盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法.pdf

1、10申请公布号CN102333773A43申请公布日20120125CN102333773ACN102333773A21申请号201080009314822申请日2010030461/159,57820090312USC07D405/06200601C07D405/14200601C07D498/04200601A61K31/4184200601A61K31/5383200601A61P13/12200601A61P3/10200601A61P5/4020060171申请人伊莱利利公司地址美国印第安纳州72发明人DA科茨K加瓦蒂那纳斯PK贾达夫74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理

2、人隋晓平黄革生54发明名称盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法57摘要本发明提供了下式的化合物或其可药用的盐，包含化合物I以及与之混合的适当的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物；以及治疗生理学疾病的方法，特别是充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病，所述方法包括给予化合物I或其可药用的盐。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011082586PCT申请的申请数据PCT/US2010/0261382010030487PCT申请的公布数据WO2010/104721EN2010091651INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书19页CN102333787A

3、1/1页21化合物，所述化合物为5E3氟二苯并B，E氧杂环庚烯116H亚基甲基17R，8AR六氢1H吡咯并2，1C1，4嗪7基1H苯并D咪唑23H酮或其可药用的盐。2权利要求1的化合物，所述化合物为5E3氟二苯并B，E氧杂环庚烯116H亚基甲基17R，8AR六氢1H吡咯并2，1C1，4嗪7基1H苯并D咪唑23H酮。3权利要求2的化合物，为结晶形式。4权利要求2的化合物，为结晶形式，其在约113、121、188和2102处有特征峰。5用于治疗的权利要求14中任一项的化合物或盐。6用于治疗下列疾病的权利要求14中任一项的化合物或盐充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病。7治疗充血性心衰、高血压

4、、糖尿病性肾病或慢性肾病的方法，所述方法包括给予需要的患者有效量的权利要求14中任一项的化合物或盐。8权利要求7的方法，所述方法包括给予需要的患者有效量的5E3氟二苯并B，E氧杂环庚烯116H亚基甲基17R，8AR六氢1H吡咯并2，1C1，4嗪7基1H苯并D咪唑23H酮。9药用组合物，所述药用组合物包含权利要求14中任一项的化合物或盐以及与之混合的一或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。10权利要求9的药用组合物，所述组合物包含5E3氟二苯并B，E氧杂环庚烯116H亚基甲基17R，8AR六氢1H吡咯并2，1C1，4嗪7基1H苯并D咪唑23H酮以及与之混合的一或多种药学上可接受的载体、稀释剂

5、或赋形剂。权利要求书CN102333773ACN102333787A1/19页3盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法0001本发明涉及用作治疗药物的三环化合物、含有它们的药用组合物、采用该化合物治疗患者的生理学疾病的方法以及在合成该化合物中使用的中间体和方法。0002醛固酮是主要的内源性盐皮质激素，它可以与盐皮质激素受体MR相互作用，促进钠和水的再吸收以及钾的排泄。由于醛固酮在维持电解质和水的平衡中的作用，所以可以采用MR拮抗剂治疗多种生理学疾病，包括高血压，低钾血症，心肌性心律失常MYOCARDIALARRHYTHMIAS、BARTTER氏综合征以及原发性或继发性高醛固酮症疾病，例如CONN氏综合

6、征。最近，MR拮抗剂已经用于治疗充血性心衰和急性心肌梗塞。另外，MR拮抗剂在肾病临床前模型中也被证明是有效的，可以与标准疗法组合用于降低肾病患者的蛋白尿，例如慢性肾病，包括糖尿病性肾病。0003然而，现有的甾体MR拮抗剂产生了限定其安全性和/或有效性的伴随作用。例如，螺内酯是非选择性的，能够与其它核激素受体例如雄性激素受体AR、黄体酮受体PR或糖皮质激素受体GR产生交互作用，从而介导其它生理学过程。螺内酯疗法也可以用于治疗高钾血症以及男性乳房发育、性功能障碍、性欲减退、月经失调和胃痛。尽管相对于其它核激素受体而言，依普利酮对MR具有选择性，但是它也与高钾血症有关。因此，本领域中需要现有MR拮抗

7、剂疗法的替代疗法。0004本发明的目的是提供具有MR拮抗活性的非甾体类MR配体。更具体地讲，本发明的目的是提供非甾体类MR拮抗剂，相对于AR、PR和GR而言，它能够与MR以较高的亲和力结合。作为更具体的实施方案，本发明的目的是提供非甾体类MR拮抗剂，相对于AR、PR和GR而言，它能够与MR以较高的亲和力结合，并且它具有有效的肾脏或心脏保护性能。作为更具体的实施方案，本发明的目的是提供非甾体类MR拮抗剂，相对于AR、PR和GR而言，它能够与MR以较高的亲和力结合，它具有有效的肾脏或心脏保护性能，但是它能够降低产生高钾血症的发生率或可能性。0005三环MR配体在本领域中是已知的。例如WO04/05

