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1、10申请公布号CN102321182A43申请公布日20120118CN102321182ACN102321182A21申请号201110283013022申请日20110922C07K19/00200601C12P21/00200601A23L3/3526200601A23K1/17200601A01N63/02200601A01P1/00200601A01P3/00200601A61K38/02200601A61P31/00200601C12R1/0720060171申请人广东海洋大学地址524088广东省湛江市麻章区湖光岩东广东海洋大学72发明人孙力军王雅玲刘唤明徐德峰聂芳红74专利代理。
2、机构广州市南锋专利事务所有限公司44228代理人刘广生54发明名称纳豆芽孢杆菌NT6菌株生产的复合抗菌肽及其生产方法57摘要本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌产生的复合抗菌肽及其生产方法，该复合抗菌肽产品为抗菌脂肽类物质ITURINS、FENGYCINS和SURFACTINS三类同系物的混合物，它们的比例分别是1020、2535和5060；该抗菌肽纯品为黄色粘稠物，能耐受10030MIN的加热，在PH212活性不丧失，对细菌、真菌具有广谱的抗菌活性，对原虫和癌细胞也具有强烈的杀伤作用，实验证实具有较高的安全性；本发明还公开了该复合抗菌肽的生产方法，用此法生产工艺简单、成本相对较低，可作为食品防腐剂、饲。
3、料添加剂、农用生物防治剂、医药和动物防病剂等。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN102321187A1/1页21纳豆芽孢杆菌NT6菌株生产的复合抗菌肽，其特征在于该复合抗菌肽是由ITURINS、FENGYCINS和SURFACTINS三类抗菌脂肽同系物的混合物组成，它们的比例分别是1020、2535和5060；其中ITURINS同系物分子量分别为10432、10572、10710、10710；FENGYCINS同系物分子量分别为14917、14925、15057、15197；SURFACTINS同系物分子量分别为9943、1009。
4、0、10088、10099、10087、10227、10226、10368、10365、10366、10518、10506、10512、10516、10658、10802道尔顿（DA），该复合抗菌肽为黄色粘稠物，水溶性好；能耐受10030MIN的加热；在PH212活性不丧失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有较高安全性；能抑制多种革兰氏阳性、阴性致病或腐败细菌，尤其对霉菌具有良好的抑制作用。2纳豆芽孢杆菌NT6菌株生产的复合抗菌肽的生产方法，其特征在于该方法采用的生产菌株为纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株，16SRRNA基因序列GENBANK登录号为JN1806。
5、28；所用培养基的组成为1）种子培养基G/L胰蛋白胨80120G，酵母膏3080G，NACL3070G，水1000ML，PH7075；2液体发酵培养基培养基1葡萄糖80120G，谷氨酸钠3070G，MGSO40307G，KCL0307G，KH2PO40812G，FESO4010020MG，MNSO43070MG，CUSO4015018MG，水1000ML，PH6570；或培养基2葡萄糖812G，土豆80120G，水1000ML；3）固体发酵培养基稻壳或甘蔗渣5080G，麸皮1525G，谷氨酸钠37G，葡萄糖37G，水150ML；方法一将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培。
6、养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2，2835，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵3048H，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCL调整PH到2，静置后离心，沉淀用甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法二将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2，2835，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵3048H，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，经甲醇或乙醇提取后，浓缩干燥，经赋型剂吸附、得抗菌肽成品；方法三将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的。
7、扩大培养，接种量为种子培养基体积的2，2835，在液体培养基中进行液体深层发酵3048H，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法四将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，将510接种于固体发酵培养基，在2837的条件下培养24天后，再经甲醇或乙醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品；或发酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。3根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌NT6菌株生产的复合抗菌肽，其特征在于所述的复合抗菌肽在食品防腐、饲料添加剂、医药和农用生物防治等方面的应用。权利要求书CN102321182ACN102。
