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盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法
    本发明涉及用作治疗药物的三环化合物、 含有它们的药用组合物、 采用该化合物 治疗患者的生理学疾病的方法以及在合成该化合物中使用的中间体和方法。
     醛固酮是主要的内源性盐皮质激素， 它可以与盐皮质激素受体 (MR) 相互作用， 促进钠和水的再吸收以及钾的排泄。由于醛固酮在维持电解质和水的平衡中的作用， 所以可以采用 MR 拮抗剂治疗多种生理学疾病， 包括高血压， 低钾血症， 心肌性心律失常 (myocardial arrhythmias)、 Bartter 氏综合征以及原发性或继发性高醛固酮症疾病， 例如 Conn 氏综合征。最近， MR 拮抗剂已经用于治疗充血性心衰和急性心肌梗塞。另外， MR 拮抗 剂在肾病临床前模型中也被证明是有效的， 可以与标准疗法组合用于降低肾病患者的蛋白 尿， 例如慢性肾病， 包括糖尿病性肾病。
     然而， 现有的甾体 MR 拮抗剂产生了限定其安全性和 / 或有效性的伴随作用。 例如， 螺内酯是非选择性的， 能够与其它核激素受体 ( 例如雄性激素受体 (AR)、 黄体酮受体 (PR) 或糖皮质激素受体 (GR)) 产生交互作用， 从而介导其它生理学过程。螺内酯疗法也可以用 于治疗高钾血症以及男性乳房发育、 性功能障碍、 性欲减退、 月经失调和胃痛。尽管相对于 其它核激素受体而言， 依普利酮对 MR 具有选择性， 但是它也与高钾血症有关。因此， 本领域 中需要现有 MR 拮抗剂疗法的替代疗法。
     本发明的目的是提供具有 MR 拮抗活性的非甾体类 MR 配体。更具体地讲， 本发明 的目的是提供非甾体类 MR 拮抗剂， 相对于 AR、 PR 和 GR 而言， 它能够与 MR 以较高的亲和力 结合。作为更具体的实施方案， 本发明的目的是提供非甾体类 MR 拮抗剂， 相对于 AR、 PR 和 GR 而言， 它能够与 MR 以较高的亲和力结合， 并且它具有有效的肾脏或心脏保护性能。作为 更具体的实施方案， 本发明的目的是提供非甾体类 MR 拮抗剂， 相对于 AR、 PR 和 GR 而言， 它 能够与 MR 以较高的亲和力结合， 它具有有效的肾脏或心脏保护性能， 但是它能够降低产生 高钾血症的发生率或可能性。
     三环 MR 配体在本领域中是已知的。例如 WO 04/052847 和 WO05/066161 公开了三 环甾体类激素受体调节剂， 它们可以用于治疗对盐皮质激素受体或糖皮质激素受体调节敏 感的疾病。本发明涉及特别的二苯并氧杂环庚烯， 如下面化合物 (I) 所示， 它在体外和体 内均具有活性， 这说明它可以用于治疗或预防对盐皮质激素受体拮抗剂的治疗有响应的疾 病。
     因此， 本发明提供了下式化合物或其可药用的盐 ：
     化合物 (I)(5-((E)-(3- 氟二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六 嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮 )。氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c][1， 4]
     作为具体的实施方案， 本发明提供了结晶形式的化合物 (I) 或其可药用的盐。
     在另一个实施方案中， 本发明提供了治疗或预防下列疾病的方法 ： 充血性心衰、 糖 尿病性肾病、 慢性肾病、 高血压、 低钾血症、 心肌性心律失常、 Bartter 氏综合征、 原发性或继 发性高醛甾酮症或 Conn 氏综合征， 该方法包括给予需要的患者有效量的化合物 (I) 或其可 药用的盐。作为更特别的方面， 本发明提供了治疗或预防充血性心衰、 高血压、 糖尿病性肾 病或慢性肾病的方法， 该方法包括给予需要的患者有效量的化合物 (I) 或其可药用的盐。
     本发明也提供了化合物 (I) 或其可药用的盐在治疗中的用途。另外， 本发明提供 了化合物 (I) 或其可药用的盐在治疗或预防下列疾病中的用途 ： 充血性心衰、 糖尿病性肾 病、 慢性肾病、 高血压、 低钾血症、 心肌性心律失常、 Bartter 氏综合征、 原发性或继发性高醛 甾酮症或 Conn 氏综合征。更具体地讲， 本发明提供了化合物 (I) 或其可药用的盐在治疗或 预防充血性心衰、 高血压、 糖尿病性肾病或慢性肾病中的用途。
     在另一个实施方案中， 本发明提供了化合物 (I) 或其可药用的盐在生产用于治疗 或预防下列疾病的药物中的用途 ： 充血性心衰、 糖尿病性肾病、 慢性肾病、 高血压、 低钾血 症、 心肌性心律失常、 Bartter 氏综合征、 原发性或继发性高醛甾酮症或 Conn 氏综合征。更 具体地讲， 本发明提供了化合物 (I) 或其可药用的盐在生产用于治疗或预防充血性心衰、 高血压、 糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的用途。
     另外， 本发明提供了药用组合物， 该组合物含有化合物 (I) 或其可药用的盐以及 与之组合的一或多种可药用的载体、 稀释剂或赋形剂。 更具体地讲， 本发明提供了用于治疗 或预防充血性心衰、 高血压、 糖尿病性肾病或慢性肾病的药用组合物， 该组合物含有化合物 (I) 或其可药用的盐以及与之组合的一或多种可药用的载体、 稀释剂或赋形剂。 本发明也包 括用于合成化合物 (I) 的新中间体和方法。
     本发明涉及化合物 (I) 的可药用盐以及化合物 (I) 或其可药用盐的溶剂化物。 因此， 本文中使用的术语 “化合物 (I)” 在其定义中包括化合物的任何溶剂合物。可药用 盐及其制备方法的实例是本领域技术人员所熟知的。参见例如， Stahl 等， “可药用盐手 册： 性能、 选择和使用 (Handbook of Pharmaceutical Salts ： Properties， Selection and Use)” ， VCHA/Wiley-VCH， (2002) ； Gould， P.L.， “碱 性 药物 的盐的 选 择 (Salt selection for basic drugs)” ， International Journal of Pharmaceutics， 33 ： 201-217(1986) ； Bastin 等 “药用新化学实体的盐的选择及优化方法 (Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities)” ， Organic Process Research and Development， 4： 427-435(2000)。特别提及的是化合物 (I) 甲苯磺酸盐， 然而应当理 解， 优选化合物 (I) 的游离碱。
     本文中使用的术语 “R” 和 “S” 如有机化学中常规定义， 代表手性中心的具体构型。 术语 “(±)” 、 “R/S” 或 “RS” 是指手性中心的外消旋构型。部分优先次序列表和立体化学讨 论参见 “有机化合物命名 ： 原则和实践 (Nomenclature of Organic compounds ： Principles and Practice)” ， (J.H.Fletcher 等编辑， 1974)。 本文中使用的表述 是指向前突 出纸平面外的键， 而表述 是指向后突出纸平面外的键。
     本领域技术人员应当理解， 含有碳 - 碳或碳 - 氮双键的分子可以以几何异构体存在。通常采用两种方法表述具体的异构体， “反式 - 顺式” 方法和 “E 和 Z” 方法， 这取决于 与每个双键原子连接的基团是相同的还是不同的。 关于几何异构现象的讨论和具体异构体 的命名可以参见 March， “Advanced Organic Chemistry( 高等有机化学 )” ， John Wiley & Sons， 1992， 第 4 章。
     化合物 (I) 可以制成药用组合物的一部分。因此， 包含化合物 (I) 或其可药用的 盐以及与之组合的可药用的载体、 稀释剂或赋形剂的药用组合物是本发明的重要的实施方 案。 药用组合物及其制备方法的实例在本领域中是众所周知的。 参见， 例如 REMINGTON ： THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY( 雷明顿 ： 药学科学与实践 )(A.Gennaro 等编辑， 第 19 版， Mack Publishing(1995))。包含化合物 (I) 的说明性组合物包括例如 ： 化合物 (I) 的混悬液， 含有 0.5％的羧基甲基纤维素、 0.25％的聚山梨醇酯 80 和 2.7％的 NaCl ； 或化合 物 (I) 的混悬液， 含有 1％的羧基甲基纤维素和 0.25％的聚山梨醇酯 80 ； 化合物 (I) 的混 悬液， 含有 1％的羧基甲基纤维素、 0.25％的聚山梨醇酯 80 和 0.05％的消泡剂 1510TM 的纯 化水溶液 ； 化合物 (I)( 射流研磨 ) 的混悬液， 含有 1％的羧基甲基纤维素钠、 0.25％的聚山 TM 梨醇酯 80 和 0.05％的消泡剂 1510 的纯化水溶液 ； 化合物 (I)( 射流研磨 ) 的混悬液， 含 有 1％的羟乙基纤维素、 10％的维生素 E TPGS(d-α- 维生素 E 聚乙二醇 1000 琥珀酸酯 ) TM 和 0.05％的消泡剂 1510 的纯化水溶液 ； 化合物 (I)( 射流研磨 ) 的混悬液， 含有 10％的维 TM 生素 E TPGS 和 0.05％的消泡剂 1510 的纯化水溶液 ； 化合物 (I) 的溶液 (15mg/ml)， 含有 20％的
