行到 50 分钟。溶剂流速为 0.5ml/ 分钟。通过 280nm 的 UV 吸收检测峰。通过 将其驻留时间与用作标准样品的纯化腺苷 (Sigma) 的驻留时间进行比较鉴定 HPLC 色谱图 中腺苷的峰。然后， 将含有腺苷的级分与基质 (α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 ) 共同点样， 在具 有反射器的条件 (reflector positive condition) 下进行 MALDI-MS。参考文献
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     Emp 和 / 或 Eap 调节剂还可以是编码 Emp 和 / 或 Eap 肽的重组核酸分子。重组核 酸分子可编码 Emp 和 / 或 Eap 肽， 以及至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。 核酸可编码 或者多肽可包含多种抗原， 所述抗原包括以下抗原之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA 或其变体。核 酸可编码额外的葡萄球菌抗原， 其包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， 所述方法和组合物使用或包含或编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽、 肽 或抗原之全部或部分， 以及与它们结合的抗体。 在另一些方面中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡 萄球菌因子或细菌因子联用， 例如以下的全部或部分 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA， 或者其免疫原性片段或其组合。可与 Emp 和 / 或 Eap 调节剂联用的额外葡萄球菌抗原 包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNAIII 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些实施方案中， 可以从本发明的方法、 组合物或制剂中具 体排除或包含以下分子中的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 种或更多种 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 ClfA、 ClfB、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。可明确排除的额外葡萄球菌抗原包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。 本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或编码其的核苷酸。 在又一些方面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽是多聚化的， 例如二聚化的。在本发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多个分离 的细胞表面蛋白质或其区段的多聚体。在另一方面中， 其它多肽或肽可表达或包含在细菌 组合物中， 其包括但不限于 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其免疫原性片 段。可表达或包含在细菌组合物中的额外的葡萄球菌多肽包括但不限于 ： 52kDa 玻连蛋白 结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结 合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋 白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。或者， 所述组合物可以是或包含经重组改造的葡萄球菌， 其以某种方式被改变， 包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行特定改变。例如， 所述细菌可被重组修饰为表达与 未修饰时相比更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     术语 “Emp 多肽” 或 “Eap 多肽” 是指包括从葡萄球菌中分离的野生型 Emp 或 Eap 蛋白的多肽， 以及刺激针对葡萄球菌 Emp 或 Eap 蛋白之免疫应答的变体和区段或片段。类 似地， 术语 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白是指包括从葡萄球菌分离的野生型 EsaB、
     术语 “Emp 多肽” 或 “Eap 多肽” 是指包括从葡萄球菌中分离的野生型 Emp 或 Eap 蛋白的多肽， 以及刺激针对葡萄球菌 Emp 或 Eap 蛋白之免疫应答的变体和区段或片段。类 似地， 术语 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白是指包括从葡萄球菌分离的野生型 EsaB、
     EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA) 或 SpA 多肽的蛋白质， 以及刺激针对葡萄球菌 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA 蛋白之免疫应答的变体、 区段或片段。此外， 术语 52kDa 玻连蛋白结 合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白表示包括从 葡萄球菌分离的野生型 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨 基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋 白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层 粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 以及刺激针对葡萄球菌 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白之免疫应答的 变体、 区段或片段。免疫应答是指生物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。可通过包 括下列但不限于此的测定来检测免疫应答 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体 的存在或量的测定、 测量 T 细胞活化或增殖的测定和 / 或测量与一种或多种细胞因子之活 性或表达有关的调节的测定。
     本发明的一些实施方案包括在对象中引发针对葡萄球菌之免疫应答的方法， 其 包括向对象提供 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种有效量的抗原或其区段 / 片段。葡萄 球菌抗原包括但不限于 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变 体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA， 或者其 区段、 片段或免疫原性片段。额外的葡萄球菌抗原包括但不限于 52kDa 玻连蛋白结合蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     在某些实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 多肽或其免疫原性片段可与以下一种或多种 蛋白的一种或多种抗原或免疫原性片段相组合地提供 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdSA)、 Ebh、 Coa、 vWa 或 SpA。 也可使用以下额外抗原或免疫原性片段 ： 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     本发明的一些实施方案包括可包含与以下蛋白在 5、 10、 15、 20、 50、 100、 200 或 更多连续氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 上有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或相似性之多肽、 肽或蛋白质的组合物 ： Emp、 Eap EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在本发明的另一实施 方案中， 组合物可包含与 Emp 多肽 (SEQ ID NO ： 2， 50-53) 和 / 或 Eap 多肽 (SEQ ID NO ： 4) 或 Emp 核酸 (SEQ ID NO ： 1) 和 / 或 Eap 核酸 (SEQ ID NO ： 3) 有或有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或相似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面 中， Emp 多肽或 Eap 多肽将分别具有 (SEQ ID NO ： 2) 或 (SEQ ID NO ： 4) 的氨基酸序列。类 似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于鉴定蛋白质 ( 或 核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似性使用本领域 已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序列同一性算法，通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软件包中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设置 )， 或者通过肉 眼比较。 优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计算同一性百分比。
     术语 “AdsA 多肽” 是指包括分离的野生型细菌 AdsA 蛋白的多肽， 例如葡萄球菌 ( 金 黄色葡萄球菌 SEQ ID NO ： 36) 或芽孢杆菌 ( 炭疽芽孢杆菌 (B.anthracis)SEQ ID NO ： 41)， 以及 AdsA 蛋白的变体和区段或片段。在某些方面中， AdsA 多肽刺激针对细菌 AdsA 蛋白的 免疫应答。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsxB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsxB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 8 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrD 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrD 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 10 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrE 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrE 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 16 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SpA 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， SpA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 18 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 20 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 IsdC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， IsdC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 22 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasF 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasF 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 24 的氨基酸序列。