副产物降低的高固体聚胺-表卤代醇组合物 发明领域
本发明涉及树脂和含有树脂的含水组合物，以及形成树脂组合物的方法，特别是用于造纸业，包括强度剂，例如湿强度和干强度剂，和起皱剂。本发明还涉及树脂及其生产方法，其中所述树脂、和含有这些树脂的组合物以及产品，例如纸产品，具有减少的残余物，例如表卤代醇和表卤代醇水解产物。另外，本发明涉及树脂、和组合物以及产品，例如纸产品，当贮存时保持低水平的残余物，例如表卤代醇和表卤代醇水解产物。再者，本发明的每一方面涉及具有不同固体含量，特别是高固体含量的树脂的组合物。
发明背景
经常在生产时将湿强度树脂加入到纸和纸板中。在缺少湿强度树脂的情况下，在用水湿润之后纸正常仅保留3％-5％的强度。然而，用湿强度树脂制备的纸当湿润时通常保留至少10％-50％的强度。湿强度可用于各种纸领域，其中一些实例是毛巾料、牛奶和汁液纸盒、纸袋和波纹容器地衬板。
干强度也是一种关键纸性能，特别是根据最近造纸者为了获得较低成本而将高产量木纸浆用于纸中的趋势。当与由高度精制的浆生产的纸进行比较时，这些高产量的木浆通常生产强度显著低的纸。
可商购获得的湿强度树脂包括Kymene557H、Kymene557LX、KymeneSLX、KymenePlus、Kymene450和Kymene736湿强度树脂，它们可从Hercules Incorporated，Wilmington，Del获得。湿强度树脂，例如上面所列的，也给纸提供了增加的干强度。
与用于赋予纸强度的那些类似的树脂也经常用作起皱粘合剂。在生产一些纸产品如面巾纸、卫生纸或毛巾纸时，通常将纸幅经过起皱处理以便赋予其所需的质地特征，例如柔软度和容积。起皱处理典型地涉及将该纸幅，当为纸的情况下为纤维素网，粘合到旋转起皱圆筒上，例如已知为Yankee干燥器的设备，然后用刮片使粘合的网分开。该网相对刮片的冲击使得网中一些纤维-纤维键断裂并使网起皱或成褶。
该起皱作用的程度取决于许多因素，包括网与起皱圆筒表面之间的粘合程度。较大的粘性使柔软度增加，尽管通常损失一部分强度。由于网中的水分含量，为了增加粘性，可以使用起皱粘合剂增强网可以具有的任何天然存在的粘性，这将根据网预先干燥的程度广泛地变化。起皱粘合剂还应防止干燥器表面的磨损并在刮片和干燥器表面之间提供润滑并减少化学腐蚀，以及控制起皱程度。使薄片刚好牢固地足以与转筒粘合的起皱粘合剂涂层将赋予良好的皱褶，赋予吸收性和柔软性，同时纸强度损失尽可能最小。如果与干燥器转筒的粘性太强，那么薄片可能拾取或者甚至“塞住”，即在刮片下移动，并围绕干燥器转筒缠绕。如果没有足够的粘性，薄片将太容易地起飞并经过太少的起皱。
起皱粘合剂，通常以水溶液或分散液，通常喷雾到起皱圆筒或转筒的表面，例如Yankee干燥器。这促使热转移，使得薄片更有效地干燥。如果浆装备与起皱圆筒粘附得太强，可以将释放剂喷雾到圆筒上。释放剂典型地是烃油。这些试剂有助于在起皱刮片上均匀地释放纸网，并且还润滑并防止刮片过度磨损。
起皱粘合剂组合物的实例包括Furman的US5187219公开的那些(将其全文引入本文作为参考)。这些组合物含有水溶性乙醛酸化丙烯酰胺/氯化二烯丙基二甲基铵聚合物和作为聚合物的增塑剂的分子量低于3000的水溶性多元醇。
Hollenberg等的US5246544(将其全文引入本文作为参考)公开了一种可逆交联的起皱粘合剂，它含有非自交联的材料，如具有通过离子交联而交联的官能团的聚合物或低聚物和至少一种金属、四价或更高的阳离子交联剂。含有改进交联聚合物的机械性能的添加剂，例如二元醇、聚乙二醇和其它多元醇如单糖和低聚糖。
聚氨基酰胺/环氧氯丙烷起皱粘合剂公开于Espy等的US5338807、Maslanka的US5994449和Giles等的加拿大专利979579(将它们的全文加入本文作为参考)。
Sommese等的US5374334(将其全文加入本文作为参考)公开了一种起皱粘合剂，它是一种含有约1-约99％乙烯胺的交联乙烯胺/乙烯醇聚合物。公开了环氧氯丙烷作为交联剂。
Soerens的US4684439和4788243(将它们的全文加入本文作为参考)公开了含有聚乙烯醇和水溶性热塑性聚酰胺树脂的混合物的起皱粘合剂，所述聚酰胺树脂含有聚亚烃聚胺、饱和脂族二元羧酸和聚(氧化乙烯)二胺的反应产物。
在Soerens的US4501640和4528316(将它们的全文加入本文作为参考)中，公开了一种起皱粘合剂，它含有聚乙烯醇和水溶性、热固性阳离子聚酰胺树脂的混合物。
可商购获得的起皱粘合剂包括Crepetrol190、Crepetrol290和Crepetrol80E阳离子聚合物，它们可从Hercules Incorporated，Wilmington，Del获得。
而且，聚胺-表卤代醇树脂，例如聚氨基聚酰胺-表卤代醇树脂经常含有大量的表卤代醇水解产物。例如，工业聚氨基聚酰胺-含有氯丙烷树脂典型地含有1-10wt％干基的环氧氯丙烷(epi)副产物、1，3-二氯丙醇(1，3-DCP)、2，3-二氯丙醇(2，3-DCP)和3-氯丙二醇(CPD)。epi副产物还已知为epi残余物。具有减少量epi副产物的这些树脂的生产已是许多研究的主题。生产具有较低量可吸附有机卤(AOX)物质的树脂的环境压力日益增加。“AOX”是指树脂的可吸附有机卤含量，它可以通过吸附在碳上测定。AOX包括环氧氯丙烷(epi)和epi副产物(1，3-二氯丙醇、2，3-二氯丙醇和3-氯丙二醇)以及与聚合物主链相连的有机卤。
已设计了几种减少表卤代醇水解产物的量的方法。在US5171795中另外教导了减少合成步骤中所用的表卤代醇的量。结果反应时间更长。在US5017642中教导了控制生产方法以生产减少浓度的水解产物的组合物。将这些专利的全文引入本文作为参考。
也教导了合成后处理。US5256727(将其全文加入本文作为参考)教导了表卤代醇及其水解产物与二元磷酸盐或烷醇胺以等摩尔比反应将氯化有机化合物转变成非氯化物质。为此必须将第二个反应步骤进行至少3小时，这样显著增加了成本并且在湿强度组合物中产生大量不需要的有机或无机物料。在含有大量表卤代醇和表卤代醇水解产物(例如，约1-6％wt的组合物)的组合物中，形成的有机物的量同样以不理想的大量存在。
US 5,516,885和WO 92/22601(将它们的全文加入本文作为参考)包括了使用离子交换树脂可以将卤化副产物从含有大量卤化副产物和少量卤化副产物的产物中除去。然而，从呈现的数据清楚地看到，湿强度组合物的产量显著降低并且湿强度效力降低。
已知可以将含有无氮有机卤的化合物转变成相对无害物质。例如，1，3-二氯-2-丙醇、3-氯-1，2-丙二醇(还已知为3-氯丙二醇、3-一氯丙二醇、一氯丙二醇、氯丙二醇、CPD、3-CPD、MCPD和3-MCPD)和环氧氯丙烷以用碱处理生产甘油。
还已知用含有脱卤酶的微生物转化无氮有机卤化合物。例如，C.E.Castro等(″Biological Cleavage of Carbon-Halogen BondsMetabolism of 3-Bromopropanol by Pseudomonas sp.″，Biochimica etBiophysica Acta，100，384-392，1962)(将其全文加入本文作为参考)描述了从土壤中分离的假单胞菌属种将3-溴丙醇依次代谢为3-溴丙酸、3-羟基丙酸和CO2的用途。
许多美国专利还描述了微生物用于卤代醇脱卤的用途，例如US4452894、4477570和4493895。将这些专利分别引入本文作为参考，好象本文完全陈述过。
US5470742、5843763和5871616(将它们的全文加入本文作为参考)公开了在没有降低湿强度效力的情况下微生物或得自微生物的酶用于从湿强度组合物中除去表卤代醇和表卤代醇水解产物的用途。
2000年7月31日提出的US申请09/629629(将其全文加入本文作为参考)涉及微生物或得自微生物的酶用于从树脂组合物中除去表卤代醇和表卤代醇水解产物的用途，并公开了一种这些微生物生长的优选连续方法。
甚至，US5972691和WO 96/40967(将它们的全文加入本文作为参考)公开了已实现在合成步骤之后(即在聚合反应形成树脂之后)用无机碱处理湿强度组合物并在低pH下将树脂稳定，从而减少湿强度组合物的有机卤(例如氯化水解产物)含量至适当量(例如以组合物的重量为基础约0.5％)。如此形成的组合物然后可以用微生物或酶处理以经济地生产表卤代醇和表卤代醇水解产物含量非常低的湿强度组合物。
还已知表卤代醇和表卤代醇水解物可以与碱反应形成氯离子和多元醇。US4975499教导在合成步骤中使用碱将湿强度组合物的有机氯含量减少至适当量(例如，以组合物重量为基础至约0.11-约0.16％的适当量)。US5019606教导将湿强度组合物与有机或无机碱反应。将这些专利的全文引入本文作为参考。
而且，1997年12月31日申请的US申请09/001787和Riehle于1998年12月22日申请的09/224107和WO 99/33901(将它们的全文加入本文作为参考)公开了在其它特征中，一种降低含有吖丁啶鎓离子和叔氨基卤代醇的原料水溶性湿强度树脂的AOX含量的方法，包括用碱处理树脂水溶液形成处理过的树脂，其中存在于原料树脂中的至少约20mo1％的叔氨基卤代醇转变成环氧化物并且吖丁啶鎓离子的量基本上没有改变，并且处理过的树脂在赋予湿强度方面的效力至少与原料湿强度树脂的差不多。
而且，2000年6月12日申请的US专利申请09/592681、1999年7月30日申请的09/363224、1999年6月11日申请的09/330200(将它们的全文加入本文作为参考)涉及聚胺-表卤代醇树脂产物，特别是可以在含卤残余物如3-氯丙二醇(CPD)的形成至少降低的情况下贮藏的聚胺-表卤代醇树脂产物。而且，这些申请公开了使用微生物或得自微生物的酶从湿强度组合物中除去表卤代醇和表卤代醇水解产物，并且湿强度效力没有降低。
WO 99/09252描述了由封端的聚氨基酰胺聚合物制备的热固性湿强度树脂。所用封端物是单羧酸或单官能羧酸酯类，并且用于控制聚氨基酰胺的分子量以便获得具有高固体含量的湿强度树脂。
前面的每一种方案已提供了不同结果，并且在使用聚胺-表卤代醇，特别是在高固体含量方面一直需要改进。具体地说，仍然需要树脂组合物，例如湿强度、干强度和起皱剂树脂，它们可以相对高聚合物固体含量的粘度合理的溶液或分散液提供。因此，仍然需要以含有高固体浓度的分散液或溶液制备、贮藏、处理和运输的树脂，并且没有聚合物交联的产物变质，例如胶凝问题。
发明概述
当使用适度平衡的时间、温度、pH和酶浓度的条件时，可以在前面公开的浓度较高的情况下进行叔胺基树脂的酶处理。
本发明涉及聚胺-表卤代醇树脂产物，特别是可以在含卤残余物如3-氯丙二醇(CPD)的形成至少降低的情况下贮藏的聚胺-表卤代醇树脂产物。
本发明还涉及含卤残余物的形成至少降低的聚胺-表卤代醇树脂例如用作强度剂，包括湿和干强度剂，和起皱剂的不同用途。
本发明还涉及贮藏时CPD形成量减少的聚胺-表卤代醇树脂产品，特别是纸产品。
本发明还涉及聚胺-表卤代醇树脂的各种处理，包括处理以降低与树脂和/或含这些树脂的组合物有关的含卤残余物的浓度。
本发明还涉及贮藏稳定的聚胺-表卤代醇的制备和/或聚胺-表卤代醇树脂的处理以使这些树脂贮藏稳定，特别在高固体含量下。
发明详述
除非另有说明，所有百分比、份、比例等都是以重量计。
除非另有说明，所述化合物或组分包括化合物或组分本身，以及与其它化合物或组分的组合，例如化合物的混合物。
而且，当量、浓度或其它值或参数以上面优选的值和下面优选的值的列表给出时，这应理解为具体公开了由任何成对的上面优选值和下面优选值形成的所有范围，不管是否单独公开了范围。
2000年6月12日提出的US专利申请09/592681、1999年7月30日申请的09/363224和1999年6月11日申请的09/330200(将它们的全文加入本文作为参考)涉及发现了在贮藏之后在聚胺-表卤代醇树脂中形成的CPD是由于形成的CPD物质与树脂的低聚和/或聚合组分有关。在这些申请中公开了在生产期间和/或之后可以这种方式处理聚胺-表卤代醇树脂以便防止与贮藏时形成CPD的聚胺-表卤代醇树脂有关的元素的形成、抑制和/或除去这些元素。例如，这些申请公开了酸处理、碱处理、减少预聚物中的酸端基、和酶处理以除去或减少CPD形成物质。
因此，在US专利申请09/592681中公开的本发明的一个方面，通过用酶试剂处理树脂可以生产贮藏时CPD的形成量降低且纸产品中CPD量最小化的的聚胺-表卤代醇树脂产品。因此，通过用能够从树脂中释放CPD形成物质的酶试剂处理树脂可以减少和/或除去CPD形成物质。所述酶试剂可以包括一种或多种能够从树脂中释放CPD形成物质的酶，例如酯酶、脂肪酶和蛋白酶中的至少一种。优选酶试剂具有酯酶活性。本领域技术人员已知蛋白酶类酶可以具有酯酶活性并且酯酶类酶可以具有蛋白酶活性。优选的蛋白酶类是枯草杆菌蛋白酶组(E.C.3.4.31.62.Homology modeling and proteinengineering strategy of subtilases.the family of subtilisin-like serineproteinases，Siezen RJ，de Vos WM，Leunissen JA，Dijkstra BW，ProteinEng.1991，4，719-37)，特别是由地衣芽孢杆菌(Swiss-Prot AccessionNumber：P00780)、解淀粉芽孢杆菌(P00782)和迟缓芽孢杆菌(P29600)生产的酶。该酶可以为纯态，或者该酶未经纯化。而且，可以使用酶的混合物，这些混合物可以包括纯酶的混合物、未纯化的酶的混合物、或者二者的混合物。特别地，优选的酶试剂是ALCALASE和SAVINASE，它们都可以从Novozymes North America，Inc.Franklinton，North Carolina(以前已知为Novo Nordisk Biochem，NorthAmerica，Inc.)获得。
由上面延伸，在以前的工作中，具有约12-13.5wt％固体的聚胺-表卤代醇树脂用ALCALASE 2.5L型DX(Novozymes)处理以减少或除去CPD形成物质。在这些处理条件下，例如pH8、40℃、6-8小时和0.25g ALCALASE的30g树脂，树脂趋于呈现高粘度并变得不能用。根据本发明出人意料地发现，通过平衡处理条件，包括pH、温度、酶试剂的浓度、含有聚胺-表卤代醇树脂的组合物的开始粘度和固体浓度，例如聚氨基聚酰胺-表卤代醇树脂组合物，可以用酶试剂处理以减少或除去CPD形成物质，而且具有所需粘度特征并且CPD释放优异。这些新发现的酶处理条件使树脂粘度增加、减少或保持在所需水平，并且允许酶处理在低固体含量，以及15wt％或更大的高固体含量。
不希望受理论的约束，据信随着活性固体含量增加，交联速度增加，因此粘度增加。通过正确地选择反应条件，可以将增加粘度的交联反应的速度与酶水解反应的速度平衡，这样降低粘度，从而可以预测获得所需粘度。
由于本发明能够较高产量地酶处理生产并且由于可以使用较低含量的昂贵酶，因此本发明是有用的。因此本技术能够(1)通过更长时间地形成吖丁啶鎓生产高固体、高效力的树脂和(2)通过增加叔氨基氯代醇官能度向吖丁啶鎓官能度转变生产含有较低AOX的树脂。
因此，根据本发明，已发现减少或除去CPD形成物质的酶处理可以在比希望的高的固体含量下进行。在这一点上，在上述US专利申请09/592681中的酶处理实例是在约13-14wt％固体下进行的。因此，本发明的酶处理可以包括现有技术中公开的固体含量，包括低至4wt％或更低的浓度。然而，与现有技术相反，根据本发明用酶试剂处理的含水树脂组合物的固体含量可以高于15wt％，更优选高于约20wt％，并且特别是与起皱剂一起可以高于约25wt％。优选的固体含量范围包括约15-50wt％，更优选约18-40wt％。就湿强度试剂而言，优选固体含量是约15-40wt％，更优选约18-25wt％，一个优选的固体值是约21wt％；并且，就起皱剂而言，固体含量是约20-40wt％，更优选约22-30wt％，一个优选的固体值是约26wt％。
术语“起皱助剂、起皱树脂、起皱剂和起皱粘合剂”可以互换地使用，并且在整个说明书中都具有相同的意义。
在适宜条件下将至少一种酶试剂加入到树脂中以实现在高树脂固体组合物中CPD形成物质的足够水解。优选，将时间、温度、pH、酶浓度、开始粘度和固体含量的条件平衡以便能够水解反应同时使树脂性能，例如树脂的湿强度或起皱效力的降低最小化或者防止不希望的高树脂粘度。因此，通过平衡时间、温度、pH、酶浓度、开始粘度和固体含量的条件可以出人意料地在高固体浓度下进行CPD形成物质的水解。例如，随着固体浓度增加，pH和/或温度经常应降低。而且，随着固体浓度增加，酶浓度经常应增加。
注意，在酶处理期间树脂组合物的粘度可以从开始粘度增加或降低，并且可以保持相同或者基本上相同，如上所述这取决于反应条件。就起皱剂而言，经常优选，但不限于，酶处理结束时的粘度与开始的粘度相同或者基本上相同。例如，就湿强度剂而言，经常优选，但不限于，保持在处理时间的开始部分的开始粘度或从其降低，然后保持或者在处理时间结束时增加至所需粘度。例如，就具有约100-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的树脂而言，优选对条件进行选择以便处理之后，保持树脂粘度或者随着活性固体为约19-22wt％而降低。而且例如，就具有约100-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的树脂而言，优选反应开始时的Gardner Holdt粘度是约G-J，然后理想的是Gardner Holdt粘度在反应期间降低至反应结束时的约F。而且例如，就具有约100-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的树脂而言，还优选如果反应开始时的Gardner-Holdt粘度是约G-J，那么理想的是Gardner-Holdt粘度在反应期间降低至反应结束时的约A-E，理想的是增加处理温度直到Gardner-Holdt粘度增加至约F-I。而且例如，就具有约200-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得)而言，如果反应开始时的Gardner-Holdt粘度是约I，那么理想的是Gardner-Holdt粘度在反应期间降低至反应结束时的约F，使得最终树脂(在约pH 3-3.5下稳定化)具有约100-150cps的Brookfield粘度。例如，就具有约200-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得)而言，如果反应开始时的Gardner-Holdt粘度是约I，那么理想的是Gardner-Holdt粘度在反应期间降低至反应结束时的约C，理想地是增加处理温度直到Gardner-Holdt粘度增加至约F。
例如，就起皱剂而言，经常优选，但不限于，开始粘度低于约150cps，更优选低于约100cps，更优选低于约80cps，甚至更优选低于约40cps。优选反应混合物的开始粘度范围是约10cps-150cps，更优选是约20cps-100cps，甚至更优选约40-80cps。
就上述而言，优选使副反应，例如聚合故障或分子量增加，最小化或者至少平衡以便反应混合物的粘度保持低于不能使反应进行的粘度。优选，使用Brookfield LVDV-II+可编程粘度计于25℃下，或者等价物如Brookfield DV II+，Spindle LV2在60或100rpm下测定粘度，这取决于其粘度。就可编程粘度计而言，所用步骤以Operating Instructions，Manual No.M/97-164为基础。根据说明手册仅仅如果将正确的轴和rpm用于样品的粘度时，该粘度计将测定粘度。
优选起皱剂的性能在处理之后与处理之前几乎相同。因此，如上所述，优选在起皱剂的反应期间将反应混合物的粘度保持恒定或者基本上恒定。具体地说，反应混合物的粘度不增加超过开始粘度的约50％，更优选不超过约20％，最优选不超过约10％。
还应注意的是，在反应期间可以改变条件，优选温度、pH和酶试剂的浓度。例如，如果反应混合物的浓度高于所需的，那么可以降低pH和/或温度和/或可以加入其它酶试剂。相反，例如，如果反应混合物的粘度低于所需的，那么可以升高pH和/或温度。
本发明还涉及一种降低含聚胺-表卤代醇树脂的组合物的分子量或粘度的方法，包括用至少一种酶试剂处理含聚胺-表卤代醇树脂的组合物。所述组合物可以含有高固体含量，例如至少15wt％的固体含量。反应条件变化经常改变反应时间。可以降低其pH和/或温度和/或可以加入其它酶试剂。
就湿强度树脂并使用ALCALASE 2.5L型DX作为酶而言，优选条件的具体实例包括如下。就具有约150-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的树脂而言，优选使用约20-33℃的温度、约6.8-7.8的pH，ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)与活性固体之比是约1.0∶20-1.0∶5.0。更特别地，就具有约200-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得)而言，优选使用约23-27℃的温度、约6.8-7.5的pH，ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)与活性固体之比是约1.0∶8.0-1.0∶18.0，处理时间为6-10小时。应指出的是，当处理时间增加时，从产生CPD的物质中释放的CPD的量理想地增加，优选的处理时间是6-10小时。条件的另一实例如下：具有约200-300cps的开始Brookfield粘度和约20-22wt％活性固体的KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得)而言，温度为约35℃，pH为约7.5，ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)重量与活性固体之比(重量)是约1.0∶8.3。
温度可以是至少约0℃，更优选是约10℃-80℃，甚至更优选约20-60℃，更优选约20℃-40℃，更优选约20℃-30℃。反应时间可以是约3分钟-350小时，更优选约30分钟-48小时，更优选约30分钟-96小时，更优选约1小时-24小时，甚至更优选约2小时-12小时。酶处理的pH将取决于特定酶的pH依赖性和其它处理条件，并且可以在1-11之间变化，优选2-10，甚至更优选约2.5-9，甚至更优选约7-9，甚至更优选7-8。其它优选的pH范围包括：5.0-8.0、5.5-7.5、6-9、6-8.5、6.5-8。
例如，组合处理可以在pH 6.8-7.8开始持续前4-24小时并降低至pH 5.5-7.0，或者使pH位移至6.5-7.2持续组合处理的后8-48小时。
酶浓度将取决于其活性。例如，但不限于，酶可以如下量存在：约0.04g活性酶干基/1600g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基-0.04g活性酶干基/1.5g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基，酶也可以如下量存在：约0.04g活性酶干基/160g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基-0.04g活性酶干基/4g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基。
酶浓度将取决于其活性。例如，但不限于，当为ALCALASE时，酶可以如下量存在：约1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/1600g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基-1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/1.5g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基，酶也可以如下量存在：约1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/160g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基-1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/4g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基。
指出的是，按照本申请陈述的这些准则和非限制性实例，本领域普通技术人员将能够确定处理条件和处理条件的平衡以获得在高固体浓度下CPD形成物质的水解和/或获得分子量或粘度的降低。例如，当固体浓度增加时，通常应降低其pH和/或温度，并且经常增加酶试剂的浓度。而且，按照这些准则，本领域普通技术人员将能够确定用于除去CPD形成物质和/或获得分子量或粘度降低的酶试剂。
而且，通过使用适宜类型和数量的酶可以改变优选的反应条件。例如，如果对聚胺-环氧氯丙烷树脂而言，酶试剂具有比酯酶活性(蛋白酶/酯酶平衡)更高的蛋白酶，那么反应条件能够变为更高pH、温度和/或固体，例如反应条件是约pH8以上和/或温度大于约40℃和/或固体高于约40wt％。实践定义为获得降低形成CPD的树脂，同时具有所需粘度的树脂。尽管条件取决于具体酶的酯酶和蛋白酶活性的平衡，但是就ALCALASE 2.5L型DX而言的本发明的优选条件如下：15-50wt％活性固体、pH6.9-7.9、于0-35℃下，持续4-24小时和8-20g活性固体相对1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)，并且开始粘度是10cP-1000cP。而且，应指出的是，在整个本申请中，使用术语“酶试剂浓度”。然而，本领域普通技术人员应理解，酶可以具有不同的活性，并且酶的浓度可以根据其活性调整。