     25mM 的磷酸盐缓冲液 (pH ～ 2) 和 1eq.HCl。然而， 应当理解， 优选的本发明组合物含有化合物 (I) 或其可药用的盐， 制成胶囊或片剂。 化合物 (I) 或其可药用的盐或者含有化合物 (I) 或其可药用的盐的组合物可以通 过能够使得化合物可生物利用的任何途径给药， 包括口服和肠胃外途径。然而， 应当理解， 优选口服给药。
     本领域技术人员应当理解， 颗粒大小能够影响药物成分的体内溶出， 这又影响成 分的吸收。 本文中使用的 “颗粒大小” 是指药物成分颗粒的直径， 可以通过常规技术确定， 例 如激光散射、 激光衍射、 米氏散射、 沉降场流分离、 光子相关光谱等。 当药物成分具有较差的 溶解度， 较小或者减小的颗粒大小可能有助于溶出， 因此能够增加成分的吸收。Amidon 等， Pharm.Research， 12 ； 413-420(1995)。用于减小或控制颗粒大小的方法 ( 微粉化 ) 是常规 方法， 包括球磨研磨、 针铣 (pin milling)、 射流研磨、 湿法研磨等。用于控制颗粒大小的另 一种方法包括在纳米混悬液中制备药物成分。本发明的特殊实施方案包括化合物 (I) 或化 合物 (I) 可药用的盐或者含有化合物 (I) 或其可药用的盐的药用组合物， 其中所述化合物 或盐的颗粒大小为 d90( 即， 90％的颗粒的大小小于或等于 ) 小于约 10μm。
     本领域技术人员应当理解， 只有具有某些物理特性的药物成分才是符合要求的。 具体而言， 稳定的、 结晶固体成分是满足需要的， 因为它们特别符合常规要求 ： 化学合成、 纯 化、 储存以及制剂或剂型开发。本文中使用的术语 “晶形” 或 “结晶形式” 是指化学物质的 结晶制品。
     特别的结晶形式可以被定性， 因此采用常规技术可以与相同化学物质的其它固 体形式区别开来， 所述技术包括 X- 射线粉末衍射 (XRPD)、 光谱方法 ( 例如红外 (IR) 或核 磁共振 (NMR) 光谱 ) 和热技术 ( 例如差示扫描量热法 (DSC)、 热重分析 (TGA) 或差热分析 (DTA))。尽管 XRPD 为鉴定化学物质结晶形式的特别有用的方法， 但是应当理解， 即使是相同的结晶形式， X- 射线图谱中的实际峰强度也由于分析方法的不同而不同， 这取决于分析 的样品和设备、 采用的溶剂或方法。另外， 也应当理解， 当自给定的结晶形式分析获得的准 确峰位 ( 以° 2θ 测定 ) 在不同的分析之间有差别 ( 例如 ±0.1° ) 时， 光谱之间的峰位置 的相对模式保持基本相同。
     本发明提供了结晶形式的化合物 (I)。 更具体地讲， 本发明提供了结晶形式的化合 物 (I) 的游离碱， 其在约 10.5、 13.0、 15.5 和 19.7 处有° 2θ 特征峰 ( 本文实施例中的游 离碱 I 型 )。另外， 本发明提供了结晶形式的化合物 (I) 的游离碱， 其在约 11.3、 12.1、 18.8 和 21.0 处有° 2θ 的特征峰 ( 本文实施例中的游离碱 II 型 )。
     本文中使用的术语 “患者” 是指人类或非人类哺乳动物， 例如犬、 猫、 牛、 猴、 马或 羊。更具体地讲， 术语 “患者” 是指人类。本文中使用的术语 “治疗” 包括阻止、 预防、 控制、 减缓、 停止或逆转现有症状或疾病的进展或严重程度。 本文中使得的术语 “预防” 是指阻止、 控制或抑制症状或疾病的发生率或发生。 本领域技术人员可以理解， 生理学疾病可以为 “慢 性” 状态或者为 “急性” 事件。因此， 疾病的治疗既包括急性事件也包括慢性状态。在急性 事件中， 化合物在症状发作时立即给予， 当症状消失时停止给予， 而慢性状态应在疾病的整 个过程中始终给予治疗。 本文中使用的术语 “有效量” 是指以单剂量或多剂量给予患者并能够在诊断或治 疗中提供患者所需要的效果的化合物 (I) 或其可药用的盐的量或剂量。有效量可以由作 为本领域技术人员的主治诊断医师根据下列多种因素容易地确定 ： 例如哺乳动物的种类 ； 动物体积、 年龄和一般健康情况 ； 所涉及的具体疾病 ； 疾病的程度或严重性 ； 个体患者的响 应； 给予的特定化合物 ； 给药的模式 ； 给予的制剂的生物利用度特性 ； 选择的剂量方案 ； 任 何伴随药物的使用。
     当在本发明的方法或用途中使用时， 本发明的化合物和组合物可以单独给药或者 与用于治疗特定疾病或病症的常规治疗药物组合给药。 例如， 化合物 (I) 或含有化合物 (I) 的组合物可以与用于治疗高血压、 糖尿病性肾病或慢性肾病的常规药物组合给药， 例如血 管紧张素转化酶 (ACE) 抑制剂或血管紧张素受体阻断剂 (ARB 药物 )。 当本发明的化合物或 组合物作为组合疗法的一部分时， 化合物 (I) 或含有化合物 (I) 的组合物可以分别给药或 者作为含有与之组合的治疗药物的制剂的一部分给药。
     生物学活性测定 ：
     本文中使用的 “Kd” 是指配体 - 受体复合物的平衡解离常数 ； “Ki” 是指药物 - 受 体复合物的平衡解离常数， 它是处于平衡状态时与一半的结合位点结合的药物浓度的指 示； “Kb” 是指拮抗剂 - 受体复合物的平衡解离常数 ； “IC50” 是指能够使得所述药物所可能 产生的最大抑制响应的 50％的药物浓度， 或者能够使得与受体结合的配体产生 50 ％置换 的药物的浓度 ； “EC50” 是指能够使得所述药物所可能产生的最大响应的 50％的药物浓度 ； “ED50” 是指能够使得所述药物所可能产生的最大响应的 50％所给予的治疗药物的剂量。
     A. 类固醇核激素受体结合实验 ：
     将获自过度表达人 MR( 盐皮质激素受体 )、 GR( 糖皮质激素受体 )、 AR( 雄激素受 体 ) 或 PR( 黄体酮受体 ) 的人胚胎肾 HEK293 细胞的细胞裂解物用于受体 - 配体竞争结合 实验以测定 Ki 值。
     简而言之， 类固醇受体竞争结合实验在缓冲液中进行， 所述缓冲液含有 20mM
     HEPES 缓冲液 (pH ＝ 7.6)、 0.2mM EDTA、 75mM NaCl、 1.5mMMgCl2、 20％丙三醇、 20mM 钼酸钠、 0.2mM DTT( 二硫苏糖醇 )、 20μg/mL 抑肽酶和 20μg/mL 亮抑肽酶 ( 实验缓冲液 )。 通常， 类 3 固醇受体结合实验包括放射性标记的配体， 例如用于 MR 结合的 0.25nM[ H]- 醛固酮、 用于 3 3 GR 结合的 0.7nM[ H]- 地塞米松、 用于 AR 结合的 0.36nM[ H]- 美曲勃龙 (methyltrienolone) 3 和用于 PR 结合的 0.29nM[ H]- 美曲勃龙， 每孔还包括 20μg 293-MR 裂解物、 20μg 293-GR 裂解物、 22μg 293-AR 裂解物或 40μg293-PR 裂解物。实验通常以 96 孔模式进行。加入各 种浓度的竞争性实验化合物， 浓度范围在约 0.01nM 至 10μM 之间。在用于 MR 结合的 500nM 醛固酮、 用于 GR 结合的 500nM 地塞米松或用于 AR 和 PR 结合的 500nM 美曲勃龙存在下， 测 定非特异性结合。将结合反应物 (140μL) 于 4℃温育过夜， 然后向各反应物中加入 70μL 冷活性炭 - 葡聚糖缓冲液 ( 每 50mL 实验缓冲液中含有 0.75g 活性炭和 0.25g 葡聚糖 )。将 板于 4℃在轨道振动器中混合 8 分钟。然后将板于 4℃以 3,000rpm 离心 10 分钟。然后将 等份的 120μL 结合反应混合物转移至另一个 96 孔板中， 向每个孔中加入 175μL 的 Wallac TM Optiphase Hisafe3 闪烁液。将板密封并在轨道振动器中剧烈振摇。温育 2 小时后， 在 Wallac Microbeta 计数器中读板。
     采用获得的数据计算估算的 IC50 以及 10μM 的抑制百分率。MR 结合的 [3H]- 醛固 酮、 GR 结合的 [3H]- 地塞米松、 AR 结合的 [3H]- 美曲勃龙或 PR 结合的 [3H]- 美曲勃龙的 Kd 通过饱和结合测定。采用 Cheng-Prusoff 方程将化合物的 IC50 值转化为 Ki。
     基本上根据上述方案， 在 MR 结合实验中化合物 (I) 的 Ki 约为 0.40nM， 由此证明化 合物 (I) 为人 MR 的有效配体。另外， 在 AR、 GR 和 PR 结合实验中， 化合物 (I) 的 Ki 分别约 为 1170nM、 669nM 和 478nM， 因此证明化合物 (I) 为 MR 的选择性配体。
     B. 类固醇核激素受体调节的功能性实验 ：