在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SdrC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SdrC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 26 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 ClfA 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， ClfA 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 28 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 30 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 EsaC 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， EsaC 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 32 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasB 蛋白有或至少有 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。 在某些方面中， SasB 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 34 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 SasH(AdsA) 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋 白质。在某些方面中， SasH(AdsA) 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 的氨基酸序 列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Hla 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99 ％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在 某些方面中， Hla 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 37 的氨基酸序列。在某些方面中， Hla 变体包括 D24C、 H35C、 H35K、 H35L、 R66C、 E70C 或 K110C 的氨基酸替换或者其任何组合 ( 氨基酸使用 单字母代码表示 )。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Ebh 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Ebh 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 38 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 Coa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， Coa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 39 的氨基酸序列。
     在本发明的又一些实施方案中， 组合物可包含与 vWa 蛋白有或至少有 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质。在某 些方面中， vWa 蛋白将具有 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸序列。
     在某些方面中， 多肽或区段 / 片段可具有与参考多肽有至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％或至少 99％或更高同一性的氨基酸序列。术语 “相似性” 表示其序列具有 一定百分比的与参考多肽相同或构成与参考多肽的保守性替换的氨基酸的多肽。
     本文所述多肽或区段或片段可包含 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ：30、 SEQ ID NO ： 32、 SEQ ID NO ： 34、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 37、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 39、 SEQ ID NO ： 40、 SEQ ID NO ： 41 或 SEQ ID NO ： 41 的下列或至少或至多 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550 或更多个连续氨 基酸或其间任何可得出的范围。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码下列蛋白之 1、 2、 3、 4 或更多种的重组核 酸分子 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或 多糖任意组合或排列的 Emp 和 / 或 Eap 多肽。
     又一些实施方案包括包含如下可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 或者其区段或片段， 或者本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方 面中， 分离的 Emp 和 / 或 Eap 多肽， 和 / 或本文所述蛋白质或肽或多糖的任何其它组合或排 列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 Emp 和 / 或非 Eap 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是这样的可药用组合物， 所述组合物具有编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核 酸， 其中所述组合物能够刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 Emp 和 / 或 Eap 多肽之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。 在某些实施方案中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选 地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向对象施用有效量的 Emp 和 / 或 Eap 多肽或其区段 / 片段之组合物， 其包含下 列一种或多种 ： (i)EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外 毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾 液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白多肽或者其区段 或片段， 或者 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 Emp 和 / 或 Eap 组合物， 其 含有不同组合的下列 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种蛋白 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷 酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋 白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在又一方面中， 本发明包括缺少 Emp 和 / 或 Eap 多肽和 / 或 EsaB 多肽的葡萄球 菌。此类细菌在长期或持续脓肿形成和 / 或生物膜形成方面是有限的或减弱的。此特征可 用于提供生产减毒细菌的菌株， 所述菌株用于制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或 治疗。在又一方面中， Emp 和 / 或 Eap 可在减毒细菌中过表达， 以进一步提高或补充免疫应 答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面中所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特 别地， 述及 Emp 和 / 或 Eap 肽或核酸时的任何实施方案可针对以下蛋白或核酸或结合它 们的抗体来实施 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 SpA、 Ebh、 Coa、 vWa、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白， 反之亦然。
     本发明人研究了金黄色葡萄球菌逃脱血液中噬菌细胞清除的能力， 并鉴定了作为 关键毒力因子的腺苷合酶 A(AdsA)—— 一种将一磷酸腺苷转化为腺苷的锚定于细胞壁的 酶。在血液中葡萄球菌的腺苷合成、 逃脱噬菌细胞的清除以及随后形成器官脓肿全都依赖 于 adsA， 并且可通过外源提供腺苷来挽救。在炭疽病原体中鉴定到 AdsA 同源物， 腺苷合成 也使得炭疽芽胞杆菌能够逃脱噬菌细胞清除。 总之， 这些结果表明， 葡萄球菌及其它细菌病 原体利用腺苷的免疫调节性质来逃脱宿主免疫应答。本发明的某些实施方案基于以下发 现： 信号传导分子腺苷的合成具有免疫抑制作用， 对其合成活性的调节可用于治疗目的。 本申请在一个实施方案中描述了 AdsA 或者与 AdsA 之全部或部分结合的抗体或者 AdsA 活性抑制剂在用于治疗细菌和 / 或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。 本申请还 提供了包含 AdsA 抗原或其免疫原性片段的免疫原性组合物。此外， 本发明提供了可用于治 疗 ( 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取 ) 或预防细菌感染的方法和组合物。在一些情况下， 刺激免疫应答的方法包括向对象施用有效量的包含或编码细菌 AdsA 多肽或抗原之全部或 部分的组合物， 在某些方面所述组合物还包含或编码其它细菌蛋白质和细菌多糖。其它细 菌蛋白质包括但不限于 (i) 分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽， 或者 (ii) 编码分泌 型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或肽的重组核酸分子。
     在另一些方面中， 可向对象施用 AdsA 调节剂， 例如结合 AdsA 的抗体 ( 例如多克 隆、 单克隆或单链抗体或者其片段 ) 或者抑制 AdsA 活性或稳定性的小分子。AdsA 调节剂 可直接与 AdsA 结合。AdsA 调节剂可以是结合 AdsA 的抗体或细胞。抗体可以是抗体片段、 人源化抗体、 人抗体和 / 或单克隆抗体等。在某些方面中， 通过提供导致在对象中产生结合 AdsA 之抗体的 AdsA 肽或表达其的细菌来产生 AdsA 调节剂。AdsA 调节剂通常配制成可药 用组合物。AdsA 调节剂组合物还可包含至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段， 或者结 合这些 ( 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SasB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 Spa、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 Coa、 Ebh、 vWa 或 SasF) 的抗体。葡萄球菌抗原或抗体可以与 AdsA 调节剂同时施用。抗原和 / 或抗体和 / 或抗生素以及 AdsA 调节剂可以在同一组合物中施 用。
     一些实施方案涉及这样治疗性组合物， 其在可药用组合物中包含结合 AdsA 蛋白 或抗原或其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中葡萄球菌的细菌感 染， 例如调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述调节剂可以是小分子， 例如腺苷类似物。所述抗 体可以是人或人源化抗体。 在某些方面中， 所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体， 或者单链 抗体， 或其片段。
     抗体组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 该抗体结合选自以下的抗原或其 片段 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。重组核酸分子可编码 AdsA 肽和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种 抗原， 其包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其 变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     AdsA 调节剂还可以是编码 AdsA 肽的重组核酸分子。 重组核酸分子可编码 AdsA 肽 和 / 或至少一种葡萄球菌抗原或免疫原性片段。核酸可编码或者多肽可包含多种抗原， 其 包括以下蛋白之全部或部分的一种或多种的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： AdsA(SasH)、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Coa、 Ebh、 vWa、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA。