8、2847和WO05/066161公开了三环甾体类激素受体调节剂，它们可以用于治疗对盐皮质激素受体或糖皮质激素受体调节敏感的疾病。本发明涉及特别的二苯并氧杂环庚烯，如下面化合物I所示，它在体外和体内均具有活性，这说明它可以用于治疗或预防对盐皮质激素受体拮抗剂的治疗有响应的疾病。0006因此，本发明提供了下式化合物或其可药用的盐00070008化合物I说明书CN102333773ACN102333787A2/19页400095E3氟二苯并B，E氧杂环庚烯116H亚基甲基17R，8AR六氢1H吡咯并2，1C1，4嗪7基1H苯并D咪唑23H酮。0010作为具体的实施方案，本发明提供了结晶形式的化合物I

9、或其可药用的盐。0011在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防下列疾病的方法充血性心衰、糖尿病性肾病、慢性肾病、高血压、低钾血症、心肌性心律失常、BARTTER氏综合征、原发性或继发性高醛甾酮症或CONN氏综合征，该方法包括给予需要的患者有效量的化合物I或其可药用的盐。作为更特别的方面，本发明提供了治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的方法，该方法包括给予需要的患者有效量的化合物I或其可药用的盐。0012本发明也提供了化合物I或其可药用的盐在治疗中的用途。另外，本发明提供了化合物I或其可药用的盐在治疗或预防下列疾病中的用途充血性心衰、糖尿病性肾病、慢性肾病、高血压、低钾血症

10、、心肌性心律失常、BARTTER氏综合征、原发性或继发性高醛甾酮症或CONN氏综合征。更具体地讲，本发明提供了化合物I或其可药用的盐在治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病中的用途。0013在另一个实施方案中，本发明提供了化合物I或其可药用的盐在生产用于治疗或预防下列疾病的药物中的用途充血性心衰、糖尿病性肾病、慢性肾病、高血压、低钾血症、心肌性心律失常、BARTTER氏综合征、原发性或继发性高醛甾酮症或CONN氏综合征。更具体地讲，本发明提供了化合物I或其可药用的盐在生产用于治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的用途。0014另外，本发明提供了药用组合物，

11、该组合物含有化合物I或其可药用的盐以及与之组合的一或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。更具体地讲，本发明提供了用于治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的药用组合物，该组合物含有化合物I或其可药用的盐以及与之组合的一或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。本发明也包括用于合成化合物I的新中间体和方法。0015本发明涉及化合物I的可药用盐以及化合物I或其可药用盐的溶剂化物。因此，本文中使用的术语“化合物I”在其定义中包括化合物的任何溶剂合物。可药用盐及其制备方法的实例是本领域技术人员所熟知的。参见例如，STAHL等，“可药用盐手册性能、选择和使用HANDBOOKOFPHARMACEUT

12、ICALSALTSPROPERTIES，SELECTIONANDUSE”，VCHA/WILEYVCH，2002；GOULD，PL，“碱性药物的盐的选择SALTSELECTIONFORBASICDRUGS”，INTERNATIONALJOURNALOFPHARMACEUTICS，332012171986；BASTIN等“药用新化学实体的盐的选择及优化方法SALTSELECTIONANDOPTIMIZATIONPROCEDURESFORPHARMACEUTICALNEWCHEMICALENTITIES”，ORGANICPROCESSRESEARCHANDDEVELOPMENT，4427435200

13、0。特别提及的是化合物I甲苯磺酸盐，然而应当理解，优选化合物I的游离碱。0016本文中使用的术语“R”和“S”如有机化学中常规定义，代表手性中心的具体构型。术语“”、“R/S”或“RS”是指手性中心的外消旋构型。部分优先次序列表和立体化学讨论参见“有机化合物命名原则和实践NOMENCLATUREOFORGANICCOMPOUNDSPRINCIPLESANDPRACTICE”，JHFLETCHER等编辑，1974。本文中使用的表述是指向前突出纸平面外的键，而表述是指向后突出纸平面外的键。0017本领域技术人员应当理解，含有碳碳或碳氮双键的分子可以以几何异构体存说明书CN102333773ACN1