可以将该酶处理用于树脂合成法中生产且没有进一步处理的树脂上。而且，在减少和/或除去CPD形成物质之前，树脂可以通过不同方法处理。而且，在减少和/或除去CPD形成物质的处理之后，树脂可以通过不同方法处理。甚至，在减少和/或除去CPD形成物质之前树脂可以通过不同方法处理，并且在减少和/除去CPD形成物质之后树脂也可以通过不同方法处理。为了简化起见，本文不重复这些方法的完整描述，并且参考上面引证的US专利申请09/629629、09/592681、09/363224和09/330200(将它们的全文引入本文作为参考)。
本发明的树脂能够在没有过度形成CPD的情况下贮藏。更特别地，例如，当以约13.5wt％树脂固体含量贮藏时，溶液将含有低于约10ppm(百万分之)，更优选低于约ppm，最优选低于1ppm的CPD。在本发明上下文中，短语“树脂固体”意思是组合物中的活性聚胺-表卤代醇。
为了测定本发明树脂溶液的贮藏稳定性，进行树脂溶液稳定性试验，其中将树脂溶液于50℃和pH为约2.5-8，优选2.8下贮藏2周，并在2周时间结束时测定其CPD含量。因此，如果在2周时间结束时测定其含有低于约250ppm干基的CPD，更优选在2周时间结束时测定低于约150ppm干基的CPD，更优选在2周时间结束时测定低于约75ppm干基的CPD，甚至更优选在2周时间结束时测定低于约40ppm干基的CPD，甚至更优选在2周时间结束时测定低于约10ppm干基的CPD，那么本发明含有聚胺-表卤代醇的溶液将贮藏稳定。
可以对含有各种百分比树脂固体含量的溶液进行树脂溶液稳定性试验；然而，产生的CPD应相对固体含量进行校准。例如，就具有15ppm的测定CPD含量的15wt％树脂固体含量溶液而言，校准的CPD，以干基计将是100ppm干基(15ppm/0.15重量树脂固体含量)。
通过将一部分聚胺-表卤代醇树脂倒入含搅拌器的容器中进行树脂溶液稳定性试验。将该容器放入50℃水浴中并在搅拌下保持在50℃。从容器中取出一等分试样并按照下述的GC步骤进行GC(气相色谱)分析。典型地，首先使用火焰电离检测器(FID)分析样品。当需要增加的灵敏度时，特别是待分析的物质低于约20ppm时，使用电解电导率检测器(ELCD)或卤素特异性检测器(XSD)。可以使用其它灵敏检测器，例如电子捕获检测器。本试验是在约32℃下较长时间内对于一模型老化的加速老化试验。
测定本发明树脂溶液贮藏稳定性的其它试验是如下试验(“酸试验”)：将一部分待测定的树脂加入到含有一搅拌器的容器中。用96wt％硫酸将其pH调整至pH1.0。将容器密封并放入一50℃水浴中并在搅拌下保持在50℃。在24小时将一等分试样从容器中取出，并以下述的方式进行GC分析以提供贮藏稳定性的指示。
可以对含有各种百分比树脂固体含量的溶液进行该酸试验；然而，产生的CPD应相对固体含量进行校准。例如，就具有15ppm的测定CPD含量的15wt％树脂固体含量溶液而言，校准的CPD，以干基计将是100ppm干基(15ppm/0.15重量树脂固体含量)。
就将酶处理用于树脂合成法中不需要进一步处理的树脂的本发明实施方式而言，尽管可以使用进一步处理，但是CPD释放和/或树脂产生的量，当在pH 1、50℃下贮藏24小时并在24小时测定时，释放和/或产生低于约1000ppm干基的CPD，更优选释放和/或产生低于约750ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约500ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约250ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约200ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约150ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约100ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约75ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约50ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约25ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约15ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约5ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约3ppm干基的CPD，甚至更优选释放和/或产生低于约1ppm干基的CPD。
就酶处理是与一附加处理同时、在其之前或之后以减少表卤代醇、表卤代醇副产物和与聚合物主链相连的有机卤之一的本发明实施方式而言，所述附加处理可以是，但不限于，在有效地脱卤化残余量的有机连接卤素的量的pH和温度下，将减少的形成CPD的树脂与至少一种微生物，或者从至少一种微生物中分离的至少一种酶接触，当在pH 1、50℃下贮藏24小时并在24小时测定时，含有低于约1000ppm干基的CPD，更优选含有低于约750ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约500ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约250ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约200ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约150ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约100ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约75ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约50ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约25ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约15ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约5ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约3ppm干基的CPD，甚至更优选含有低于约1ppm干基的CPD。
GC步骤和仪器：使用以下方法用GC测定处理和未处理的树脂中的epi和epi副产物。将树脂样品吸收到Extrelut柱(可从EM Science，Extrelut QE，Part#901003-1获得)上并将乙酸乙酯通过柱进行萃取。将一部分乙酸乙酯溶液在一宽孔径毛细柱上进行色谱分析。如果使用火焰离子化检测器(FID)，使用正辛醇作为内标物对这些组分定量。如果使用电解质电导率检测器(ELCD)或者卤素特异性检测器(XSD)，使用利用峰匹配定量的外标准法。数据系统或者是Millennium2010或者是HP ChemStation。FID检测器购自Hewlett-Packard(HP)作为5890 GC的部件。ELCD检测器，5220型，购自OI Analytical。XSD检测器购自OI Analytical，5360 XSD型。所用GC仪器是HP 5890型系列II。柱是DB-WAX(Megabore，J&W Scientific，Inc.)30m×0.53mm，具有1.5微米的膜厚。就FID和ELCD而言，载气是流速为10mL/min的氦气。炉程序是35℃，7分钟，接着以8℃/分钟上升至200℃并在200℃下保持5分钟。FID使用30mL/min的氢和250℃、400mL/min的空气。ELCD使用正丙醇作为电解质，且电解质流速设定为50％，反应器温度为900℃。XSD反应器以氧化态于1100℃下操作，高纯度空气流速是25mL/min。
而且，含有本发明树脂的纸产品能够在没有不适当形成的CPD的情况下贮藏。因此，本发明的纸产品可以具有最初低含量的CPD，并且可以在延长的贮藏时间内保持低含量的CPD。更具体地说，本发明的纸产品，用1wt％附加量的树脂制成，当贮藏2周，优选至少6月，甚至更优选至少1年时，将含有低于约250份/十亿(ppb)的CPD，更优选低于约100ppb的CPD，甚至更优选低于约50ppb的CPD，甚至更优选低于约10ppb的CPD，甚至更优选低于约1ppb的CPD。而且，本发明的纸产品，用1wt％附加量的树脂制成，当贮藏2周，优选至少6月，甚至更优选至少1年时，CPD含量增加低于约250ppb，更优选低于约100ppb的CPD，甚至更优选低于约50ppb的CPD，甚至更优选低于约10ppb的CPD，甚至更优选低于约1ppb的CPD。换句话说，本发明的纸产品具有贮藏稳定性并且当纸产品贮藏短至1天到长至1年在纸产品中都不将产生过量的CPD含量。因此，本发明的树脂在纸产品中形成有最少的CPD，特别是暴露于含水环境的那些，尤其是热含水环境，例如茶袋、咖啡过滤器等。纸产品的其它实例包括包装用纸板级以及面巾纸和贴花纸级。
纸可以通过加入除约1wt％之外的附加含量的树脂制成；然而，应相对该附加含量校准CPD含量。例如，就通过以0.5wt％附加含量加入具有50ppb的测定CPD含量的纸产品而言，以1wt％附加含量为基础校准的CPD将是100ppb(50ppb/0.5％附加含量)。
为了测定纸产品中的CPD，根据1993年10月注明的欧洲标准EN 647中所述的方法将纸产品用水提取。然后将5.80g氯化钠溶于20ml水提物中。将所述盐化含水提取物转移到一20g容量的Extrelut柱中并使柱饱和15分钟。3ml乙酸乙酯洗涤3次并将柱饱和之后，将该Extrelut柱洗脱直到在约1小时内回收300ml的洗脱液。使用一500-ml Kuderna-Danish浓缩设备将300ml的乙酸乙酯提取物浓缩至约5ml(如果需要的话，使用微型Kuderna-Danish设备进行进一步浓缩)。使用上述的步骤和仪器将浓缩过的提取物通过GC分析。典型地，使用电解质电导率检测器(ELCD)或卤素特异性检测器(XSD)。可以使用其它灵敏的检测器，例如电子捕获检测器。或者，可以使用实施例4中所述的步骤测定纸产品中的CPD。
可以用本发明的酶试剂处理的树脂可以包括任何聚胺-表卤代醇树脂。本发明还涉及通过使表卤代醇，例如环氧氯丙烷，与预聚物(本文也可以互换地称之为聚合物)，例如聚氨基酰胺预聚物反应制备的聚胺-表卤代醇，例如聚氨基聚酰胺-环氧氯丙烷的制备、用途和处理。当为聚氨基聚酰胺树脂时，应指出的是，聚氨基酰胺预聚物也称之为聚酰氨基胺、聚氨基聚酰胺、聚酰氨基聚胺、聚酰胺聚胺、聚酰胺、碱性聚酰胺、阳离子聚酰胺、氨基聚酰胺、酰氨基聚胺或聚氨基酰胺。
用于本发明的优选的聚合物包括阳离子聚合物，单独或与其它聚合物一起。特别优选的阳离子聚合物包括为了给纸赋予湿强度的用的那些以及起皱剂。可用于造纸配方的许多聚合物列表，例如湿强度和起皱剂，描述在Paper Chemistry，ISBN 0-216-92909-1第78-96页，在美国由Chapman Hall，New York出版。该书第6章的题目是“Wet Strength Chemistry”，并将其全文加入本文作为参考。第6章描述了用于向纸赋予湿强度的几类聚合物，包括：聚氨基酰胺-环氧氯丙烷树脂、脲-甲醛树脂、蜜胺-甲醛树脂、环氧化聚酰胺树脂、乙醛酸化聚丙烯酰胺树脂、聚乙烯亚胺树脂、双醛淀粉、用甲醛处理过的蛋白质粘合剂、黄原酸纤维素(粘胶)、合成胶乳、植物胶和乙二醛。聚氨基酰胺-环氧氯丙烷可以是Kymene牌聚氨基酰胺-环氧氯丙烷树脂，例如Kymene557LX、KymeneSLX2或Kymene617，或者聚胺-环氧氯丙烷如Kymene2064、Kymene367树脂和Kymene736或者聚酰胺-聚亚脲基-表卤代醇树脂如Kymene450。
本发明涉及可以单独使用或者与其它聚合物组合使用用于纸的湿增强和起皱剂的阳离子聚合物如聚胺-环氧氯丙烷树脂。这些树脂包括环氧氯丙烷树脂和含氮阳离子聚合物，它们都得自环氧氯丙烷反应物。用于本发明目的的优选的树脂包括聚氨基酰胺-环氧氯丙烷湿强度树脂，例如US2926154、3332901、3891589、3197427、4240935、4857586；EP0349935和GB865727、以及美国专利申请09/629629、09/592681、09/363224和09/330200。而且，树脂包括Crepetrol80E或CrepetrolA3025、CrepetrolA6115、CrepetrolA8225、Crepetrol870、SPC 003和Rezosol8289起皱剂，它们都可以从Hercules Incorporated，Wilmington，Delaware得到。指出的是这些树脂在本文中通常称之为聚胺-表卤代醇树脂，并且这些树脂包括，但不限于，聚氨基聚酰胺-表卤代醇树脂(还已知为聚氨基酰胺-表卤代醇树脂、聚酰胺聚胺-表卤代醇树脂、聚胺聚酰胺-表卤代醇树脂、氨基聚酰胺-表卤代醇树脂、聚酰胺-表卤代醇树脂)；聚亚烷基聚胺-表卤代醇；和聚氨基亚脲基-表卤代醇树脂、共聚酰胺-聚亚脲基-表卤代醇树脂、聚酰胺-聚亚脲基-表卤代醇树脂，在每一实例中优选的表卤代醇是环氧氯丙烷。这些已知树脂的制备方法也公开在这些文献中，将它们全文加入本文作为参考。
这些专利中的例证的环氧氯丙烷树脂的特征在于存在下式的N-氯丙烷基团：
和下式的季N-氯丙烷基团：
其中四取代的氮原子带正电(季氮)，并且因此为阳离子；
和下式的同分异构的氯化3-羟基吖丁啶鎓基团：
用于本发明的优选的阳离子聚合物是具有下式的聚合物：
其中标注星号的四取代的氮原子带正电(季氮)，并且因此为阳离子。该氮原子在一4-元环(即，3-羟基吖丁啶鎓基团)中。其它不带电的聚合物单元也共同存在于这类树脂的聚合物链中。甚至少量的带负电(即阴离子)基团也可以存在于该聚合物上，但是沿聚合物链的净电荷是正的。X-是一简单的阴离子，它不与聚合物链共价地相连。通常所述阴离子是氯离子，并且n是约5-几千的整数，优选5-3000。
起皱剂包括，但不限于，Crepetrol80E或CrepetrolA3025、CrepetrolA6115、CrepetrolA8225、Crepetrol870、SPC 003和Rezosol8289起皱剂。
就湿强度试剂而言，尽管可以使用比例大于1，但是优选树脂包括在表卤代醇与仲氨基团的摩尔比小于1的聚酰胺-表卤代醇反应中形成的树脂，更优选表卤代醇与仲氨基团的摩尔比小于约0.975，其中表卤代醇与仲氨基团的摩尔比的优选范围是约0.5-0.975，更优选表卤代醇与仲氨基团的摩尔比是约0.6-0.975，甚至更优选是约0.8-0.975。就起皱剂而言，优选树脂包括在表卤代醇与仲氨基团的摩尔比小于约0.50，更优选小于约0.25，并且甚至可以低于0.1，优选下限是约0.05的聚酰胺-表卤代醇反应中形成的树脂。
而且，本发明的起皱剂不需要象湿强度试剂中那么多的交联官能团，并且因此可以具有比湿强度试剂低的吖丁啶鎓含量。因此，优选起皱剂的吖丁啶鎓含量低于约10mol％，优选范围是约5-10mol％，并且优选湿强度试剂的吖丁啶鎓含量大于约30mol％，优选范围是约30-70mol％。吖丁啶鎓的mol％和其它物质的mol％可以通过以下NMR步骤测定。
NMR步骤
使用配备有10mm宽带探针的BRUKER AMX分光计获得其13CNMR光谱。100MHz(AMX400)或125MHz(AMX500)的13C NMR操作频率足够用于数据收集。在这两种情况下，获得具有连续的1H去耦的光谱。适当信号的电子集成提供以下烷基化组分的摩尔浓度：ACH、EPX、GLY和AZE。
其中：ACH＝聚合氨基氯丙烷类、EPX＝聚合环氧化物类、GLY＝聚合二醇类、AZE＝吖丁啶鎓离子类
为了计算这些物质各自的浓度，整数值必须以1个碳为基础放置。例如，20-42ppm的光谱区代表二亚乙基三胺-己二酸酯主链中的6个碳，因此整数值除以6。该值用作计算烷基化物质的聚合物公分母(PCD)。以下提供这些物质的化学位移(使用1.3ppm的乙腈场参考)。将每个烷基化产物的相应整数值用于分子计算用，参见下面的实例：
-在68-69ppm下的ACH信号代表1个碳；
ACH÷PCD的整数＝摩尔份ACH
-在69-70ppm下的GLY信号代表1个碳；
GLY÷PCD的整数＝摩尔份GLY
-在51-52ppm下的EPX碳代表1个碳；
EPX÷PCD的整数＝摩尔份EPX
-在73-74ppm下的AZE信号代表2个碳，因此，需要2的分割因数；
AZE/2÷PCD的整数＝摩尔份AZE
以下光谱参数是在Bruker AMX400上13C NMR分析Kymene树脂或起皱剂的标准试验条件。 温度 25℃ 共振频率 100MHz #数据点 64K 停留时间 20微秒 采集时间 13秒 扫描宽度 25000Hz 扫描数字 1K 松弛延迟 3秒 脉冲顶锥角 70° 脉冲程序 zgdc 处理过的谱大小 64K 切趾函数 指数 谱线展宽 3Hz
而且根据本发明，就得自含有叔胺官能团的预聚物的起皱剂而言，所述起皱剂将优选具有含量低于约30mol％的季氨基卤丙烷，例如氨基氯丙烷，而本发明的湿强度试剂优选具有含量大于30mol％的季氨基卤丙烷，例如氨基氯丙烷。而且，在希望不受理论约束的情况下，据信仲胺化合物，例如二乙三胺，形成吖丁啶鎓基团，而叔胺化合物，例如甲基二(3-氨基丙基)胺，形成季氨基氯丙烷基团。叔胺类化合物的实例包括，但不限于，己二酸和甲基二(3-氨基丙基)胺的反应产物，获得叔胺预聚物。将这种预聚物用于制备含有季氨基卤丙烷基团的叔胺基树脂。
本发明的优选聚胺是通过二羧酸或其衍生物与甲基二(3-氨基丙基)胺或与含有2-4个具有2-4个碳的亚烷基基团、2个伯胺基团和1-3个叔胺基团的聚亚烷基聚胺反应生产的。适用于制备所述聚氨基酰胺的二羧酸衍生物包括酯、酸酐和酰基卤。
由聚亚烷基聚胺制备聚氨基酰胺的步骤描述在Keim的US2926154(将其全文加入本文作为参考)。利用甲基二(3-氨基丙基)胺制备聚氨基酰胺的步骤描述在Espy等的US5338807和US5994449(将它们的全文加入本文作为参考)。
通过上面的展开，聚氨基聚酰胺-环氧氯丙烷树脂包括环氧氯丙烷和得自聚亚烷基聚胺和含有约2-约10个碳原子的饱和脂族二元羧酸的聚酰胺的水溶性聚合反应产物。已发现这类树脂赋予无论在酸性、碱性或中性条件下制备的纸的湿强度。而且，这些树脂实质性是纤维素纤维以便它们可以经济地应用，同时这些纤维为用于造纸厂稠度的稀水悬液。
在制备试图用于本文的阳离子树脂时，二元羧酸在例如产生含有如下循环基团的水溶性聚酰胺的条件下首先与聚亚烷基聚胺反应：
-NH(CnH2nNH)x-CORCO-
其中n和x各自是2或更大，R是二元羧酸的二价烃基。然后将这种水溶性聚酰胺与表卤代醇反应形成水溶性阳离子树脂。打算用于制备本发明树脂的二元羧酸是含有2-10个碳原子的饱和脂族二元羧酸如乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、壬二酸等。优选在分子中具有4-8个碳原子的饱和二元酸，例如己二酸和戊二酸。也可以使用两种或多种所述饱和二元羧酸的混合物。也可以将二元羧酸的衍生物，例如酯、半酯和酸酐，用于本发明，例如己二酸二甲酯、己二酸二乙酯、戊二酸二甲酯、戊二酸二乙酯、丁二酸二甲酯和丁二酸二乙酯。也可以使用二元羧酸的两种或多种衍生物的混合物，以及二元羧酸的一种或多种衍生物与二元羧酸的混合物。
可以使用各种聚亚烷基聚胺，包括聚亚乙基聚胺类、聚亚丙基聚胺类、聚亚丁基聚胺类、聚亚戊基聚胺类、聚亚己基聚胺类等及其混合物，其中所述聚亚乙基聚胺类代表一经济优选类。更具体地说，打算使用的聚亚烷基聚胺可以聚胺类为代表，其中氮原子通过式-CnH2n-的基团链在一起，其中n是大于分子量中这些基团的单元和数量的小整数，为2-约8。氮原子可以与基团-CnH2n-中的相邻碳原子或者较远的碳原子相连，但是不与相同碳原子相连。本发明不仅包括使用可以合适纯形式获得的如下聚胺：二乙三胺、三乙四胺、四乙五胺和二丙三胺，而且可以使用混合物和各种粗聚胺物料。例如，通过氨与二氯乙烷反应获得的聚亚乙基聚胺的混合物，仅精炼至除去氯化物、水、过量氨和乙二胺的程度，是一种令人满意的原料。权利要求书中所用的术语“聚亚烷基聚胺”因此是指并包括上面所指的任何聚亚烷基聚胺或这些聚亚烷基聚胺及其衍生物的混合物。适用于本发明的其它聚胺包括：二-六亚甲基三胺(BHMT)、甲基二氨基丙胺(MBAPA)、其它聚亚烷基聚胺(例如精胺、亚精胺)。优选聚胺是二乙三胺、三乙四胺、四乙五胺和二丙三胺。
在某些情况下，增加聚酰胺分子上仲氨基的间隔以便改变聚酰胺-环氧氯丙烷复合物的反应性将是理想的。这可以通过用二胺如乙二胺、丙二胺、己二胺等代替一部分聚亚烷基聚胺来实现。为此，高达约80％的聚亚烷基聚胺可以用等摩尔量的二胺代替。通常，为此目的将替换约50％或更少。
含有至少3个碳原子的适宜氨基羧酸或其内酰胺也适用于增加本发明的间隔。例如，6-氨基己酸和己内酰胺。
聚氨基亚脲基-表卤代醇树脂，特别是聚氨基亚脲基-环氧氯丙烷树脂，也包括在本发明中，例如US4487884和3311594(将其全文加入本文作为参考)中公开的，例如Kymene450型的树脂(可从Hercules Incorporated，Wilmington，Delaware)。打算用于制备和本文中使用的聚氨基亚脲基树脂是通过将环氧氯丙烷与含自由氨基的聚氨基亚脲基反应制备的。这些聚氨基亚脲基是含有叔胺基团和/或叔胺基团与伯和/或仲氨基和/或季铵基团的混合物的水溶性物质。然而，叔氨基团应占存在于聚氨基亚脲基中的碱性氮基团的至少70％。这些聚氨基亚脲基可以通过脲或硫脲与含有至少3个氨基的聚胺反应制得，其中至少1个氨基是叔氨基。如果需要的话，该反应可以在适宜溶剂如二甲苯中进行。
所述聚胺反应物应优选具有至少3个氨基，其中至少一个是叔氨基。所述聚胺反应物也可以具有有限量的仲氨基。这类适用于用作本文上面所述的典型聚胺是甲基二(3-氨基丙基)胺(MBAPA)、甲基二(2-氨基乙基)胺、N-(2-氨基乙基)哌嗪、4，7-二甲基三乙四胺等，它们可以合理纯的形式获得，但是也可以是各种粗聚胺物料的混合物。
为了由二酸和聚亚烷基聚胺制备预聚物，在大气压下将反应混合物优选在约125-200℃的温度下加热优选约0.5-4小时。当使用减压时，可以使用例如75℃-150℃的低温。这种聚缩反应产生水作为副产物，将其通过蒸馏除去。在反应结束时，所得产物以约50％wt总聚合物固体的浓度溶于水中。
当使用二酯代替二酸时，可以在大气压下与较低温度，优选约100-175℃下进行该预聚合反应。这种情况下副产物将是醇，醇的类型取决于二酯的相同性。例如，当使用二甲酯时，醇副产物是甲醇，而乙醇是由二乙酯获得的副产物。当使用减压时，可以使用例如75℃-150℃的较低温度。
在将如上所述形成的聚酰胺转化成阳离子树脂时，在从大于约0℃，更优选约25℃，到约100℃，并且优选约35℃-约70℃的温度下将其与环氧氯丙烷反应，直到20％固体溶液在25℃下的粘度达到Gardner Holdt等级上的约C或更高。为了使该反应缓和，优选该反应在水溶液下进行。尽管不是必须的，但是可以进行pH调整以增加或降低交联速度。
当达到所需粘度时，可以加入足够的水以将树脂溶液的固体含量调整至所需量，即约15wt％左右，可以将产物冷却至约25℃，然后通过加入足够的酸以将其pH降低至低于约6，优选低于约5，最优选低于约4提高胶凝稳定性以稳定地贮藏。可以使用任何适宜的无机或有机酸如盐酸、硫酸、甲磺酸、硝酸、甲酸、磷酸和乙酸来稳定产物。优选不含卤素的酸，例如硫酸。
使用本发明的组合物通过以下将纤维性网起皱：(1)将上述组合物涂敷到网的干表面上或者涂敷到网上；(2)相对其干表面压所述纤维性网以将网与干表面有效粘合；和(3)用起皱设备如刮片将网从干表面移走以使纤维性网起皱。优选在步骤(1)中，将所述组合物涂敷到网的干表面上。优选的纤维性网是纤维素网。
优选将起皱粘合剂以含有约0.1-约10wt％树脂组合物的水溶液涂敷。更优选所述树脂组合物是以约0.25-约5wt％，最优选约0.5-约2wt％的量的溶液。就干重基的起皱剂而言，使用以浆或纸的干重为基础约0.001wt％的最小量。更优选的最小量是约0.005wt％，最优选的最小量是约0.01wt％。树脂组合物的优选最大量是约2wt％。更优选的最大量是约1wt％，最优选的最大量是约0.5wt％。最常用于工业操作的干表面是Yankee干燥器，并且粘合剂的水溶液最经常通过喷雾施加到起皱圆筒或转筒上。或者，然而，可以通过涂敷到纤维性网上，优选通过喷雾加入。当为纤维素网，即纸时，可以在造纸机的湿润结束时通过涂敷到湿润网上加入起皱粘合剂。在一些情况下可以在形成薄片之前将起皱粘合剂加到纸浆上。
其它组分，尤其是改进网与干表面的粘性的试剂，可以与本发明的起皱粘合剂结合使用。
这些试剂，还已知为释放剂或增塑剂，包括水溶性多元醇、二醇、聚乙二醇、糖、低聚糖和烃油。
利用本发明的树脂组合物造纸的方法包括：(a)提供含水纸浆悬液；(b)向所述含水纸浆悬液中加入树脂，和(c)将(b)中生产的含水纸浆悬液压片并干燥以获得纸。