     本发明的实施方案包括含有或不含细菌的组合物。 组合物可以包含或不包含减毒 的或活的或完整的葡萄球菌或其它细菌。在某些方面中， 所述组合物包含非葡萄球菌的细 菌， 或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中， 细菌组合物包含分离的或重组表达的 AdsA 多肽或编码其的核酸。在又一些方面中， 分离的 AdsA 多肽是多聚化的， 例如二聚化。在本 发明的某些方面中， 组合物包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个分离的细胞表面蛋白 或其区段的多聚体。 在另一方面中， 所述其它多肽或肽可表达或包含于细菌组合物中， 其包 括但不限于 ： AdsA、 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 或其免疫原性片段。或者， 所述 组合物可以是或包含以某种方式改变的经重组改造的葡萄球菌， 所述改造包括在分泌型毒 力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行了特定改变。例如， 所述细菌可被重组改变成表达 比未经改变时更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
     类似地， 术语 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 Coa、 Ebh、 vWa、 SasF 或 SpA 蛋白是指包括含从葡萄球菌分离的各 野生型多肽的蛋白质， 以及刺激针对其之免疫应答的变体、 区段或片段。免疫应答是指生 物体中的体液应答、 细胞应答或者两者兼有。免疫应答可通过以下测定来测量， 其包括但 不限于 ： 测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白之抗体存在或数量的测定， 测量 T 细胞活 化或增殖的测定和 / 或测量一种或多种细胞因子之活性或表达方面的调节的测定。细菌 AdsA 多肽包括但不限于下列细菌之氨基酸序列 ( 登记号 ) 的全部或部分 ： 金黄色葡萄球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261、 ref|NP_370547、 ref|YP_042156、 ref|NP_644838、 ref|YP_415541、 dbj|BAA82250) ；溶 血 葡 萄 球 菌 (Staphlyococcus hemolyticus)(ref|YP_254367) ； 血链球菌 (Streptococcus sanguinis) (ref|YP_001035187) ； 格 氏 链 球 菌 (Streptococcus gordonii)(ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)(ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (Streptococcus suis) (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ； 变 形 链 球 菌 (Streptococcus mutans)(ref|NP_721592) ； 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)(ref|YP_141373、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP_001321391) ； 肉 毒 梭 菌(Clostridium botulinum)(ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ；类 芽 孢 杆 菌 属 (Paenibacillus)(ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克 劳 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillus clausii)(ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (Bacillus halodurans)(ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)(ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解 纤 维 梭 菌 (Clostridium cellulolyticum)(ref|ZP_01574143) ； 以 及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个均通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽 可与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 具有至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包括其间的所有值和范围。
     在本发明的又一实施方案中， 组合物可包含与 AdsA 多肽 (SEQ ID NO ： 36) 或 AdsA 核酸 (SEQ ID NO ： 35) 有或至少有 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99％同一性或类似性的多肽、 肽或蛋白质， 在某些方面中， AdsA 多肽具有 SEQ ID NO ： 36 的 氨基酸序列。类似性或同一性 ( 优选同一性 ) 是本领域中已知的， 许多不同的程序可用于 鉴定蛋白质 ( 或核酸 ) 与已知序列是否具有序列同一性或类似性。序列同一性和 / 或类似 性使用本领域已知的标准技术来确定， 包括但不限于 Smith & Waterman(1981) 的局部序 列同一性算法， 通过 Needleman & Wunsch(1970) 的序列同一性比对算法， 通过 Pearson & Lipman(1988) 的类似性检索方法， 通过这些算法的计算机实施方式 (GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA， 在 Wisconsin Genetics 软 件 包 中， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.)， Devereux 等 (1984) 描述的 Best Fit 序列程序 ( 优选使用缺省设 置 )， 或者通过肉眼比较。优选地， 通过使用本领域技术人员已知和易于确定的比对工具计 算同一性百分比。
     所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 葡萄球菌是金黄色 葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在另一方面中， 细菌是芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌。
     可使用本领域技术人员已知的方法以及本文所述方法评估作为 AdsA 抑制剂之化 合物的活性。筛选测定可包含用于校准和验证测定组分之正确操作的对照。通常包含含 有除了化学文库成员之外所有反应物的空白孔。作为另一实例， AdsA 的已知抑制剂 ( 或 活化剂 ) 可与一个测定样品一起孵育， 所得酶活性的降低 ( 或升高 ) 用作比较或对照。应 理解， 所述调节剂还可与酶活化剂或抑制剂相组合， 以发现抑制酶活化或阻遏的调节剂， 否则其由已知酶调节剂的存在造成。本文使用的术语 “高通量筛选 (high throughput screening)” 或 “HTS” 是指测试成千上万个分子 ( 或测试化合物 ) 对蛋白质功能的作用。 就基团转移反应酶来说， 可测试许多分子对其催化活性的作用。HTS 方法是本领域已知的， 它们通常在多孔板中借助自动液体操作和检测装置来进行 ； 但是， 设想本发明的方法可利 用微阵列或微流体系统来实施。本文使用的术语 “文库” 或 “药物文库” 是指具有作为 AdsA 调节剂潜力的多种化学分子 ( 测试化合物 )、 多种核酸、 多种肽或多种蛋白质及其组合。其 中通过高通量筛选技术进行筛选， 其中该技术利用多孔板或微流体系统。
     评估 AdsA 活性的测定 / 试剂盒的一个实例包括但不限于 Diazyme 酶反应试剂盒 ： 该试剂盒是 5′ - 核苷酸酶 (5′ -NT) 测定试剂盒， 其通常用于测定人血清样品中的 5′ -NT 活性。5′ -NT 测定是基于 5′ - 单磷酸酯 (5′ -IMP) 酶促水解形成肌苷， 后者通过嘌呤核 苷磷酸化酶 (PNP) 转化为次黄嘌呤。次黄嘌呤随后由黄嘌呤氧化酶 (XOD) 转化为尿酸和过氧化氢 (H2O2)。在过氧化物酶 (POD) 存在下， H2O2 进一步与 N- 乙基 -N-(2- 羟基 -3- 磺丙 基 )-3- 甲基苯胺 (EHSPT) 和 4- 氨基安替比林 (4-aminoantipyrine， 4-AA) 反应产生醌染 料， 而后对该染料进行动力学监测。该方法快速但是不如放射性测定灵敏。
     抑制剂和候选抑制剂包括但不限于下列试剂的衍生物或类似物 ： α， β- 亚甲基 腺苷 5′ - 二磷酸 (AOPCP)、 5′ - 外核苷酸酶 ( 细菌 AdsA 的人同源物 ) 的抑制剂， 此抑制 剂不抑制来自鸟毛滴虫 (Trichomonas gallinae) 滋养体的分泌型 5′ - 核苷酸酶 (Borges 等， 2007) ； 杀核酶菌素 (nucleoticidin) 和黑杀菌素 (melanocidin)A 和 B， 这些化合物 显示针对来自大鼠肝膜和蛇毒的 5′ - 核苷酸酶的有力抑制活性 (Uchino 等， 1986) ； 多酚 化合物， 这些化合物具有抗肿瘤活性， 以及抑制来自多种来源的 5′ - 核苷酸酶， 并且已从 槟榔 (Areca catechu) 以及葡萄的种子中分离得到 (Iwamoto 等， 1988 ； Uchino 等， 1988 ； Toukairin 等， 1991)。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 AdsA 多肽或其区段 / 片段的重组核酸分 子。通常， 编码 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文在例如 AdsA 多 肽中所述的一种或多种多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种革兰氏阳性细 菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免疫应答的其它 动物。在另一些方面中， 含有或表达 AdsA 多肽的葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。在另一些实 施方案中， 免疫应答是保护性和 / 或治疗性的免疫应答。
     又一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 其包括向所述对象施用有效量的组合物， 其包含 ： (i)AdsA 多肽或其肽 ； 或 (ii) 编码 AdsA 多肽或其肽的核酸分子， 或 (iii) 施用与本文所述细菌蛋白质或多糖任意组合或排列 的 AdsA 多肽。
     又一些实施方案包括包含可药用组合物的疫苗， 所述组合物具有分离的 AdsA 多 肽、 其区段或片段、 或者本文所述蛋白质或肽的任何其它组合或排列， 其中所述组合物能够 刺激针对葡萄球菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的 AdsA 多肽和 / 或本文所述蛋白质、 肽或多糖的任何其它组合或排列。在本发明的某些方面中， 分离的 AdsA 多肽或者本文所述 蛋白质或肽的任何其它组合或排列是多聚化的， 例如二聚化。
     在另一方面中， 疫苗组合物包含少于约 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.05％ ( 或其间可得出的任何范围 ) 的其它葡萄球菌蛋白质杂质。组合物还可包含分离的非 AdsA 多肽。通常， 所述疫苗包含佐剂。在某些方面中， 本发明的蛋白质或肽与佐剂相连 ( 共价或 非共价偶联 )， 优选所述佐剂与所述蛋白质化学缀合。
     在又一些实施方案中， 疫苗组合物是如下可药用组合物， 其具有编码 AdsA 多肽之 全部或部分和 / 或本文所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸， 其中所述组合 物能够刺激针对葡萄球菌或芽孢杆菌的免疫应答。所述疫苗组合物可包含编码 AdsA 多肽 之全部或部分和 / 或所述蛋白质或肽之任何其它组合或排列的重组核酸。在某些实施方案 中， 所述重组核酸包含异源启动子。优选地， 所述重组核酸是载体。更优选地， 所述载体是质粒或病毒载体。
     在另一些实施方案中， 疫苗组合物是可药用组合物， 其包含结合 AdsA 蛋白或抗原 或者其片段的分离抗体或其片段， 其中所述组合物能够减弱对象中的葡萄球菌感染， 例如 调节噬菌细胞对细菌的摄取。所述抗体可以是人抗体或人源化抗体。在某些方面中， 所述 抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或者单链抗体， 或其片段。
     疫苗组合物还可包含至少一种额外的分离抗体， 其结合选自以下的抗原 ： 分离的 ClfA、 ClfB、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 Hla、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Emp、 Eap、 SasB、 SasF、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE 和 SpA 抗原， 或其片段。