14、02333787A3/19页5在。通常采用两种方法表述具体的异构体，“反式顺式”方法和“E和Z”方法，这取决于与每个双键原子连接的基团是相同的还是不同的。关于几何异构现象的讨论和具体异构体的命名可以参见MARCH，“ADVANCEDORGANICCHEMISTRY高等有机化学”，JOHNWILEYSONS，1992，第4章。0018化合物I可以制成药用组合物的一部分。因此，包含化合物I或其可药用的盐以及与之组合的可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物是本发明的重要的实施方案。药用组合物及其制备方法的实例在本领域中是众所周知的。参见，例如REMINGTONTHESCIENCEANDPRACTI

15、CEOFPHARMACY雷明顿药学科学与实践AGENNARO等编辑，第19版，MACKPUBLISHING1995。包含化合物I的说明性组合物包括例如化合物I的混悬液，含有05的羧基甲基纤维素、025的聚山梨醇酯80和27的NACL；或化合物I的混悬液，含有1的羧基甲基纤维素和025的聚山梨醇酯80；化合物I的混悬液，含有1的羧基甲基纤维素、025的聚山梨醇酯80和005的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物I射流研磨的混悬液，含有1的羧基甲基纤维素钠、025的聚山梨醇酯80和005的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物I射流研磨的混悬液，含有1的羟乙基纤维素、10的维生素ETPGSD维生

16、素E聚乙二醇1000琥珀酸酯和005的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物I射流研磨的混悬液，含有10的维生素ETPGS和005的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物I的溶液15MG/ML，含有20的25MM的磷酸盐缓冲液PH2和1EQHCL。然而，应当理解，优选的本发明组合物含有化合物I或其可药用的盐，制成胶囊或片剂。0019化合物I或其可药用的盐或者含有化合物I或其可药用的盐的组合物可以通过能够使得化合物可生物利用的任何途径给药，包括口服和肠胃外途径。然而，应当理解，优选口服给药。0020本领域技术人员应当理解，颗粒大小能够影响药物成分的体内溶出，这又影响成分的吸收。本文中使用的“颗粒

17、大小”是指药物成分颗粒的直径，可以通过常规技术确定，例如激光散射、激光衍射、米氏散射、沉降场流分离、光子相关光谱等。当药物成分具有较差的溶解度，较小或者减小的颗粒大小可能有助于溶出，因此能够增加成分的吸收。AMIDON等，PHARMRESEARCH，12；4134201995。用于减小或控制颗粒大小的方法微粉化是常规方法，包括球磨研磨、针铣PINMILLING、射流研磨、湿法研磨等。用于控制颗粒大小的另一种方法包括在纳米混悬液中制备药物成分。本发明的特殊实施方案包括化合物I或化合物I可药用的盐或者含有化合物I或其可药用的盐的药用组合物，其中所述化合物或盐的颗粒大小为D90即，90的颗粒的大小小

18、于或等于小于约10M。0021本领域技术人员应当理解，只有具有某些物理特性的药物成分才是符合要求的。具体而言，稳定的、结晶固体成分是满足需要的，因为它们特别符合常规要求化学合成、纯化、储存以及制剂或剂型开发。本文中使用的术语“晶形”或“结晶形式”是指化学物质的结晶制品。0022特别的结晶形式可以被定性，因此采用常规技术可以与相同化学物质的其它固体形式区别开来，所述技术包括X射线粉末衍射XRPD、光谱方法例如红外IR或核磁共振NMR光谱和热技术例如差示扫描量热法DSC、热重分析TGA或差热分析DTA。尽管XRPD为鉴定化学物质结晶形式的特别有用的方法，但是应当理解，即使是相说明书CN102333

19、773ACN102333787A4/19页6同的结晶形式，X射线图谱中的实际峰强度也由于分析方法的不同而不同，这取决于分析的样品和设备、采用的溶剂或方法。另外，也应当理解，当自给定的结晶形式分析获得的准确峰位以2测定在不同的分析之间有差别例如01时，光谱之间的峰位置的相对模式保持基本相同。0023本发明提供了结晶形式的化合物I。更具体地讲，本发明提供了结晶形式的化合物I的游离碱，其在约105、130、155和197处有2特征峰本文实施例中的游离碱I型。另外，本发明提供了结晶形式的化合物I的游离碱，其在约113、121、188和210处有2的特征峰本文实施例中的游离碱II型。0024本文中使用的

20、术语“患者”是指人类或非人类哺乳动物，例如犬、猫、牛、猴、马或羊。更具体地讲，术语“患者”是指人类。本文中使用的术语“治疗”包括阻止、预防、控制、减缓、停止或逆转现有症状或疾病的进展或严重程度。本文中使得的术语“预防”是指阻止、控制或抑制症状或疾病的发生率或发生。本领域技术人员可以理解，生理学疾病可以为“慢性”状态或者为“急性”事件。因此，疾病的治疗既包括急性事件也包括慢性状态。在急性事件中，化合物在症状发作时立即给予，当症状消失时停止给予，而慢性状态应在疾病的整个过程中始终给予治疗。0025本文中使用的术语“有效量”是指以单剂量或多剂量给予患者并能够在诊断或治疗中提供患者所需要的效果的化合物