该方法的步骤(a)的含水纸浆悬液是通过本领域公知的方式获得的，例如已知的机械、化学和半化学等制浆方法。通常，在机械粉碎和/或化学打浆步骤之后，将纸浆洗涤以除去残余的打浆化学物质并溶解木材组分。可以将漂白或未漂白的纸浆纤维用于本发明的方法中。循环的纸浆纤维也适用。
在步骤(b)中，优选将本发明的树脂以纸浆干重为基础约0.1wt％的最小量加入到纸浆浆液中。更优选最小量是约0.2wt％。树脂组合物的优选最大量是约5wt％，更优选最大量是约3wt％，最优选最大量是约1.5wt％。树脂组合物通常以水溶性的形式加入。除了树脂之外，也可以加入常用于纸中的其它物质。这些包括例如上浆剂、颜料、明矾、增亮剂、染料和干强度试剂，以本领域公知的量加入。
步骤(c)是按照造纸领域的技术人员公知的步骤进行的。
正如上面所讨论的，具有至少降低的CPD形成量的树脂可以是在没有进一步处理的树脂合成法中生产的树脂。而且，树脂可以在减少和/或除去CPD形成物质之前通过各种方法处理。而且，在减少和/或除去CPD形成物质之后，树脂可以通过各种方法处理。甚至，树脂可以在减少和/或除去CPD形成物质之前通过不同方法处理，并且在减少和/除去CPD形成物质之后树脂也可以通过不同方法处理。例如，树脂可以通过各种方法处理，例如除去低分子量表卤代醇和表卤代醇副产物，例如环氧氯丙烷和环氧氯丙烷副产物，例如树脂溶液中的CPD的方法。在不限制所述处理或可以利用的树脂的情况下，注意可以在用如US5516885和WO 92/22601中公开的碱离子交换柱；如WO 93/21384中公开的碳吸附；如U.S.StatutoryInvention Registration H1613中公开的膜分离，例如超滤、如乙酸乙酯的萃取；或者例如US5972691、WO 96/40967和US5470742、5843763和5871616以及US申请09/629629中公开的生物脱卤作用减少或除去CPD形成物质之前和/或之后处理树脂，例如KymeneSLX2、Kymene617和Kymene557LX(可从Hercules Incorporated，Wilmington，Delaware获得)、和Crepetrol80E或CrepetrolA3025、CrepetrolA6115、CrepetrolA8225、Crepetrol870、SPC 003和Rezosol8289起皱剂。将这些文献各自公开的内容通过全文引用加入本文。而且，可以将上面引证的US专利申请09/592681、09/363224和09/330200中公开的CPD形成物质减少或除去的任何组合与减少和/或除去CPD形成物质的酶处理一起使用。
而且，根据本发明，还注意到，除去或减少CPD形成物质的酶处理可以与生物脱卤作用重叠的方式进行，或者可以与生物脱卤作用同时进行。因此，本发明也涉及一种组合方法，其中开始于酶促释放树脂3-CPD，并且同时进行无氮有机卤化合物的减少。
还应注意的是，处理生物脱卤处理之后的酶促处理之外，还可以将这两种处理同时进行(已知为组合处理)。“同时”意思是第二种处理(或者生物脱卤作用或者酶处理)可以在第一处理(或者生物脱卤作用或者酶处理)结束之前开始。就本发明而言，通过平衡条件：时间、温度、pH、酶浓度、开始粘度和固体含量来获得所需粘度。例如，组合处理可以在pH 6.8-7.8下开始持续头4-24小时并降低至pH5.5-7.0，或者在组合处理的后8-48小时内其pH下降至6.5-7.2。优选的组合处理条件包括，但不限于，pH 6.5-8.0，更优选pH 6.8-7.6；优选的温度范围是20℃-35℃，更优选25℃-33℃。组合处理条件的酶浓度将取决于其活性。例如，当为ALCALASE的情况下，酶可以如下量存在：约1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/1600g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基-1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/1.5g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基，酶也可以如下量存在：约1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/160g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基-1g的ALCALASE 2.5L型DX(原样使用)/4g聚胺-环氧氯丙烷树脂干基。优选组合处理在48小时或更少内结束。最优选组合处理在24小时或更少内结束。就起皱助剂而言，当使用所述组合处理条件时固体含量可以低于约15wt％，典型地4-14.5wt％，优选约8wt％-约14.5wt％。起皱助剂的组合处理也可以在15wt％和之上的固体含量下进行，优选的总固体含量是15-40wt％，优选18-35wt％，甚至更优选18-28wt％。可用于本发明的其它范围是15-30wt％。
当将组合处理条件用于15wt％或更高的湿强度树脂时优选的总固体含量是15-40wt％，优选16-35wt％，甚至更优选18-28wt％。当对低于15wt％的湿强度树脂进行组合处理时优选的范围是约4wt％-约14.5wt％，和约8wt％-约14.5wt％。
而且，本发明能够在高总固体含量下进行生物脱卤作用，以及组合酶处理以除去或减少CPD形成物质，并且在高总固体含量下进行生物脱卤作用，这样可以减少处理循环时间，同时当以批量或者(重复的)加料模式进行该方法时产生最佳的反应器容积用途。
在有或者没有预先无机碱处理的情况下，生物脱卤作用可以各种方式进行，例如US5470742、5843763和5871616以及US申请09/629629中任一公开的，或者如US5972691和WO 96/40967中公开的预先碱处理和生物脱卤作用，其中树脂组合物可以与适量的微生物或酶反应以将表卤代醇水解物处理至低水平。微生物使用脱卤酶将卤离子从表卤代醇和卤代醇中释放，然后使用其它的酶将反应产物最终分解为二氧化碳和水。
尽管不希望受理论的约束，但是注意到，当将CPD形成物质除去或减少时，CPD从树脂的低聚和/或聚合组分中释放，因此CPD是树脂溶液的组分。在这种观念下，树脂优选经过处理以除去或减少CPD形成物质，然后将树脂经过生物脱卤。以这种方式，例如通过生物脱卤作用可以除去表卤代醇和表卤代醇水解物(也称之为水解副产物)，包括释放的CPD。然而，树脂可以最初经过处理，例如通过生物脱卤作用，然后经过处理除去、抑制和/减少CPD形成物质。具体地说，任何通过处理释放的CPD应是易溶性的，并且因此可以是至少部分从树脂中洗掉的。例如，当具有释放的CPD的树脂包含在纸产品中时，CPD可以至少部分地从纸产品中洗掉，并且由于该处理，纸产品中的树脂不将产生CPD或者不将产生不希望量的CPD。而且，正如上面讨论的，酶处理除去或减少CPD形成物质可以与生物脱卤作用重叠/同时的方式进行。
生物催化剂可以活细胞或者固定化、未精制的无细胞提取物或者精制过的脱卤酶的形式提供。术语“生物脱卤作用”是指使用生物催化剂对无氮有机卤化合物脱卤化。
作为能够进行生物脱卤作用的生物催化剂，可以利用任何能够使无氮生物脱卤化合物，优选CPD和DCP脱卤的微生物，而在无氮有机卤化合物的脱卤作用期间使含氮阳离子聚合物基本上保持不受影响。优选，所用微生物是放射性土壤杆菌(HK7)或噬组氨醇节杆菌(HK1)，并且优选利用放射性土壤杆菌(HK7)或噬组氨醇节杆菌(HK1)的双组分混和物。当仅存在CPD时，优选使用单一微生物HK1。当仅存在DCP时，优选使用单一微生物HK7。尽管没有精确鉴定使该方法可操作的酶，但是据信完成该方法的酶属于一类称之为“卤化氢裂合酶类脱卤酶”的酶。
具体地说，许多菌株公开于US5470742、5843763、5871616和5972691以及US申请09/629629中，将其内容通过引用加入本文。这些菌株包括含有使卤代醇和表卤代醇能够脱卤化的脱卤酶的微生物，它们以NCIMB保藏登记号40271、40272、40273、40274、40313和40383保藏。NCIMB代表“National Collection of Industrial andMarine Bacteria”。NCIMB位于23 St.Machar Drive，Aberdeen AB21RY，Scotland，UK，是英国负责证明和保留专利申请提交的细菌样品的一个组织。在专利事务中，NCIMB将向所请求的有关方面提供专利文献中要求保护的细菌的可信性样品。NCIMB 40271(节杆菌属种)、40272(放射性土壤杆菌HK7)、40273(洋葱伯克霍尔德菌，以前称之为洋葱假单胞菌)和40274(噬组氨醇节杆菌HK1)保藏于1990年4月2日。NCIMB 40383(红球菌属种)保藏于1991年3月11日，并且NCIMB 40313(洋葱伯克霍尔德菌，以前称之为洋葱假单胞菌)保藏于1990年8月30日。因此，这些微生物已贮藏在布达佩斯条约规定的保藏处，并且当专利公布之后这些菌株将不能撤销地并且没有限制或条件地提供给公众。
而且，注意的是，优选使用两个细菌菌株，它们从土壤样品分离并联合命名为HKC，即噬组氨醇节杆菌(HK1)(2000年7月10日保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures at Oosterstraat 1，P.O.Box273，3740 AG BAARN，The Netherlands，登记号为CBS 108919)和放射性土壤杆菌(HK7)(2000年7月10日保藏在Centraalbureau voorSchimmelcultures at Oosterstraat 1，P.O.Box 273，3740 AG BAARN，The Netherlands，登记号为CBS 108920)。在专利事务中，Centraalbureau voor Schimmelcultures是遵守布达佩斯条约的保藏处，将向所请求的有关方面提供专利文献中要求保护的细菌样品。因此，这些微生物已贮藏在布达佩斯条约规定的保藏处，并且当专利公布之后这些菌株将不能撤销地并且没有限制或条件地提供给公众。注意，NCIMB 40272和CBS 108920据信是相同的微生物，并且NCIMB 40274和CBS 108919据信是相同的微生物。
这些微生物各自都能够降解1，3-DCP和3-CPD。而且，放射性土壤杆菌(HK7)能够比噬组氨醇节杆菌HK1快地降低1，3-DCP水平，而噬组氨醇节杆菌(HK1)显示优先降解3-CPD。因此，正如US申请09/629629中公开的，假定当两种细菌都存在时获得最好的生物脱卤化性能。为了确保这两种细菌都存在于生物脱卤化方法中，优选用放射性土壤杆菌(HK7)开始该方法，接着加入噬组氨醇节杆菌(HK1)。对开始连续的生物脱卤化方法的情况尤其如此。
在有或者没有最初无机碱处理的情况下，将含有适宜酶的微生物用于树脂组合物中所含的表卤代醇水解物的脱卤化。将酶和微生物保持在适宜浓度下以将所述水解物基本上代谢成氯离子并且最终代谢为二氧化碳和水。因此在生物脱卤化处理之后本发明树脂组合物中的水解物浓度优选低于约100ppm(相对生物反应步骤之后含树脂的水溶液总重量的百万分之重量份)，更优选低于约50ppm(相对生物反应步骤之后含树脂的水溶液总重量的百万分之重量份)，更优选低于约10ppm(相对生物反应步骤之后含树脂的水溶液总重量的百万分之重量份)，更优选低于约5ppm(相对生物反应步骤之后含树脂的水溶液总重量的百万分之重量份)，甚至更优选低于约1ppm(相对生物反应步骤之后含树脂的水溶液总重量的百万分之重量份)。
为此，微生物的浓度应是至少约5×107个细胞/ml，优选至少约108个细胞/ml，最优选至少约109个细胞/ml。为了保持反应器中细胞的最佳活性含量，反应最好在搅拌罐反应器中于约30℃+/-5℃在有氧(例如约5-约100％DOT)和营养素的情况下进行。正如本文所用的，术语“DOT”是指“溶解的氧张力”并且是在相同温度和压力下相对氧饱和的水的给定体积的水中溶解的氧的量，以百分比表示。在一连续方法中，通过流速控制停留时间并加以监控以确保完全反应。因此，在稳定状态下反应器中表卤代醇水解物的浓度将是从约1到约1000ppm。在批量或加料模式下，可以优选将它们重复，通过监控，例如通过GC分析可以确保完全反应，从而获得所需减少量的表卤代醇水解物。
本发明的生物脱卤方法是通过将微生物或无细胞的含酶提取物与含有不想要的有机卤污染物的含水组合物接触进行的。这种接触典型地是通过在含水组合物中形成微生物或无细胞的提取物的浆液或悬液在充分搅拌下实现的。
如果需要的话，微生物或酶可以通过过滤、沉淀、离心或其它本领域技术人员已知的方式从产物流中除去。或者微生物或酶可以留在最终产物中并任选通过热杀菌(例如通过在140℃下处理20秒钟)或者通过加入适宜浓度的适宜杀生物剂使其失活。适宜的杀生物剂可以通过本领域普通技术人员容易地选择。因此，微生物的失活可以通过将含水混合物的pH降低至2.8，然后加入足量(以含水组合物的重量为基础通常为0.02％-0.1％)的专有杀生物剂(例如，ProxellBD杀生物剂，包括1，2-苯并异噻唑啉-3-酮)。可以将杀生物剂与山梨酸钾一起加入。
微生物的除去可以通过过滤、离心、沉淀或从混合物中除去微生物的任何其它已知技术中的一种或多种步骤进行。微生物矿化无氮有机卤化合物，产生CO2、水和生物质，在树脂中不留下甘油。当生物催化剂是固定化脱卤酶时，反应产物是缩水甘油，它可以用固定化裂合酶为甘油。
与从混合物中除去微生物有关的问题是强度分离法，例如微过滤，不仅除去微生物而且除去了阳离子聚合物颗粒，结果降低了湿强度性能，这不是所希望的。因此，优选留下混合物中的失活微生物以避免降低湿强度性能的问题。
出人意料地已测定，当树脂含有叔胺基树脂，例如Kymene450、CrepetrolA3025或Crepetrol80E时，具有高浓度固体，即大于15wt％，更优选大于20wt％，优选大于25wt％的树脂组合物可以使用微生物和/或酶经过生物脱卤。在过去，仲胺基树脂，例如Kymene557H、Kymene557LX、KymeneSLX、KymenePlus在固体浓度为15或更大wt％下不能有效生物脱卤。在本发明中，仲胺基树脂可以在15或更大wt％下有效地生物脱卤。此外，已发现Daniels树脂可以在15或更大wt％下生物脱卤。
就Daniel′s树脂而言，应指出的是得自表卤代醇如环氧氯丙烷与聚亚烷基聚胺如乙二胺(EDA)、二-六亚甲基三胺(BHMT)和六亚甲基二胺(HMDA)的反应的阳离子水溶性树脂早已被知道了。这些聚亚烷基聚胺-表卤代醇树脂描述在例如J.M.Baggett等的US3655506的专利，和其它如Daniel等的US3248353和US2595935，由此一般将其描述为“Daniel′s树脂”。将这些专利的公开内容通过引用加入本文。
本发明所用的聚亚烷基聚胺可以优选选自下式的聚亚烷基聚胺：
H2N-[CH2-CHZ-(CH2)n-NR-]x-H
其中：n＝1-7，x＝1-6，R＝H或者CH2Y，Z＝H或CH3，和Y＝CH2Z、H、NH2或CH3
下式的聚亚烷基聚胺：
H2N-[(CHZ)m-(CH2)n-NR-]x-H
其中：m＝1-6，n＝1-6，并且m+n＝2-7，R＝H或者CH2Y，Z＝H或CH3，和Y＝CH2Z、H、NH2或CH3，及其混合物。
聚亚烷基聚胺-表卤代醇树脂含有表卤代醇和聚亚烷基聚胺的水溶性聚合反应产物。在制备Daniel′s树脂时将聚亚烷基聚胺加入到表卤代醇的含水混合物中以便在加入期间混合物的温度不超过60℃。较低的温度使得进一步提高，尽管太低的温度在该系统中危险地积聚潜在的反应性。优选的温度为约25℃-约60℃。更优选是约30℃-约45℃。
根据表卤代醇和聚胺的相对量，聚胺的烷基化将快速进行以形成仲胺和叔胺。表卤代醇和聚胺的量使得约50％-100％的可获得的胺氮位置烷基化为叔胺。优选量是胺氮位置约50％-约80％烷基化。超过将所有胺位置完全烷基化为叔胺所需的过量表卤代醇不是优选的，这是由于这使得表卤代醇副产物的产生增加。
在聚胺完全加入之后，使混合物的温度升高和/或将混合物加热进行交联并形成吖丁啶鎓盐。交联速度是浓度、温度、搅拌和聚胺的加入条件的函数，所有这些可以通过本领域技术人员容易地测定。交联速度可以在交联温度下或其附近通过加入小粒聚胺或本发明的其它聚胺或者加入各种碱来加速。
通过加入酸、用水稀释、或者二者组合可以将树脂稳定化以抗进一步交联胶凝。通常适宜地酸化至pH 5.0。
优选的聚胺是双六亚甲基三胺、六亚甲基二胺及其混合物。
尽管不希望受理论的约束，但是应指出的是，树脂例如Kymene在高固体浓度下由于粘度增加并且树脂胶凝导致细菌生长降低，并因交联失去产品功能性(＝失去官能团)，因此这些树脂具有困难并且在高固体浓度，例如大于15％总固体下不容易生物脱卤。通过控制条件，包括pH、时间、温度、微生物或酶的浓度，可以在可以获得较高的总固体下对Daniels树脂和叔胺基树脂实现生物脱卤。Daniels树脂，例如Kymene736的优选条件是总固体含量是15-40wt％，优选18-30wt％，甚至更优选18-22wt％。叔胺基树脂的优选条件是总固体含量是15-40wt％，优选18-35wt％，甚至更优选18-28wt％。Daniels树脂和叔胺基树脂二者的优选pH范围是pH 5.0-8.0，更优选pH 5.5-7.5。Daniels树脂和叔胺基树脂二者的优选温度范围是20-40℃，更优选25-35℃。优选生物脱卤步骤从接种开始在48小时或更少时间内结束。更优选生物脱卤步骤从接种开始在24小时或更少时间内结束。
未预料到的是，由于微生物缺少水、较高固体含量的高渗透压、和不确定的问题，例如低分子量物质的浓度，因此可以在高固体浓度下进行生物脱卤。而且，应预料到可能需要预处理以除去较高残余物，例如通过稀释或过滤。而且，未预料到的是，可以在合理的时间内，例如48小时内实现生物脱卤。而且，应预料到高固体浓度下的贮藏不稳定性；然而，本发明的树脂组合物贮藏稳定，并且不易胶凝。对高固体而言，无论树脂组合物是否经过处理除去或减少CPD形成物质，都获得本发明的优点。
而且，在本发明中，高固体、湿强度树脂可以经过生物脱卤。此外，可以与生物脱卤处理同时进行酶处理。尽管在没有封端下以预聚物为基础的树脂，例如Kymene E7219可以经过生物脱卤或者生物脱卤期间的酶处理，但是优选这些湿强度树脂是WO 99/09252和US6222006(将其内容通过引用加入本文)中所述的封端树脂。尽管不希望受理论的约束，应指出的是封端剂优选不是生物脱卤的抑制剂。例如，生产封端预聚物的残余己酸抑制微生物生物脱卤，而残余的乙酸不抑制微生物生物脱卤。湿强度树脂的优选固体含量是15-40wt％，优选16-35wt％，甚至更优选18-28wt％。可用于本发明的其它范围是15-30wt％。
为了更清楚地描述本发明，提供了以下非限制性实施例用于陈述，而不解释为限制本发明范围。实施例中的所有份和百分比都是以重量计，除非另有说明。而且，实施例中的ND是指“未检出”。
实施例
除非另有说明，Brookfield粘度是用Brookfield LVDV-II+可编程粘度计于25℃下测定的。所用步骤以Operating Instructions，ManualNo.M/97-164为基础。仅仅如果将正确的轴和rpm用于样品的粘度时该粘度计将测定粘度。除非另有说明，所有CPD和DCP测量是以湿基为基准的。
实施例1高固体聚氨基聚酰胺树脂的合成
一 3-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、加料漏斗和机械搅拌器。向该锅中加入775.0g的49.6wt％的含水聚(己二酸-共-二乙三胺)(可从Hercules Incorporated获得)和505.3g的水。将溶液加热至25℃，然后在约2分钟内加入162.5g的环氧氯丙烷(Aldrich，99％)。使温度增加至40℃并保持在该温度下。加入环氧氯丙烷2.45小时之后，加入1046.5g水并将反应混合物加热。反应混合物达到50℃(20分钟)之后，加入7.54g的96％硫酸。将温度升高至70℃并检测其在25℃下的Gardner-Holdt粘度。当其Gardner-Holdt粘度达到G之后，加入187.5g含有12.90g的96％硫酸的水将反应骤冷。使反应混合物冷却至25℃。加入3.00g的96％硫酸将其pH调整至pH3.5。该树脂具有21.08％总固体和153cps的Brookfield粘度。
实施例2酶处理聚氨基聚酰胺-epi树脂(实施例1)
一 250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入200.0g的实施例1。用4.88g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.58。取出一 5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。然后加入5.18g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)。在15分钟内将其温度从21℃升高至30℃并检测25℃下的Gardner-Holdt粘度。取出5g反应混合物等分试样并在加入ALCALASE之后的1、2、4、6和8小时用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。在2小时用0.27g的30％氢氧化钠水溶液并在4小时用0.18g的30％氢氧化钠水溶液将其pH调整至pH7.5。8小时之后，通过加入2.22g的96％硫酸将其pH降低至3.4。树脂具有95cps的Brookfield粘度(25℃下)。
实施例3：实施例2的生物脱卤作用
一 250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入100.0g的实施例2和55.56g的水。用2.24g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.9，然后加入17.28g含有得自生物脱卤化聚氨基聚酰胺-环氧氯丙烷树脂的接种物的微生物的混合物。这表示细胞浓度为约105-约106个细胞/ml的开始值。该开始值相当于随着该方法进行的约109个细胞/ml的最终处理水平。将该接种物与1.36g营养液一起加入。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)所用微生物是：噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)。开始喷射空气，其温度保持在30℃，并通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将其pH保持在5.8。48小时之后，将混合物冷却至室温并用0.97g的96％硫酸将其pH调整至pH3.0并加入2.05g的杀生物剂溶液。[所述杀生物剂溶液由10％活性ProxelBD(得自Zeneca Biocides)和1.67％山梨酸钾的去离子水组成。]树脂具有14.5wt％的总固体并具有62cps的Brookfield粘度(25℃下)。
酸试验
使用以下酸试验评价其中产生CPD的物质的量。将一部分待测定的树脂倒入含有磁性搅拌器的瓶中。用96％硫酸将其pH调整至pH 1.0。将该瓶盖住并放入50℃水浴中在搅拌下保持在50℃。定期地从瓶中取出等分试样并进行GC分析。将24小时之后产生的CPD用于评价产生CPD的物质的量。结果参见表1。
表1树脂信息 温度 (℃) 时间 (小时) Gardner- Holdt粘度 Epi (ppm) 1，3-DCP (ppm) 2，3-DCP (ppm) 3-CPD (ppm)实施例2a 21 0 N 15 1746 1.3 276实施例2b 30 1 F-G 20 2004 1.6 478实施例2c 30 2 E-F 22 1720 1.7 508实施例2d 30 4 D-E 24 1802 1.4 680实施例2e 30 6 D-E 26 1753 1.5 664实施例2f 30 8 E-F ---- ---- ---- ----实施例3 ---- ---- ---- 0.1 ND 0.8 ND酸试验 50 24 ---- ND ND 0.10 0.66
比较例4：酶处理聚氨基聚酰胺-epi树脂
酶处理：将一部分实施例1稀释到13.5％总固体。一 1-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入900.0g的13.5％实施例1。用13.85g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.54。取出一5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。然后加入15.0g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)。在15分钟内将其温度从22℃升高至35℃，并检测25℃下的Gardner-Holdt粘度。取出5g反应混合物等分试样并在加入ALCALASE之后的1、2、4、6和8小时用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。在2小时用0.80g的30％氢氧化钠水溶液、在4小时用0.48g的30％氢氧化钠水溶液和在6小时用0.78g的30％氢氧化钠水溶液将其pH调整至pH7.5。在6小时，将温度升高至38℃。8小时之后，通过加入6.54g的96％硫酸将其pH降低至3.5。树脂具有32cps的Brookfield粘度(25℃下)。