     另一些实施方案包括刺激对象中针对葡萄球菌之保护性或治疗性免疫应答的方 法， 包括向所述对象施用有效量的 AdsA 多肽或其区段 / 片段的组合物， 所述组合物包含下 列一种或多种 ： (i)Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 Spa、 ClfA、 ClfB、 Coa、 Ebh、 vWa、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 多肽， 或者其区段或片 段； 或 (ii) 编码它们的核酸分子。本发明的方法还包括 AdsA 组合物， 其含有不同组合的下 列蛋白的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多种 ： Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 Coa、 Ebh、 vWa、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 IsdC、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 Spa。在某些方面中， 疫苗制剂包含 IsdA 多肽或者其区段或片段。
     在另一方面中， 本发明包括缺少 AdsA 多肽的葡萄球菌。这样的细菌在逃避吞噬细 胞摄取和 / 或识别的能力上有限或减弱。此特征可用于提供生产减毒细菌的菌株， 其用于 制备针对葡萄球菌感染或相关疾病的疫苗或治疗。在又一方面中， AdsA 可在减毒细菌中过 表达， 以进一步提高或补充免疫应答或疫苗制剂。
     在本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适于本发明的其它方面。特别地， 述及 AdsA 肽或核酸时的任何实施方案可针对其它分泌型毒力因子和 / 或细胞表面蛋白或 核酸或结合它们的抗体来实施， 例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 Coa、 Ebh、 vWa、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF 或 SpA 蛋白， 反之亦 然。
     术语 “提供” 或 “施用” 根据其常规含义使用， 表示 “供给或供应以使用” 。在一些实 施方案中， 通过施用蛋白质直接提供蛋白质， 而在另一些实施方案中， 通过施用编码蛋白质 的核酸来有效提供或施用该蛋白质。在某些方面中， 本发明涵盖包含抗体、 核酸、 抗原、 肽、 表位和 / 或多糖等之多种组合的组合物。
     对象通常患有 ( 例如诊断患有持续葡萄球菌感染 )、 怀疑患有葡萄球菌感染， 或者 具有发生葡萄球菌感染的风险。本发明的组合物包括免疫原性组合物， 其中以有效实现预 定目的 ( 例如治疗或预防感染 ) 的量包含所述抗原或表位。更具体地， “有效量” 表示刺激 或引发免疫应答或者提供针对感染的抗性、 减轻或缓和感染所需的活性成分的量。在更具 体地方面中， 有效量预防、 减轻或改善疾病或感染的症状， 或者延长所治疗对象的存活。确 定有效量在本领域技术人员的能力范围内， 尤其是在本文所提供的详细公开的教导下。对 于本发明方法使用的任何制备物， 有效量或剂量最初可从体外、 细胞培养和 / 或动物模型 测定来估计。例如， 可在动物模型中制定实现期望之免疫应答或循环抗体浓度或效价的剂 量。这些信息可用于更精确地确定人中的有用剂量。
     本文使用的术语 “调节” 涵盖了 “增强” 或 “抑制” 的含义。活性的 “调节” 可以是活性提高或降低。本文使用的术语 “调节剂” 是指实现某部分之功能的化合物， 包括上调、 诱导、 刺激、 增强、 抑制、 下调或阻抑蛋白质、 核酸、 基因、 生物体等。
     术语 “分离的” 可表示基本上不含其来源的细胞物质、 细菌物质、 病毒物质或培养 基 ( 当通过重组 DNA 技术产生或者从天然生物体中分离时 ) 或者化学前体或其它化学物质 ( 当化学合成时 ) 的核酸或多肽或肽。 此外， 分离的化合物是指可作为分离的化合物施用给 对象的化合物 ； 换句话说， 如果附着在柱子上或者嵌在琼脂糖凝胶中， 则所述化合物不可以 简单地认为是 “分离的” 。此外， “分离的核酸片段” 或 “分离的肽” 是非天然的和 / 或以片 段起作用和 / 或通常不是功能性状态的核酸或蛋白质片段。
     本发明的部分 ( 例如抗体、 多肽、 肽、 抗原或免疫原 ) 可以与其它部分 ( 例如佐剂、 蛋白质、 肽、 支持物、 荧光部分或标签 ) 共价或非共价地缀合或连接。术语 “缀合” 或 “免疫 缀合” 广义地用于定义一个部分与另一物质的有效结合， 其不旨在仅仅表示任何类型的有 效结合， 还特别地不限于化学 “缀合” 。特别地， 还考虑到重组融合蛋白。本发明的组合物还 可包含佐剂或可药用赋形剂。佐剂可以与本发明的多肽或肽共价或非共价偶联。在某些方 面中， 佐剂与蛋白质、 多肽或肽化学缀合。 在另一方面中， 佐剂是重组蛋白质的一部分， 其包 含在含有一种或多种目的抗原的融合蛋白中。 所述组合物可配制成可药用组合物。在本发明的某些方面中， 所述葡萄球菌是金 黄色葡萄球菌。
     在本发明的另一些方面中， 可超过一次地将组合物施用给对象， 可以施用 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20 或更多次。所述组合物的施用包括但不限于经鼻、 经胸膜、 经口、 肠 胃外、 皮下、 肌内、 静脉内施用， 或其多种组合， 包括吸入或吸取。
     在另一些实施方案中， 组合物包含编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽或其区段 / 片段 的重组核酸分子。通常， 编码 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的重组核酸分子含有异源启动子。
     在某些方面中， 本发明的重组核酸分子是载体， 在另一些方面中， 所述载体是质 粒。在某些实施方案中， 所述载体是病毒载体。本发明的某些方面包括另外包含编码额外 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多多肽或肽之核酸的组合物。
     在某些方面中， 组合物包含重组的非葡萄球菌， 其包含或表达本文所述的一种或 多种多肽， 例如 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽。特别地， 重组非葡萄球菌是沙门氏菌或另一种 革兰氏阳性细菌。 组合物通常施用给哺乳动物， 例如人对象， 但是也设想施用给能够引发免 疫应答的其它动物。在另一些方面中， 含有或表达 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽的葡萄球菌是 金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中， 免疫应答是保护性免疫应答。
     本发明的组合物通常施用给人对象， 但是设想施用给能够引发对葡萄球菌之免疫 应答的其它动物， 特别是小鼠、 狗、 猫、 牛、 马、 山羊、 绵羊及其它家畜， 即哺乳动物， 包括转基 因动物 ( 例如， 经操作表达人抗体的动物 )。
     在另一些方面中， 本发明的方法和组合物可用于预防、 改善、 减少或治疗组织或腺 体 ( 例如乳腺 ) 的感染， 特别是乳腺炎及其它感染。其它方法包括但不限于， 在未表现感染 征兆的对象 ( 特别是怀疑靶细菌定殖或具有该风险的对象， 例如在医院停留、 治疗和 / 或恢 复期间具有或将具有感染风险或者对其易感的患者 ) 中预防性地减少细菌负荷。
     本文提供的任何列表可特别地排除或包含列表中的任何 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个或更多个成员。
     实施例章节中的实施方案应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施方案。
     尽管本公开内容支持仅择一选择以及 “和 / 或” 的定义， 但是权利要求中使用的术 语 “或” 表示 “和 / 或” ， 除非另外指明仅择一选择或者可选项是互相排斥的。还考虑到， 使 用术语 “或” 列出的任何项也可特别地排除。
     在本申请全文中， 术语 “约” 用于表示数值包括测定该值所用仪器或方法的标准误 差。
     遵循长期以来的专利法， 在权利要求或说明书中， 与 “包含” 联用时， 无数量词修饰 的名词表示一个或多个， 除非具体指明。
     通过下文的详细描述， 本发明的其它目标、 特征和优点将是很明显的。但是， 应当 理解的是， 仅仅通过举例说明的方式给出了详细描述和具体实例 ( 即本发明的具体实施方 案 )， 因为通过这一详细描述， 在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员 而言将是很明显。 附图说明为了使本发明的上述特征、 优点和目的以及其它方面更加清楚，
     并且使详述便于理解， 附图中举例说明了上文简述的本发明的更具体描述和某些 实施方案。这些附图构成说明书的一部分。但是， 应注意， 附图举例说明了本发明的某些实 施方案， 因此不应视为对其范围的限制。
     图 1A-1H 检测金黄色葡萄球菌形成的脓肿。( 图 1A)Newman 株感染的肾脏的照 片。( 图 1B)srtA 突变体感染的肾脏的照片。( 图 1C)Newman 株感染的肾脏的 H&E 组织切 片。( 图 1D)ΔSrtA 感染的肾脏的组织切片。( 图 1E)Newman 株感染的肾脏的特写。( 图 1F)ΔSrtA 感染的肾脏的特写。( 图 1G)Newman 株脓肿的扫描电子显微镜照片。( 图 1H) ΔSrtA 感染的肾脏的 SEM 照片。
     图 2 鼠肾脓肿筛选。从各个突变株感染的肾脏回收的集落形成单位 (CFU)。
     图 3A-3G 生物膜筛选。( 图 3A) 体外生物膜生长的 96 孔板测定。( 图 3B)Newman 株体外生物膜的 SEM 照片。( 图 3C)ΔsrtA 生物膜。( 图 3D)ΔEmp 生物膜。( 图 3E)ΔIcaA 生物膜。( 图 3F)ΔIsdB 生物膜。( 图 3G)ΔSdrD 生物膜。
     图 4A-4B Emp 毒力。( 图 4A)Newman、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSrtA、 ΔEap/ΔSrtA、 ΔEmp/ ΔSrtA 回收的 CFU。( 图 4B) 各菌株的组织病理学。
     图 5A-5E Eap、 Emp 免疫。( 图 5A)Newman、 ΔSrtA、 ΔIsdB、 ΔIcaA、 ΔEap、 ΔEmp、 ΔSaeR 的 SDS 提取。( 图 5B)Eap(70kDa) 和 Emp(45kDa) 的蛋白质纯化。( 图 5C) 从用 PBS、 Eap 或 Emp 免疫并且用 Newman 株攻击的小鼠中回收的 CFU。( 图 5D) 来自经免疫小鼠的 ELISA IgG 效价。( 图 5E) 来自经免疫小鼠的组织病理学。
     图 6A-6B Ica 毒力。( 图 6A) 从用 Newman、 DIcaA、 DIcaB、 DIcaC、 DIcaD、 DIcaR、 DIca:tet( 整个操纵子缺失 ) 感染的小鼠回收的 CFU。( 图 6B) 来自被感染小鼠的组织病理 学。
     图 7A-7K 静脉内感染小鼠后的葡萄球菌脓肿形成。(A) 用 1×107 集落形成单位 (CFU) 的金黄色葡萄球菌 Newman 株通过眼眶后注射感染 BALB/c 小鼠。以一定的时间间 隔， 通过心脏穿刺检查一组五只小鼠的血液中细菌负荷 ； 将样品等分试样涂覆于琼脂培养
     基上， 对每毫升血液中的 CFU 进行统计。这些结果的平均值以黑色棒表示。(B) 以一定时间 间隔， 测量小鼠 ( 一组十只动物 ) 肾脏中金黄色葡萄球菌 Newman 株向外周器官组织的播散 以及病原体的复制， 对肾脏匀浆并涂覆于琼脂培养基上， 统计 CFU。(C) 以一定时间间隔， 在 受感染肾脏的苏木精 - 伊红染色组织薄切片中测量脓肿病变的直径。(D-K) 以一定时间间 隔， 在苏木精 - 伊红染色组织薄切片中分析受感染肾脏的图像。箭头指向脓肿病变。
     图 8A-8F 葡萄球菌脓肿群落的组织病理学。通过眼眶后注射用金黄色葡萄球菌 Newman 株感染 BALB/c 小鼠。通过光学显微镜分析感染后第 2 天 (ABC) 和第 5 天 (DEF) 的 受感染肾脏的薄切片苏木精伊红染色的组织， 并获得图像。在第 2 天， 带有偶见的胞内葡萄 球菌 (C 中黄色箭头 ) 的多形核粒细胞 (PMN) 的大量浸润 (A 中蓝色箭头 ) 是感染病变早期 的特征。在第 5 天， 葡萄球菌脓肿群落形成中心病灶 (D， 黑色箭头 )。葡萄球菌由无定形的 嗜伊红假荚膜 ( 黑色框表示 ) 包覆， 周围是死的 PMN 的区域 ( 白色框表示 )、 看上去健康的 PMN 的区域 ( 红色框表示 ) 以及坏死 PMN 的边界 ( 绿色框表示 )， 其通过嗜伊红层与健康肾 组织隔开。
     图 9A-9P 分选酶 A 是宿主组织中脓肿形成和葡萄球菌持续存在所需的。在接种后 第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 的动物尸检过程中取出用金黄色葡萄球菌 Newman 株、 其同基 因型分选酶 A 突变体 (ΔsrtA) 或甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 USA300 感染的 BALB/c 小 鼠 ( 十只动物的组 ) 的肾脏。 肉眼检查肾脏的表面脓肿 (A、 F、 K)， 或者将其固定于福尔马林 中， 包埋， 切成薄片并用苏木精 - 伊红染色。用光学显微镜以 10×(B、 G、 L、 D、 I、 N) 或 100× 放大倍数 (C、 H、 M、 E、 J、 O) 获得组织病理学图像。(P) 在感染后第 5 和 15 天测量肾组织中 葡萄球菌复制和持续存在。 在尸检时从被感染的小鼠中取出肾脏， 将组织匀浆， 并铺板于琼 脂培养基上， 用以检测集落形成和统计数目。