21、I或其可药用的盐的量或剂量。有效量可以由作为本领域技术人员的主治诊断医师根据下列多种因素容易地确定例如哺乳动物的种类；动物体积、年龄和一般健康情况；所涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的响应；给予的特定化合物；给药的模式；给予的制剂的生物利用度特性；选择的剂量方案；任何伴随药物的使用。0026当在本发明的方法或用途中使用时，本发明的化合物和组合物可以单独给药或者与用于治疗特定疾病或病症的常规治疗药物组合给药。例如，化合物I或含有化合物I的组合物可以与用于治疗高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的常规药物组合给药，例如血管紧张素转化酶ACE抑制剂或血管紧张素受体阻断剂ARB药物。当本发明的化

22、合物或组合物作为组合疗法的一部分时，化合物I或含有化合物I的组合物可以分别给药或者作为含有与之组合的治疗药物的制剂的一部分给药。0027生物学活性测定0028本文中使用的“KD”是指配体受体复合物的平衡解离常数；“KI”是指药物受体复合物的平衡解离常数，它是处于平衡状态时与一半的结合位点结合的药物浓度的指示；“KB”是指拮抗剂受体复合物的平衡解离常数；“IC50”是指能够使得所述药物所可能产生的最大抑制响应的50的药物浓度，或者能够使得与受体结合的配体产生50置换的药物的浓度；“EC50”是指能够使得所述药物所可能产生的最大响应的50的药物浓度；“ED50”是指能够使得所述药物所可能产生的最大

23、响应的50所给予的治疗药物的剂量。0029A类固醇核激素受体结合实验0030将获自过度表达人MR盐皮质激素受体、GR糖皮质激素受体、AR雄激素受体或PR黄体酮受体的人胚胎肾HEK293细胞的细胞裂解物用于受体配体竞争结合实验以测定KI值。0031简而言之，类固醇受体竞争结合实验在缓冲液中进行，所述缓冲液含有20MM说明书CN102333773ACN102333787A5/19页7HEPES缓冲液PH76、02MMEDTA、75MMNACL、15MMMGCL2、20丙三醇、20MM钼酸钠、02MMDTT二硫苏糖醇、20G/ML抑肽酶和20G/ML亮抑肽酶实验缓冲液。通常，类固醇受体结合实验包括放

24、射性标记的配体，例如用于MR结合的025NM3H醛固酮、用于GR结合的07NM3H地塞米松、用于AR结合的036NM3H美曲勃龙METHYLTRIENOLONE和用于PR结合的029NM3H美曲勃龙，每孔还包括20G293MR裂解物、20G293GR裂解物、22G293AR裂解物或40G293PR裂解物。实验通常以96孔模式进行。加入各种浓度的竞争性实验化合物，浓度范围在约001NM至10M之间。在用于MR结合的500NM醛固酮、用于GR结合的500NM地塞米松或用于AR和PR结合的500NM美曲勃龙存在下，测定非特异性结合。将结合反应物140L于4温育过夜，然后向各反应物中加入70L冷活性炭

25、葡聚糖缓冲液每50ML实验缓冲液中含有075G活性炭和025G葡聚糖。将板于4在轨道振动器中混合8分钟。然后将板于4以3,000RPM离心10分钟。然后将等份的120L结合反应混合物转移至另一个96孔板中，向每个孔中加入175L的WALLACOPTIPHASEHISAFE3TM闪烁液。将板密封并在轨道振动器中剧烈振摇。温育2小时后，在WALLACMICROBETA计数器中读板。0032采用获得的数据计算估算的IC50以及10M的抑制百分率。MR结合的3H醛固酮、GR结合的3H地塞米松、AR结合的3H美曲勃龙或PR结合的3H美曲勃龙的KD通过饱和结合测定。采用CHENGPRUSOFF方程将化合物

26、的IC50值转化为KI。0033基本上根据上述方案，在MR结合实验中化合物I的KI约为040NM，由此证明化合物I为人MR的有效配体。另外，在AR、GR和PR结合实验中，化合物I的KI分别约为1170NM、669NM和478NM，因此证明化合物I为MR的选择性配体。0034B类固醇核激素受体调节的功能性实验0035醛固酮通过与盐皮质激素受体的相互作用发挥其生理学作用。随着醛固酮与MR的细胞质的结合，配体受体复合物易位至细胞核，它在此处与DNA上的激素响应元素结合从而启动靶基因的表达。为了证实本发明化合物调节即激动、部分激动、部分拮抗或拮抗类固醇激素受体的能力，可以进行生物验，该生物实验能够检测