生物脱卤：一1-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入700.0g上面生产的树脂。用8.21g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.9，然后加入77.8g含有得自生物脱卤化聚氨基聚酰胺-环氧氯丙烷树脂的接种物的微生物的混合物。这表示细胞浓度为约105-约106个细胞/ml的开始值。该开始值相当于随着该方法进行的约109个细胞/ml的最终处理水平。将该接种物与6.12g营养液一起加入。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)所用微生物是：噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)。开始喷射空气，其温度保持在30℃，并通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将其pH保持在5.8。48小时之后，将混合物冷却至室温并用4.02g的96％硫酸将其pH调整至pH3.0并加入8.42g的杀生物剂溶液。[所述杀生物剂溶液由10％活性ProxelBD(得自Zeneca Biocides)和1.67％山梨酸钾的去离子水组成。]树脂具有14.77wt％的总固体并具有61cps的Brookfield粘度(25℃下)。
实施例5：实施例3和比较例4的手抄纸评价
在Noble and Wood手抄纸机上于pH 7.5下用精制至500mL加拿大标准打浆度的50∶50的Rayonier漂白牛皮纸：Crown Vantage漂白硬木牛皮纸干湿浆板制备手抄纸。产生含有0.5-1.0％处理过的树脂(以未处理过的树脂的固体为基础)的具有40lb/3000sq.ft.的手抄纸。将手抄纸湿压至33％固体并在圆筒干燥器上于230℃下干燥55秒钟得到3-5％水分。按照TAPPI法T-402将纸调理并测定。使用TAPPI法T-494测定干拉伸强度。使用TAPPI法T-456在浸泡2小时下测定湿拉伸强度。通过以下步骤测定纸产品的CPD：
纸产品中CPD的步骤
冷水提取纸
将样品切割并用水于23℃(±2℃)下提取24小时，偶尔混合。提取时间之后，如果需要的话将提取物过滤。
注：确保所有纸浸泡在水中。
步骤
1、戴上保护手套，将样品切割成小片(约1cm×1cm)，并收集在塑料袋中。将这些片充分混合。
2、称重10g样品，最接近0.0001g，并放入锥形烧瓶中。
3、加入200mL试剂级水并塞住烧瓶。
4、将烧瓶放入水浴中于23℃(±2℃)下持续24小时。
5、将溶液倾析到一 250mL容量瓶中。如果需要的话，使用带过滤器烧瓶的多孔玻璃过滤器漏斗将制品过滤。用其它试剂级水将这些片冲洗2次并填充至刻度。
设备
1、锥形烧瓶，宽颈，磨口玻璃塞
2、容量瓶，250mL
3、多孔玻璃过滤器漏斗(可从Lab Glass以cat#1G-7080-170获得)，具有过滤器烧瓶，500mL
4、水浴，保持23℃(±2℃)的恒定温度。
5、纸切割器或剪刀
6、分析天平，能够称重至最接近0.0001g。
试剂
1、水，可从Burdick & Jackson以cat.#365-4获得
ECD法-醚洗脱和衍生
通过液-液萃取柱将分析物从含水提取物中分离出。将DCP和3-CPD用七氟丁酰基咪唑(HFBI)衍生并使用微电子捕获检测器(μ-ECD)通过气相色谱进行分析。
步骤
1、将20mL萃取过的水溶液吸移到一 35-mL小瓶中。
2、向小瓶中加入2.34g NaCl并充分摇动直到NaCl溶解。
3、将该溶液倒在一extrelut柱上并静置15分钟。
4、等待之后，用250mL洗脱液(95％二乙醚/异辛烷)洗脱。(将洗脱液收集在容量瓶中)
5、将该洗脱液倒入一500mL圆底烧瓶中
6、使用旋转蒸发器除去溶剂(注：真空不超过200mm Hg)，直到剩余约15mL。
7、向剩余异辛烷中吸移1mL内标准溶液。
8、也必须进行按照步骤2-7制备的试剂级水的方法空白以检测干扰。
衍生
1、使用注射器或微量移液管将200μL的HFBI加入到烧瓶中。塞住烧瓶并将溶液旋转至充分混合。
2、让烧瓶在室温下静置15分钟。
3、将溶液定量转移到一25mL混合量筒中并用异辛烷填充至刻度。
4、向容量瓶中加入约1.5mL试剂级水，塞住并摇动充分混合。形成沉淀物，但是当与水充分混合时沉淀消失。
5、相分离之后，取出约20mL的有机相并放入一30mL含有2mL试剂级水的玻璃小瓶中。剧烈摇动1分钟。
6、相分离之后，取出水层并倒掉。使用微电子捕获检测器(ECD)通过气相色谱分析该有机相。
试剂
1、二乙醚，可从FLUKA，P.O.Box 355，Milwaukee，WI以Cat.No.31690获得。
**必须使用分析纯质量；该醚可以既不经过干燥也不用乙醇稳定。
1、水，可从Burdick & Jackson以cat.#365-4获得
2、氯化钠
3、1，3-DCP；可从TCI Americas以Cat.No.D0402获得。
4、3-CPD；可从Aldrich以Cat.No.10227-1获得。
5、乙腈，纳米级，可从Fisher以Cat.No.2442获得。
6、异辛烷，EM Science以Cat.No.TX1389
7、洗脱剂：95mL二乙醚/5mL异辛烷。
8、七氟丁酰基咪唑(HFBI)，可从Pierce以Cat.No.44211获得
9、3-甲氧基-1，2-丙二醇(内标准)
10、固相提取柱，Supelco，Supelco Park，Bellefonte，PA 16823-0048，根据Section XXXCat.No.57022制备。
11、Varian Hydromatrix；可从Varian，Inc.以Cat.No.00198003获得。
设备
1、气相色谱，Hewlett Packard 5890型，或等价物，能够进行线性柱温编程，并且配备有微电子捕获检测器(μ-ECD)。
2、数据处理系统，Hewlett Packard ChemStation或等价物。
3、色谱柱，DB-5MS，60m×0.25mm I.D.-可从J&W ScientificInc.，91 Blur Ravin Road，Folsom，CA 95630以Cat.No.122-5562获得。
4、烧瓶，容量、玻璃塞，5mL、10mL、25mL、50mL、100mL、250mL。
5、小瓶，具有特氟纶衬的螺帽的玻璃，17mL、30mL、4oz。
6、移液管，转移0.5、1、2、3、5、10、20mL A类。
7、药物塞，玻璃-Fisher，Cat.No.13-701
8、分析天平，能够称重至最接近0.0001g。
9、固相提取柱，Supelco，Supelco Park，Bellefonte，PA 16823-0048，根据Section XXX制备。Cat.No.57022。
10、玻璃棉
11、500mL圆底烧瓶，带塞，可从Lab Glass以Cat.No.013和Cat.No.114获得。
12、旋转真空蒸发器，在35-40℃/800mbar下操作
13、500μL注射器或一次性微量移液管
14、A型混合量筒，25mL；可从Fisher以Cat.No.08-563-1F获得。
内标准溶液(低水平)
1、称重50mg的3-甲氧基-1，2-丙二醇到一50-mL容量瓶中并将其重量记录至最接近0.0001g。
2、用乙腈稀释至刻度。
3、将步骤2中的0.25mL溶液吸移到一100-mL容量瓶中并用二乙醚稀释至容积。
4、将步骤3中的10.0mL溶液吸移到一100mL容量瓶中并用二乙醚稀释至容积。
1，3-DCP、3-CPD校准溶液(低水平)
1、称重50mg的1，3-二氯-2-丙醇到一50-mL容量瓶中并将其重量记录至最接近0.0001g。
2、用乙腈稀释至刻度。
3、将步骤2中的0.5mL溶液吸移到一10-mL容量瓶中并用二乙醚稀释至容积。
4、称重50mg的3-氯-1，2-丙二醇到一50-mL容量瓶中并将其重量记录至最接近0.0001g。
5、用乙腈稀释至刻度。
6、将步骤5中的0.5mL溶液吸移到一10-mL容量瓶中并用二乙醚稀释至容积。
7、将步骤3和步骤6中的溶液混合到一30-mL小瓶中并充分混合
8、将步骤7中的2.5mL溶液吸移到一100mL容量瓶中并用二乙醚稀释至容积。
9、将步骤8中的10.0mL溶液吸移到一100-mL容量瓶中并用二乙醚稀释至容积。这是校准原液。
校准曲线(低水平)：
1、将0.1mL校准原液吸移到一25-mL含有1.0mL内标准溶液的容量瓶中。使用移液管，向烧瓶中加入5.9mL二乙醚。这是校准水平#1。
2、将0.2mL校准原液吸移到一25-mL含有1.0mL内标准溶液的容量瓶中。使用移液管，向烧瓶中加入5.8mL二乙醚。这是校准水平#2。
3、将0.5mL校准原液吸移到一25-mL含有1.0mL内标准溶液的容量瓶中。使用移液管，向烧瓶中加入5.5mL二乙醚。这是校准水平#3。
4、将1.0mL校准原液吸移到一25-mL含有1.0mL内标准溶液的容量瓶中。使用移液管，向烧瓶中加入5.0mL二乙醚。这是校准水平#4。
5、将2.0mL校准原液吸移到一25-mL含有1.0mL内标准溶液的容量瓶中。使用移液管，向烧瓶中加入4.0mL二乙醚。这是校准水平#5。
6、向步骤1-6中的每一容量瓶中加入15mL异辛烷。
7、使用注射器，向步骤7的每一容量瓶中加入200μL HFBI，然后塞住并在室温下静置15分钟，偶尔摇动一下。
8、用异辛烷将每一烧瓶稀释至最终25mL的体积。
9、向每一容量瓶中加入约1.5mL试剂级水，塞住并摇动至充分混合。将形成沉淀，但是当与水充分混合时沉淀将消失。
10、相分离之后，向每个含有2mL试剂级水的30-mL玻璃小瓶中转移约20mL所述有机相。剧烈摇动1分钟。
11、相分离之后，除去水层并扔掉。使用微电子捕获检测器(μ-ECD)通过气相色谱分析该有机相以确定校准曲线。
GC操作条件
温度
柱
最初 50℃
最初保持时间 2分钟
最初速度 1.5℃/分钟
第2温度 100℃
第2保持时间 5分钟
第2速度 25℃/分钟
最终 300℃
最终保持时间 10分钟
入口 250℃
检测器温度320℃
流速
氦(载气) 1.5mL/min在20psi下(于35℃下柱压头)
氩/甲烷 60mL/min
SECTION XXX
制备EXTRELUT QE柱
1、使用固相萃取贮存器，将约0.5g玻璃棉压到底部。
2、称重18g Varian Hydromatrix并倒入贮存器中。使用玻璃探针，将extrelut紧紧包住。
3、将约0.5g玻璃棉放在贮存器上面。
结果报道于表2。数据显示，在21％固体下的酶处理结果与13.5％固体下处理的结果基本上相同。这些结果使得酶处理更经济。
表2：天然老化纸结果
天然老化纸 标准化基重 实施例 ％加入 的树脂 干拉伸强 度(lbs/in) 湿拉伸强 度(lbs/in) ％ 湿/干 比较例XX 的％ 纸中的 CPD(ppb) 空白 ---- 17.55 0.53 3 ---- ＜3 比较例4a 0.25 24.47 3.89 16 ---- ＜3 比较例4b 0.50 24.61 4.86 20 ---- ＜3 比较例4c 1.00 24.65 5.70 23 ---- 10 实施例3a 0.25 22.58 3.60 16 93 ＜3 实施例3b 0.50 23.88 4.63 19 95 ＜3 实施例3c 1.00 24.72 5.38 22 94 7
实施例6-17：酶处理聚氨基聚酰胺-epi树脂的一般步骤
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入400.0g的KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得；21.51％固体，25℃下Brookfield粘度为267cps)。用30％氢氧化钠水溶液将其pH升高。取出一 5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。加入(量如表3中所示)ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)。在15分钟内将其温度升高至所需处理温度并检测25℃下的Gardner-Holdt粘度。取出5g反应混合物等分试样并在加入ALCALASE之后的1、2、4、6和8小时用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。每小时检查其pH，并且如果其pH位移超过0.10就用30％氢氧化钠水溶液加以调整。8小时之后，通过加入96％硫酸将其pH降低至3.5。如果Gardner-Holdt粘度读数在两个字母之间，那么将两个字母都记录在表中。如果粘度增加超过所需，则停止用30％氢氧化钠水溶液调整其pH。如果其粘度增加至危险胶凝的点，则加入96％硫酸将其pH降低至3.5。BV(cps)是最终树脂的Brookfield粘度(在25℃下测定)。将ALCALASE：活性固体比定义为与树脂中活性固体的量比较的ALCALASE 2.5L型DX的量(原样使用)。具体参见表3。
实施例18-19：酶处理聚氨基聚酰胺-epi树脂的一般步骤
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入200.0g的实施例1。用30％氢氧化钠水溶液将其pH升高。取出一4g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。加入(量如表3中所示)ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)。在15分钟内将其温度升高至所需处理温度并检测25℃下的Gardner-Holdt粘度。取出4g反应混合物等分试样，并在加入ALCALASE之后的1、2、4、6和8小时，如果无胶凝，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。每小时检查其pH，并且如果其pH位移超过0.10就用30％氢氧化钠水溶液加以调整。8小时之后，通过加入96％硫酸将其pH降低至3.5。如果Gardner-Holdt粘度读数在两个字母之间，那么将两个字母都记录在表3中。如果粘度增加超过所需，则停止用30％氢氧化钠水溶液调整其pH。用这两个反应，使其粘度增加至胶凝点。BV(cps)是最终树脂的Brookfield粘度(在25℃下测定)。将ALCALASE：活性固体比定义为与树脂中活性固体的量比较的ALCALASE 2.5L型DX的量(原样使用)。具体参见表3。
表3 树脂实施例 ALCALASE： 活性固体 pH 温度 (℃) 时间 (小时) Gardner-Holdt 粘度 BV (cps) 实施例6a 1.0:8.3 7.2 21 0 I-J 实施例6b 1.0:8.3 7.2 30 1 E-F 实施例6c 1.0:8.3 7.2 30 2 D-E 实施例6d 1.0:8.3 7.2 30 4 D 实施例6e 1.0:8.3 7.2 30 6 D 实施例6f 1.0:8.3 7.2 30 8 D 84 实施例7a 1.0:8.3 7.8 21 0 I-J 实施例7b 1.0:8.3 7.8 30 1 E-F 实施例7c 1.0:8.3 7.8 30 2 E-F 实施例7d 1.0:8.3 7.8 30 4 E-F 实施例7e 1.0:8.3 7.8 30 6 F-G 实施例7f 1.0:8.3 7.8 30 8 H-I 255 实施例8a 1.0:16.6 7.2 22 0 I-J 实施例8b 1.0:16.6 7.2 25 1 G-H 实施例8c 1.0:16.6 7.2 25 2 G 实施例8d 1.0:16.6 7.2 25 4 F 实施例8e 1.0:16.6 7.2 25 6 E-F 实施例8f 1.0:16.6 7.2 25 8 E-F 105 实施例9a 1.0:16.6 7.8 22 0 I-J 实施例9b 1.0:16.6 7.8 25 1 G-H 实施例9c 1.0:16.6 7.8 25 2 G-H 实施例9d 1.0:16.6 7.8 25 4 I 实施例9e 1.0:16.6 7.8 25 6 J-K 实施例9f 1.0:16.6 7.8 25 7 L-M 379 实施例10a 1.0:11.1 7.2 23 0 I-J 实施例10b 1.0:11.1 7.2 25 1 F-G 实施例10c 1.0:11.1 7.2 25 2 F 实施例10d 1.0:11.1 7.2 25 4 E 实施例10e 1.0:11.1 7.2 25 6 D-E 实施例10f 1.0:11.1 7.2 25 8 D 77 实施例11a 1.0:11.1 7.8 23 0 I-J 实施例11b 1.0:11.1 7.8 25 1 F-G 实施例11c 1.0:11.1 7.8 25 2 F 实施例11d 1.0:11.1 7.8 25 4 E-F 实施例11e 1.0:11.1 7.8 25 6 F 实施例11f 1.0:11.1 7.8 25 8 F 149 实施例12a 1.0:8.3 7.2 22 0 H-I 实施例12b 1.0:8.3 7.2 25 1 F-G 实施例12c 1.0:8.3 7.2 25 2 E-F 实施例12d 1.0:8.3 7.2 25 4 D-E 实施例12e 1.0:8.3 7.2 25 6 C 实施例12f 1.0:8.3 7.2 25 8 B-C 60 实施例13a 1.0:8.3 7.8 22 0 H-I 实施例13b 1.0:8.3 7.8 25 1 F-G 实施例13c 1.0:8.3 7.8 25 2 E-F 实施例13d 1.0:8.3 7.8 25 4 D-E 实施例13e 1.0:8.3 7.8 25 6 C 实施例13f 1.0:8.3 7.8 25 8 C-D 85 实施例14a 1.0:8.3 7.2 22 0 H-I 实施例14b 1.0:8.3 7.2 35 1 F-G 实施例14c 1.0:8.3 7.2 35 2 E-F 实施例14d 1.0:8.3 7.0 35 4 F 实施例14e 1.0:8.3 6.9 35 6 F-G 实施例14f 1.0:8.3 6.8 35 8 G-H 175 实施例15a 1.0:8.3 7.5 22 0 H-I 实施例15b 1.0:8.3 7.5 35 1 F-G 实施例15c 1.0:8.3 7.5 35 2 F 实施例15d 1.0:8.3 7.3 35 4 J-K 实施例15e 1.0:8.3 7.3 35 4.5 N 434 实施例16a 1.0:16.6 7.5 22 0 H-I 实施例16b 1.0:16.6 7.5 25 1 G 实施例16c 1.0:16.6 7.5 25 2 G 实施例16d 1.0:16.6 7.5 25 4 F-G 实施例16e 1.0:16.6 7.5 25 6 E-F 实施例16f 1.0:16.6 7.5 25 8 E-F 138 实施例17a 1.0:11.1 7.5 22 0 H-I 实施例17b 1.0:11.1 7.5 25 1 F-G 实施例17c 1.0:11.1 7.5 25 2 E-F 实施例17d 1.0:11.1 7.5 25 4 D-E 实施例17e 1.0:11.1 7.5 25 6 D 实施例17f 1.0:11.1 7.5 25 8 D 80 实施例18a 1.0:16.3 7.5 22 0 H 实施例18b 1.0:16.3 7.5 33 1 I 实施例18c 1.0:16.3 7.5 33 2 K 实施例18d 1.0:16.3 7.5 33 3 V 实施例18e 1.0:16.3 7.5 33 4 W-X 实施例19a 1.0:8.1 7.5 22 0 H 实施例19b 1.0:8.1 7.5 33 1 F 实施例19c 1.0:8.1 7.5 33 2 E-F 实施例19d 1.0:8.1 7.5 33 4 F 实施例19e 1.0:8.1 7.5 33 6 H 实施例19f 1.0:8.1 7.5 33 7 L 实施例19g 1.0:8.1 7.5 33 8 Gel
实施例20聚氨基聚酰胺-epi树脂的
组合的酶处理和生物脱卤作用
按比例放大1(制备发酵剂)
将一部分KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得；21.51％固体，25℃下Brookfield粘度为267cps)稀释至13.5％总固体。一400-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入400g的所述13.5％ KymeneE7219。用7.42g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.54。取出一5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。然后加入3.33g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)，然后加入44.4g含有得自生物脱卤化聚氨基聚酰胺-环氧氯丙烷树脂的接种物的微生物的混合物。这表示细胞浓度为约105-约106个细胞/ml的开始值。该开始值相当于随着该方法进行的约109个细胞/ml的最终处理水平。将该接种物与3.50g营养液一起加入。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)所用微生物是：噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)。开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过Gardner-Holdt粘度监控该处理，并通过光密度(OD600)监控细菌生长。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。定期取出5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。在头30小时内通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将处理的pH保持在7.1-7.5。30小时之后，通过加入96％硫酸将其pH降低至5.8。48小时之后，将所得混合物用作下面按比例放大2的接种物。
按比例放大2
将一部分KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得；21.51％固体，25℃下Brookfield粘度为267cps)稀释至13.5％总固体。一2-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入1600g的所述13.5％ KymeneE7219。用30.38g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.52。取出一 5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。然后加入13.32g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)，然后与14.0g营养液一起加入177.8g得自上面按比例放大1的接种物。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过Gardner-Holdt粘度监控该处理，并通过光密度(OD600)监控细菌生长。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(SpectronicInstruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。定期取出5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。在头8.5小时内通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将处理的pH保持在7.2-7.5。在剩余的处理时间内，通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将其pH保持在pH 6.8-7.2。48小时之后，将混合物冷却至室温，并用12.80g的96％硫酸将其pH调整至pH2.8，并加入19.26g的杀生物剂溶液。[所述杀生物剂溶液由10％活性Proxel BD(得自Zeneca Biocides)和1.67％山梨酸钾的去离子水组成。]检测处理的结果参见表4。