     图 10A-10C 脓肿病变中心的葡萄球菌群落。对来自用金黄色葡萄球菌 Newman 株 ( 野生型 )、 其同基因型分选酶 A 突变株 (ΔsrtA) 或者用 MRSA 株 USA300 感染的小鼠的肾 组织切片， 固定， 脱水并用 80％铂 /20％钯喷射涂覆以进行扫描电子显微镜分析。(A) 在脓 肿的中心野生型病原体组织成紧密相连的菌苔——葡萄球菌脓肿群落 (SAC)， 其包含在无 定形假荚膜 ( 白色箭头 ) 中， 假荚膜将 SAC 与白细胞套隔开。红细胞位于葡萄球菌中 (R)。 (B) 分选酶突变株 (ΔsrtA， 箭头 ) 不形成 SAC， 在健康肾组织中发现分离的葡萄球菌。(C) 与金黄色葡萄球菌 Newman 株类似， MRSA 株 USA300 也形成包含在假荚膜中的 SAC( 白色箭 头 )。
     图 11A-11B 葡萄球菌脓肿群落的形成需要特定表面蛋白质。(A)BALB/c 小鼠 (20 只动物的组 ) 感染后五天， 研究了在表面蛋白质基因中具有 bursa aurealis 插入物的金 黄色葡萄球菌 Newman 变体在匀浆肾组织中的细菌负荷。(B) 通过光学显微镜研究了苏木 精 - 伊红染色的被感染肾脏的薄切片， 显示脓肿病变的 10× 倍放大 ( 白色箭头 )。
     图 12A-12L 葡萄球菌脓肿病变中的 Emp 和 Eap。在接种后第 5 天 (d5) 和第 15 天 (d15) 取出用在 emp 或 eap 中带有 bursa aurealis 插入物的金黄色葡萄球菌 Newman 变体 感染的 BALB/c 小鼠的肾脏。用苏木精 - 伊红对肾脏染色， 用光学显微镜以 10×(A、 C、 E、 H) 或 100× 放大倍数 (B、 D、 F、 I) 获得组织病理学图像。在为检测多形核白细胞核用 Hoechst 染料 ( 蓝色 ) 染色以及为显示葡萄球菌脓肿群落用 BODIPY- 万古霉素 ( 绿色 ) 染色的肾组 织中， 用兔抗 Emp 或抗 Eap 抗体以及第二 Alexafluor-647 标记的抗体 ( 红色 ) 检测野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株的脓肿病变中 Eap(J) 和 Emp(K) 表达。(L) 在静脉内接种后第 5 天、 15 天和 30 天测量肾组织中葡萄球菌复制和持续存在。从被感染的小鼠 (10 只动物的 组 ) 中取出肾脏， 将组织匀浆， 铺板于琼脂培养基上， 用以集落形成和统计数目。
     图 13A-13E 用 Eap 的主动和被动免疫产生对葡萄球菌攻击的保护。(A) 用纯化的 Eap 或 Emp 来免疫 BALB/c 小鼠或者仅用佐剂模拟处理， 通过 ELISA 分析血清 IgG 效价。(B) 免疫三周后， 通过静脉内接种葡萄球菌来攻击动物。感染后第 5 天， 在尸检时取出肾脏， 分 析肾组织的葡萄球菌负荷或组织病理学。 (C) 通过亲和色谱纯化针对 Eap 或 Emp 的兔抗体， 通过腹膜内注射被动转移进小鼠体内。24 小时后， 通过 ELISA 分析被动免疫之动物的血清 IgG 效价。(D) 随后用金黄色葡萄球菌 Newman 株攻击用抗 Eap 或 Emp 的纯化抗体被动免疫 的动物以及模拟免疫的动物， 在第 4 天对细菌负荷进行统计。 (E) 在苏木精 - 伊红染色的组 织薄切片中检测肾脏中脓肿形成。
     图 14 宿主组织中葡萄球菌脓肿形成和持续存在的工作模型。阶段 1- 静脉内接种 后， 金黄色葡萄球菌在血流中存活， 并通过脉管系统散播到外周器官组织。阶段 II- 在肾组 织中， 葡萄球菌吸引多形核白细胞以及其它免疫细胞的大量浸润。阶段 III- 脓肿成熟， 其 中心积累了病原体 ( 葡萄球菌脓肿群落 -SAC)， 由嗜伊红假荚膜所包覆。SAC 周围是死 PMN 的区域、 看上去健康的 PMN 以及最后具有嗜伊红物质边界的死 PMN 的外层区域。阶段 4- 脓 肿成熟， 在器官表面破裂， 从而释放葡萄球菌进入循环， 并引起新一轮的脓肿发生。葡萄球 菌脓肿发生特定阶段所需的细菌包膜组分的基因在这些基因发挥功能的相应阶段下以红 色显示。
     图 15A-15H AdsA 是在血液中存活所必需的细胞壁相关蛋白质。比较 BALB/c 小 鼠 ( 图 15A) 或 Sprague-Dawley 大鼠 ( 图 15D) 血液中野生型金黄色葡萄球菌 Newman 株 (WT) 和同基因型 srtA 变体的存活。数据是来自三个独立分析的平均值以及平均值的标准 差 (±SEM)。为了评估分选酶 A 锚定的细胞壁表面蛋白质对血液中葡萄球菌存活的相对贡 献， 将所示基因中具有转座子插入物的同基因型突变株在来自小鼠 ( 图 15B) 或大鼠 ( 图 15E) 血液中孵育 60 分钟。在来自小鼠 ( 图 15C)、 大鼠 ( 图 15F) 或人志愿者 ( 图 15G) 的 血液中， padsA 的表达挽救了 adsA 突变株的葡萄球菌存活。显示吉姆萨染色的人血液样本 中与吞噬细胞一起的 WT、 adsA 和 adsA(padsA) 葡萄球菌 ( 图 15H)。箭头指示细胞外的和 中性粒细胞相关的金黄色葡萄球菌。数据表示使用两个不同供体的两个独立分析。
     图 16A-16E AdsA 是在体内实现葡萄球菌复制和脓肿形成的毒力因子。 10 只 BALB/ c 小鼠的组被金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16A) 或 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16C) 感染后肾脏中的葡萄球菌负荷 ( 对于 Newman 和 USA300 感染， 均为 P ＜ 0.03， 不成对 t 检验 )。金黄色葡萄球菌 Newman 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16B) 或金黄 色葡萄球菌 USA300 野生型和 adsA 突变株 ( 图 16D) 感染的小鼠尸检后获得的苏木精 - 伊红 染色的肾组织在 10 倍 ( 上图 ) 和 100 倍放大 ( 下图 ) 下的显微镜照片。黑色箭头指示葡萄 球菌的中央浓度和 PMN 浸润。 数据是每种菌株 5 只动物的组的代表性样品和 2 个独立分析。 ( 图 16E) 细菌负荷测定为 30 或 90 分钟时从 BALB/c 小鼠获得的每 500 微升血液的 CFU， 所 述小鼠通过眼眶后注射感染野生型 (WT)、 adsA 或 adsA:padsA 金黄色葡萄球菌 Newman 株。 数据是每个时间点使用 10 只动物的组进行的两个独立分析的代表。使用不成对 t 检验进 行统计学分析。图 17A-17F AdsA 显示 5′ - 核苷酸酶活性并水解 AMP。将来自所示菌株的溶葡 萄菌素细胞壁提取物与放射性标记的 [14C]AMP 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 测定 [14C] Ado( 腺苷 ) 产生。( 图 17A) 通过磷光成像仪 (PhosphorImager) 捕获 TLC 后的 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17B) 对来自 (a) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对金黄 色葡萄球菌 Newman 株的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行校准， 显示为百分比的量。 数据是三个 独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 WT 比 adsA， P ＜ 0.05)。( 图 17C) 在存在或不 存在纯化的 AdsA1-400(2μM) 以及存在或不存在 5mM 不同金属离子时孵育放射性标记的 [14C] AMP。用磷光成像仪捕获 TLC 后 [14C]AMP 和 [14C]Ado 的放射性信号。( 图 17D) 对来自 (c) 的放射性 [14C]Ado 信号进行定量， 针对氯化锰 (Mn2+) 存在时的腺苷合酶活性 (100％ ) 进行 校准， 显示为百分比的量。显示的数据是 2 个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。( 对于 +2 +2 +2 +2 Zn 比 Mn 和 Cu 比 Mn ， P ＜ 0.05)。( 图 17E) 从重组大肠杆菌纯化 GST-AdsA， 用凝血酶 切割产生 AdsA1-400， 通过考马斯染色的 SDS-PAGE 分析纯化的蛋白。( 图 17F) 在不同浓度腺 苷存在或不存在时， 大鼠血液中 adsA 葡萄球菌的存活。
     图 18A-18D 葡萄球菌 AdsA 在血液中合成腺苷。( 图 18A) 反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 定量腺苷 ( 左图， 100μM 腺苷 ) 并通过基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI-MS， 右图 ) 鉴定其单同位素离子。在没有 ( 图 18B) 或有金黄色葡萄球菌 Newman 野生型 (WT) ( 图 18C) 或其同基因型 adsA 变体 ( 图 18D) 存在下孵育小鼠血液一小时， 除去血浆中的蛋 白质， 过滤并进行 RP-HPLC， 以定量腺苷 ( 左图 )， 以及通过 MALDI-MS 鉴定其单同位素离子 ( 右图 )。 从纯化的腺苷对照外推计算得到的血液中腺苷丰度为 1.1μM(18B， 无葡萄球菌 )、 13.2μM(18C， WT 金黄色葡萄球菌 Newman 株 ) 和 2.1μM(18D， adsA 突变株葡萄球菌 )。
     图 19A-19E 5’ - 核苷酸酶活性增强炭疽芽孢杆菌的存活。 ( 图 19A) 来自炭疽芽孢 杆菌 Sterne 株 (WT， 野生型 ) 或 adsA(basA) 突变株芽孢杆菌的变溶菌素提取物与放射性标 14 记的 [ C]AMP 一起孵育， 通过 TLC 检测腺苷的产生。( 图 19B) 用针对不参与腺苷产生的对 照蛋白 BasA(αBasA) 或 BasC(αBasC) 的抗血清分析来自变溶菌素提取物的蛋白质。( 图 19C) 使用抗 BasA 抗血清 ( 上图 ) 或非反应性血清 (NRS) 以及 Cy3- 标记的第二抗体 ( 红 色 ) 染色的以及 Hoechst 对核酸染色 ( 蓝色 ) 的野生型 (WT) 炭疽芽孢杆菌 Sterne 株和其 同基因型 adsA 突变株的荧光显微照片。( 图 19D) 在 5mM 不同金属离子存在下放射性标记 的 [14C]AMP 与纯化的 BasA(2μM) 一起孵育， 通过薄层色谱 (TLC) 和磷光成像仪测量 [14C] Ado( 腺苷 ) 的产生。数据代表 3 个独立的分析。( 图 19E) 大鼠血液中野生型和 adsA/basA 突变株炭疽芽孢杆菌 Sterne 株随时间 ( 分钟 ) 的存活， 表示为琼脂板上的菌落形成单位。 数据是两个独立分析的平均值， 误差线表示 SEM。
     图 20 显示 adsA 破坏和 padsA 补偿。为了能够显示 AdsA， 我们使用蛋白 A 缺陷型 (Δspa) 金黄色葡萄球菌菌株 SEJ2， 因为蛋白 A 特异性结合抗体的 Fc 结构域并干扰免疫 印迹分析。通过 SDS-PAGE 分离来自转化有 padsA 的野生型 Δspa SEJ2( 泳道 1)、 Δspa、 adsA:ermB( 泳道 2) 或 Δspa、 adsA:ermB 细胞的细胞壁提取物， 用抗 GST-AdsA1-400 的抗血 清进行免疫印迹分析。* 表示非特异性反应物质。
     图 21 从感染 USA300 的小鼠分离的肾脏的组织学检查。 用金黄色葡萄球菌 USA300 野生型 ( 下图 ) 和 adsA 突变株 ( 上图 ) 感染 4 天的小鼠尸检后获得的肾组织苏木精 - 伊 红染色的 10× 显微照片。黑色箭头表示葡萄球菌的中央浓度和 PMN 浸润。数据是每种细菌菌株 5 只动物的组的代表性样品以及 2 个独立分析。
     发明详述
     生物膜是嵌入到分泌的细胞外基质中的微生物群落 (Hall-Stoodley 等， 2004 ； Kolter 和 Greenberg， 2006)。许多细菌物种能够从漂浮生长转换为形成生物膜， 从而显示 增强的抗生素抗性 (Drenkard 和 Ausubel， 2002)， 逃脱宿主免疫防御 (Singh 等， 2002)， 以及 更有利于在人中建立慢性感染 (Brady 等， 2008)。葡萄球菌物种的生物膜已经与许多疾病 包括心内膜炎 (Xiong 等， 2005)、 骨髓炎 (Brady 等， 2006) 以及多种植入物 ( 包括导尿管、 假体心脏瓣膜和人造关节 ) 介导的感染相关联 (Cassat 等， 2007)。这尤其适于表皮葡萄球 菌， 其是一种非常容易在体外和体内形成生物膜的机会致病菌 (Mack 等， 1996)。对于表皮 葡萄球菌来说， 形成生物膜的能力与毒力之间有明确的相关性， 该相关性此前未在金黄色 葡萄球菌中证实 (Cassat 等， 2007)。
     金黄色葡萄球菌是人皮肤和鼻孔的共生生物， 其是导致血流和皮肤 / 软组织感染 的主要原因 (Klevens 等， 2007)。葡萄球菌感染的致病是从细菌通过外伤、 手术创口或医疗 器械侵入皮肤或血流开始 (Lowy， 1998)。通过噬菌细胞的杀伤， 一些葡萄球菌从血流中被 清除， 但是逃脱了免疫防御的葡萄球菌将感染接种到器官组织， 并诱导促炎症应答， 其由来 自巨噬细胞、 中性粒细胞及其它吞噬细胞的细胞因子和趋化因子释放所介导 (Lowy， 1998)。 所导致的免疫细胞侵入感染部位伴随着中央液化性坏死以及形成外周纤维蛋白壁， 以试图 阻止微生物散布并允许除去坏死的组织碎片 (Lowy， 1998)。可通过显微镜观察到如下形式 的病变 ： 含有坏死组织、 白细胞和细菌中央病灶的多细胞区域。 器官脓肿在感染两天内发生 ( 未公开数据 )， 其代表了葡萄球菌疾病的标志。 I. 葡萄球菌抗原