8、321187A1/4页3纳豆芽孢杆菌NT6菌株生产的复合抗菌肽及其生产方法技术领域0001本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌NT6菌株生产的复合抗菌肽及其方法，属于生物技术领域。该方法生产的抗菌脂肽具有广谱的抗菌活性和生物表面活性，在医药、农业、食品和环境治理等领域有广泛的应用前景。背景技术0002细菌性豆豉在日本称为纳豆在中国是一种非常普遍的富含风味物质的大豆发酵食品，已有2000多年的历史。其发酵菌株是纳豆芽孢杆菌（BACILLUSNATTO）。纳豆芽孢杆菌能产生许多功能因子，使发酵产品对人体具有许多有益功能。目前，国内外针对纳豆菌的研究，主要集中在具有溶栓作用的代谢产物纳豆激酶。而其产生的抗菌作。
9、用，近些年来才受到人们重视。据文献报道，纳豆菌对细菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及大肠杆菌等致病菌的作用，其抗菌谱较广，而且具有一定的耐热性（钟青萍等，食品科学，2002，23（10）109112）。尽管对纳豆菌的抗菌性已有一些研究报道，但对其产生的抗菌物质多没有明确的研究报告。有研究者认为产生的抗菌物质是2，6吡啶羧酸，也有人认为是多粘菌素或杆菌肽或抗菌蛋白，但没有鉴定的资料（纪宁等，食品研究与开发，2006，271138142）；曹小红等对BACILLUSNATTOTK1菌株产生的抗菌物质进行了研究，发现了一种有抗菌活性的分子量为1036DA的脂肪酸。
10、链上有15个碳的环状脂肽SURFACTIN（曹小红等，中国生物工程志，2009，2925458）。除此之外未见其它相关纳豆菌抗菌物质的鉴定文献，特别是未见一种菌株同时产生二十多种抗菌脂肽同系物的文献报道。0003抗菌脂肽具有生物表面活性和广谱的抗菌活性，对细菌、真菌、原虫和癌细胞具有很强的杀伤作用，在医药、农业、食品及化妆品、石油开采和环境治理等领域有重要的应用前景。特别是由于抗菌脂肽具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产的要求，在食品防腐、饲料添加剂、动物防病和农业生物防治等领域受到广泛的关注。发明内容0004本发明的主要目的是利用纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATT。
11、O通过深层发酵或固态发酵及下游工艺生产一种复合抗菌脂肽，此抗菌肽具有广谱的抗菌活性、PH适应范围广、耐热性能好、安全，可作为食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂、动物防病剂和环境治理剂等。0005为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是1本发明利用纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株产生的抗菌肽，特征如下该抗菌肽主要含有三组抗菌物质，它们的分子量分别为一组10432、10572、10710、10710；二组14917、14925、15057、15197；三组9943、10090、10088、10099、10087、10227、10226、10368、10365、10366、10。
12、518、10506、10512、10516、说明书CN102321182ACN102321187A2/4页410658、10802（LCMS图谱见附图1）。该抗菌肽为抗菌脂肽类物质，由一系列同系物组成，第一组物质为ITURIN系列，第二组物质为FENGYCIN系列，第三组为SURFACTIN系列；它们的比例分别是1020、2535和5060；纯品为黄色粘稠物；在水中溶解性好；能耐受10030MIN的加热；在PH212活性不丧失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有较高安全性；有广谱的抗菌活性，它对食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血链球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠。
13、杆菌O157、单增李斯特氏菌、沙门氏菌等具有很好的抑制作用；对食品腐败细菌，如藤黄微球菌、大肠埃希氏杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、肠膜明串珠菌等，食品腐败霉菌，如黑曲霉、米曲霉、少根根霉、青霉、镰孢菌、黄曲霉等抑制作用较好；对许多植物致病菌，如扩展青霉、点青霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病、小麦纹枯病菌、八角炭疽病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等显示了很强的抑制作用；对动物致病菌，如猪肠炎沙门氏菌、溶血性大肠杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、水霉、鳃霉、链弧菌等也有较好的抑制作用。00062本发明生产上述复合抗菌肽是通过以下方法实现的该方法采用的。
14、生产菌株为纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株，16SRRNA基因序列GENBANK登录号为JN180628；所用培养基的组成为1）种子培养基G/L胰蛋白胨80120G，酵母膏3080G，NACL3070G，水1000ML，PH7075；2液体发酵培养基培养基1葡萄糖80120G，谷氨酸钠3070G，MGSO40307G，KCL0307G，KH2PO40812G，FESO4010020MG，MNSO43070MG，CUSO4015018MG，水1000ML，PH6570；或培养基2葡萄糖812G，土豆80120G，水1000ML；3）固体发酵培养基稻壳或甘蔗渣5080G，麸皮152。