表4 等分试样 时间 pH (30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) DCP (ppm) CPD (ppm) -1 ″0″ 7.49(21℃) D/E 0.058 679 204 -78A 0 时间″0″是正好在加入NaOH之后， 时间0是之后在加入Alcalase之后。 ---- 0.25 7.43 ---- ---- ---- ---- -2 1 7.39 B/C ---- 589 242 -3 2 7.32 B/C 0.062 585 268 -4 4 7.32 B/C 0.067 586 309 -5 6 7.25 B 0.064 584 322 ---- 7 7.20-7.52 ---- ---- ---- ---- -6 8 7.50 B 0.061 554 331 -7 10 7.40 B 0.064 540 363 -8 14 7.26-7.45 B 0.064 519 399 -9 24 7.20 D 0.109 476 384 ---- 28 7.09 E/F 0.165 ---- ---- -10 30 7.05-5.79 G/H 0.201 422 296 ---- 32 5.83 H 0.260 ---- ---- ---- 34 5.84 ---- 0.300 ---- ---- -11 37 5.81 H/I 0.328 360 317 -12 48 5.60 I/J 0.473 ND 198 等分试样 时间 pH (30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) DCP (ppm) CPD (ppm) -1 ″0″ 7.48(26℃) D/E 0.071 745 256 -82A&- 84B 0 时间″0″是正好在加入NaOH之后， 时间0是之后在加入Alcalase之后。 ---- 0.25 7.46 ---- ---- -2 1 7.39 C/D ---- 639 394 -3 2 7.32 C/D 0.086 614 427 -4 4 7.20-7.40 C 0.108 579 531 -5 6 7.31 C 0.138 537 540 -6 8.5 7.16 B/C 0.198 391 629 -7 12.5 7.02 B/C 0.271 66 796 -8 22 6.81 D 0.481 ND 144 ---- 24 6.78-7.12 ---- ---- ---- 树脂是浅淡褐黄色。 ---- 28 7.02 D/E 0.560 -9 30 6.99 D/E 0.578 0.3 7.8 -10 48 6.95 D/E 0.611 0.3 0.5 酸试验 ---- ---- ---- ---- ND 1.1
实施例21：
聚氨基聚酰胺-epi树脂的组合的酶处理和生物脱卤作用
(使用2倍于实施例20中的Alcalase)
按比例放大1(制备发酵剂)
将一部分KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得；21.51％固体，25℃下Brookfield粘度为267cps)稀释至13.5％总固体。一400-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入400g的所述13.5％KymeneE7219。用7.38g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.52。取出一5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。然后加入6.66g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)，然后加入44.4g含有得自生物脱卤化聚氨基聚酰胺-环氧氯丙烷树脂的接种物的微生物的混合物。这表示细胞浓度为约105-约106个细胞/ml的开始值。该开始值相当于随着该方法进行的约109个细胞/ml的最终处理水平。将该接种物与3.50g营养液一起加入。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)所用微生物是：噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)。开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过Gardner-Holdt粘度监控该处理并通过光密度(OD600)监控细菌生长。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。定期取出5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。在头24小时内通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将处理的pH保持在7.2-7.5。24小时之后，经过24小时的过程使其pH位移降至pH 6.71。48小时之后，所得混合物的Brookfield粘度是71cps(在25℃下测定)。将该混合物用作下面按比例放大2的接种物。
按比例放大2
将一部分KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得；21.51％固体，25℃下Brookfield粘度为267cps)稀释至13.5％总固体。一 2-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入1600g的所述13.5％KymeneE7219。用29.99g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.55。取出一 5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。然后加入26.64g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得，原样使用)，然后与14.0g营养液一起加入177.8g得自上面按比例放大1的接种物。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过Gardner-Holdt粘度监控该处理并通过光密度(OD600)监控细菌生长。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(SpectronicInstruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。定期取出5g等分试样，用96％硫酸将其pH降低至约3并通过GC分析。在头8小时内通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将处理的pH保持在7.1-7.5。在剩余的处理时间内，通过定期加入30％氢氧化钠水溶液将其pH保持在pH 6.8-7.2。48小时之后，将混合物冷却至室温，并用12.85g的96％硫酸将其pH调整至pH2.8并加入19.26g的杀生物剂溶液。[所述杀生物剂溶液由10％活性ProxelBD(得自Zeneca Biocides)和1.67％山梨酸钾的去离子水组成。]树脂的Brookfield粘度是30cps(在25℃下测定)。检测处理的结果参见表5。
表5 样品 时间 pH(30℃) G/H 粘度 OD600 (绝对值) DCP (ppm) CPD (ppm) -1 ″0″ 7.50(21℃) D/E 0.060 770 269 -80B 0 时间″0″是正好在加入NaOH之后， 时间0是之后在加入Alcalase之后。 ---- 0.25 7.44 ---- ---- ---- ---- -2 1 7.37 B ---- 657 412 -3 2 7.34 B 0.058 645 477 -4 4 7.30 A/B 0.063 677 526 -5 6 7.25 A/B 0.062 623 508 ---- 7 7.20-7.52 ---- ---- ---- ---- -6 8 7.50 A 0.059 599 504 -7 10 7.40 A/A-1 0.062 615 559 -8 14 7.26-7.47 A/A-1 0.065 592 569 -9 24 7.22 A/B 0.139 516 560 ---- 28 7.12 A/B 0.259 ---- ---- -10 30 7.11 B 0.295 387 508 ---- 32 7.07 B 0.336 ---- ---- ---- 34 7.03 ---- 0.391 ---- ---- -11 37 6.93 B 0.475 ND 497 -12 48 6.71 C 0.716 ND ND
按比例放大2 等分试样 时间 pH (30℃) G/H粘 度 OD600 (绝对值) DCP (ppm) CPD (ppm) -1 ″0″ 7.48(26℃) D/E 0.101 778 237 -84B 0 时间″0″是正好在加入NaOH之后， 时间0是之后在加入Alcalase之后。 ---- 0.25 7.46 ---- ---- -2 1 7.39 C ---- 641 384 -3 2 7.31 B/C 0.129 583 433 -4 4 7.10-7.40 B 0.199 507 531 -5 6 7.34 B 0.270 371 562 -6 8.5 ---- A/B 0.422 96 653 -7 12.5 6.75-7.14 A 0.618 ND 303 -8 22 6.85 A/B 0.877 ND 0.5 ---- 24 6.85-7.09 ---- ---- ---- ---- 树脂是黑橙色、淡棕褐色。 ---- 28 7.01-7.10 A/B 0.932 -9 30 7.08 A/B 0.959 ND ND -10 48 6.84 B 1.080 ND ND 酸试验 ---- ---- ---- ---- ND 0.1
实施例20和21清楚地显示了可以将酶处理和生物脱卤化处理有效地结合。当使用2倍的Alcalase时，优选的平衡条件能够获得优选的粘度。
实施例22
KymeneE7219的Alcalase-生物脱卤作用
(数据和细节参见表6)
将KymeneE7219(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE；Zwijindrecht，Netherlands plant获得)稀释至13.40％并具有76cps的Brookfield粘度。
巴氏杀菌：一3-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入2800g的树脂。用浓硫酸将其pH从3.4调整至pH3.0，并在15分钟内从25℃加热到80℃。将树脂在80℃下保持15分钟，在10分钟内冷却至75℃，然后冷却至30℃。经过巴氏杀菌的树脂具有48cps的Brookfield粘度，并贮藏在无菌容器中。
Kymene E7219的灭菌：将一份500g的Kymene E7219稀释至8％，放入一可高压灭菌的瓶中，并在高压锅中于121℃下加热20分钟。将树脂冷却并用于开始树脂接种物的按比例放大1制备。注：将巴氏杀菌过的Kymene E7219(使用上述条件)也成功地用于开始树脂接种物的按比例放大1制备。
生物脱卤作用：树脂接种物的制备[按比例放大1(SU1)]：一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入200g的灭菌过的KymeneE7219，并用3.28g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入400微升的HK7浓发酵剂培养物(以1∶500将HK7加入到树脂中)[浓发酵剂培养物的制备参见实施例24]并加入1.75g营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。通过定期加入30％氢氧化钠水溶液保持反应混合物的pH。34小时之后，加入68微升的HK1浓发酵剂培养物(以1∶3000将HK1加入到树脂中)[浓发酵剂培养物的制备参见实施例24]。43小时之后，将所得树脂用作SU2的接种物。
按比例放大2(SU2)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入350g的所述巴氏杀菌过的树脂。用7.40g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.5，然后加入5.03g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、87.5g SU1树脂接种物(20％接种率)和3.06g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。通过定期加入30％氢氧化钠水溶液保持反应混合物的pH。23小时之后，将所得树脂用作SU3的接种物。为了增加树脂的分子量(通过Gardner-Holdt粘度或Brookfield粘度显示)，用1.17g的30％氢氧化钠水溶液将一份200g的剩余树脂(Brookfield粘度为10cps)升高至pH 8.5并将温度升高至40℃。3小时之后，树脂具有理想的粘度并通过加入浓硫酸将反应骤冷至pH 2.7。所得树脂具有25cps的Brookfield粘度。
按比例放大3(SU3)和重复批量模式的一般步骤：
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入350g的所述巴氏杀菌过的树脂。用8.59g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.6，然后加入4.38g的ALCALASE 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、87.5g SU2树脂接种物(20％接种率)和3.06g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。通过定期加入30％氢氧化钠水溶液保持反应混合物的pH。23小时之后，将所得树脂用作SU4的接种物。浓硫酸将剩余树脂的pH调整至pH2.8，将300ppm的山梨酸钾以10％的水溶液形式加入。树脂具有49cps的Brookfield粘度。
按比例放大4(SU4)批量：步骤与SU3相似，数据和细节参见表6。
按比例放大5-10批量：步骤与SU3相似，只是使用没有经过巴氏杀菌的13.40％Kymene E7219(数据和细节参见表6)。
SU3-SU8是一系列类似的具有10％接种率的试验，产生成功且有效的批量生物脱卤作用。
表6按比例放大1：200g 8％E7219(高压灭菌过的)，没有Alcalase， 400微升HK7，1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.25 ---- ---- 3.28 ---- ---- X33031-15-1 1 7.24 ---- 0.174 ---- 445 183 X33031-15-2 4 7.22 ---- 0.154 ---- 402 211 X33031-15-3 20 7.15 ---- 0.138 ---- 259 309 X33031-15-4 24 7.12 ---- 0.152 ---- 222 333 X33031-15-5 28 7.07-7.27 ---- 0.177 0.12 140 375 ---- 32 7.17 ---- 0.211 ---- ---- ---- ---- 34 7.13 ---- 0.249 加入68微升HK1接种物 ---- ---- 7.13 ---- 0.272 ---- ---- ---- X33031-15-6 43 6.84 ---- 0.657 ---- ND 0.36按比例放大2：350g 13.5％E7219(巴氏杀菌过的)，5.03g Alcalase， 87.5g的-15，3.06g营养液 样品 时间 (小时) (pH 7.50) pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.49 ---- ---- 7.40 ---- ---- X33031-18-1 1 7.39-7.64 A-B 0.128 0.65 434 485 X33031-18-2 4 7.41-7.64 A 0.170 0.49 10 814 X33031-18-3 7 7.50-7.6 A 0.257 0.26 ND 720 X33031-18-4 10 7.44-7.64 A 0.372 0.29 ND 380 X33031-18-5 13 7.47-7.59 A 0.543 0.22 ND 0.56 X33031-18-6 23 7.56 A-1/A 0.678 ---- ND 0.38取出接种物用于下一批量，剩余物放于一旁用于交联。Brookfield粘度是10cps(在pH 7.50下)，8小时之后开始交联200g的-18： 7.20(24℃) ---- 7.11(31℃) ---- 0 8.50(31℃) ---- 1.17 0.5 8.23(40℃) 1 8.01 1.5 7.93 A-1/A 2 7.82 2.5 7.74 X33047-27-1 3 7.68 用硫酸终止反应 2.65
最终树脂具有25cps的Brookfield粘度。按比例放大3：350g 13.5％E7219(巴氏杀菌过的)，4.38g Alcalase， 87.5g的-18，3.06g营养液 样品 时间 (小时) (pH7.60) pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.63 ---- ---- 8.59 ---- ---- X33031-20-1 1 7.51-7.79 A-B 0.148 0.70 476 430 X33031-20-2 4 7.54-7.73 A 0.209 0.40 186 616 X33031-20-3 7 7.49-7.74 A 0.307 0.56 ND 715 X33031-20-4 10 7.52-7.71 A 0.436 0.37 ND 437 X33031-20-5 13 7.49-7.70 A 0.594 0.37 ND 152 X33031-20-6 23 7.48 B-C 0.726 ---- ND 0.29
最终树脂具有49cps的Brookfield粘度。按比例放大4：350g 13.5％E7219(巴氏杀菌过的)，4.38g Alcalase， 87.5g的-20，3.06g营养液 样品 时间 (小时) (pH 7.50) pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.60 ---- ---- 7.51 ---- ---- X33031-23-1 1 7.53-7.62 A-B 0.176 0.24 588 360 X33031-23-2 4 7.40-7.61 A-B 0.211 0.48 516 470 X33031-23-3 7 7.46-7.63 A 0.258 0.38 227 736 X33031-23-4 10 7.47-7.62 A 0.312 0.29 ND 811 X33031-23-5 12.5 7.52-7.42 A 0.344 0.24 ND 747 X33031-23-6 25 7.12 C 0.642 ---- ND 0.06
最终树脂具有116cps的Brookfield粘度。按比例放大5：350g 13.5％E7219(未经过巴氏杀菌)，4.38g Alcalase， 87.5g的-23，3.06g营养液 样品 时间 (小时) (pH 7.50) pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.63 ---- ---- 6.88 ---- ---- X33031-25-1 1 7.37-7.64 B 0.175 0.67 499 426 X33031-25-2 3 7.47-7.64 B 0.248 0.39 384 527 X33031-25-3 7 7.35-7.65 B 0.378 0.71 48 631 X33031-25-4 24 7.12 F-G 0.743 ---- ND 0.06
最终树脂为软凝胶(可以分散)。按比例放大6：350g 13.5％E7219(未经巴氏杀菌)，4.38g Alcalase， 118g的-25，3.06g营养液 样品 时间 (小时) (pH 7.3) pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.41 ---- ---- 6.60 ---- ---- X33031-27-1 1 7.34-7.51 B-C 0.234 0.43 466 438 X33031-27-2 7 7.13-7.33 B-C 0.342 0.42 ND 766 X33031-27-3 19 6.91 B-C 0.542 ---- ND 7.1
最终树脂具有87cps的Brookfield粘度。按比例放大7：350g 13.5％E7219(未经巴氏杀菌)，4.38g Alcalase， 87.5g的-27，3.06g营养液 样品 时间 (小时) (pH 7.35) pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.44 ---- ---- 7.27 ---- ---- X33031-29-1 1 7.35-7.54 B-C 0.146 0.52 676 548 X33031-29-2 4 7.30-7.65 B 0.213 0.70 319 959 X33031-29-3 8 7.37 A-B 0.301 0.00 ND 1074 X33031-29-4 11 7.29-7.42 A 0.354 0.26 ND 774 X33031-29-5 14 15 7.27-7.43 7.33 ---- B 0.402 ---- 0.30 ND 442 X33031-29-6 23 7.13 C 0.645 ---- ND 0.13 酸试验 ＜0.10 2.4
最终树脂具有77cps的Brookfield粘度。按比例放大8：350g 13.5％E7219(未经巴氏杀菌)，4.38g Alcalase， 87.5g的-29，3.06g营养液 样品 时间 (小时)(pH 7.30)pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.44 ---- ---- 7.17 ---- ---- X33031-31-1 1 7.37-7.46 B-C 0.173 0.27 652 504 X33031-31-2 4 7.23-7.34 B 0.264 0.28 351 754 X33031-31-3 7 7.16-7.38 A-B 0.361 0.46 ND 921 X33031-31-4 10 7.20-7.42 B 0.456 0.47 ND 486 X33031-31-5 13 7.20-7.39 B 0.628 0.43 ND 4.6 X33031-31-6 23 7.23 B-C 0.726 ND 0.14
最终树脂具有65cps的Brookfield粘度。按比例放大9：700g 13.5％E7219(未经巴氏杀菌)，8.76g Alcalase， 175g的-31，6.12g营养液 样品 时间 (小时)(pH 7.25)pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.27 ---- ---- 12.86 ---- ---- X33031-33-1 1 7.18-7.39 B-C 0.191 1.02 527 402 X33031-33-2 4 7.15-7.38 B 0.271 0.99 283 672 X33031-33-3 7 7.18-7.40 A-B 0.337 1.05 ND 859 X33031-33-4 10 7.24-7.38 A-B 0.397 0.68 ND 619 X33031-33-5 13 7.27-7.39 B 0.474 0.53 ND 361 X33031-33-6 23 7.11 B-C 0.697 ND 0.12 酸试验 ＜0.10 2.9
最终树脂具有40cps的Brookfield粘度。按比例放大10：350g 13.5％E7219(未经巴氏杀菌)，4.38g Alcalase， 87.5g的-33，3.06g营养液 样品 时间 (小时)(pH 7.20)pH(30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.17 ---- ---- 7.20 ---- ---- X33031-35-1 1 7.15-7.34 B-C 0.188 0.48 582 462 X33031-35-2 4 7.17-7.32 B 0.293 0.43 299 624 X33031-35-3 7 7.17-7.31 A-B 0.380 0.45 ND 812 X33031-35-4 10 7.16-7.28 A-B 0.487 0.29 ND 487 X33031-35-5 13 7.12-7.30 B 0.647 0.32 ND 150 X33031-35-6 23 7.12 A-B 0.820 ND 0.22 酸试验 ＜0.10 2.7
最终树脂具有34cps的Brookfield粘度。
实施例：
对以下实施例而言，TS表示总固体
Demi Water表示软化水
DO表示是溶解的氧
实施例23：
证实对具有增加的％TS的起皱助剂Crepetrol80E
施加生物脱卤技术以将1，3-DCP和/或3-CPD水平
降低至低于1ppm的浓度的可行性
Crepetrol80E(＝A3025)起皱助剂树脂(26.6％TS)，可从HerculesIncorporated(Wilmington，DE)获得的叔胺基树脂，从the Voreppe plant，France获得。
向3个无菌250ml Erlenmeyer烧瓶中装入50ml批量的具有增加％TS(表7)的树脂。用无菌软化水将树脂稀释。
表7：Crepetrol80E的EPI残余物和总固体 样品Crepetrol 80E(ml) Demi water(ml) EPI (ppm)1，3-DCP (ppm) 2，3-DCP (ppm) 3-CPD (ppm) TS (％)26.6％(原样) 50 0 nd 35 nd 100 26.58 20％ 37.6 12.4 nd 26 nd 75 20.0 15％ 28.2 21.8 nd 20 nd 56 15.0