     金黄色葡萄球菌 Ess 途径可视为配备了专门的转运组件 (Ess)、 辅助因子 (Esa) 和 同源分泌基质 (Esx) 的分泌模块。EssA、 EssB 和 EssC 是 EsxA 和 EsxB 分泌所必需的。因 为预计 EssA、 EssB 和 EssC 是跨膜蛋白质， 所以设想这些蛋白质形成分泌装置。ess 基因簇 中的某些蛋白质可主动转运分泌的底物 ( 作为马达 )， 而另一些可调节转运 ( 调节剂 )。调 节可通过分泌型多肽的转录或翻译后机制、 将特异性底物分选到限定的位置 ( 例如细胞外 基质或宿主细胞 )， 或者感染过程中分泌事件的时间安排来实现， 但不一定限于此。对于这 一点， 不清楚是否所有分泌的 Esx 蛋白质均起到毒素的作用或者间接导致发病。
     葡萄球菌依赖表面蛋白质介导的宿主细胞粘附或者组织侵入来作为逃脱免疫防 御的策略。此外， 在感染期间， 金黄色葡萄球菌利用表面蛋白质来螯合来自宿主的铁。大多 数参与葡萄球菌致病的表面蛋白质带有 C 端分选信号， 即它们通过分选酶与细胞壁包膜共 价连接。此外， 缺少表面蛋白质锚定所需基因 ( 即分选酶 A 和 B) 的葡萄球菌菌株在几种不 同的小鼠疾病模型中显示出毒力的显著缺陷。因此， 表面蛋白质抗原代表了有效的疫苗靶 标， 因为对应的基因是葡萄球菌疾病发生必需的， 并且可在本发明的多个实施方案中利用。 分选酶超家族是革兰氏阳性菌转肽酶， 其负责将表面蛋白质毒力因子锚定到肽聚糖细胞壁 层。已在金黄色葡萄球菌中鉴定出两种分选酶同工型—— SrtA 和 SrtB。这些酶已显示识 别底物蛋白中的 LPXTG 基序。SrtB 同工型似乎在血红素铁获得和铁动态平衡中非常重要， 而 SrtA 同工型则在革兰氏阳性细菌的致病中起关键作用 ( 其通过调节细菌粘附宿主组织 的能力而起作用， 所述粘附是通过粘附物和其它蛋白质与细胞壁肽聚糖的共价锚定来实现
     的 )。 本发明的实施方案包括但不限于涉及 Emp 和 / 或 Eap 的组合物和方法。在某些 实施方案中， Emp 和 / 或 Eap 可与其它葡萄球菌蛋白 ( 例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa 和 / 或 SpA 蛋白 ) 联用。Emp(SEQ ID NO ： 2) 或 Eap(SEQ ID NO ： 4) 是葡萄球菌多肽。 其它 Emp 和 / 或 Eap 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于登记号 ( 对于 Emp) YP_185731、 NP_371337、 NP_645584、 CAB75985、 YP_416239、 YP_040269 和 NM0758 以及 ( 对 于 Eap)YP_500650、 CAB94853、 YP_186825、 CAB51807、 NP_646697、 YP_041404、 NM1872， 其每 个均如同在本申请的优先权日通过引用并入本文。其它的葡萄球菌抗原包括 52kDa 玻连蛋 白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原 结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合 蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运 载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/ MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。
    在哺乳动物中， 腺苷在调节固有和获得性免疫应答中起到关键性作用 (Thiel 等， 2003)。强的或过度的宿主炎性应答 ( 例如响应于细菌感染 ) 加剧了入侵病原体所致的组 织损伤 (Thiel 等， 2003)。因此， 成功的微生物免疫清除包括平衡促炎和抗炎介导物。细胞 因子 IL-4、 IL-10、 IL-13 和 TGF-β 限制了过度的炎症， 但是只有腺苷能够完全阻抑免疫应 答 (Nemeth 等， 2006)。腺苷的免疫调节特性由四个跨膜腺苷受体所介导—— A1、 A2A、 A2B 和 A3(Hasko 和 Pacher， 2008)。 T 淋巴细胞表达高亲和力 A2A 受体以及低亲和力 A2B 受体 (Thiel 等， 2003)。根据其活性状态， 巨噬细胞和中性粒细胞表达所有四种腺苷受体， 而 B 细胞仅 具有 A2A(Thiel 等， 2003)。A2A 的参与在单核细胞 (Khoa 等， 2001) 和树突状细胞 (Panther 等， 2001) 中抑制 IL-12 产生， 增加 IL-10， 以及在中性粒细胞中减少细胞毒性作用和趋化因 子产生 (McColl 等， 2006 ； Cronstein 等， 1986)。炎症、 缺氧、 器官损伤和外伤性休克部位产 生腺苷是先后由两种酶所介导的。胞外 -ATP 二磷酸水解酶 (CD39) 将循环中的三磷酸腺苷 (ATP) 和二磷酸腺苷 (ADP) 转化为 5′ - 一磷酸腺苷 (AMP)(Eltzshig 等， 2003)。内皮细胞 (Deussen 等， 1993) 和 T 细胞亚群 (Thompson 等， 1989 ； Thompson 等， 1987 ； Yang 等， 2005) 表面上表达的 CD73 随后将 5′ -AMP 转化为腺苷 (Zimmermann， 1992)。
     尽管细胞外腺苷对炎症抑制来说是必要的， 但是过量的腺苷积累也是有害的。 例如， 具有腺苷脱氨酶 (ADA) 缺陷的患者中的情形， 所述 ADA 是将腺苷转化为肌苷的 酶 (Giblett 等， 1972)。ADA 缺 陷 导 致 严 重 复 合 免 疫 缺 陷 综 合 征 (severe compromised immunodeficiency syndrome， SCID)， 其具有削弱的细胞免疫和显著减少的免疫球蛋白产 生 (Buckley 等， 1997)。因为细胞外腺苷的调节在维持免疫动态平衡中是关键的， 所以对腺 苷水平的扰动很可能影响感染期间的宿主免疫应答。本发明人在本文中描述了细菌 ( 例如 金黄色葡萄球菌和炭疽芽胞杆菌 ) 利用腺苷合成来逃脱宿主免疫应答， 并提供了利用这一 信息治疗和 / 或预防细菌感染 ( 例如菌血症 ) 的方法和组合物。
     本发明的某些实施方案涉及诱导免疫应答， 提供抗 AdsA 或抑制 AdsA 的抗体。 AdsA(SEQ ID NO ： 55) 是葡萄球菌多肽。其它 AdsA 多肽的序列可见于蛋白质数据库， 包括但不限于 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (ref|YP_001573948、 ref|YP_184935、 ref|YP_039500、 ref|NP_373261 、 ref|NP_370547 、 ref|YP_042156 、 ref|NP_644838 、 ref|YP_415541 、 dbj|BAA82250) ； 溶 血 葡 萄 球 菌 (ref|YP_254367) ； 血 链 球 菌 (ref|YP_001035187) ； 格氏 链 球 菌 (ref|YP_001450531) ； 粪 肠 球 菌 (ref|NP_813870) ； 猪 链 球 菌 (dbj|BAB83980、 ref|YP_001200571、 ref|YP_001198366) ；变 形 链 球 菌 (ref|NP_721592) ；嗜 热 链 球 菌 (ref|YP_141373 、 ref|YP_139455) ； Alkaliphilus metalliredigens(ref|YP _001321391) ； 肉 毒 梭 菌 (ref|YP_001887045、 ref|YP_001921966) ； 类芽孢杆菌属 (ref|ZP_02846642) ； Alkaliphilus oremlandii(ref|YP_001512463) ； 克劳氏芽孢杆 菌 (ref|YP_174466) ； 耐 盐 芽 孢 杆 菌 (ref|NP_240892) ； 艰 难 梭 菌 (ref|ZP_03126518、 ref|ZP_02748384、 ref|YP_001089051、 ref|ZP_02726436、 ref|ZP_01801990) ； 解纤维梭菌 (ref|ZP_01574143) ； 以及 Anaerotruncus colihominis(ref|ZP_02441436)， 其每个如同在 本申请优先权日通过引用并入本文。在某些方面中， AdsA 多肽可具有与 SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 41 至少或多于 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 99％的同一性， 包 括其间所有值和范围。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽、 结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： Emp 和 / 或 Eap 及其它 葡萄球菌抗原例如 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋 白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     本发明的某些方面包括涉及蛋白质组合物的方法和组合物， 所述蛋白质组合物 包含下述多肽、 肽和 / 或结合这些多肽和肽的抗体或者编码其的核酸 ： AdsA 及其它葡萄 球菌抗原例如 Eap、 Emp、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 SasH(AdsA)、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合 蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合 蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋 白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白或其组合。这 些蛋白质可以通过缺失、 插入和 / 或替换进行修饰。
     这些多肽包含来自葡萄球菌属细菌的蛋白质的氨基酸序列。 所述序列可来自特定 的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 也可以来自特定的菌株 ( 例如 Newman 株 )。
     分选酶底物多肽包括但不限于下列氨基酸序列 ： 来自葡萄球菌属细菌的 SdrC、 SdrD、 SdrE、 IsdA、 IsdB、 SpA、 ClfA、 ClfB、 IsdC 或 SasF 蛋 白 质。 分 选 酶 底 物 多 肽序列可来自特定的葡萄球菌物种 ( 例如金黄色葡萄球菌 )， 可来自特定的菌株 ( 例 如 Newman 株 )。在某些实施方案中， SdrD 序列来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373773.1(gi|15926240) 获得， 其通过引用并入本文。在另一些实施方案中， SdrE 序列 来自菌株 N315， 可使用 GenBank 登记号 NP_373774.1(gi|15926241) 获得， 其通过引用并入 本文。在另一些实施方案中， IsdA 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1130( 其与 Newman 株具有 相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371654.1(gi|15924120) 获得， 其通过引用 并入本文。在另一些实施方案中， IsdB 序列是来自菌株 Mu50 的 SAV1129( 其与 Newman 株 具有相同的氨基酸序列 )， 可使用 GenBank 登记号 NP_371653.1(gi|15924119) 获得， 其通过 引用并入本文。在另一些实施方案中， 可使用通过 Ess 途径转运或通过分选酶加工的其它 多肽， 本领域技术人员可使用数据库和国际互联网可获取的资源来确定其序列。
     可通过分析细菌基因组的数据库提交来鉴定可用于本发明中的多种蛋白质实例， 其包括但不限于登录号 NC_002951(GI ： 57650036 和 GenBank CP000046)、 NC_002758(GI ： 57634611 和 GenBank BA000017)、 NC_002745(GI ： 29165615 和 GenBank BA000018)、 NC_003923(GI ： 21281729 和 GenBank BA000033)、 NC_002952(GI ： 49482253 和 GenBank BX571856)、 NC_002953(GI ： 49484912 和 GenBank BX571857)、 NC_007793(GI ： 87125858 和 GenBank CP000255)、 NC_007795(GI ： 87201381 和 GenBank CP000253)， 其每个均通过引用并 入本文。
     本文所用的 “蛋白质” 或 “多肽” 是指含有至少十个氨基酸残基的分子。在一些实 施方案中， 使用蛋白质或多肽的野生型形式， 但是在本发明的许多实施方案中， 使用经修饰 的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可互换使用。 “经修饰的蛋白质” 或 “经修饰的 多肽” 是指其化学结构 ( 特别是其氨基酸序列 ) 与野生型蛋白质或多肽相比发生改变的蛋 白质或多肽。在一些实施方案中， 经修饰的蛋白质或多肽具有至少一种改变的活性或功能 ( 认为蛋白质或多肽可具有多种活性或功能 )。本发明特别涉及的是， 可针对某一活性或功 能来改变被修饰的蛋白质或多肽， 而在其它方面保留野生型活性或功能 ( 如免疫原性 )。