     醛固酮通过与盐皮质激素受体的相互作用发挥其生理学作用。随着醛固酮与 MR 的细胞质的结合， 配体受体复合物易位至细胞核， 它在此处与 DNA 上的激素响应元素结合 从而启动靶基因的表达。为了证实本发明化合物调节 ( 即激动、 部分激动、 部分拮抗或拮 抗 ) 类固醇激素受体的能力， 可以进行生物验， 该生物实验能够检测采用核受体蛋白和激 素响应元素报告基因构建物瞬时转染的细胞中的靶基因表达的功能性调节。 在功能性实验 中采用的溶剂、 试剂和配体易于自商业获得， 或者可以由本领域技术人员制备。
     1. 核激素受体组筛选 (Panel Screen)
     采用适当的转染试剂例如 FugeneTM， 将人胚胎肾 HEK293 细胞采用类固醇激素受 体和报道子基因质粒转染。简而言之， 采用能够组成性表达人类雄激素受体 (AR) 的质粒 并采用病毒 CMV( 巨细胞病毒 ) 启动子， 将含有荧光素酶报道子 cDNA 的上游的两个拷贝的 probasin ARE 和 TK( 胸腺嘧啶激酶 ) 启动子的报道子质粒转染到 HEK293 细胞中。采用能 够组成性表达人糖皮质激素受体 (GR)、 人盐皮质激素受体 (MR) 或人黄体酮受体 (PR) 的质 粒以及病毒 CMV 启动子， 将含有荧光素酶报道子 cDNA 的上游的两个拷贝的 GRE 和 TK 启动 子的报道子质粒转染。将细胞在 T150cm 烧瓶中、 在含有 5％活性炭处理的胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 介质中进行转染。 温育过夜后， 将转染细胞进行胰蛋白酶化， 将其涂布于含有 5％活 性炭处理的 FBS 的 DMEM 介质的 96 孔盘中， 温育 4 小时后， 将其暴露于各种浓度的实验化合 物中， 浓度范围在约 0.01nM 至 10μM 之间。在拮抗剂模式实验中， 将用于各个不同受体的 低浓度激动剂加至介质中 (0.08nM 醛固酮用于 MR ； 0.25nM 地塞米松用于 GR ； 0.66nM 美曲勃龙用于 AR ； 0.08nM 普美孕酮用于 PR)。与实验化合物一起温育 24 小时后， 将细胞裂解， 采 用标准技术测定荧光素酶活性。
     将数据拟合到四参数拟合对数曲线以确定 EC50 值。确定效能百分率 ( 饱和最大响 应的化合物 ) 或最大刺激百分率 ( 未达饱和的最大响应的化合物 )， 所述百分率相对于下列 对照激动剂所获得的最大刺激而言 ： 30nM 醛固酮用于 MR 实验 ； 100nM 美曲勃龙用于 AR 实 验； 30nM 普美孕酮用于 PR 实验 ； 100nM 地塞米松用于 GR 实验。采用拮抗剂模式实验数据， 可以同样确定 IC50 值。在拮抗剂模式中， 通过将在低浓度激动剂 (0.08nM 醛固酮用于 MR ； 0.25nM 地塞米松用于 GR ； 0.66nM 美曲勃龙用于 AR ； 0.08nM 普美孕酮用于 PR) 存在下的实 验化合物活性与实验化合物不存在下低浓度激动剂所产生的响应进行比较， 确定抑制百分 率。
     基本上根据上述方案， 化合物 (I) 在 MR、 PR、 GR 和 AR 实验中 ( 拮抗模式 ) 的 IC50 值分别约为 21nM、 924nM、 ＞ 10000nM 和＞ 10000nM， 在激动模式中对于 MR、 PR、 GR 和 AR 的 EC50 值均＞ 10000nM。因此， 化合物 (I) 为 hMR 的选择性功能拮抗剂。
     2.hMR 竞争性拮抗分析 ：
     采用上面核激素受体组筛选中所述相同的转染试剂、 质粒、 启动子、 报道子构建 物、 缓冲液和方法， 将人胚胎肾 HEK293 细胞用人 MR 转染。将转染的细胞胰蛋白酶化， 将其 涂布于含有 5％活性炭处理的 FBS 的 DMEM 介质的 96 孔盘中， 温育 4 小时后， 将其暴露于各 种浓度 (10 倍稀释 ) 的醛固酮中 ( 浓度范围在约 0.001nM 至 0.03μM 之间 )。在固定浓度 的实验化合物存在或者不存在下， 确定醛固酮拮抗 hMR 的性能， 采用标准技术通过测定荧 光素酶活性进行监测。采用 Schild 分析， 以 log( 剂量比 -1) 对 log 拮抗剂浓度绘图， 通过 下列方程确定实验化合物的 Kb ： Log(DR-1) ＝ Log[ 拮抗剂 ]-Log Kb， 其中剂量比 (DR) 代表 在实验化合物存在下醛固酮 EC50 与实验化合物不存在下醛固酮 EC50 的比值。
     基本上根据上述方案， 在 MR 竞争性拮抗实验中， 化合物 (I) 的 Kb 约为 5.1nM， 因此 证明了化合物 (I) 为人 MR 的有效拮抗剂。
     C. 醛固酮介导的肾病体内模型
     雄性单侧肾切除 Sprague Dawley 大鼠 (240-280g) 单独饲养， 随意给予饮水， 每周 给予啮齿类 5001 食物 (rodent 5001diet)。适应环境后， 收集 24 基准尿样， 分析总尿蛋白 和肌酐。根据体重和基准尿蛋白， 将动物随即分成实验组。通过尾剪 (tail-clip) 收集基 准血清， 分析血尿氮 (BUN)、 肌酐和电解质。获得基准样品后， 在整个研究期间， 将除了对照 组外的所有大鼠继续给予含有 6％盐的食物， 给予含有 0.3％ KCl 的饮水。对照组动物在研 究期间维持给予 5001 食物和饮用水， 不给予醛固酮。在异氟烷 (isoflourane) 麻醉下， 将 能够以 0.75μg/h， s.c. 传递 d- 醛固酮的 0.01％ DMSO 溶液 (2.5μl/h×28 天 ) 的的 Alza 微型泵植入非对照动物 ( 例如实验化合物组和载体组 )。醛固酮植入后第二天， 开始每天 一次口服管饲 (10mL/kg) 给予实验化合物 ( 在含有 1％羧基甲基纤维素 (CMC)/0.25％聚山 梨醇酯 80 的载体中 ) 或者只给予载体。化合物或载体单独给予 2 和 4 周后重复收集尿样， 分析总尿蛋白和肌酐。在研究结束时， 获得 8 个时间点的药代动力学样本 (0.5、 1、 2、 3、 6、 8、 12 和 24h)。另外， 将心脏和肾脏移出并在 10％缓冲的福尔马林中固化， 用于苏木精和曙 红 (H&E) 以及 Masson 的三色染色以测定心脏和肾脏组织的结构性损伤。在研究结束时也 可以通过心脏穿刺收集血清， 进行血清 BUN、 肌酐和电解质分析。基本上根据上述方案， 当以 10mg/kg/ 天 ×28 天给予化合物 (I) 时， 与载体治疗动 物相比， 它能够将尿蛋白排泄率减少约 60％， 因此证明化合物 (I) 具有有效的体内肾保护 活性。
     采用下列模型证实化合物具有抗高血压作用。
     D. 醛固酮调节的高血压的体内模型
     将雄性单侧肾切除 Sprague Dawley 大鼠 (240-280g) 单独饲养， 随意给予饮水， 每 周给予啮齿类 5001 食物。适应环境后， 将 Alzet 泵植入动物皮下， 以 2.5μl/h 的速度给予 0.25μg/h 的醛固酮， 多达 28 天， 在试验期间， 持续给予含有 6％ NaCl 的食物和含有 0.3％ KCl 的饮用水。植入无线电遥测装置监测动脉血压。例如， 在研究期间， 每隔 10 分钟收集每 个动物的信号。24 小时采集的所有数值的平均值 (±SEM) 代表每个动物的平均日动脉压。
     在泵植入的第二天， 每天一次口服管饲 (10mL/kg) 给予在载体中的实验化合物 ( 载体含有 1％中等粘度的羧甲基纤维素钠 /0.25％聚山梨醇酯 80/0.05％消泡剂 1510TM) 或只给予载体。
     基本上根据上述方案， 当每天一次口服给予 (1-30mg/kg/ 天 )×14 天时， 在盐存在 的情况下， 与载体相比， 化合物 (I) 能够剂量依赖性地降低醛固酮的高血压作用， 这证明了 化合物 (I) 具有抗高血压作用。
     采用下列模型证实化合物能够降低高钾血症的发生率或可能性。
     E. 电解质调节的体内试验
     将雄性 Sprague Dawley 大鼠 (240-280g) 切除肾上腺， 手术后 6 天持续给予 5001 啮齿类食物和 1％ NaCl 饮用溶液。然后动物禁食过夜， 用随意给予的饮用水代替 1％的盐 饮用水。 在实验开始的早上， 将禁食动物根据禁食减少的体重随机分组。 对照动物 ( 例如没 有给予醛固酮或实验化合物的那些动物 ) 通过口服管饲给予 10mL/kg 实验化合物载体 ( 含 有 0.5％ CMC/0.25％聚山梨醇酯 80/2.7％ NaCl) 并通过皮下注射给予 1mL/kg 醛固酮载体 (0.01％ DMSO/ 水 )。载体动物通过口服管饲给予相同的实验化合物载体和醛固酮 3μg/ kg， s.c。将实验物悬浮于羧甲基纤维素 /NaCl 载体中。实验化合物治疗组给予悬浮于羧甲 基纤维素 /NaCl 载体中的实验物和 3μg/kg s.c 的醛固酮。给药后立即将动物置于代谢笼 中， 可以随意饮水。收集给药后 5 小时的尿样， 分析电解质排泄情况。数据表示为相对于肾 上腺切除后载体处理动物的 log Na/K 排泄比或 Na/K 比的％。化合物 I 可以以各种剂量进 行试验以确定该化合物诱导尿 Na/K 比 ( 血清钾浓度增加的指标 ) 增加的程度。