在接种之前，将每一稀释的50ml树脂补充有0.5ml营养液，并使用33％NaOH溶液将溶液的pH调整至pH 5.8。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5g KH2PO4、5gMgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。从-80℃冰箱中取出1ml的噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的浓发酵剂培养物并在水浴中于30℃下解冻1-2分钟。将50μl等分试样的噬组氨醇节杆菌(HK1)悬液和200μl等分试样的放射性土壤杆菌(HK7)悬液都用于接种含有所述50ml补充过的Crepetrol80E稀液的250ml无菌Erlenmeyer摇瓶。接种之后，将培养物于30℃下在旋转摇动的培养器(250rpm；G25型；New Brunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)中培养48小时。细菌及时生长并使用Ultrospec 1000 UV/Vis分光光度计(Pharmacia Biotech，Sweden)和具有1-cm径长的3ml一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度来确定(表8)。用浓硫酸将样品的pH调整至pH3.5并加入0.1％ProxelBD(可从Zeneca Biocides获得)。通过GC分析测定样品的EPI残余物(1，3-DCP和3-CPD)(表8)。
表8：具有增加％TS的Crepetrol80E中细菌生长 OD600值 时间(小时) C80E 15％TS C80E 20％TS C80E 26.6％TS 0 0.296 0.256 0.246 16.5 0.558 0.525 0.440 19.5 0.570 0.530 0.460 25 0.575 0.545 0.475 41 0.643 0.590 0.490 48 0.735 0.600 0.505 42小时之后的 1，3-DCP(ppm) ＜1 ＜1 ＜1 42小时之后的3- CPD(ppm) ＜1 ＜1 ＜1
实施例24
具有高％TS的顺序酶和生物处理
证实Crepetrol80E经过ALCALASE处理开始释放3-CPD，接着生物脱卤的处理的效率。使用酸试验测定结合3-CPD的残余聚合物的生物脱卤过的产物。
A.2.5L Crepetrol80E的处理
将干净且无菌的2.5L生物反应器(BioFlo3000生物反应器，通过AFS-BioCommand软件控制；New Brunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)装有2.5kg 从Hercules Voreppe plant，France获得的Crepetrol80E树脂(26.6％TS)。使用33％NaOH溶液和安装的生物反应器的pH-PID控制器(Proportional Intergral Display)将Crepetrol80E的pH调整至pH 7.5。通过加入12.5g Alcalase2.5LDX(Novozymes)开始酶处理。使用以下培养条件将树脂进行酶处理6小时：
-pH 7.5
-温度 控制在25℃
-搅拌 控制在600rpm
在2、4和6小时之后的时间取出样品(25ml)以检测epi残余物(表9)。用浓硫酸将收集的样品的pH调整至pH 3.5并贮藏在4℃进一步分析。通过GC分析EPI残余物(3-CPD和1，3-DCP)。
表9：在26.6％TS下处理Crepetrol80E时释放的3-CPD 样品培养时间 3-CPD(ppm)1，3-DCP(ppm)Crepetrol80E 26.6％ 0 100 35 C80E-Alc1 A 2 129 37 C80E-Alc1 B 4 170 39 C80E-Alc1 C 6 168 39
B.制备开始生物脱卤处理的HK1和HK7的预培养物
将单菌落噬组氨醇节杆菌(HK1)和单菌落放射性土壤杆菌(HK7)(都分别生长于含有DCP/CPD的最小培养基盐培养基上)用于各自单独地接种含有50ml无菌Brain Heart Infusion培养基(BHI；Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshire，England；现成的培养基，cat.no.CM225)的无菌Erlenmeyer摇瓶(250ml)。将这两个预培养物单独地于30℃下在控制温度的旋转摇动培养器(250rpm；G25型；NewBrunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)中培养24小时。使用Ultrospec 1000UV/Vis分光光度计(Pharmacia Biotech，Sweden)于600nm的波长下并使用具有1-cm径长的3ml一次性比色杯测定生长的HK1和HK7培养物的光密度。
使用20倍(水)稀释的培养样品通过测定600nm下的光密度来确定其生长(表10)。使用这些预培养物开始酶处理过的Crepetrol80E的生物脱卤处理。
表10：24小时BHI生长的HK1和HK7批量培养物的光密度培养物OD600(20倍稀释)噬组氨醇节杆菌HK1 0.386氮菌落放射性土壤杆菌HK7 0.455
为了制备浓发酵剂培养物，经过离心(10000rpm持续10分钟，4℃下)将预培养物浓缩并补充10％甘油，然后于-80℃下贮藏。
C.处理过的Crepetrol80E的生物脱卤。
酶处理6小时之后(A段)，用浓硫酸将生物反应器中的树脂的pH调整至pH 5.8。将反应器内容物补充25ml营养液和0.04％PPG2000(防沫剂)(聚丙二醇P2000(Fluka Chemie AG，Germany))。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5g KH2PO4、5g MgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。使用噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的预培养物(各自50ml；B段)开始酶处理过的树脂的生物脱卤处理。将这两种培养物同时用于接种2.5L生物反应器中的批量发酵。以批量模式操作的生物反应器控制装置的参数设定如下：pH控制在pH 5.8(PID控制加入25％NaOH溶液)温度控制在30℃搅拌速度600rpm(最大速度为800rpm，经DO值控制)通风设定在1.0vvm(2.5L/min；压缩空气)，最小DO值设定在5％空气饱和
通过气相色谱分析(GC-XSD；表11)及时密切地监控从生物反应器内容物中完全除去epi残余物。在51小时的总培养时间之后，结束批量培养。用浓硫酸将酶处理和生物脱卤过的树脂的pH调整至pH3.5，并且该产物补充有0.2％山梨酸钾和0.12％ProxelBD。将最终产物样品用于酸试验以测定结合3-CPD部分的聚合物。用浓硫酸将该样品(25ml)的pH调整至pH 1.0，接着将样品于50℃下培养24小时。培养之后用33％NaOH溶液将其pH再次调整至pH 3.5。通过GC-XSD测定确定epi残余物(表11)。
表11：顺序酶处理、生物处理和酸试验之后的epi残余物 处理处理时间(小时)1，3-DCP(ppm)3-CPD(ppm)Crepetrol80E 26.6％TS 0 35 100第一处理阶段 2 4 6 37 39 39 129 170 168第二生物脱卤阶段 7 29.5 50 39 nd nd 168 ＜1 ＜1C80E原料的酸试验(对照) 38 188产品的酸试验 nd 29
实施例25：具有高％TS的组合的酶-生物处理
证实经过Crepetrol80E处理同时开始释放3-CPD并且同时生物脱卤自由3-CPD的处理的效率。使用酸试验测定结合3-CPD的残余聚合物的生物脱卤过的产物。
将干净且无菌的2.5L生物反应器(BioFlo3000生物反应器，通过AFS-BioCommand软件控制；New Brunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)装有2.5kg从Hercules Voreppe plant，France获得的Crepetrol80E树脂(26.6％TS)。使用浓NaOH(33％)溶液将树脂的pH调整至pH 7.5，补充25ml营养液和0.04％PPG2000(防沫剂)。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5gKH2PO4、5g MgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。从-80℃冰箱中取出等分试样的噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的浓发酵剂培养物并在水浴中于30℃下解冻1-2分钟。为了同时开始酶处理和生物脱卤处理，向补充过的树脂中加入以下酶/细菌量：
-12.5g Alcalase2.5L DX(Novozymes)
-0.83ml噬组氨醇节杆菌(HK1)发酵剂培养物
-4.17ml放射性土壤杆菌(HK7)发酵剂培养物
以批量模式操作的生物反应器控制装置的参数设定，在初始处理阶段设定如下： pH控制在pH 7.5(PD控制加入25％NaOH溶液) 温度控制在25℃ 搅拌速度600rpm(最大速度为800rpm，经DO值控制) 通风设定在1.0vvm(2.5L/min；压缩空气)，最小DO值设定在5％空气饱和
在2、4和6小时之后的时间取出样品以检测epi残余物(表12)。通过GC测定epi残余物。用浓硫酸将这些样品(25ml)的pH调整至pH 3.5并贮藏在4℃进一步分析。
培养6小时之后，用浓硫酸将批量的pH降低至pH 5.8并将培养温度升高至30℃。在“生物脱卤处理阶段”期间以批量模式操作的生物反应器控制装置的参数设定如下： PH控制在pH 5.8(PID控制加入25％NaOH溶液) 温度控制在30℃ 搅拌速度600rpm(最大速度为800rpm，经DO值控制) 通风设定在1.0vvm(2.5L/min；压缩空气)，最小DO值设定在5％空气饱和
通过气相色谱分析(GC-XSD；表12)及时密切地监控从生物反应器内容物中完全除去epi残余物。在52小时的总培养时间之后，结束批量培养。用浓硫酸将同时酶处理和生物脱卤过的树脂的pH调整至pH 3.5，并且该产物补充有0.2％山梨酸钾和0.12％Proxel BD。将最终产物样品用于酸试验以测定结合3-CPD部分的聚合物。用浓硫酸将该样品(25ml)的pH调整至pH 1.0，接着将样品于50℃下培养24小时。培养之后用33％NaOH溶液将其pH再次调整至pH 3.5。通过GC-XSD测定确定epi残余物(表12)。
表12：同时酶处理和生物处理和酸试验之后的epi残余物 处理处理时间(小时)1，3-DCP(ppm)3-CPD(ppm)Crepetrol80E 26.6％TS 0 35 100 “酶”处理条件 2 4 6 nd nd nd 141 135 132″生物脱卤″处理条件 24 31 48 ＜1 nd nd 2 ＜1 ＜1 C80E原料的酸试验(对照) 38 188 产品的酸试验 nd 18
实施例26：Crepetrol80E起皱剂
(也已知为CrepetrolA3025)的生物脱卤作用
生产和制备结果
(1)在没有防腐剂的情况下制备总3225L Crepetrol A3025(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE获得)
(2)清洗SU2反应器：
·完全填充热水(90℃)，充气和搅拌。加入苛性碱高达pH 11。
·在90℃下保持30分钟。
·将热/苛性碱反应器内容物排放到SU1容器中。
(3)清洗SU1容器：
·完全填充来自SU2反应器的热(90℃)/苛性水。
·在清洗/加热期间在SU1容器中开启充气和搅拌。
·60分钟之后排放内容物。
·完全填充热水(90℃)并排放容器的内容物(＝第2次冲洗)。
·热处理(蒸汽)用于自由排放的容器出口、连接口和所有管道。
(4)将Crepetrol A3025巴氏杀菌：
·用3225L Crepetrol A3025(26％TS)填充反应器SU2，并将原料加热至80℃。
·在巴氏杀菌过程中在SU2反应器中开启充气和搅拌。
·将原料在80℃下保持15分钟。
·排放巴氏杀菌过的SU1容器中的175L(热)A3025。
·排放巴氏杀菌过的贮藏容器中的2000L(热)A3025。
·将剩余1050L巴氏杀菌过的A3025保留在SU2反应器中直到在SU2中进一步使用。
·关掉充气和搅拌。
(5)仅将巴氏杀菌过的水(15分钟，90℃)用于SU1的稀释步骤。
(6)加入适量干形式的K4营养素(营养素的量参见下面)。
(7)制备0.5L无菌甘油溶液(161g甘油/500ml；在121℃下杀菌15分钟)。
按比例放大1(SU1)：制备树脂接种物
(1)清洗和巴氏杀菌SU1容器(参见上面)。
(2)将50％巴氏杀菌和稀释过的原料用于SU1容器：
SU1容器装有175L巴氏杀菌过的Crepetrol A3025(26％TS)和
175L巴氏杀菌过的(15分钟，90℃)水。
(3)开始搅拌
(4)用30％氢氧化钠将SU1中的pH调整至pH 5.8±0.2。
(5)开始充气反应器(0.5vvm)
(6)调整SU1中的温度并保持在30±1℃。
(7)加入干形式的K4营养素(通过清洗容器)：
·组分 浓度(g/L) 350L容积
尿素 0.33 115.5g
KH2PO4 0.10 35.0g
(8)加入0.5L(161g/500ml)无菌甘油溶液(＝460ppm最终浓度)。
(9)用HK1和HK7发酵剂接种SU1(所用接种密度：HK1 1∶3500且HK7 1∶700，接种物∶树脂比)。[参见实施例24的浓发酵剂培养物制备]
(10)样品测定：
-每2小时的OD600
-在SU1末端的DCP/CPD值
(11)在30±1℃和pH 5.8±0.2下培养16-24小时(必要时增加pH以进行校正)。
(12)当
-OD600＞0.5或者OD600值开始稳定时
转移到SU2
按比例放大2
(1)清洗和巴氏杀菌SU2容器(参见上面)。
(2)使用1050L巴氏杀菌过的Crepetrol A3025原料。
(3)开始搅拌
(4)用30％氢氧化钠将SU2中的pH调整至pH 5.8±0.2。
(5)开始充气反应器(0.5vvm)
(6)调整SU2中的温度并保持在30±1℃。
(7)加入干形式的K4营养素(通过干净容器)：
·组分 浓度(g/L) 1050L容积
尿素 0.33 346.5g
KH2PO4 0.10 105.0g
(8)使用清洗且巴氏杀菌过的连接口/管道(参见上面)通过重力用350L SU1培养物接种SU2(接种密度25％)。
(10)样品测定：
-每2小时的OD600
-在SU2末端的DCP/CPD值
(10)在30±1℃和pH 5.8±0.2下培养16-24小时(必要时增加pH以进行校正)。
(11)当
-DCP/CPD值＜5ppm或者当溶解的氧水平增加时
-培养时间＞24小时时
开始SU3。
按比例放大3
(1)贮藏容器中的“巴氏杀菌过的原料”：
·热处理(用蒸汽)用于混合原料的所有设备。
·用30％氢氧化钠将pH调整至pH 5.8±0.2。
(2)通过重力将贮藏容器排放到SU2反应器(经过清洗/巴氏杀菌过的连接口/管道)(参见上面)。
(3)根据增加的体积增加充气容积(0.5vvm)。
(4)控制搅拌和温度(30±1℃)在设定值。
(5)加入干形式的K4营养素(通过清洗容器)用于增加2000L体积：
·组分 浓度(g/L) 2000L容积
尿素 0.33 660g
KH2PO4 0.10 200g
(6)样品测定：
-每2小时的OD600
-每4小时的DCP/CPD值
-在SU3末端用于酸试验的样品。
(7)在30±1℃和pH 5.8±0.2下培养16-24小时(必要时增加pH的校正)。
(8)当[DCP]+[CPD]＜5ppm时结束SU3中的生物脱卤作用。
(9)产物完成：
·用浓硫酸将pH调整至pH 3.0±0.2
·加入2000ppm(0.2％)山梨酸钾
通过50-100-μm过滤器将最终产物排放到新搬运箱。
结果：EPI-残余物分析
表13：通过GC-FID测定epi-残余物的结果 样品EPI[ppm]1，3-DCP[ppm]2，3-DCP[ppm]3-CPD[ppm]Crepetrol 80E原料ND 42 ND 131本实施例ND ND ND ND酸试验之后Crepetrol 80E原料ND 38 ND 227酸试验之后本实施例ND ND ND 56
ND＝未检出
检测极限：
EPI[ppm]： 10
1，3-DCP[ppm]： 10
2，3-DCP[ppm]： 10
3-CPD[ppm]： 10
实施例27：具有增加％TS的KymeneSLX2的生物脱卤
将干净且无菌的500mL烧瓶装有380g从Hercules Zwijndrechtplant，The Netherlands获得的KymeneSLX2(25.3％TS)。通过逐渐加入(同时剧烈混合)8.3g 33％NaOH溶液将该树脂的pH调整至pH5.8。一系列杀菌过的250ml Erlenmeyer烧瓶装有50ml批量具有增加％TS的树脂。使用灭菌过的软化水进行树脂的稀释(表14)。
表14：KymeneSLX2稀释范围 样品(％TS)KymeneSLX2(ml) 软化水(ml) 8 15.8 34.2 10 19.8 30.2 12 23.7 26.3 14 27.7 22.3 16 31.6 18.4 18 35.6 14.4 20 39.5 10.5 25.3 50 0
接种之前，每个稀释过的树脂样品补充有0.5ml过滤器无菌营养液。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5gKH2PO4、5g MgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。从-80℃冰箱中取出1ml的噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的浓发酵剂培养物样品，并在水浴中于30℃下解冻1-2分钟。将20μl等分试样的噬组氨醇节杆菌(HK1)悬液和100μl等分试样的放射性土壤杆菌(HK7)悬液都用于接种所述50ml补充过的KymeneSLX2稀液。接种之后，将培养物于30℃下在旋转摇动的培养器(250rpm；G25型；NewBrunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)中培养22小时。细菌及时生长并使用Ultrospec 1000 UV/Vis分光光度计(Pharmacia Biotech，Sweden)和具有1-cm径长的3ml一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度来确定(表8)。用浓硫酸将样品的pH调整至pH 2.8并加入0.1％Proxel BD。通过GC分析测定样品的EPI残余物(3-CPD和1，3-DCP)(表15)。
表15：具有增加％TS的KymeneSLX2中细菌生长 样品 (％TS) OD600nm t＝22小时培养 “粘度”外观 0小时 17小时 22小时 3-CPD (ppm) 3-CPD (ppm) 8 0.141 0.655 0.654 ＜10 ＜10 - 10 0.126 0.742 0.717 ＜10 ＜10 - 12 0.122 0.797 0.762 ＜10 ＜10 - 14 0.114 0.705 0.769 ＜10 32 - 16 0.107 0.609 0.623 ＜10 294 + 18 0.094 0.556 0.560 ＜10 407 ++ 20 0.096 0.486 0.541 ＜10 492 ++ 25.3 0.095 0.139 0.130 胶凝 胶凝 +++
-：不粘，与原料相似。
+：粘，与原料相比粘度增加。
++：非常粘，与原料相比粘度猛烈增加。
+++：胶凝树脂。
检出极限：10ppm 1，3-DCP
10ppm 3-CPD。
实施例28：具有增加％TS的KymeneE7220
(酸处理过的物料)的生物脱卤
将干净且无菌的500mL烧瓶装有300g从Hercules Voreppeplant，France获得的KymeneE7220(22.5％TS)。通过逐渐加入(同时剧烈混合)15.3g 33％ NaOH溶液将该树脂的pH调整至pH 7.0。一系列杀菌过的250ml Erlenmeyer烧瓶装有50ml批量具有增加％TS的树脂。使用灭菌过的软化水进行树脂的稀释(表16)。
表16：KymeneE7220稀释范围 样品(％TS) KymeneE7220(ml) 软化水(ml) 8 17.8 32.2 10 22.2 27.8 12 26.7 23.3 14 31.1 18.9 16 35.6 14.4 18 40.0 10.0 20 44.4 5.6 22.5 50 0
接种之前，每个稀释过的树脂样品补充有0.5ml过滤器杀菌过的营养液。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5g KH2PO4、5g MgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。从-80℃冰箱中取出1ml的噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的浓发酵剂培养物样品并在水浴中于30℃下解冻1-2分钟。将20μl等分试样的噬组氨醇节杆菌(HK1)悬液和100μl等分试样的放射性土壤杆菌(HK7)悬液都用于接种所述50ml补充过的KymeneE7220稀液。接种之后(开始OD600＝0.208)，将培养物于30℃下在旋转摇动的培养器(250rpm；G25型；New Brunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)中培养91小时。细菌及时生长并使用Ultrospec 1000 UV/Vis分光光度计(Pharmacia Biotech，Sweden)和具有1-cm径长的3ml一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度来确定(表17)。用浓硫酸将样品的pH调整至pH 2.8并加入0.1％Proxel BD。通过GC分析测定样品的EPI残余物(3-CPD和1，3-DCP)(表17)。
表17：具有增加％TS的KymeneE7220中细菌生长 样品 (％TS) OD600nm t＝91小时培养 “粘度”外观 19小时 27小时 91小时 3-CPD (ppm)1，3-DCP (ppm) 8 1.103 1.073 nd ＜10 ＜10 - 10 1.190 1.168 nd ＜10 ＜10 - 12 1.145 1.205 nd ＜10 ＜10 - 14 0.870 1.237 nd ＜10 ＜10 - 16 0.500 1.197 1.025 ＜10 ＜10 - 18 0.276 0.647 1.095 ＜10 ＜10 - 20 0.195 0.290 1.176 ＜10 ＜10 - 25.3 0.139 0.140 1.067 ＜10 49 -
nd：未检出
-：不粘，与原料相似。
+：粘，与原料相比粘度增加。
++：非常粘，与原料相比粘度猛烈增加。
+++：胶凝树脂。
检出极限：10ppm 1，3-DCP
10ppm 3-CPD。
实施例29：以50ml在15-20％TS的Kymene736
(聚胺/吖丁啶鎓盐基树脂)的生物脱卤
Kymene736(Crepetrol 73)起皱助剂树脂(39.6％TS)，可从Hercules Incorporated(Wilmington，DE)获得的聚胺/吖丁啶鎓盐基树脂，从the Voreppe plant，France获得。
将干净且无菌的250mL烧瓶装有100g Kymene736(39.6％TS)，通过逐渐加入(同时剧烈混合)33％NaOH溶液将该树脂的pH调整至pH 7.0。将2个无菌250ml Erlenmeyer烧瓶装有50ml批量或者稀释到15％或者稀释到20％TS的树脂。使用灭菌过的软化水进行树脂的稀释(表18)。
表18：Kymene736稀释范围 样品(％TS) Kymene736(ml) 软化水(ml) 15 19.0 31.0 20 25.2 24.8
接种之前，每个稀释过的树脂样品补充有0.5ml过滤器杀菌过的营养液。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5g KH2PO4、5g MgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。从-80℃冰箱中取出1ml的噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的浓发酵剂培养物样品，并在水浴中于30℃下解冻1-2分钟。将50μl等分试样的噬组氨醇节杆菌(HK1)悬液和200μl等分试样的放射性土壤杆菌(HK7)悬液都用于接种所述50ml补充过的Kymene736稀液。接种之后，将培养物于30℃下在旋转摇动的培养器(250rpm；G25型；New Brunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)中培养43小时。细菌及时生长并使用Ultrospec 1000UV/Vis分光光度计(PharmaciaBiotech，Sweden)和具有1-cm径长的3ml一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度来确定(表19)。用浓硫酸将样品的pH调整至pH 2.8并加入0.1％Proxel BD。