     在某些实施方案中， 蛋白质或多肽 ( 野生型或经修饰的 ) 的大小可以包括但不局 限于 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 450、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 625、 650、 675、 700、 725、 750、 775、 800、 825、 850、 875、 900、 925、 950、 975、 1000、 1100、 1200、 1300、 1400、 1500、 1750、 2000、 2250、 2500 个氨基分子或更多、 以及其中可得出的任何范围， 或者本文所述或所引用的对应氨基酸序列的衍生物。本发明还 涉及的是， 可通过截短 ( 使其短于相应的野生型形式 ) 来突变多肽， 也可通过融合或缀合具 有特定功能 ( 例如用于靶向或定位、 用于增强免疫原性、 用于纯化目的等 ) 的异源蛋白质序 列来改变多肽。
     本文使用的 “氨基分子” 是指本领域所知的任何氨基酸、 氨基酸衍生物或氨基酸模 拟物。 在某些实施方案中， 蛋白质性分子的残基是连续的， 没有任何非氨基分子间插氨基分 子残基的序列。在另一些实施方案中， 所述序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在一 些具体实施方案中， 蛋白质性分子的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分所间插。
     因此， 术语 “蛋白质性组合物” 包括氨基分子序列， 所述序列含有天然合成蛋白质 中 20 种常见氨基酸的至少一种或者至少一种经修饰的或非常见氨基酸。
     可采用本领域技术人员所知的任何技术来制造蛋白质性组合物， 所述技术包括 (i) 通过标准分子生物学技术表达蛋白质、 多肽或肽， (ii) 从天然来源中分离蛋白质性化 合物， 或 (iii) 化学合成蛋白质性材料。先前已经公开了多种基因的核苷酸及蛋白质、 多肽 和肽的序列， 还可以在公认的计算机化数据库中找到上述序列。其中一个数据库是国立生 物技术信息中心的 Genbank 和 GenPept 数据库 ( 网址为 ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文 公开的或为本领域普通技术人员所知的技术来扩增和 / 或表达这些基因的编码区。
     Emp 或 Eap 或 AdsA 以及下列本发明其它多肽的氨基酸序列变体可以是替换、 插入 或缺失变体 ： EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻 连 蛋 白 结 合 蛋 白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连 蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类 似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋 白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白结合蛋白。与野生型相比， 本发明 多肽的修饰可影响所述多肽的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500 或更多非连续或连续氨基 酸。
     本发明的抗原可包含本文所述抗原 (AdsA、 Emp、 Eap、 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素酰 胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白 ) 的区段或片段， 其包含所述抗原的第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、 441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多 ( 包含其间所有值和范围 ) 位氨基酸至第 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138、 139、 140、 141、 142、 143、 144、 145、 146、 147、 148、 149、 150、 151、 152、 153、 154、 155、 156、 157、 158、 159、 160、 161、 162、 163、 164、 165、 166、 167、 168、 169、 170、 171、 172、 173、 174、 175、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 187、 188、 189、 190、 191、 192、 193、 194、 195、 196、 197、 198、 199、 200、 201、 202、 203、 204、 205、 206、 207、 208、 209、 210、 211、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218、 219、 220、 221、 222、 223、 224、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 233、 234、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 235、 236、 237、 238、 239、 240、 241、 242、 243、 244、 245、 246、 247、 248、 249、 250、 251、 252、 253、 254、 255、 256、 257、 258、 259、 260、 261、 262、 263、 264、 265、 266、 267、 268、 269、 270、 271、 272、 273、 274、 275、 276、 277、 278、 279、 280、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 287、 288、 300、 301、 302、 303、 304、 305、 306、 307、 289、 290、 291、 292、 293、 294、 295、 296、 297、 298、 299、 308、 309、 310、 311、 312、 313、 314、 315、 316、 317、 318、 319、 320、 321、 322、 323、 324、 325、 326、 327、 328、 329、 330、 331、 332、 333、 334、 335、 336、 337、 338、 339、 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 361、 362、 363、 364、 365、 366、 367、 368、 369、 370、 371、 372、 373、 374、 375、 376、 377、 378、 379、 380、 381、 382、 383、 384、 385、 386、 387、 388、 389、 390、 391、 392、 393、 394、 395、 396、 397、 398、 399、 400、 401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418、 419、 420、 421、 422、 423、 424、 425、 426、 427、 428、 429、 430、 431、 432、 433、 434、 435、 436、 437、 438、 439、 440、441、 442、 443、 444、 445、 446、 447、 448、 449、 450、 451、 452、 453、 454、 455、 456、 457、 458、 459、 460、 461、 462、 463、 464、 465、 466、 467、 468、 469、 470、 471、 472、 473、 474、 475、 476、 477、 478、 479、 480、 481、 482、 483、 484、 485、 486、 487、 488、 489、 490、 491、 492、 493、 494、 495、 496、 497、 498、 499、 500、 501、 502、 503、 504、 505、 506、 507、 508、 509、 510、 511、 512、 513、 514、 515、 516、 517、 518、 519、 520、 521、 522、 523、 524、 525、 526、 527、 528、 529、 530、 531、 532、 533、 534、 535、 536、 537、 538、 539、 540、 541、 542、 543、 544、 545、 546、 547、 548、 549、 550、 551、 552、 553、 554、 555、 556、 557、 558、 559、 560、 561、 562、 563、 564、 565、 566、 567、 568、 569、 570、 571、 572、 573、 574、 575、 576、 577、 578、 579、 580、 581、 582、 583、 584 或更多位氨基酸 ( 包含其间所有值和范 围 )， 包括其中所有区段和片段。 本发明的某些方面涉及结合上文所述一个或多个片段或区 段的抗体。
     缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质中的一个或多个残基。可以缺失单个残 基， 或者可以缺失多个连续的氨基酸。可将终止密码子 ( 通过替换或插入 ) 引入编码的核 酸序列中， 以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽非末端位点处加入物质。这 可包括插入一个或多个残基。还可产生末端添加， 称作 “融合蛋白” 。
     替换变体通常包含在蛋白质一个或多个位点处将一种氨基酸替换为另一种， 并可 被设计成调节多肽的一个或多个特性， 同时丢失或不丢失其它功能或特性。替换可以是保 守性的， 即将一种氨基酸替换成形状和电荷相似的氨基酸。 保守性替换为本领域所熟知， 包 括例如以下改变 ： 丙氨酸变为丝氨酸 ； 精氨酸变为赖氨酸 ； 天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨 酸； 天冬氨酸变为谷氨酸 ； 半胱氨酸变为丝氨酸 ； 谷氨酰胺变为天冬酰胺 ； 谷氨酸变为天冬 氨酸 ； 甘氨酸变为脯氨酸 ； 组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺 ； 异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨 酸； 亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸 ； 赖氨酸变为精氨酸 ； 甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸 ； 苯丙氨酸变为酪氨酸、 亮氨酸或甲硫氨酸 ； 丝氨酸变为苏氨酸 ； 苏氨酸变为丝氨酸 ； 色氨酸 变为酪氨酸 ； 酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸 ； 缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者， 替换可 以是非保守的， 从而影响多肽的功能或活性。非保守性改变通常包括将残基替换成化学性 质上不相似的残基， 如极性或带电氨基酸替换非极性或不带电氨基酸， 反之亦然。
     表 1. 金黄色葡萄球菌菌株的示例性表面蛋白质。
    39SAV# SpA FnBPA FnBPB ClfA ClfB Can SdrC SdrD SdrE Pls SasA SasB SasC SasD 241 2186 686 2481 213 241 2275 2271 2271 2481 2186 241 1141 1141 1141 1347 1385 1385 955 953 953 947 1315 1166 1183 907 877 877 913 873 1183 906 1137 1351 2222 2189 221 946 935 989 933 1029 943 961 961 965 1015 1038 1038 1015 957 928 905 1183 492 450 450 516 492SA#表面MW2Mu50N315NewmanMRSA252*MSSA476*SAV0111SA0107102333540 A CN 102333554SAV2503SA2291SAV2502SA2290SAV0811SA0742SAV2630SA2423Npnp说SAV0561SA0519957 1365 1141 2275 685 2186 241明40SAV0562SA0520书SAV0563SA0521NpnpSAV2654SA2447SAV2160SA1964SA1577SAV0134SA012929/86 页102333540 A CN 102333554说明书30/86 页
    SAV1130 41SA0977SasE/IsdA350350350354350
     SasF SasG SasH SasI SasJ/IsdB SasK SasL IsdC 227 227 232 227 198 211 211 645 645 645 895 891 891 772 772 1371 525 927 786 534 652 227 635 635 635 627 635 1371 786 895 645 197 227102333540 A CN 102333554SAV2646SA2439SAV2496SAV0023SA0022说SAV1731SA1552明本发明的蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者， 可以从细菌中分离出非重组 或重组的蛋白质。 还考虑可将含有上述变体的细菌应用于本发明的组合物和方法中。 因此， 不需要分离蛋白质。42SAV1129SA0976书SA2381NpSAV1131SA097831/86 页102333540 A CN 102333554