27、采用核受体蛋白和激素响应元素报告基因构建物瞬时转染的细胞中的靶基因表达的功能性调节。在功能性实验中采用的溶剂、试剂和配体易于自商业获得，或者可以由本领域技术人员制备。00361核激素受体组筛选PANELSCREEN0037采用适当的转染试剂例如FUGENETM，将人胚胎肾HEK293细胞采用类固醇激素受体和报道子基因质粒转染。简而言之，采用能够组成性表达人类雄激素受体AR的质粒并采用病毒CMV巨细胞病毒启动子，将含有荧光素酶报道子CDNA的上游的两个拷贝的PROBASINARE和TK胸腺嘧啶激酶启动子的报道子质粒转染到HEK293细胞中。采用能够组成性表达人糖皮质激素受体GR、人盐皮质激素受体

28、MR或人黄体酮受体PR的质粒以及病毒CMV启动子，将含有荧光素酶报道子CDNA的上游的两个拷贝的GRE和TK启动子的报道子质粒转染。将细胞在T150CM烧瓶中、在含有5活性炭处理的胎牛血清FBS的DMEM介质中进行转染。温育过夜后，将转染细胞进行胰蛋白酶化，将其涂布于含有5活性炭处理的FBS的DMEM介质的96孔盘中，温育4小时后，将其暴露于各种浓度的实验化合物中，浓度范围在约001NM至10M之间。在拮抗剂模式实验中，将用于各个不同受体的低浓度激动剂加至介质中008NM醛固酮用于MR；025NM地塞米松用于GR；066NM美曲勃说明书CN102333773ACN102333787A6/19页

29、8龙用于AR；008NM普美孕酮用于PR。与实验化合物一起温育24小时后，将细胞裂解，采用标准技术测定荧光素酶活性。0038将数据拟合到四参数拟合对数曲线以确定EC50值。确定效能百分率饱和最大响应的化合物或最大刺激百分率未达饱和的最大响应的化合物，所述百分率相对于下列对照激动剂所获得的最大刺激而言30NM醛固酮用于MR实验；100NM美曲勃龙用于AR实验；30NM普美孕酮用于PR实验；100NM地塞米松用于GR实验。采用拮抗剂模式实验数据，可以同样确定IC50值。在拮抗剂模式中，通过将在低浓度激动剂008NM醛固酮用于MR；025NM地塞米松用于GR；066NM美曲勃龙用于AR；008NM普

30、美孕酮用于PR存在下的实验化合物活性与实验化合物不存在下低浓度激动剂所产生的响应进行比较，确定抑制百分率。0039基本上根据上述方案，化合物I在MR、PR、GR和AR实验中拮抗模式的IC50值分别约为21NM、924NM、10000NM和10000NM，在激动模式中对于MR、PR、GR和AR的EC50值均10000NM。因此，化合物I为HMR的选择性功能拮抗剂。00402HMR竞争性拮抗分析0041采用上面核激素受体组筛选中所述相同的转染试剂、质粒、启动子、报道子构建物、缓冲液和方法，将人胚胎肾HEK293细胞用人MR转染。将转染的细胞胰蛋白酶化，将其涂布于含有5活性炭处理的FBS的DMEM介

31、质的96孔盘中，温育4小时后，将其暴露于各种浓度10倍稀释的醛固酮中浓度范围在约0001NM至003M之间。在固定浓度的实验化合物存在或者不存在下，确定醛固酮拮抗HMR的性能，采用标准技术通过测定荧光素酶活性进行监测。采用SCHILD分析，以LOG剂量比1对LOG拮抗剂浓度绘图，通过下列方程确定实验化合物的KBLOGDR1LOG拮抗剂LOGKB，其中剂量比DR代表在实验化合物存在下醛固酮EC50与实验化合物不存在下醛固酮EC50的比值。0042基本上根据上述方案，在MR竞争性拮抗实验中，化合物I的KB约为51NM，因此证明了化合物I为人MR的有效拮抗剂。0043C醛固酮介导的肾病体内模型004

32、4雄性单侧肾切除SPRAGUEDAWLEY大鼠240280G单独饲养，随意给予饮水，每周给予啮齿类5001食物RODENT5001DIET。适应环境后，收集24基准尿样，分析总尿蛋白和肌酐。根据体重和基准尿蛋白，将动物随即分成实验组。通过尾剪TAILCLIP收集基准血清，分析血尿氮BUN、肌酐和电解质。获得基准样品后，在整个研究期间，将除了对照组外的所有大鼠继续给予含有6盐的食物，给予含有03KCL的饮水。对照组动物在研究期间维持给予5001食物和饮用水，不给予醛固酮。在异氟烷ISOFLOURANE麻醉下，将能够以075G/H，SC传递D醛固酮的001DMSO溶液25L/H28天的的ALZA微