表19：具有增加％TS的Kymene736中细菌生长 OD600nm 时间(小时) 15％TS 20％TS 0 0.441 0.378 20 0.935 0.419 23 1.081 0.430 41 0.997 0.910 43 nd 0.899
nd：未检出
实施例30
Kymene736以20％TS在2L批量Kymene736(Crepetrol73)起皱助剂树脂(39.6％TS原样)中的生物脱卤
该起皱助剂树脂是一种可从Hercules Incorporated(Wilmington，DE)获得的聚胺/吖丁啶鎓盐基树脂，从the Voreppe plant，France获得。
将干净且无菌的2.5L生物反应器(BioFlo3000生物反应器，通过AFS-BioCommand软件控制；New Brunswick Scientific Co.，Inc.New Jersey，USA)装有1010ml Kymene736树脂(39.6％TS)和990ml无菌软化水。使用浓NaOH溶液(33％)稀(20％TS)树脂的pH调整至pH 7.0，补充有20ml营养液和0.0025％PPG2000(防沫剂)。该营养液的每升无菌软化水中含有以下组分：33g尿素、5g KH2PO4、5gMgSO4·7H2O和1g CaCl2·2H2O。从-80℃冰箱中取出等分试样的噬组氨醇节杆菌(HK1)和放射性土壤杆菌(HK7)的浓发酵剂培养物并在水浴中于30℃下解冻1-2分钟。将2ml的噬组氨醇节杆菌(HK1)悬液样品和8ml的放射性土壤杆菌(HK7)悬液样品用于同时接种2.5L生物反应器的内容物。以批量模式操作的生物反应器控制装置的参数设定如下：pH控制在pH 7.0(PID控制加入25％NaOH溶液)温度控制在30℃搅拌速度600rpm(最大速度为800rpm，经DO值控制)通风设定在1.0vvm(2.5L/min；压缩空气)，最小DO值设定在5％空气饱和
通过气相色谱分析(GC-XSD；表20)及时监控从生物反应器内容物中完全除去epi残余物。48小时的总培养时间之后结束批量培养。用浓硫酸将生物脱卤过的树脂的pH调整至pH 2.8，并且该树脂补充有0.02％山梨酸钾和0.12％Proxel BD。
表20：Kymene736以20％TS的epi残余物和细菌生长 时间(小时) OD600nm1，3-DCP(ppm)3-CPD(ppm) 0 0.412 - - 5 0.422 - - 22 0.572 - - 27 0.697 - - 30 0.818 ＜1 18 46 0.840 ＜1 ＜1
-：未检出
实施例31-叔胺基树脂的Alcalase处理
将以下步骤用于通过在Crepetrol A3025(Hercules Incorporated，Wilmington，DE)中水解聚合物连接的氯乙醇物质促进3-MCPD形成。
将191.88g CrepetrolA3025样品(不含加入的防腐剂)放入一250玻璃烧瓶(配备有塑料密封的螺帽)。用精确度是±0.005g的MettlerLaboratory数字标尺测定样品重量。
在150℃下15分钟之后测定重量损失的单独试验中确定CrepetrolA3025的总固体浓度。发现样品总固体浓度是26.9％。
用10％w/w NaOH溶液(总共12.52g)将其pH仔细地调整至7.00，同时用磁性搅拌器搅拌，用配备有InLab电极(组合电极，具有Ag离子捕获的内标准ARGENTHAL)的Mettler pH-计(MP 220)监控其pH。在其pH调整之前在7.00-10.00 pH范围内校准该pH计。
将样品放入冰熔融浴(0℃)中。
将0.9g的Alcalase2.5L DX(从Novozymes获得)加入到CrepetrolA3025样品中。
然后将烧瓶放入25℃下的水平摇动(200冲程/分钟)热稳定浴中，搅拌14小时。
14小时之后取出样品，并用浓硫酸将其pH调整至3.5。
使用气相色谱技术分析最初物料样品(CrepetrolA3025)和上面处理之后的物料样品以测定其中的3-一氯丙二醇的含量。
以处理之后样品的3-一氯丙二醇浓度与原始样品CrepetrolA3025的之差计算处理期间产生的3-一氯丙二醇的量。
使用Ubbelohde毛细管于25℃下测定最终样品的粘度降低。制备2％的1N氯化铵溶液并测定流过毛细管的时间。同样测定氯化铵溶液流过的时间。根据下式计算降低的粘度：
RSV[dl/g]＝{(时间样品[秒]/时间溶剂[秒])-1}/浓度样品[g/100ml]
CPD释放的结果如下：
释放的3-MCPD[ppm]＝浓度处理后[ppm]-浓度最初[ppm]＝182-101.9＝80.1ppm
在下面页中报道了一表，它显示了改变酶剂量、pH、总固体、温度和处理时间的条件，用该步骤进行的一系列试验的结果。
上面所给的实施例相应于表21的数31-4。
表21 #标准(样品标记) 酶 g Alcalase酶 ％wt TS％TS实际计算 温度℃ pH 时间 小时 3-MCPD的 释放比例 δ粘度％ δ粘度 cP RSV δRSV 绝对值 31-2 0.9 0.45 15 15.0 25 7 6 0.548 -5.8 -1.6 0.265 -0.001 31-3 0.45 0.225 26 26.0 25 7 6 0.360 -1.6 -1.2 0.265 -0.001 31-9 0.47 0.235 15 15.0 25 8 6 0.486 -11.1 -3.1 0.266 0 31-12 0.9 0.45 26 26.0 25 8 6 0.964 9.2 6.6 0.274 0.008 31-21 0.675 0.3375 20.5 20.5 25 7.5 10 0.729 -16.8 -7.6 0.261 -0.005 31-1 0.45 0.225 15 15.0 25 7 14 0.568 3.9 1.1 0.265 -0.001 31-11 0.45 0.2116 26 24.4 25 8 14 0.852 49.4 31.4 0.354 0.088 31-4 0.9 0.4384 26 25.3 25 7 14 0.974 -0.5 -0.4 0.266 0 31-10 0.9 0.45 15 15.0 25 8 14 0.938 -4.7 -1.3 0.27 0.004 31-25 0.675 0.3372 20.5 20.5 32.5 7.5 2 0.325 -5.4 -2.4 0.264 -0.002 31-27 0.73 0.365 20.5 20.5 32.5 7.5 10 0.639 -7.5 -3.4 0.265 -0.001 31-29 0.675 0.3375 20.5 20.5 32.5 7.5 10 0.519 -16.8 -7.6 0.267 0.001 31-23 0.675 0.3375 20.5 20.5 32.5 6.5 10 0.218 -14.8 -6.7 0.267 0.001 31-20 0.675 0.329 26 25.3 32.5 7.5 10 0.645 -1.6 -1.1 0.28 0.014 31-24 0.675 0.3375 20.5 20.5 32.5 8.5 10 0.579 81.0 36.5 0.453 0.187 31-30 0.675 0.3374 20.5 20.5 32.5 7.5 10 0.639 -8.8 -4.0 0.266 0 31-28 0.675 0.3375 20.5 20.5 32.5 7.5 10 0.444 -9.5 -4.3 0.27 0.004 31-19 0.675 0.3375 9.5 9.5 32.5 7.5 10 0.544 -58.6 -10.2 0.27 0.004 31-18 1.13 0.5649 20.5 20.5 32.5 7.5 10 0.910 -6.2 -2.8 0.262 -0.004 31-17 0.21 0.105 20.5 20.5 32.5 7.5 10 0.203 13.8 6.2 0.272 0.006 31-26 0.675 0.3375 20.5 20.5 32.5 7.5 18 0.789 -5.5 -2.5 0.27 0.004 31-15 0.45 0.225 26 26.0 40 8 6 0.017 440.8 319.8 0.685 0.419 31-5 0.45 0.225 15 15.0 40 7 6 0.383 -14.3 -4.0 0.255 -0.011 31-8 0.9 0.45 26 26.0 40 7 6 0.609 4.2 3.0 0.277 0.011 31-14 0.9 0.45 15 15.0 40 8 6 0.814 14.2 4.0 0.319 0.053 31-6 0.9 0.45 15 15.0 40 7 14 0.938 -12.2 -3.4 0.268 0.002 31-7 0.45 0.225 26 26.0 40 7 14 0.680 24.0 17.4 0.31 0.044 31-13 0.45 0.225 15 15.0 40 8 14 0.650 93.8 26.3 0.53 0.264 31-16 0.9 0.45 26 26.0 40 8 14 na 胶凝 胶凝 1 0.734 31-22 0.675 0.3375 20.5 20.5 47.5 7.5 10 0.189 12.5 5.6 0.306 0.04
根据报道的结果经统计计算得出本树脂的酶处理的最佳条件是：
酶浓度[％W]： 0.45
TS聚合物[％]： 22.17
温度[℃] 25
pH 7.94
时间[小时] 10.43
该处理使得高度释放3-MCPD(约95％)并且最终粘度没有增加。(较高的最终粘度是产品稳定性的一个问题，尤其是如果树脂需要附加处理时)。
根据详细的统计模式，当需要获得相似的最终效果时可以选择其它条件。希望使用更低量的酶并且最终释放约90％的3-MCPD的以下实例条件，并且粘度增加不显著。
酶浓度[％w]： 0.25
TS聚合物[％]： 22.4
温度[℃] 25
pH 8.00
时间[小时] 14.00
实施例32：粘附力测定结果
在以下图表中报道了选择数量的酶处理样品(从上表中报道的系列提取的)的粘附力测定的结果。聚合物显著水解(并因此平均MW降低)能够使得剥离强度显著丧失，因此我们想要检查是否可以检测出任何重要的粘附力降低。
通过将一条织物浸泡在起皱助剂的2％固体溶液中然后在92℃下与标准金属板(软钢)接触将条固化7.5分钟来进行剥离测试。使用Zwick005万能试验机测定从金属板上剥离掉条的平均力。
将结果相对酶处理之后观察到的粘度变化绘图。可以清楚地见到样品粘附力是随机分布的(因试验变化而振动)，不依赖于观察到的粘度变化。
而且这些值都分布于未处理的物料的典型值(0.75-0.8N/cm)周围。
这些结果显示酶处理未引起聚合物粘附强度的任何可测定的降低。
表22 标准# 剥离强度N/cm δRSV 31-4 0.7 0 31-10 0.65 0.004 31-11 0.71 0.088 31-12 0.75 0.008 31-21 0.72 -0.005 31-18 0.81 -0.004 31-24 0.82 0.187 29 0.74 0.001 5 0.76 -0.011 6 0.93 0.002 13 0.69 0.264 14 0.77 0.053 15 0.74 0.419
实施例33：Crepetrol870的生物脱卤作用
(数据和细节参见表23)
用去离子水将一部分没有杀生物剂的Crepetrol870(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE；Voreppe，France plant获得)稀释至18.9％总固体。该稀释的树脂具有53cps的Brookfield粘度。
巴氏杀菌：一2-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入1780g的18.9％树脂。该树脂具有4.6的pH，并在1小时内从25℃加热到85℃。将树脂在85℃下保持20分钟，然后在45分钟内冷却至25℃。经过巴氏杀菌的树脂贮藏在无菌容器中。
生物脱卤作用：树脂接种物的制备[按比例放大1(SU1)]：一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。用无菌的去离子水将一部分巴氏杀菌过的树脂稀释至10％。向烧瓶中加入198g的该10％树脂和2.0g的5mM无菌甘油水溶液。用3.18g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入68微升的HK1浓发酵剂培养物(1∶3000，HK1∶树脂)[浓发酵剂培养物的制备参见实施例24]并加入1.75g营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。17小时之后，将所得树脂用作SU2的接种物。
按比例放大2(SU2)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的18.9％树脂。用4.52g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入50.0g的SU1树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU3的接种物。
按比例放大3(SU3)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的18.9％树脂。用4.45g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入50.0g SU2树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。14.5小时之后，将所得树脂用作SU4的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大4(SU4)：
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的18.9％树脂。用8.94g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入100.0g SU3树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU5的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大5(SU5)：
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的18.9％树脂。用8.96g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入100.0g SU4树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。15.5小时之后，将所得树脂用作SU6的接种物。将不用于接种物的剩余树脂通过用85％磷酸将其pH降低至4.7并加入2000ppm的山梨酸钾作为杀生物剂转化为最终产品。
按比例放大6(SU6)：
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的18.9％树脂。用8.84g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入100.0g SU5树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂通过用7.20g的85％磷酸将其pH降低至4.7并加入2000ppm的山梨酸钾(7.11mL的10wt％山梨酸钾水溶液)作为杀生物剂转化为最终产品。
监控处理的结果参见表23。
表23： Crepetrol 870样品的酸试验 DCP (ppm) CPD (ppm) X33047-19A 巴氏杀菌之前的Voreppe ND 47 X33047-19A 酸试验之后 ND 71 X33047-39 巴氏杀菌之后的Voreppe ND 43 X33047-39 酸试验之后 ND 69 按比例放大1：198g 10％Crepetrol 870，2g 0.5M甘油， 68微升HK1，1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.81 ---- 3.18 ND 23 X33047-41-1 1 5.81 0.020 ---- ND 24 X33047-41-2 17 5.82 0.473 ---- 0.26 0.08 按比例放大2：150g 18.87％ Crepetrol 870，50.0g-41，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.82 ---- 4.52 ND 32 X33047-43-1 1 5.82 0.126 ---- ND 28 X33047-43-2 4 5.83 0.159 ---- 1.0 1.12 X33047-43-3 8 5.82 0.168 ---- 0.57 0.50 按比例放大3：150g 18.87％ Crepetrol 870，50.0g-43，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH(30℃) OD600(绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.81 ---- 4.45 ND 32 X33047-45-1 0.117 5.81 0.048 ---- ND 29 X33047-45-2 14.5 5.81 0.093 ---- 0.56 0.49 按比例放大4：300g 18.87％ Crepetrol 870，100.0g-45，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.82 ---- 8.94 ND 32 X33047-47-1 0.25 5.82 0.029 ---- ND 30 X33047-47-2 4.25 5.82 0.067 ---- 0.58 0.30 X33047-47-3 8 5.81 0.065 ---- 0.59 0.72 按比例放大5：300g 18.87％ Crepetrol 870，100.0g-47，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH(30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g)DCP(ppm)CPD(ppm) ---- 0 5.81 ---- 8.96 ND 32 X33047-49-1 0.083 5.81 0.053 ---- ND 33 X33047-49-2 15.5 5.80 0.049 ---- 0.6 0.12 X33047-49 酸试验 ND 29 按比例放大6：300g 18.87％ Crepetrol 870，100.0g-49，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH(30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP(ppm) CPD(ppm) ---- 0 5.80 ---- 8.84 ND 32 X33047-51-1 0.083 5.80 0.023 ---- ND 32 X33047-51-2 4 5.80 0.039 ---- ND 8.7 X33047-51-3 8 5.80 0.050 ---- 0.59 1.0 X33047-51 酸试验 ND 30
实施例34：起皱剂的粘附力测定
已构建了一种评价潜在起皱粘合剂的粘附力性能的设备。该设备由安装在MTS测定仪器的驱动器上的受热铸铁块组成。将该压盘加热到120℃。将纸样品贴到具有双面胶带的测定仪器的负荷单元的上压盘上。为了进行该试验，将已知量的已知浓度的起皱粘合剂的水溶液喷雾到受热块上。这是使用已安装有容量喷雾瓶的喷枪完成的。容量喷雾瓶使得人们能够精确地测定施加到测定压盘上的溶液的体积。所用标准测试条件为1.2ml的4.0％固体水溶液。在测定之前溶液的pH可以接近7.0或者可以调整至7.0。将树脂溶液喷雾到受热块上之后，驱动器上升以10kg的力将受热块与纸样品接触。然后将驱动器降低并且该力将压盘拉离开其接触的纸。这样测定的力是所测特定树脂的粘附力值。由于施加的力不是总是精确地为10kg，因此该粘附力值经标准化以解释施加力的略微变化。这是将测定的粘附力值乘以[10/(施加力(kg))]获得的。用于测定的纸是由50/50硬木/软木漂白过的牛皮纸制成的40lb.基重片。
下表含有粘附力试验和Brookfield粘度数据：
表24 命名 粘度 (cps) 测定(Kg) (周围pH) 测定(Kg) (pH 7.0) X33047-19A 比较例 53 23.4 21.7 X33047-39 比较例 54 23.4 23.2 X33047-47 实施例 45 ---- ---- X33047-49 实施例 46 21.6 22.1 X33047-51 实施例 49 23.7 22.2
这张表格中的数据说明本发明具有粘度，和未经处理过多树脂相比较的粘合力测试说明生物脱卤过的树脂的性能与未经生物脱卤作用的树脂相当。
实施例35：Crepetrol870的Alcalase-生物脱卤作用
(数据和细节参见表25)
用去离子水将一部分没有杀生物剂的Crepetrol 870(可从Hercules Incorporated，Wilmington，DE；Voreppe，France plant获得)稀释至18.7％总固体。该稀释的树脂具有53cps的Brookfield粘度。
巴氏杀菌：一 2-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入2942g的18.7％树脂。该树脂具有4.6的pH，并在1.5小时内从25℃加热到85℃。将树脂在85℃下保持20分钟，然后在30分钟内冷却至25℃。经过巴氏杀菌的树脂贮藏在无菌容器中。
生物脱卤作用：树脂接种物的制备[按比例放大1(SU1)]：一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。用无菌的去离子水将一部分巴氏杀菌过的树脂稀释至10％。向烧瓶中加入198g的该10％树脂和2.0g的5mM无菌甘油水溶液。用8.31g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入68微升的HK1浓发酵剂培养物(1∶3000，HK1∶树脂)[浓发酵剂培养物的制备参见实施例24]，并加入1.75g营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。16小时之后，将所得树脂用作SU2的接种物。
按比例放大2(SU2)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的18.7％树脂。用10.97g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.02g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、50.0g的SU1树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU3的接种物。
按比例放大3(SU3)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的18.7％树脂。用11.42g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入0.87g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、50.0g SU2树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。14小时之后，将所得树脂用作SU4的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大4(SU4)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的18.7％树脂。用22.17g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.73g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、100.0g SU3树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU5的接种物。将不用于接种物的剩余树脂通过用85％磷酸将其pH降低至4.7并加入2000ppm的山梨酸钾作为杀生物剂转化为最终产品。