     基本上根据上述方案， 当给予 30mg/kg p.o.， 与载体处理动物相比， 化合物 (I) 能 够使得脲 Na/K 排泄比增加仅约 30％， 这证明化合物 (I) 能够降低高钾血症产生的发生率或 可能性。
     无需其它详细说明， 相信本领域技术人员能够利用上述说明在最大程度上实施本 发明。下面的制备和实施例更详细地阐明本发明并代表了化合物 (I) 的典型合成方法。对 于本领域技术人员而言， 试剂和原料易于获得或者易于合成。本领域技术人员可以迅速识 别实施例中所述方法的适当的变化形式。本发明化合物的命名通常由 ChemDraw 版本 10.0 提供。
     本文中使用的下列术语具有指定的含义 ： “DMSO” 代表二甲基亚砜 ； “DMAC” 代表 N， N- 二甲基乙酰胺 ； “tBOC” 或 “boc” 代表叔 - 丁氧基羰基 ； “TLC” 代表薄层色谱。制备 1 1- 溴 -4- 氟 -2-(2- 碘 - 苄基氧基 )- 苯将 2- 碘苄基溴 (90g， 0.29mol)、 2- 溴 -5- 氟苯酚 (57.9g， 0.29mol) 和碳酸钾 (63g， 0.46mol) 在 N， N- 二甲基甲酰胺 (750mL) 中的混合物于室温下搅拌 16h。加入水 (1L)， 将获 得的混合物搅拌 1 小时， 过滤固体， 用水洗涤， 在真空干燥箱中干燥 (20mm Hg/60℃ )， 获得 1 目标化合物 (121g， ＞ 100％ )。HNMR(400MHz， DMSO-d6)δ5.11(s， 2H)， 6.81(t， 1H)， 7.13(t， 1H)， 7.19(dd， 1H)， 7.46(t， 1H)， 7.59(d， 1H)， 7.62(t， 1H)， 7.93(d， 1H)。
     制备 2
     3-[2-(2- 溴 -5- 氟 - 苯氧基甲基 )- 苯基 ]- 丙烯酸乙酯
     于 55-60℃， 向 1- 溴 -4- 氟 -2-(2- 碘 - 苄基氧基 )- 苯 (117.4g， 0.29mol)、 乙酸 钠 (36.1g， 0.44mol)、 四 - 正 - 丁 基 溴 化 铵 (90.3g， 0.29mol)、 乙 酸 钯 (II)(1.8g， 8mmol， 3mol ％ ) 和 N- 甲基吡咯烷酮 (900mL) 的混合物中滴加丙烯酸乙酯 (34.3mL， 0.32mol) 的 N- 甲基吡咯烷酮 (200mL) 溶液。将反应混合物冷却至室温， 用水 (2L) 和甲基叔 - 丁基醚 (2L) 处理。将反应物通过硅藻土， 加入乙酸乙酯 (1L)， 分层， 用水 (2L) 洗涤。有机部分经 无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。将获得的固体悬浮于己烷 (1L) 中， 冷藏 2h， 过滤， 用冷的己 烷 (500mL) 洗涤。在真空干燥箱中干燥 (50℃ /20mm Hg)， 获得目标化合物， 为浅黄色固体 + (104.4g， 95％ )。LC-MS m/z 381.0[M+H] 。
     可替代方法 ：
     在氮气环境中， 于搅拌下， 向清洁干燥的 100- 加仑反应器中加新鲜的 N- 甲基吡咯 烷酮 (72L)、 乙酸钠 (2721g， 33.17mol)、 1- 溴 -4- 氟 -2-(2- 碘 - 苄基氧基 )- 苯 (9000g， 22.11mol) 和四丁基溴化铵 (7128g， 22.11mol)。充入氮气将反应混合物在完全真空下搅拌 并脱气 30min。 使得反应器在氮气下重归环境压力， 重复脱气过程。 向反应混合物中加入乙 酸钯 (II)(180g， 2％ / 重量比 )， 加热至 60℃。于 60℃， 通过加料漏斗向反应混合物中缓解 加入丙烯酸乙酯 (2258g， 22.55mol) 的 N- 甲基吡咯烷酮 (18L) 溶液。加入完成后， 将反应 混合物加热至 70℃。于 70℃继续搅拌最少 2h。将反应混合物的内部温度调节至 5-10℃。 向另一份清洁的适当大小的反应器中加入水 (225L)， 剧烈搅拌并冷却至内部温度≤ 5℃。 在最少 1 小时内将反应混合物转移至剧烈搅拌的水中。将获得的混悬液于室温下搅拌 30 分钟至 1 小时。通过聚丙烯滤垫过滤， 收集浅紫色固体。用水 (25L) 洗涤滤饼， 采用橡胶坝 (rubber dam) 在滤器上抽干。 将固体再置于有水 (45L) 的反应器中， 将混悬液再搅拌 30min
     至 1 小时。在聚丙烯滤垫上再过滤固体， 用水 (25L) 洗涤滤饼。采用橡胶坝在滤器上抽干。 将所得浅紫色物转移至干燥盘中， 在通风橱中空气干燥最少 24h。将固体于＜ 50℃真空干 燥箱中干燥， 获得目标化合物 (8.4kg， 100％ )。
     制备 3
     (E)-(3- 氟 -6H- 二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11- 亚基 )- 乙酸乙酯
     将 3-[2-(2- 溴 -5- 氟 - 苯氧基甲基 )- 苯基 ]- 丙烯酸乙酯 (94g， 0.25mol)、 乙酸钠 (30g， 0.37mol)、 四 - 正 - 丁基溴化铵 (81g， 0.25mol) 和乙酸钯 (II)(1.7g， 7mmol， 3mol％ ) 在 N- 甲基吡咯烷酮 (850mL) 中的混合物于 100-110℃加热 6h。冷却至室温， 用水 (1L) 稀 释， 通过硅藻土过滤， 用乙酸乙酯 (2L) 洗涤。将其转移至分液漏斗中， 加入水 (500mL)， 分 层。 用水洗涤 (2×1.5L) 有机层， 经无水硫酸钠干燥， 硅胶垫过滤， 乙酸乙酯洗涤 (1.5L)， 浓 缩至干。 向残留的固体中加入己烷 (1L)， 冷藏 2h， 过滤， 用己烷 (500mL) 洗涤， 于 50℃ /20mm + Hg 干燥， 获得目标化合物 (64.3g， 87％ )。LC-MS m/z 299.0[M+H] 。
     可替代方法 ：
     在氮气环境中， 在搅拌下， 向清洁干燥的 100- 加仑反应器中加入 N- 甲基吡咯烷酮 (83.4L)、 乙酸钠 (2.706kg， 32.98mol)、 3-[2-(2- 溴 -5- 氟 - 苯氧基甲基 )- 苯基 ]- 丙烯酸 乙酯 (9.256kg， 21.99mol) 和四丁基溴化铵 (7.088kg， 21.99)。 将反应混合物充入氮气在完 全真空下搅拌并脱气 30min。 使得反应器在氮气下重归环境压力， 重复脱气过程。 向反应混 合物中加入乙酸钯 (II)(167g， 2％ / 重量比 )。
     将反应物于 100 ℃至 125 ℃加热， 搅拌至少 3-5h。加入乙酸乙酯 (100L)， 搅拌 30min。加入水 (100L) 并搅拌 30min。停止搅拌， 静置最少 1 小时使其分层。收集有机层， 水层用乙酸乙酯萃取 ( 先用 50L， 然后用 25L)。合并有机部分， 用水 (40L)、 20％氯化钠水 溶液 (2×20L) 洗涤， 每次最少搅拌 30min， 静置至少 30min 分层。有机溶液采用硫酸镁 (8.0kg) 干燥， 加入活性炭 (2.0kg) 和硅胶 60(2.0kg)， 搅拌最少 1 小时。过滤除去固体。 滤液在真空下于＜ 35℃干燥至干。向固体残留物中加入甲醇 (20L)。于 50-60℃将混合物 加热转变为澄清溶液。加入庚烷 (40L)， 在 20℃ -25℃冷却。在最少 3h 内将反应混合物进 一步冷却至 -10℃。于 -10℃搅拌最少 12h。过滤收集获得的固体产物， 用庚烷∶甲醇混合 物 (75 ∶ 25) 洗涤 (2×20L)。将固体于＜ 40℃真空干燥至恒重， 获得目标化合物 (3.7kg， 64％ )。
     可替代方法 2 ：
     将 1- 溴 -4- 氟 -2-(2- 碘 - 苄 基 氧 基 )- 苯 (50g， 0.123mol)、 乙 酸 钠 (30.2g， 0.369mol)、 四丁基溴化铵 (39.6g， 0.123mol) 和乙酸钯 (1g) 在 N- 甲基吡咯烷 (250mL) 中 加热至 60℃。20 分钟内滴加丙烯酸乙酯 (12.91g， 0.129mol) 的 N- 甲基吡咯烷 (50mL) 溶 液。加入完成后， 将混合物加热至 145℃ 3h。将反应混合物冷却至室温， 通过硅藻土过滤，
     采用甲基叔 - 丁基醚 (2×150mL) 洗涤固体。采用甲基叔 - 丁基醚 (0.5L) 稀释滤液， 用水 (0.5L) 洗涤。 分离有机层， 用甲基叔 - 丁基醚萃取水层 (2×300mL)。 用水 (2×200mL) 洗涤 合并的有机层。 有机部分经硫酸镁干燥， 活性炭处理， 过滤， 固体用甲基叔 - 丁基醚 (100mL) 处理， 浓缩。将残留物在异丙醇 (20mL) 中、 于 55℃、 无真空下、 在 Buchi 烧瓶中制浆。搅拌 下加入庚烷 (100mL)。将黑色混悬液置于冷处过夜。过滤固体， 用冷的庚烷 / 异丙醇洗涤 (9 ∶ 1， 2×100mL)， 然后用庚烷 (50mL) 洗涤， 于 35℃真空干燥至恒重， 获得目标化合物， 为 褐色粉末 (22.25g， 61％ )。
     制备 4