33、型泵植入非对照动物例如实验化合物组和载体组。醛固酮植入后第二天，开始每天一次口服管饲10ML/KG给予实验化合物在含有1羧基甲基纤维素CMC/025聚山梨醇酯80的载体中或者只给予载体。化合物或载体单独给予2和4周后重复收集尿样，分析总尿蛋白和肌酐。在研究结束时，获得8个时间点的药代动力学样本05、1、2、3、6、8、12和24H。另外，将心脏和肾脏移出并在10缓冲的福尔马林中固化，用于苏木精和曙红HE以及MASSON的三色染色以测定心脏和肾脏组织的结构性损伤。在研究结束时也可以通过心脏穿刺收集血清，进行血清BUN、肌酐和电解质分析。说明书CN102333773ACN102333787A7/1

34、9页90045基本上根据上述方案，当以10MG/KG/天28天给予化合物I时，与载体治疗动物相比，它能够将尿蛋白排泄率减少约60，因此证明化合物I具有有效的体内肾保护活性。0046采用下列模型证实化合物具有抗高血压作用。0047D醛固酮调节的高血压的体内模型0048将雄性单侧肾切除SPRAGUEDAWLEY大鼠240280G单独饲养，随意给予饮水，每周给予啮齿类5001食物。适应环境后，将ALZET泵植入动物皮下，以25L/H的速度给予025G/H的醛固酮，多达28天，在试验期间，持续给予含有6NACL的食物和含有03KCL的饮用水。植入无线电遥测装置监测动脉血压。例如，在研究期间，每隔10分

35、钟收集每个动物的信号。24小时采集的所有数值的平均值SEM代表每个动物的平均日动脉压。0049在泵植入的第二天，每天一次口服管饲10ML/KG给予在载体中的实验化合物载体含有1中等粘度的羧甲基纤维素钠/025聚山梨醇酯80/005消泡剂1510TM或只给予载体。0050基本上根据上述方案，当每天一次口服给予130MG/KG/天14天时，在盐存在的情况下，与载体相比，化合物I能够剂量依赖性地降低醛固酮的高血压作用，这证明了化合物I具有抗高血压作用。0051采用下列模型证实化合物能够降低高钾血症的发生率或可能性。0052E电解质调节的体内试验0053将雄性SPRAGUEDAWLEY大鼠240280

36、G切除肾上腺，手术后6天持续给予5001啮齿类食物和1NACL饮用溶液。然后动物禁食过夜，用随意给予的饮用水代替1的盐饮用水。在实验开始的早上，将禁食动物根据禁食减少的体重随机分组。对照动物例如没有给予醛固酮或实验化合物的那些动物通过口服管饲给予10ML/KG实验化合物载体含有05CMC/025聚山梨醇酯80/27NACL并通过皮下注射给予1ML/KG醛固酮载体001DMSO/水。载体动物通过口服管饲给予相同的实验化合物载体和醛固酮3G/KG，SC。将实验物悬浮于羧甲基纤维素/NACL载体中。实验化合物治疗组给予悬浮于羧甲基纤维素/NACL载体中的实验物和3G/KGSC的醛固酮。给药后立即将动

37、物置于代谢笼中，可以随意饮水。收集给药后5小时的尿样，分析电解质排泄情况。数据表示为相对于肾上腺切除后载体处理动物的LOGNA/K排泄比或NA/K比的。化合物I可以以各种剂量进行试验以确定该化合物诱导尿NA/K比血清钾浓度增加的指标增加的程度。0054基本上根据上述方案，当给予30MG/KGPO，与载体处理动物相比，化合物I能够使得脲NA/K排泄比增加仅约30，这证明化合物I能够降低高钾血症产生的发生率或可能性。0055无需其它详细说明，相信本领域技术人员能够利用上述说明在最大程度上实施本发明。下面的制备和实施例更详细地阐明本发明并代表了化合物I的典型合成方法。对于本领域技术人员而言，试剂和原

38、料易于获得或者易于合成。本领域技术人员可以迅速识别实施例中所述方法的适当的变化形式。本发明化合物的命名通常由CHEMDRAW版本100提供。0056本文中使用的下列术语具有指定的含义“DMSO”代表二甲基亚砜；“DMAC”代表N，N二甲基乙酰胺；“TBOC”或“BOC”代表叔丁氧基羰基；“TLC”代表薄层色谱。说明书CN102333773ACN102333787A8/19页100057制备100581溴4氟22碘苄基氧基苯00590060将2碘苄基溴90G，029MOL、2溴5氟苯酚579G，029MOL和碳酸钾63G，046MOL在N，N二甲基甲酰胺750ML中的混合物于室温下搅拌16H。加