    说明书32/86 页本文中使用的术语 “功能等价密码子” 是指编码同一氨基酸的密码子 ( 如精氨酸 或丝氨酸的六个密码子 )， 也指编码生物学上等价之氨基酸的密码子 ( 见下面的表 2)。
     表 2 密码子表
    还应当理解， 氨基酸和核酸序列可包含额外的残基， 如分别为额外的 N 端或 C 端氨 基酸、 或 5′或 3′序列， 但仍然基本如本文公开的序列之一所示， 只要该序列满足上文设 定的标准 ( 包括保持与蛋白质表达相关的蛋白质生物活性 ) 即可。末端序列的添加特别适 用于核酸序列 ( 例如， 其可包含位于编码区 5′或 3′部分之侧翼的不同非编码序列 )。
     下文是基于改变蛋白质的氨基酸来产生等价或改进的第二代分子的讨论。例如， 蛋白质结构中的某些氨基酸可以替换为其它氨基酸， 而没有相互结合能力 ( 与例如抗体的 抗原结合区或底物分子上的结合位点之结构结合 ) 的明显损失。由于蛋白质的相互作用能 力和性质决定了蛋白质的生物学功能活性， 因此可在蛋白质序列 ( 及其 DNA 编码序列 ) 中 进行某些氨基酸替换， 而仍产生具有相似特性的蛋白质。因而， 本发明人考虑可在基因的 DNA 序列中进行多种改变， 而不导致其生物学应用和活性 ( 例如免疫原性 ) 的明显损失。
     进行这种改变时， 可考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质 以相互作用生物学功能中的重要性已为本领域所广泛了解 (Kyte 和 Doolittle、 1982)。为 人们所接受的是， 氨基酸的相对亲水性决定了产物蛋白质的二级结构， 其二级结构进而决 定了该蛋白质与其它分子 ( 例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等 ) 的相互作用。
     还为本领域所了解的是， 可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的替换。通过引 用并入本文的美国专利 4,554,101 陈述了蛋白质的最大局部平均亲水性 ( 由其邻近氨基酸 亲水性所决定 ) 与蛋白质的生物学特性相关。应理解的是， 氨基酸可以被替换为具有相似 亲水性值的其它氨基酸， 而仍产生生物学等价的或免疫学等价的蛋白质。
     如上所述， 氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性， 例如它们的
     疏水性、 亲水性、 电荷、 大小等。将前述多种特征考虑在内的示例性替换是众所周知的， 包 括： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 以及缬氨 酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
     本发明涉及的是， 在每 ml 本发明组合物中有约 0.001mg 至约 10mg 的总多肽、 肽和 / 或蛋白质。因此， 组合物中的蛋白质浓度可以是约、 至少约或至多约 0.001、 0.010、 0.050、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 9.5、 10.0μg 或 mg/ml 或更高 ( 或其中可得出的任何范 围 )。在其中， 约、 至少约或至多约 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100％可以是 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA， 并且可与本文所述其它多肽序列联用。
     本发明还公开了葡萄球菌抗原的组合， 当组合时， 其导致产生有效治疗或预防葡 萄球菌感染的免疫原性组合物。葡萄球菌感染经历几个不同阶段。例如， 葡萄球菌的生活 周期包含共生定殖， 通过进入邻近组织或血流起始感染， 在血液中厌氧性扩增， 金黄色葡萄 球菌毒力决定簇与宿主防御机制相互作用， 以及诱导并发症包括心内膜炎、 转移性脓肿形 成和败血症综合征。细菌表面上的不同分子参与了感染周期的不同阶段。某些抗原的组合 可引发免疫应答， 其针对葡萄球菌感染的多个阶段进行保护。可在动物模型测定中和 / 或 使用调理吞噬测定来测量免疫应答的效力。
     多肽和多肽产生
     本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、 肽和蛋白质及其免疫原性片段。 例如， 对特定多肽进行测定或用于引发免疫应答。 在一些具体实施方案中， 也可根据常规技 术在溶液中或在固体支持物上合成本发明蛋白质的全部或部分。 多种自动合成仪是可购得 的， 且可以根据已知的方案加以使用。参见例如 Stewart 和 Young(1984)、 Tam 等 (1983)、 Merrifield(1986)、 Barany 和 Merrifield(1979)， 其均通过引用并入本文。或者， 可使用重 组 DNA 技术， 其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体中， 转化或转染入合适的宿 主细胞并在适于表达的条件下培养细胞。
     本发明的一个实施方案包括利用转移至细胞 ( 包括微生物 ) 中的基因来产生和 / 或呈现蛋白质。可将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中， 接着在合适条件下培养 细胞。 可使用编码几乎任何多肽的核酸。 本文讨论了重组表达载体的产生及其包含的元件。 或者， 要生产的蛋白质可以是由用于蛋白质生产的细胞所正常合成的内源蛋白质。
     本发明的另一实施方案使用了自体 B 淋巴细胞细胞系， 所述细胞系转染有表达免 疫原产物 ( 更具体地为具有免疫原活性的蛋白质 ) 的病毒载体。哺乳动物宿主细胞系的其 它实例包括但不局限于 Vero 和 HeLa 细胞、 其它 B 和 T 细胞系 ( 如 CEM、 721.221、 H9、 Jurkat、 Raji)、 以及中国仓鼠卵巢细胞系、 W138、 BHK、 COS-7、 293、 HepG2、 3T3、 RIN 和 MDCK 细胞。此 外， 可选择调节插入序列表达的或以期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质 产物的这种修饰 ( 例如糖基化 ) 和加工 ( 例如切割 ) 可以对蛋白质功能是重要的。不同宿 主细胞在蛋白质的翻译后加工和修饰方面具有特征性的和特定的机制。 可选择合适的细胞 系或宿主系统来确保所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。可使用多种选择系统， 包括但不局限于分别位于 tk、 hgprt 或 aprt 细胞中的 HSV 胸苷激酶、 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、 腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外， 还可使 用抗代谢物抗性作为选择基础 ： dhfr 赋予对甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性 ； gpt 赋予对 霉酚酸的抗性 ； neo 赋予对氨基糖苷 G418 的抗性 ； hygro 赋予对潮霉素的抗性。
     动物细胞可以两种方式在体外增殖 ： 非锚着依赖性细胞， 其在整个培养物体积中 悬浮培养， 或者锚着依赖性细胞， 其需要附着在固体基底上进行增殖 ( 即单层类型的细胞 培养 )。
     来源于连续的已建立细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养物是大规模生产细胞和 细胞产物的最常用方法。 但是， 悬浮培养的细胞具有局限性， 例如致瘤潜力和低于附着细胞 的蛋白质产量。
     当本文具体提及蛋白质时， 优选表示天然或重组蛋白质， 或者任选地已去除任何 信号序列的蛋白质。所述蛋白质可直接从葡萄球菌菌株分离出来或者通过重组 DNA 技术产 生。蛋白质的免疫原性片段可并入本发明的免疫原性组合物中。它们是包含连续取自蛋白 质氨基酸序列的至少 10 个氨基酸、 20 个氨基酸、 30 个氨基酸、 40 个氨基酸、 50 个氨基酸或 100 个氨基酸 ( 包括其间所有值和范围 ) 的片段。另外， 此类免疫原性片段与针对葡萄球 菌蛋白产生的抗体或者与用葡萄球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体具有免疫反应性。 免疫 原性片段还包括当以有效剂量施用时 ( 单独地或作为结合运载体的半抗原 ) 引发针对葡萄 球菌感染之保护性免疫应答的片段， 在某些方面， 其具有针对金黄色葡萄球菌和 / 或表皮 葡萄球菌感染的保护作用。这些免疫原性片段可包含例如缺少 N 端前导序列和 / 或跨膜结 构域和 / 或 C 端锚定结构域的蛋白质。在一个优选方面中， 本发明的免疫原性片段包含与 片段序列长度上所选序列有至少 85％同一性、 至少 90％同一性、 至少 95％同一性或者至少 97-99％同一性 ( 包括其间所有值和范围 ) 的蛋白质的基本上全部的细胞外结构域。
     本发明的免疫原性组合物还包含由葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白免疫原性片段 组成的融合蛋白。这些融合蛋白可以通过重组产生， 可包含至少 2、 3、 4、 5 或 6 种葡萄球菌 蛋白的一部分。或者， 融合蛋白可包含至少 1、 2、 3、 4 或 5 种葡萄球菌蛋白的多个部分。它 们可在同一蛋白质中组合不同的葡萄球菌蛋白和 / 或多个相同的蛋白质或蛋白质片段或 者其免疫原性片段。 或者， 本发明还包括葡萄球菌蛋白或其免疫原性片段的各个融合蛋白， 所述融合蛋白具有异源序列， 例如提供 T- 细胞表位或纯化标签 ( 例如 ： β- 半乳糖苷酶、 谷 胱甘肽 -S- 转移酶、 绿色荧光蛋白 (GFP))、 表位标签 ( 例如 FLAG、 myc 标签、 多组氨酸 ) 或 者病毒表面蛋白质 ( 例如流感病毒血细胞凝集素 ) 或细菌蛋白质 ( 例如破伤风类毒素、 白 喉类毒素和 CRM197)。
     治疗方法
     使用疫苗进行主动免疫和使用免疫球蛋白进行被动免疫是替代经典小分子 ( 例 如抗生素 ) 治疗的具有前景的方案。曾经造成大范围疾病、 残疾和死亡的一些细菌性疾病 如今可以通过使用疫苗进行预防。疫苗是基于削弱 ( 减毒 ) 或死亡的细菌、 细菌表面的组 分或失活的毒素。疫苗产生的免疫应答主要涉及免疫原性结构 ； 由免疫系统主动加工的细 菌上有限数目的蛋白质或糖结构。
     本发明的方法包括治疗由细菌性病原体 ( 例如葡萄球菌或芽胞杆菌 ) 引起或与其 有关的疾病或病症。免疫原性多肽和 / 或与其结合的抗体可用于在感染细菌或怀疑暴露于细菌的人中诱导或提供治疗性应答。 该方法可用于经测试为暴露于葡萄球菌或芽胞杆菌呈 阳性的个体， 或者用于根据可能的暴露被认定为具有感染风险的个体。
     本发明涵盖了葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的治疗方法。特别 地， 本发明涵盖了细菌感染 ( 特别是菌血症 ) 的治疗方法。本发明的治疗性组合物和疫苗 对于非紧急手术 (elective surgery) 来说是特别有利的。这些患者预先知晓手术的日期， 因此可预先进行接种或治疗。本发明的免疫原性组合物和疫苗对于接种医疗工作者、 第一 急救者 (first responder) 等也是有利的。
     在一些实施方案中， 所述治疗在佐剂或运载体或其它葡萄球菌抗原存在下施用。 此外， 在某些实例中， 治疗包括施用常用于抗细菌感染的其它药剂， 例如一种或多种抗生 素。
     A. 疫苗
     本发明包括预防或减轻葡萄球菌感染 ( 特别是医院获得的医源性感染 ) 的方法。 因此， 本发明涉及在主动和被动免疫的实施方案中使用的疫苗。被认为适合用作疫苗的免 疫原性组合物可以从免疫原性 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 多肽 ( 例如全长的 Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 抗原或其免疫原性片段 ) 制备。在另一些实施方案中， Emp、 Eap 和 / 或 AdsA 可与其 它分泌型毒力蛋白、 表面蛋白或其免疫原性片段联合使用， 包括 EsaB、 EsaC、 EsxA、 EsxB、 SdrC、 SdrD、 SdrE、 Hla 或其变体、 IsdA、 IsdB、 ClfA、 ClfB、 IsdC、 SasB、 SasF、 Ebh、 Coa、 vWa、 SpA、 52kDa 玻连蛋白结合蛋白 (WO 01/60852)、 Aaa、 Aap、 Ant、 自溶素氨基葡糖苷酶、 自溶素 酰胺酶、 Cna、 胶原结合蛋白 (US6288214)、 EFB(FIB)、 弹性蛋白结合蛋白 (EbpS)、 EPB、 FbpA、 纤维蛋白原结合蛋白 (US6008341)、 纤连蛋白结合蛋白 (US5840846)、 FnbA、 FnbB、 GehD(US 2002/0169288)、 HarA、 HBP、 免疫显性 ABC 运载蛋白、 IsaA/PisA、 层粘连蛋白受体、 脂肪酶 GehD、 MAP、 Mg2+ 运载蛋白、 MHC II 类似物 (US5648240)、 MRPII、 Npase、 RNA III 活化蛋白 (RAP)、 SasA、 SasB、 SasC、 SasD、 SasK、 SBI、 SdrF(WO 00/12689)、 SdrG/Fig(WO 00/12689)、 SdrH(WO 00/12689)、 SEA 外毒素 (WO 00/02523)、 SEB 外毒素 (WO 00/02523)、 SitC 和 Ni ABC 运载蛋白、 SitC/MntC/ 唾液结合蛋白 (US5,801,234)、 SsaA、 SSP-1、 SSP-2 和 / 或玻连蛋白 结合蛋白或者本领域技术人员已知的其它葡萄球菌抗255