     (E)-11- 溴亚甲基 -3- 氟 -6， 11- 二氢 - 二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯
     向 (3- 氟 -6H- 二 苯 并 [b， e] 氧 杂 环 庚 烯 -11- 亚 基 )- 乙 酸 乙 基 酯 (69.5g， 0.23mol) 的异丙醇 (725mL) 悬浮液中加入氢氧化锂 (12.0g， 0.53mol) 的水 (125mL) 溶液， 将其加热至 70℃ 4h。将混合物冷却至 40℃， 然后采用冰乙酸 (0.44mol， 25mL) 处理。搅拌 15min 后， 加入 N- 溴代琥珀酰亚胺 (0.25mol， 44g)。 开始起泡， 温度上升至 45℃， 数分钟后形 成固体。 于 40-45℃将混合物搅拌 1 小时， 冷却至室温。 加入亚硫酸钠 (4.5g) 的水 (150mL) 溶液、 饱和的碳酸氢钠水溶液 (150mL) 和水 (450mL)。过滤获得的混悬液， 采用冷的 1 ∶ 1 异丙醇 / 水 (300mL) 洗涤。于 60℃ /20mm Hg 将固体干燥过夜， 获得目标化合物 (65.8g， 1 DMSO-d6)δ4.9-5.4(br d， 2H)， 6.63(dd， 1H)， 6.77(dt， 1H)， 7.13(s， 93％ )。H NMR(400MHz， 1H)， 7.32-7.46(m， 4H)， 7.52(dd， 1H)。
     可替代方法 ：
     在氮气环境中， 在搅拌下向清洁干燥的 100- 加仑反应器中加入异丙醇 (125L)、 (E)-(3- 氟 -6H- 二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11- 亚基 )- 乙酸乙酯 (13.857kg， 46.42mol) 和 氢氧化锂 (3.896kg， 92.84mol) 的水 (54L) 溶液。 将反应混合物加热至 80℃并搅拌 2h。 将反 应混合物冷却 40℃， 于 40℃至 45℃， 用 20 分钟加入乙酸 (5.575kg， 92.84mol)。于＜ 45℃， 用 30 分钟分次加入 N- 溴代琥珀酰亚胺 (48.74mol， 8.676kg)。将反应物冷却至室温并搅 拌至少 12h。加入亚硫酸钠水溶液 ( ～ 37.7L) 并搅拌 15min。加入碳酸氢钠水溶液 ( ～ 37.7L) 并搅拌 15min。加入水 (129L) 并搅拌 30min。过滤收集获得的固体， 采用异丙醇∶ 水洗涤 (1 ∶ 1， 2×20L)。于 32℃真空干燥固体至恒重， 获得目标化合物 (13.8kg， 97％ )。
     制备 5
     (E)-2-((3- 氟二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-4， 4， 5， 5- 四甲 基 -1， 3， 2- 二氧杂硼杂环戊烷
     向搅拌的 (E)-11-( 溴亚甲基 )-3- 氟 -6， 11- 二氢二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 (15g， 49mmol) 和双戊酰二硼 (16g， 64mmol) 的 1， 4- 二氧六环 (250mL) 溶液中加入乙酸钾 (15g， 150mmol)。 向混合物中充入氮， 加入二氯代 [1， 1′ - 二 ( 二苯基膦基 )- 二茂铁 ] 钯 (II) 二 氯甲烷加合物 (1.80g， 2.46mmol)， 于 65℃加热过夜。冷却至室温， 通过硅藻土过滤， 用乙酸 乙酯洗涤， 真空浓缩滤液。加入甲醇 (200mL)， 于非真空条件下在旋转蒸发仪上旋转混合物 1 小时， 形成棕色固体。过滤收集黑棕色固体， 将其真空干燥过夜， 获得目标化合物 (7.28g， 42％ )。浓缩滤液， 经柱色谱纯化， 采用 0％ -16％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱， 获得为黄色固 1 体的目标化合物 (3.46g， 20％ )。该反应的总产量为 10.7g(62％ )。 H NMR(300MHz， CDCl3) δ7.36(dd， J ＝ 8.8， 6.8Hz， 1H)， 7.32-7.27(m， 4H)， 6.64-6.57(m， 1H)， 6.48(dd， J ＝ 10.3， 2.6Hz， 1H)， 5.98(s， 1H)， 5.20(br s， 1H)， 1.15(s， 12H)。
     可替代方法 ：
     将 50L 三颈圆底烧瓶配备机械搅拌器、 热电偶、 氮入口和回流冷凝器。将其置于加 热套中。向烧瓶中加入二氧六环 (13.5L)、 (E)-11- 溴代亚甲基 -3- 氟 -6， 11- 二氢 - 二苯 并 [b， e] 氧杂环庚烯 (1.600kg， 5.24mol)、 双戊酰二硼 (1.731kg， 6.82mol)、 乙酸钾 (823g， 8.38mol)、 水 (20mL)、 三环己基膦 (29.5g， 0.105mol) 和三 ( 二苯亚甲基丙酮 ) 二 - 钯 (48g， 0.052mol)。将反应混合物加热至 80-85℃。于 85-90℃维持反应最少 6h。冷却至室温。将 反应混合物通过硅藻土垫 (2-3in) 过滤。采用乙酸乙酯洗涤滤液 (2×3.5L)。将滤液在旋 转蒸发仪上于 50-55℃浓缩。与庚烷一起共蒸发 (2×3.5L) 形成混悬液。于 50℃向浆状物 中加入甲醇 (2.5L)。搅拌 10-15min。将浆状物冷却至 -10-0℃ 20-30min。过滤固体。采 用冷 (-10℃ ) 的甲醇 (2×1.5L) 洗涤收集的固体， 随后用庚烷洗涤 (2×1.5L)。于室温下 真空干燥固体， 获得为灰白色固体的目标化合物 (1.408kg， 76％ )。
     制备 6
     (2R， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸盐酸盐
     根据 Tetrahedron ： Asymmetry， 14， (2003)3141-3152 中所述方法， 在 30 分钟内， 于 50 ℃向乙酸酐 (1.437kg， 5.65eq) 和乙酸 (4.225L) 的混合物中分次加入反式 -4- 羟 基 -L- 脯氨酸 (331g， 2.49mol)。将反应混合物于 90℃加热 5.5h， 然后将其冷却至室温。于 室温下将反应物搅拌过夜， 然后浓缩。将残留物溶于 2N 盐酸 (4.57L) 中， 回流 30h。将反应 混合物冷却至室温， 通过硅藻土过滤， 于 70℃真空浓缩至约 700mL。将反应物冷却至室温并
     搅拌过夜。将获得的浆状物用 (1L) 稀释， 过滤结晶， 用乙醚洗涤， 真空干燥， 获得目标化合 物 (340g)。 将固体溶于热乙醇 (2.5L)， 冷却， 于 35℃缓慢搅拌， 在 1 小时内分次缓慢加入乙 醚 (2.5L)。 搅拌 2h， 过滤获得的白色固体， 于真空箱中干燥过夜， 获得目标化合物 (270.6g， 20 1 65 ％ )。[α]D +12.0(c ＝ 1.0 在 甲 醇 中 )。 H NMR(400MHz， D2O)， δ2.34-2.39(m， 1H)， 2.45-2.53(m， 1H)， 3.38(dd， 1H)， 3.45(d， 1H)， 4.50(dd， 1H)， 4.58(br s， 1H)。
     制备 7
     (2R， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 叔 - 丁基酯 2- 甲酯
     于 0℃、 氮气环境中， 将亚硫酰氯 (233mL， 3.10mol) 滴加至 (2R， 4R)-4- 羟基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸盐酸盐 (355g， 2.12mol) 的无水甲醇 (3.5L) 中。加入完成后， 将反应混合物温 热至室温并搅拌 6h。减压浓缩反应混合物， 获得相应的甲酯盐酸盐， 为蜡状固体。将固体 于 0℃悬浮于无水二氯甲烷 (3.5L)， 30 分钟内小心地加入三乙胺 (640mL， 4.66mol)， 再搅拌 30min。顺序加入 N， N- 二甲基氨基吡啶 (39g， 0.32mol) 和二碳酸二 - 叔 - 丁基酯 (500g， 2.25mol)。将反应混合物温热至室温并搅拌 18h。用水 (4L)、 饱和的碳酸氢钠 (4L) 和盐 水 (4L) 萃取溶液。有机层用乙二胺 (8mL) 处理， 搅拌 15min， 采用 10 ％的柠檬酸水溶液 (4L) 再萃取。有机层经无水硫酸钠干燥， 过滤并真空浓缩， 获得黄色油状物 (484g)， 将其固 化过夜。溶于甲基叔 - 丁基醚 (1L)， 浓缩至较小体积。加入己烷 (2L)， 将混合物静置 1 小 时。过滤白色固体， 用己烷洗涤。将白色固体干燥 (20mm Hg/60℃ ) 过夜， 获得目标化合物 20 1 (354g， 68％ )。[α]D +56.3(c ＝ 1.0 在甲醇中 )。 H NMR(400MHz， CDCl3)δ1.43(s， 9H)， 1.46(s， 9H)， 2.05-2.10(m， 2H)， 2.26-2.35(m， 2H)， 3.48-3.56(m， 2H)， 3.58-3.61(m， 1H)， 3.64-3.70(m， 2H)， 3.77(s， 3H)， 3.79(s， 3H)， 4.27-4.29(m， 1H)， 4.34-4.38(m， 2H)。