15、5G，谷氨酸钠37G，葡萄糖37G，水150ML；方法一将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2，2835，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵3048H，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCL调整PH到2，静置后离心，沉淀用甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法二将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2，2835，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵3048H，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，经甲醇或乙醇提取后，浓。
16、缩干燥，经赋型剂吸附、得抗菌肽成品；方法三将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2，2835，在液体培养基中进行液体深层发酵3048H，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法四将纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，将510接种于固体发酵培养基，在2837的条件下培养24天后，再经甲醇或乙醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品；或发酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽说明书CN102321182ACN102321187A3/4页5成品。0007。
17、上述的复合抗菌肽在食品防腐、饲料添加剂、医药和农用生物防治等方面的应用。0008本发明的主要优点和积极效果如下1本发明首次利用纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTO生产抗菌肽，用于食品防腐和动物饲料添加剂、农用生物防治剂、动物防病剂等。目前实践中应用的天然抗菌肽如NISIN、天蚕素、爪蟾素MAGAININS等，其抗菌谱和PH适应范围相对较窄，使用范围受到一定限制。而本发明的复合抗菌肽抗菌谱广（对多株革兰氏阴性、阳性细菌和霉菌有明显的抑制作用，其中包括食源性致病菌、食品腐败菌、植物病原菌和动物病原菌等。），在PH212活性不丧失，因此，其适应范围较现使用的抗菌肽广。该抗菌肽能耐受木瓜蛋白酶、胃蛋。
18、白酶和胰蛋白酶的水解，在动物消化道内仍能保持活性；且在100条件下加热30MIN活性不丧失，显示了能耐受食品加工及饲料制粒的高温处理的优越性。00092纳豆芽孢杆菌来源于食品，且其产生的抗菌肽经小鼠口服毒性试验证实无毒，因此，在实际使用中具有极高的安全性。目前科学家经过实验证实，抗菌肽作为一种新型的食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产及对环境友好的要求。00103本发明采用纳豆菌生产抗菌肽，可大规模工业化生产，生产周期短，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，相对于动物来源的抗菌肽具有明显优势。00114本发明方法简。
19、便，成本低。附图说明0012图1NT6菌株发酵提取物的LCMS离子流谱图。具体实施方式0013下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。0014实施例1通过种子的扩大培养，再于发酵罐2835，进行液体深层发酵3048H，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCL调整PH到2，静置后离心，沉淀用35倍甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100G/KG。0015实施例2纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过上述种子培养基的扩大培养后，于发酵罐在上述液体。
20、发酵培养基中进行液体深层发酵2835，积累抗菌代谢产物3048H，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100G/KG。0016实施例3纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过上述种子培养基的扩大培养后，于发酵罐在上述液体发酵培养基中进行液体深层发酵2835，积累抗菌代谢产物3048H，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、35倍甲醇提取、干燥，得抗菌肽成品，通过高效说明书CN102321182ACN102321187A4/4页6液相色谱测定，抗菌肽含量不小于500G/KG。0017实施例4纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子的扩大培养，510接种于固体发酵培养基，经2837的培养24天后，经甲醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100G/KG。0018实施例5纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTONT6菌株通过种子的扩大培养，510接种于固体发酵培养基，经2837的培养24天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于5G/KG，可用于动物饲料添加剂。说明书CN102321182ACN102321187A1/1页7图1说明书附图CN102321182A。