39、入水1L，将获得的混合物搅拌1小时，过滤固体，用水洗涤，在真空干燥箱中干燥20MMHG/60，获得目标化合物121G，100。1HNMR400MHZ，DMSOD6511S，2H，681T，1H，713T，1H，719DD，1H，746T，1H，759D，1H，762T，1H，793D，1H。0061制备20062322溴5氟苯氧基甲基苯基丙烯酸乙酯00630064于5560，向1溴4氟22碘苄基氧基苯1174G，029MOL、乙酸钠361G，044MOL、四正丁基溴化铵903G，029MOL、乙酸钯II18G，8MMOL，3MOL和N甲基吡咯烷酮900ML的混合物中滴加丙烯酸乙酯343ML，0

40、32MOL的N甲基吡咯烷酮200ML溶液。将反应混合物冷却至室温，用水2L和甲基叔丁基醚2L处理。将反应物通过硅藻土，加入乙酸乙酯1L，分层，用水2L洗涤。有机部分经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将获得的固体悬浮于己烷1L中，冷藏2H，过滤，用冷的己烷500ML洗涤。在真空干燥箱中干燥50/20MMHG，获得目标化合物，为浅黄色固体1044G，95。LCMSM/Z3810MH。0065可替代方法0066在氮气环境中，于搅拌下，向清洁干燥的100加仑反应器中加新鲜的N甲基吡咯烷酮72L、乙酸钠2721G，3317MOL、1溴4氟22碘苄基氧基苯9000G，2211MOL和四丁基溴化铵7128G，2

41、211MOL。充入氮气将反应混合物在完全真空下搅拌并脱气30MIN。使得反应器在氮气下重归环境压力，重复脱气过程。向反应混合物中加入乙酸钯II180G，2/重量比，加热至60。于60，通过加料漏斗向反应混合物中缓解加入丙烯酸乙酯2258G，2255MOL的N甲基吡咯烷酮18L溶液。加入完成后，将反应混合物加热至70。于70继续搅拌最少2H。将反应混合物的内部温度调节至510。向另一份清洁的适当大小的反应器中加入水225L，剧烈搅拌并冷却至内部温度5。在最少1小时内将反应混合物转移至剧烈搅拌的水中。将获得的混悬液于室温下搅拌30分钟至1小时。通过聚丙烯滤垫过滤，收集浅紫色固体。用水25L洗涤滤饼

42、，采用橡胶坝RUBBERDAM在滤器上抽干。将固体再置于有水45L的反应器中，将混悬液再搅拌30MIN说明书CN102333773ACN102333787A9/19页11至1小时。在聚丙烯滤垫上再过滤固体，用水25L洗涤滤饼。采用橡胶坝在滤器上抽干。将所得浅紫色物转移至干燥盘中，在通风橱中空气干燥最少24H。将固体于50真空干燥箱中干燥，获得目标化合物84KG，100。0067制备30068E3氟6H二苯并B，E氧杂环庚烯11亚基乙酸乙酯00690070将322溴5氟苯氧基甲基苯基丙烯酸乙酯94G，025MOL、乙酸钠30G，037MOL、四正丁基溴化铵81G，025MOL和乙酸钯II17G，

43、7MMOL，3MOL在N甲基吡咯烷酮850ML中的混合物于100110加热6H。冷却至室温，用水1L稀释，通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯2L洗涤。将其转移至分液漏斗中，加入水500ML，分层。用水洗涤215L有机层，经无水硫酸钠干燥，硅胶垫过滤，乙酸乙酯洗涤15L，浓缩至干。向残留的固体中加入己烷1L，冷藏2H，过滤，用己烷500ML洗涤，于50/20MMHG干燥，获得目标化合物643G，87。LCMSM/Z2990MH。0071可替代方法0072在氮气环境中，在搅拌下，向清洁干燥的100加仑反应器中加入N甲基吡咯烷酮834L、乙酸钠2706KG，3298MOL、322溴5氟苯氧基甲基苯基丙烯酸乙