     制备 8
     (2R， 4S)-4- 溴 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 叔 - 丁基酯 2- 甲酯
     在 30 分钟内， 于 0-5 ℃ ( 干冰 / 二氯甲烷浴 )， 向 (2R， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 叔 - 丁基酯 2- 甲酯 (320g， 1.30mol) 和四溴化碳 (540g， 1.94mol) 的二氯甲烷 (3.2L) 溶液中分次加入三苯膦 (1.95mol， 514g)， 于室温下搅拌 4h。加入乙醇 (3.2L) 并再 搅拌 2h。将反应物转移至 18L 大玻璃瓶中， 加入乙醚 (8L) 直到沉淀生成。将混合物搅拌过 夜。 过滤固体， 浓缩醚层。 将油状残留物溶于二氯甲烷， 通过硅胶柱过滤， 采用二氯甲烷洗脱 直到薄层色谱检测没有产物为止。浓缩二氯甲烷层， 采用 5％的乙酸乙酯己烷溶液 (4L) 处 理形成白色固体。将混合物通过硅胶柱过滤， 采用 5％的乙酸乙酯己烷溶液洗脱， 只收集合 有需要产物的部分。 将溶液浓缩， 溶于 5％的乙酸乙酯己烷溶液 (2L)， 通过 1kg 硅胶柱纯化， 采用 5 ％的乙酸乙酯己烷溶液洗脱， 获得为浅黄色油状物的目标化合物 (372.4g， 93 ％ )。[α]D20+53.6(c ＝ 1.0 在甲醇中 )。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.33 和 1.39(two s， 9H)， 2.40(m， 1H)， 2.53(m， 1H)， 3.35(m， 1H)， 3.66(s， 3H)， 3.80(m， 1H)， 4.35(q， 1H)， 4.73(m， 1H)。
     制备 9
     (2R， 4R)-4- 叠氮基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 叔 - 丁基酯 2- 甲酯
     将叠氮化钠 (157g， 2.39mol) 加至 (2R， 4S)-4- 溴 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 叔 - 丁 基酯 2- 甲酯 (370g， 1.20mol) 的 N， N- 二甲基甲酰胺 (2.5L) 溶液中， 于 70-75℃、 氮气环境 中加热 16h。冷却至室温， 用水 (5L) 洗涤， 用乙酸乙酯 (3L) 萃取。用盐水 (2L) 洗涤。用乙 酸乙酯 (3L) 萃取盐水层， 合并有机层， 经硫酸钠干燥， 过滤并浓缩， 获得油状物 (324.5g)。 将产物溶于乙醚 (2L)， 用水洗涤 (2×2L)， 硫酸钠干燥， 过滤并浓缩， 获得 261.2g 深黄色油 状物。用乙醚 (2×2L) 再萃取水层， 硫酸钠干燥， 过滤并浓缩， 又获得 7.3g 产物。总产量 20 1 268.5g(83％ )。 [α]D +39.5(c ＝ 1.0 在甲醇中 )。 H NMR(400MHz， CDCl3)δ1.40-1.41(s，
     9H) ， 2.09-2.13(m ， 1H) ， 2.40-2.44(m ， 1H) ， 3.37-3.45(m ， 1H) ， 3.61-3.65(m ， 1H) ， 3.67-3.69(s， 3H)， 4.09-4.15(m， 1H)， 4.25-4.38(m， 1H)。
     制备 10
     (2R， 4R)-4- 叠氮基 -2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔 - 丁基酯
     于 -30℃、 氮气环境中， 将硼氢化锂 (8.50g， 351mmol) 加至 (2R， 4R)-4- 叠氮基 - 吡 咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 叔 - 丁基酯 2- 甲酯 (95g， 351mmol) 的乙醚 (1L) 溶液中。 1.5h 内将温 度升高至 0℃并再搅拌 2h。 冷却至 -70℃， 滴加饱和的碳酸氢钠水溶液 (1L)。 将其温热至室 温， 分层， 用乙醚 (1L) 萃取水层。 合并醚层， 经硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。 将获得的产物高真 20 1 空下干燥， 获得黄色油状物 (82g， 96％ )。 [α]D +20.3(c ＝ 1.0 在甲醇中 )。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.38(s， 9H)， 1.99(br s， 1H， OH)， 2.20(m， 1H)， 3.34(m， 1H)， 3.50-3.78(m， 1H)， 4.29(m， 1H)， 4.78(m， 1H)。
     制备 11
     (2R， 4R)-4- 氨基 -2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔 - 丁基酯
     将 (2R， 4R)-4- 叠氮基 -2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔 - 丁基酯 (225g， 0.93mol) 和 10 ％披钯炭 (22.5g， 采用甲苯预先润湿 ) 的甲醇 (2.3L) 混合物在 15psi 的氢中于室
     温下氢化 16h。滤除催化剂， 浓缩滤液， 获得为油状物的目标化合物 (198g， 92 ％ )。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.38(s， 9H)， 1.58(m， 1H)， 2.16(m， 1H)， 2.95(m， 1H)， 3.20-3.58(m， 6H)， 3.61(m， 1H)， 3.65(br s， 1H)。
     制备 12
     (2R， 4R)-4-(4- 溴 -2- 硝基 - 苯基氨基 )-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔 - 丁基 酯
     将 (2R， 4R)-4- 氨基 -2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔 - 丁基酯 (198g， 0.92mol)、 5- 溴 - 氟硝基苯 (224g， 0.98mol)、 三乙胺 (273mL， 1.96mol) 的乙酸乙酯 (2L) 混合物在氮 气环境中剧烈搅拌回流 16h。冷却至室温， 用盐水洗涤。用乙酸乙酯 (1L) 再萃取盐水层， 合并有机层， 经硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。将获得的固体溶于温热的乙酸乙酯 (2L)， 浓缩至 约 500mL， 结晶开始形成。采用己烷 (2L) 缓慢处理溶液， 将混合物于室温下静置 2h。过滤 收集黄色固体， 用己烷洗涤， 于 40℃ /20mm Hg 干燥， 获得 227g 需要的产物。 减压浓缩滤液， 残留物经硅胶柱色谱纯化 (2 ∶ 3 ∶ 5 乙酸乙酯 / 二氯甲烷 / 庚烷逐渐增加至 2 ∶ 3 乙酸 乙酯 / 庚烷 )， 又获得 54g 需要的产物。总产量 ： 281g(70 ％ )。[α]D20-81(c ＝ 1.0， 在甲 1 醇中 )。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.40(s， 9H)， 1.90(m， 1H)， 2.48(br s， 1H)， 3.14(m， 1H)， 3.45(m， 1H)， 3.63(m， 1H)， 3.81(m， 2H)， 4.29(m， 1H)， 5.12(m， 1H)， 7.08(d， 1H)， 7.65(dd， 1H)， 8.15(d， 1H)， 8.57(br d， 1H， NH)。
     制备 13
     (2R， 4R)-[4-(4- 溴 -2- 硝基 - 苯基氨基 )- 吡咯烷 -2- 基 ]- 甲醇盐酸盐
     向 (2R， 4R)-4-(4- 溴 -2- 硝 基 - 苯 基 氨 基 )-2- 羟 基 甲 基 - 吡 咯 烷 -1- 甲 酸 叔 - 丁 基 酯 (125.5g， 0.301mol) 的 二 氯 甲 烷 (400mL) 溶 液 中 加 入 4N 盐 酸 的 二 氧 六 环 溶液 (800mL)， 于室温下搅拌 4h。过滤收集沉淀物， 用乙醚洗涤， 于 20mm Hg/60 ℃干燥， 20 获 得 目 标 化 合 物 (105.2g， 99 ％ )。[α]D -89.6(c ＝ 1.0 在 甲 醇 中 )。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.80-1.85(m， 1H)， 2.54-2.59(m， 1H)， 3.43-3.51(m， 3H)， 3.56-3.63(m， 1H)， 3.69-3.72(m， 2H)， 4.50-4.51(m， 1H)， 5.60(br s， 1H)， 7.10(d， 1H)， 7.65(dd， 1H)， 8.14(d， 1H)， 8.95(br s， 1H)， 9.91(br s， 1H)。
     制备 14
     (7R， 8aR)-7-(4- 溴 -2- 硝 基 - 苯 基 氨 基 )- 四 氢 - 吡 咯 并 [2， 1-c][1， 4]嗪 -4- 酮
     向搅拌的 (2R， 4R)-[4-(4- 溴 -2- 硝基 - 苯基氨基 )- 吡咯烷 -2- 基 ]- 甲醇盐酸 盐 (54.5g， 155mmol) 的四氢呋喃 (375mL) 和水 (376mL) 的溶液中滴加 5N 氢氧化钠直到 pH 达到 10-12。30 分钟内通过分液漏斗加入氯代乙酰氯 (27.3mL， 337mmol)。在加入酰氯期间 采用另一个分液漏斗加入 5N 氢氧化钠， 加入的速度应使得内部 pH 保持在 8-12。搅拌 6h， 通过过滤收集形成的固体， 用水洗涤。减压除去滤液中的有机组分， 过滤收集固体。合并两 批固体， 于 60℃ /20mm Hg 干燥获得 51.4g。将固体悬浮于 2％甲醇二氯甲烷溶液 (1.5L) 中， 在旋转蒸发仪上于 40℃旋转蒸发 1 小时。过滤收集沉淀物 (11g) 并弃去。通过硅胶柱 过滤， 采用二氯甲烷洗脱， 浓缩洗脱液， 获得为黄橙色固体的目标化合物 (32.8g， 60％ )。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.68(m， 1H)， 2.42(m， 1H)， 3.37(m， 1H)， 3.49(m， 1H)， 3.75-3.91(m， 3H)， 4.10(m， 2H)， 4.48(m， 1H)， 7.18(d， 1H)， 7.64(dd， 1H)， 7.93(d， 1H)， 8.19(s， 1H)。
     制备 15
     (7R， 8aR)-(4- 溴 -2- 硝 基 - 苯 基 )-( 六 氢 - 吡 咯 并 [2， 1-c][1， 4]嗪 -7- 基 )- 胺
     向无水四氢呋喃 (450mL) 中加入 (7R， 8aR)-7-(4- 溴 -2- 硝基 - 苯基氨基 )- 四 嗪 -4- 酮 (32.1g， 90.1mmol)， 于 0 至 -5℃冷却。用 10 分钟氢 - 吡咯并 [2， 1-c][1， 4]加入硼烷 - 二甲基硫化物复合物 (26mL， 0.279mol)。将混合物加热回流 3h。在冰浴中冷却 反应混合物， 小心地滴加甲醇 (450mL)。加入 4N 盐酸 (450mL) 并回流 2h。冷却至约 40℃， 通过小心地滴加 5N 氢氧化钠将 pH 调节至 10-12。减压除去有机溶剂。用水 (1.2L) 稀释 水层， 用二氯甲烷 (1.2L) 萃取。有机层经硫酸钠干燥， 过滤并浓缩， 获得油状物。此时将该 油状物与前面相同制备所获得的产物 ( 采用 30.2g 酰胺原料起始 ) 合并。将油状物通过硅 胶柱， 采用二氯甲烷洗脱， 除去较高 Rf 值的成分。采用 1％甲醇二氯甲烷溶液洗脱， 浓缩获 得固体 (57.8g)。将固体悬浮于乙醚 (1L) 中， 将其静置过夜。过滤收集固体， 采用小量的 乙醚洗涤， 获得 47.5g。浓缩滤液， 将其悬浮于乙醚 (100mL) 中， 将其于室温下静置 2h。过 滤收集又获得 3.1g 需要的产物。浓缩滤液， 残留物经硅胶柱过滤纯化， 又获得 2.9g 橙色固 体。合并所有的固体， 获得目标化合物 (53.5g， 89％ )。[α]D20-36(c ＝ 1.0 在 DMSO 中 )。 1 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.21(m， 1H)， 2.06(m， 1H)， 2.18(m， 1H)， 2.42(m， 2H)， 2.87(d， 1H)， 2.95(d， 1H)， 3.18(t， 1H)， 3.42(t， 1H)， 3.73(d， 1H)， 3.85(d， 1H)， 4.19(m， 1H)， 7.03(d， 1H)， 7.66(dd， 1H)， 8.01(d， 1H)， 8.18(s， 1H)。 LC-MS m/z 342.0， 344.0(1 ∶ 1 异 toperatio) + [M+H] 。制备 16 (E)-[4-(3- 氟 -6H- 二 苯 并 [b， e] 氧 杂 环 庚 烯 -11- 亚 基 甲 基 )-2- 硝 基 - 苯 嗪 -7- 基 )- 胺基 ]-((7R， 8aR)- 六氢 - 吡咯并 [2， 1-c][1， 4]
     向 烧 瓶 中 加 入 (7R， 8aR)-(4- 溴 -2- 硝 基 - 苯 基 )-( 六 氢 - 吡 咯 并 [2， 1-c] 嗪 -7- 基 )- 胺 (50.9g， 0.149mol)、 (E)-2-((3- 氟 二 苯 并 [b， e] 氧 杂 环 庚[1， 4]烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-4， 4， 5， 5- 四甲基 -1， 3， 2- 二氧杂硼杂环戊烷 (57.5g， 0.163mol)、 三苯膦 (10.1g， 39mmol) 和甲醇钠 (19.7g， 0.346mol) 的四氢呋喃 (1L) 和甲醇 (500mL) 的溶 液。 向混合物中充入氮气 30min。 加入乙酸钯 (II)(3.00g， 13mmol)， 向混合物中再次充入氮 气 30min。在氮气环境中加热回流 (60℃ )16h。冷却至室温， 通过硅藻土过滤并真空浓缩， 获得固体。将其溶于 1 ∶ 1 乙酸乙酯 / 盐水 (2L) 中， 通过硅藻土垫过滤。采用 1 ∶ 1 乙酸 乙酯 / 盐水 (2×1L) 洗涤所述垫， 然后用 10％甲醇的二氯甲烷溶液 (4×1L) 洗涤。分层并 合并有机相。有机部分经硫酸钠干燥， 过滤并浓缩， 获得油状物。将油状物溶于二氯甲烷， 通过硅胶垫。采用二氯甲烷洗涤硅胶垫直到 Rf 值较高的薄层色谱成分除去。采用 1％甲醇 的二氯甲烷溶液洗脱， 真空浓缩， 获得泡沫状物。将其溶于乙酸乙酯 (2L)， 浓缩至约 200mL。 加入己烷 (1.5L)， 将混悬液于室温下静置 1 小时。过滤收集橙色固体， 于 50 ℃ /20mmHg 20 干燥， 获得目标化合物 (53g， 73 ％ )。[α]D -26(c ＝ 1.0 在 DMSO 中 )。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.08(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 2.17(m， 1H)， 2.41(m， 2H)， 2.88(m， 1H)， 3.17(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.73(d， 1H)， 3.82(d， 1H)， 4.12(m， 1H)， 5.02(broad s， 1H)， 5.59(broad s， 1H)， 6.60(d， 1H)， 6.81(m， 2H)， 6.96(s， 1H)， 7.05(m， 2H)， 7.28(t， 1H)， 7.38(t， 1H)， 7.60(m， + 2H)， 7.84(s， 1H)， 8.05(d， 1H)。LC-MS m/z 458.3[M+H] 。
     实施例 1
     5-((E)-(3- 氟二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六 氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c][1， 4]
     嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮( 式 I)