44、酯9256KG，2199MOL和四丁基溴化铵7088KG，2199。将反应混合物充入氮气在完全真空下搅拌并脱气30MIN。使得反应器在氮气下重归环境压力，重复脱气过程。向反应混合物中加入乙酸钯II167G，2/重量比。0073将反应物于100至125加热，搅拌至少35H。加入乙酸乙酯100L，搅拌30MIN。加入水100L并搅拌30MIN。停止搅拌，静置最少1小时使其分层。收集有机层，水层用乙酸乙酯萃取先用50L，然后用25L。合并有机部分，用水40L、20氯化钠水溶液220L洗涤，每次最少搅拌30MIN，静置至少30MIN分层。有机溶液采用硫酸镁80KG干燥，加入活性炭20KG和硅胶6020

45、KG，搅拌最少1小时。过滤除去固体。滤液在真空下于35干燥至干。向固体残留物中加入甲醇20L。于5060将混合物加热转变为澄清溶液。加入庚烷40L，在2025冷却。在最少3H内将反应混合物进一步冷却至10。于10搅拌最少12H。过滤收集获得的固体产物，用庚烷甲醇混合物7525洗涤220L。将固体于40真空干燥至恒重，获得目标化合物37KG，64。0074可替代方法20075将1溴4氟22碘苄基氧基苯50G，0123MOL、乙酸钠302G，0369MOL、四丁基溴化铵396G，0123MOL和乙酸钯1G在N甲基吡咯烷250ML中加热至60。20分钟内滴加丙烯酸乙酯1291G，0129MOL的N甲

46、基吡咯烷50ML溶液。加入完成后，将混合物加热至1453H。将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤，说明书CN102333773ACN102333787A10/19页12采用甲基叔丁基醚2150ML洗涤固体。采用甲基叔丁基醚05L稀释滤液，用水05L洗涤。分离有机层，用甲基叔丁基醚萃取水层2300ML。用水2200ML洗涤合并的有机层。有机部分经硫酸镁干燥，活性炭处理，过滤，固体用甲基叔丁基醚100ML处理，浓缩。将残留物在异丙醇20ML中、于55、无真空下、在BUCHI烧瓶中制浆。搅拌下加入庚烷100ML。将黑色混悬液置于冷处过夜。过滤固体，用冷的庚烷/异丙醇洗涤91，2100ML，然后用庚

47、烷50ML洗涤，于35真空干燥至恒重，获得目标化合物，为褐色粉末2225G，61。0076制备40077E11溴亚甲基3氟6，11二氢二苯并B，E氧杂环庚烯00780079向3氟6H二苯并B，E氧杂环庚烯11亚基乙酸乙基酯695G，023MOL的异丙醇725ML悬浮液中加入氢氧化锂120G，053MOL的水125ML溶液，将其加热至704H。将混合物冷却至40，然后采用冰乙酸044MOL，25ML处理。搅拌15MIN后，加入N溴代琥珀酰亚胺025MOL，44G。开始起泡，温度上升至45，数分钟后形成固体。于4045将混合物搅拌1小时，冷却至室温。加入亚硫酸钠45G的水150ML溶液、饱和的碳酸

48、氢钠水溶液150ML和水450ML。过滤获得的混悬液，采用冷的11异丙醇/水300ML洗涤。于60/20MMHG将固体干燥过夜，获得目标化合物658G，93。1HNMR400MHZ，DMSOD64954BRD，2H，663DD，1H，677DT，1H，713S，1H，732746M，4H，752DD，1H。0080可替代方法0081在氮气环境中，在搅拌下向清洁干燥的100加仑反应器中加入异丙醇125L、E3氟6H二苯并B，E氧杂环庚烯11亚基乙酸乙酯13857KG，4642MOL和氢氧化锂3896KG，9284MOL的水54L溶液。将反应混合物加热至80并搅拌2H。将反应混合物冷却40，于40

49、至45，用20分钟加入乙酸5575KG，9284MOL。于45，用30分钟分次加入N溴代琥珀酰亚胺4874MOL，8676KG。将反应物冷却至室温并搅拌至少12H。加入亚硫酸钠水溶液377L并搅拌15MIN。加入碳酸氢钠水溶液377L并搅拌15MIN。加入水129L并搅拌30MIN。过滤收集获得的固体，采用异丙醇水洗涤11，220L。于32真空干燥固体至恒重，获得目标化合物138KG，97。0082制备50083E23氟二苯并B，E氧杂环庚烯116H亚基甲基4，4，5，5四甲基1，3，2二氧杂硼杂环戊烷0084说明书CN102333773ACN102333787A11/19页130085向搅拌的E11溴亚甲基3氟6，11二氢二苯并B，E氧杂环庚烯15G，49MMOL和双戊酰二硼16G，64MMOL的1，4二氧六环250ML溶液中加入乙酸钾15G，150MMOL。向混合物中充入氮，加入二氯代1，1二二苯基膦基二茂铁钯II二氯甲烷加合物180G，246MMOL，于65加热过夜。冷