     将 (E)-[4-(3- 氟 -6H- 二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11- 亚基甲基 )-2- 硝基 - 苯基 ]-((7R， 8aR)- 六 氢 - 吡 咯 并 [2， 1-c][1， 4]嗪 -7- 基 )- 胺 (52g， 0.107mol)、 三乙胺 (33mL， 0.237mol) 和 5 ％披铂炭 (18g) 的四氢呋喃 (450mL) 混合物于室温下、 50psi 氢 化 2h。滤除催化剂， 用四氢呋喃洗涤， 浓缩， 获得褐色泡沫状物。将泡沫状物溶于无水四氢 呋喃 (500mL)， 将其在冰浴中冷却。30 分钟内滴加三光气 (31.5g， 0.106mol) 的四氢呋喃 (450mL) 溶液， 于室温下搅拌 16h。将溶液浓缩， 溶于 5％的甲醇二氯甲烷溶液， 经短硅胶柱 纯化。浓缩获得褐色固体。将固体悬浮于饱和的碳酸氢钠 (1.5L) 中， 在旋转蒸发仪上搅拌 1 小时。过滤并真空干燥。将其溶于温热的 1 ∶ 1 甲醇 / 二氯甲烷 ( 约 6L)， 采用聚 (4- 乙 烯基吡啶 )2％交联树脂 (170g) 处理。搅拌浆状物 30 分钟， 通过硅藻土过滤。将滤液浓缩 至约 1.5L， 过滤收集获得的固体。 于 80℃ /20mmHg 干燥过夜， 获得为白色固体的目标化合物 20 1 (38.1g， 74％ )。 [α]D -20.5(c ＝ 1.0 在 DMSO 中 )。H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.48(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 2.19(m， 2H)， 2.52(m， 1H)， 2.91(d， 1H)， 3.03(d， 1H)， 3.25(t， 1H)， 3.50(t， 1H)， 3.79(d， 1H)， 3.88(d， 1H)， 4.95(m， 1H)， 5.03(broad s， 1H)， 5.60(broad s， 1H)， 6.59(m， 2H)， 6.78(m， 2H)， 6.97(s， 1H)， 7.02(d， 1H)， 7.25(t， 1H)， 7.38(t， 1H)， 7.48-7.61(m， 3H)， + 10.72(s， 1H， NH)。LC-MS m/z 484.0[M+H] 。
     采用实施例 1 中所述制备的材料， 获得 X- 射线衍射图谱， 显示其为特征峰位 (° 2θ 值 ) 在约 10.5、 13.0、 15.5 和 19.7 的晶型 (I 型 )。产物的熔点特征通过 DSC 测定。 熔融起始点＝ 298.9℃
     实施例 1(a)
     5-((E)-(3- 氟二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六 氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c][1， 4]
     嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮(II 型 ) 将 117.7mg 的 5-((E)-(3- 氟 二 苯 并 [b， e] 氧 杂 环 庚 烯 -11(6H)- 亚 基 ) 甲 嗪 -7- 基 )-1H- 苯 并 [d] 咪基 )-1-((7R， 8aR)- 六 氢 -1H- 吡 咯 并 [2， 1-c][1， 4]唑 -2(3H)- 酮 ( 如实施例 1 所述制备 ) 加至小瓶中， 将其在搅拌盘上以 1000rpm 的速度于 70℃与 2.5mL 的 DMAC 混合直到溶解。向样品中缓慢加入水直到出现浑浊， 然后散热。继续 搅拌 30 分钟直到溶液中形成白色固体沉淀物。过滤收集固体， 于 40℃干燥过夜。
     采用实施例 1(a) 中所述制备的材料， 获得 X- 射线衍射图谱， 显示其为特征峰位 (° 2θ 值 ) 在约 11.3、 12.1、 18.8 和 21.0 的晶型 (II 型 )。
     可替代方法 ：
     (i) 在分液漏斗中， 采用 5 ％ MeOH/CHCl3 溶液 (5×100mL) 萃取 5-((E)-(3- 氟二 苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c] [1， 4] 嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮 4- 甲基苯磺酸盐 (10.2g， 15.55mmoles) ( 基本上根据下面实施例 2 中所述方法制备 ) 在 1NNaOH(200mL) 中的悬浮液。用盐水洗涤 有机层， 经硫酸钠干燥， 通过折叠 (pleated) 滤器过滤， 真空浓缩。将残留物于 50℃真空箱 中干燥过夜， 获得白色固体 (6.71g， 收率 90％ )。LC-MS(4min) ： RT ＝ 1.87min.， 100％ M+H ＝ 484.2。
     (ii) 采用 1mL DMAc 处理 0.1g 获自上述可替代方法 (i) 的产物样品， 将获得的悬 浮液在 80℃油浴中加热 30min。向溶液中加入 15mL AcCN， 在 80℃油浴中加热 30min， 然后 于搅拌下冷却至室温。过滤收集固体， 然后在 50℃真空箱中干燥过夜， 回收获得 74.5mg 产物。 (iii) 采用 20mL AcCN 处理 0.1g 获自上述可替代方法 (i) 的产物样品， 将获得的 悬浮液在 80℃油浴中加热 30min， 然后于搅拌下冷却至室温。 过滤收集固体， 然后在 50℃真 空箱中干燥过夜， 回收获得 81.8mg 产物。
     (iv) 采用 20mL IPA 处理 0.1g 获自上述可替代方法 (i) 的产物样品， 将获得的悬 浮液在 80℃油浴中加热 30min， 然后于搅拌下冷却至室温。 过滤收集固体， 然后在 50℃真空 箱中干燥过夜， 回收获得 92.8mg 产物。
     采用上述可替代方法 (i) 中所述制备的材料， 获得 X- 射线衍射图谱， 显示其为特 征峰位 (° 2θ 值 ) 在约 11.3、 12.1、 18.8 和 21.0 的晶型 (II 型 )。
     实施例 2
     5-((E)-(3- 氟二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六
     氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c][1， 4]
     嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮甲苯磺酸盐
     将对 - 甲苯磺酸单水合物 (51.70mmol， 9.98g) 的二甲基乙酰胺 (50mL) 溶液于 40℃油浴中加热 30 分钟。在剧烈搅拌下， 向该均匀的溶液中分次加入 5-((E)-(3- 氟二苯 并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c][1， 4] 嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮 (51.70mmol， 25.00g)， 每次 5g。采用二甲基乙酰胺 (25mL) 洗涤粉末漏斗和容器瓶， 将悬浮液于 40℃搅拌 30 分钟直到固体完全溶解。 将浅棕色均匀溶液于 30℃置于氮气流中过夜。残留物采用乙腈 (200mL) 稀释， 在水浴中超 声 20 分钟。将白色固体悬浮液于 60 ℃油浴中加热 3 小时。冷却至室温， 过滤收集固体。 1 在真空箱中于 40℃干燥 2 天， 获得目标化合物 (32.88g， 97％ )。 H NMR(400MHz， DMSO-d6) δ2.00(m， 0.5H)， 2.29(m， 0.5H)， 2.44(s， 3H)， 2.48(m， 0.5H)， 3.1-4.2(m， 7H)， 5.10(broad m， 2H)， 5.55(broad s， 1H)， 6.60(dd， 1H)， 6.67(d， 1H)， 6.78(m， 2H)， 6.95(m， 3H)， 7.08(d， 2H)， 7.21(t， 1H)， 7.33(t， 1H)， 7.43(d， 2H)， 7.57(m， 2H)， 9.65(s， 0.5H)， 10.25(s， 0.5H)， + 10.98(s， 0.5H)， 11.14(s， 0.5H)。LC-MS m/z 484.2[M+H] 。
     可替代方法 ：
     (a) 将 85.8mg(0.177mmol)5-((E)-(3- 氟二苯并 [b， e] 氧杂环庚烯 -11(6H)- 亚 基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六氢 -1H- 吡咯并 [2， 1-c][1， 4] 嗪 -7- 基 )-1H- 苯并 [d] 咪 唑 -2(3H)- 酮 ( 基本上根据实施例 1 中所述方法制备 ) 溶于二甲基乙酰胺 (2mL)。加入 对 - 甲苯磺酸单水合物 (43mg， 0.226mmol) 并搅拌， 直到混合物变为澄清的溶液。加入乙腈 (7mL)， 蒸发获得澄清的油状物。加入水 (2mL)， 将样品超声。白色固体沉淀出来后， 将样品 制浆 10 分钟。过滤并干燥， 获得固体。
     (b) 将 98.0mg 的 5-((E)-(3- 氟 二 苯 并 [b， e] 氧 杂 环 庚 烯 -11(6H)- 亚 基 ) 甲基 )-1-((7R， 8aR)- 六 氢 -1H- 吡 咯 并 [2， 1-c][1， 4]嗪 -7- 基 )-1H- 苯 并 [d] 咪唑 -2(3H)- 酮 ( 基本上根据实施例 1 中所述方法制备 ) 溶于 2.5mL DMAC。加入 1.2eq. 的 对 - 甲苯磺酸单水合物并搅拌， 直到溶液澄清并无色。 加入 2mL 的 88％丙酮， 然后加入 16mL 的水， 然后蒸发除去溶剂。向获得的澄清油状物中加入 1mL 丙酮并超声。干燥获得的凝胶 物， 获得灰白色固体。将固体再次溶于 1 ∶ 10THF ∶ H2O， 蒸发获得澄清的油状物， 然后与 5mL 乙腈一起超声。白色固体沉淀出来后， 将样品制浆过夜。过滤并干燥获得固体。21