按比例放大5(SU5)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的18.7％树脂。用22.77g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.73g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、100.0g SU4树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。14.5小时之后，将所得树脂用作SU6的接种物。将不用于接种物的剩余树脂通过用85％磷酸将其pH降低至4.7并加入2000ppm的山梨酸钾作为杀生物剂转化为最终产品。
按比例放大6(SU6)：
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的18.7％树脂。用23.02g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.73g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、100.0g SU5树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂通过用22.5g的85％磷酸将其pH降低至4.7并加入2000ppm的山梨酸钾(7.69mL的10wt％山梨酸钾水溶液)作为杀生物剂转化为最终产品。
监控处理的结果参见表25。注意，使用该接种率，SU6批量在8小时的反应时间内没有完全生物脱卤。一并列试验，具有相同的反应时间，在SU4批量中使用33％接种率并在SU5和SU6批量中使用50％接种率，使得在SU6批量中提供完全生物脱卤(参见表26)。
表25：按比例放大1：198g 10％ Crepetrol 870，2g 0.5M甘油， 68微升HK1，1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.20 ---- 8.31 ND 23 X33047-62-1 0.5 7.20 0.066 ---- ND 23 X33047-62-2 15.67 7.21 0.180 ---- ND 3.3按比例放大2：150g 18.73％ Crepetrol 870，50.0g-62，1.02g Alcalase， 1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.18 ---- 10.97 ND 32 X33047-64-1 1 7.16 0.180 ---- ND 34 X33047-64-2 4 7.19 0.199 ---- ND 11 X33047-64-3 8 7.18 0.253 ---- 0.41 0.48按比例放大3：150g 18.73％ Crepetrol 870，50.0g-64，0.87g Alcalase， 1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.21 ---- 11.24 ND 32 X33047-66-1 0.083 7.21 0.207 ---- ND 33 X33047-66-2 13.75 7.17 0.299 ---- 0.42 0.25按比例放大4：300g 18.73％ Crepetrol 870，100.0g-66，1.73g Alcalase， 2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.23 ---- 22.17 ND 32 X33047-68-1 1 7.21 0.196 ---- ND 32 X33047-68-2 4 7.20 0.228 ---- ND 19 X33047-68-3 8 7.20 0.260 ---- 0.47 0.46 X33047-68 酸试验之后 0.37 5.9按比例放大5：300g 18.73％ Crepetrol 870，100.0g-68，1.73g Alcalase， 2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.23 ---- 22.77 ND 32 X33047-70-1 0.083 7.23 0.165 ---- ND 34 X33047-70-2 14.5 7.19 0.247 ---- 0.43 0.2 X33047-70 酸试验之后 0.35 2.9按比例放大6：300g 18.73％ Crepetrol 870，100.0g-70，1.73g Alcalase， 2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.24 ---- 23.02 ND 32 X33047-72-1 1 7.23 0.195 ---- ND 33 X33047-72-2 4 7.22 0.208 ---- ND 35 X33047-72-3 8 7.22 0.233 ---- ND 25
表26按比例放大1：198g 10％ Crepetrol 870，2g 0.5M甘油， 68微升HK1，1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.20 ---- 8.20 ND 23 X33047-63-1 0.5 7.19 0.073 ---- ND 23 X33047-63-2 15.67 7.17 0.185 ---- ND 2.5按比例放大2：150g 18.73％ Crepetrol 870，50.0g-63，1.02g Alcalase， 1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.18 ---- 11.13 ND 32 X33047-65-1 1 7.17 0.181 ---- ND 32 X33047-65-2 4 7.17-7.19 0.207 0.13 ND 10 X33047-65-3 8 7.18 0.261 ---- 0.45 0.42按比例放大3：150g 18.73％ Crepetrol 870，50.0g-65， 0.87g Alcalase，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600(绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.21 ---- 11.26 ND 32 X33047-67-1 0.083 7.21 0.193 ---- ND 31 X33047-67-2 13.75 7.17 0.288 ---- 0.39 0.22按比例放大4：266.7g 18.73％ Crepetrol 870，133.3g-67， 1.54g Alcalase，2.33g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.22 ---- 20.28 ND 29 X33047-69-1 1 7.20 0.194 ---- ND 24 X33047-69-2 4 7.20 0.234 ---- 0.45 2.7 X33047-69-3 8 7.19 0.258 ---- 0.41 0.35按比例放大5：200g 18.73％ Crepetrol 870，200.0g-69， 1.16g Alcalase，1.75g营养液 样品 时间 (小时) PH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.22 ---- 15.08 ND 22 X33047-71-1 0.083 7.22 0.199 ---- ND 20 X33047-71-2 14.5 7.20 0.278 ---- 0.38 0.13 X33047-71 酸试验之后 ---- 0.30 1.5按比例放大6：200g 18.73％ Crepetrol 870，200.0g-71， 1.16g Alcalase，1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) OD600 (绝对值) 30％ NaOH(g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.24 ---- 15.37 ND 22 X33047-73-1 1 7.22 0.224 ---- ND 16 X33047-73-2 4 7.21 0.261 ---- 0.42 0.43 X33047-73-3 8 7.21 0.271 ---- 0.41 0.21 X33047-73 酸试验之后 0.32 3.3
实施例36：Crepetrol A6115的生物脱卤作用
(数据和细节参见表BP4)
将一部分没有杀生物剂的Crepetrol A6115(可从HerculesIncorporated，Wilmington，DE；Milwaukee，Wisconisin plant获得)通过100目筛过滤。该树脂具有15.73％总固体、pH 5.1和86cps的Brookfield粘度。
巴氏杀菌：一3-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入2770g的该树脂。该树脂在1.5小时内从25℃加热到85℃。将树脂在85℃下保持20分钟，然后在30分钟内冷却至25℃。经过巴氏杀菌的树脂贮藏在无菌容器中。
生物脱卤作用：树脂接种物的制备[按比例放大1(SU1)]：一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。用无菌的去离子水将一部分巴氏杀菌过的树脂稀释至10％。向烧瓶中加入198g的该10％树脂和2.0g的5mM无菌甘油水溶液。用1.04g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至6.0，然后加入133微升的HK1浓发酵剂培养物(1∶1500，HK1∶树脂)[浓发酵剂培养物的制备参见实施例24]并加入1.75g营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。16小时之后，将所得树脂用作SU2的接种物。
按比例放大2(SU2)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的树脂。用0.96g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入50.0g的SU1树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU3的接种物。
按比例放大3(SU3)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的树脂。用0.96g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入50.0g SU2树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。14.5小时之后，将所得树脂用作SU4的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大4(SU4)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的树脂。用1.40g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入100.0g SU3树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU5的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大5(SU5)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的树脂。用1.69g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入100.0g SU4树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。15小时之后，将所得树脂用作SU6的接种物。将不用于接种物的剩余树脂通过用浓(96％)硫酸将其pH降低至5.3并加入2000 ppm的山梨酸钾作为杀生物剂转化为最终产品。
按比例放大6(SU6)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的树脂。用1.82g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至5.8，然后加入100.0g SU5树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂通过用0.73g的浓(96％)硫酸将其pH降低至5.3并加入2000ppm的山梨酸钾(7.6mL的10wt％山梨酸钾水溶液)作为杀生物剂转化为最终产品。
监控处理的结果参见表27。
表27：按比例放大1：198g 10％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)，2g 0.5M甘油， 133微升HK1(1∶1500，树脂∶接种物)，1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH(30℃)Gardner 粘度 OD600(绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.96 ---- ---- 1.04 1.7 30 X32989-58-1 0.25 5.95 ---- 0.059 ---- ND 30 X32989-58-2 16 5.95 ---- 0.355 ---- 1.2 0.28按比例放大2：150g 15.7％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)， 50.0g-58，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.81 ---- ---- 0.96 2.0 35 X32989-60-1 1 5.81 ---- 0.134 ---- 2.0 0.50 X32989-60-2 4 5.82 ---- 0.130 ---- 1.9 0.42 X32989-60-3 8 5.83 ---- 0.124 ---- 1.9 0.58按比例放大3：150g 15.7％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)， 50.0g-60，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.81 ---- ---- 0.96 2.0 35 X32989-62-1 0.083 5.81 ---- 0.080 ---- ND 28 X32989-62-2 14.5 5.81 ---- 0.078 ---- 2.8 0.59按比例放大4：300g 15.7％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)， 100.0g-62，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.78 ---- ---- 1.40 2.0 35 X32989-64-1 1 5.77 ---- 0.064 ---- ND 24 X32989-64-2 4 5.76 ---- 0.050 ---- 2.3 0.39 X32989-64-3 8 5.77 ---- 0.055 ---- 2.3 0.49按比例放大5：300g 15.7％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)， 100.0g-64，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.80 ---- ---- 1.69 2.0 35 X32989-66-1 0.083 5.76 E 0.054 ---- ND 33 X32989-66-2 15 5.76 E 0.042 ---- 2.3 0.55按比例放大6：300g 15.7％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)， 100.0g-66，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 5.77 ---- ---- 1.82 2.0 35 X32989-68-1 1 5.76 E 0.036 ---- ND 24 X32989-68-2 4 5.75 ---- 0.054 ---- 2.1 1.7 X32989-68-3 8 5.75 E 0.039 ---- 2.2 0.41
实施例37：CrepetrolA6115起皱剂的Alcalase-生物脱卤作用
(数据和细节参见表BP5)
将一部分没有杀生物剂的CrepetrolA6115(可从HerculesIncorporated，Wilmington，DE；Milwaukee，Wisconisin plant获得)通过100目筛过滤。该树脂具有15.73％总固体、pH 5.1和86cps的Brookfield粘度。
巴氏杀菌：一3-L圆底烧瓶安装有一冷凝器、控制温度的循环浴和机械搅拌器。向烧瓶中加入2770g的该树脂。该树脂在1.5小时内从25℃加热到85℃。将树脂在85℃下保持20分钟，然后在30分钟内冷却至25℃。经过巴氏杀菌的树脂贮藏在无菌容器中。
生物脱卤作用：树脂接种物的制备
按比例放大1(SU1)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。用无菌的去离子水将一部分巴氏杀菌过的树脂稀释至10％。向烧瓶中加入198g的该10％树脂和2.0g的5mM无菌甘油水溶液。用2.65g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入0.62g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、133微升的HK1浓发酵剂培养物(1∶1500，HK1∶树脂)[浓发酵剂培养物的制备参见实施例24]并加入1.75g营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。16小时之后，将所得树脂用作SU2的接种物。
按比例放大2(SU2)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的树脂。用3.37g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入0.73g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、50.0g的SU1树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用SpectronicGenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU3的接种物。
按比例放大3(SU3)
一250-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入150g的所述巴氏杀菌过的树脂。用3.02g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入0.73g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、50.0gSU2树脂接种物(25％接种率)和1.31g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(SpectronicInstruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。14.5小时之后，将所得树脂用作SU4的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大4(SU4)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的树脂。用6.03g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.46g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、100.0g SU3树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂用作SU5的接种物。将不用于接种物的剩余树脂扔掉，但是可用于得到最终产品。
按比例放大5(SU5)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的树脂。用6.26g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.46g的Alcalse 2.5L型DX(可以从Novozymes获得)、100.0g SU4树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。15小时之后，将所得树脂用作SU6的接种物。将不用于接种物的剩余树脂通过用浓(96％)硫酸将其pH降低至5.3并加入2000ppm的山梨酸钾作为杀生物剂转化为最终产品。
按比例放大6(SU6)
一500-mL圆底烧瓶安装有一冷凝器、pH计、控制温度的循环浴、空气喷射管和机械搅拌器。向烧瓶中加入300g的所述巴氏杀菌过的树脂。用6.02g的30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至7.2，然后加入1.46g的Alcalase 2.5L型DX(可从Novozymes获得)、100.0g SU5树脂接种物(25％接种率)和2.62g的营养液。(所述营养液由8026ppm的磷酸二氢钾、27480ppm的尿素、4160ppm的硫酸镁和840ppm的氯化钙的自来水组成。)开始喷射空气，其温度保持在30℃。通过光密度(OD600)监控细菌生长，并通过GC监控生物脱卤作用。OD600是使用Spectronic GenesysTM UV/Vis分光光度计(Spectronic Instruments，Incorporated，Rochester，New York，USA)和具有1-cm径长的一次性比色杯通过在600nm的波长下测定其光密度确定的。8小时之后，将所得树脂通过用2.92g的浓(96％)硫酸将其pH降低至5.3并加入2000ppm的山梨酸钾(7.6mL的10wt％山梨酸钾水溶液)作为杀生物剂转化为最终产品。
监控处理的结果参见表28。
表28：按比例放大1：198g 10％ Crepetrol A6115(巴氏杀菌过)，2g 0.5M甘油， 0.62g的Alcalase，133微升HK1(1∶1500，树脂∶接种物)， 1.75g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.17 ---- ---- 2.65 1.7 30 X32989-59-1 0.25 7.16 ---- 0.058 ---- ND 32 X32989-59-2 16 7.17 ---- 0.450 ---- 0.57 0.12按比例放大2：150g 15.7％ Crepetrol A6115，0.73g的Alcalase， 50.0g-59，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃) Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.19 ---- ---- 3.37 2.0 35 X32989-61-1 1 7.18 ---- 0.167 ---- 1.7 3.6 X32989-61-2 4 7.19 ---- 0.180 ---- 1.5 0.27 X32989-61-3 8 7.18 ---- 0.183 ---- 1.4 0.24按比例放大3：150g 15.7％ Crepetrol A6115，0.73g的Alcalase， 50.0g-61，1.31g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.17 ---- ---- 3.02 2.0 35 X32989-63-1 0.083 7.16 ---- 0.087 ---- ND 33 X32989-63-2 14.5 7.16 ---- 0.130 ---- 1.5 0.22按比例放大4：300g 15.7％ Crepetrol A6115，1.46g的Alcalase， 100.0g-63，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.15 ---- ---- 6.03 2.0 35 X32989-65-1 1 7.13 ---- 0.079 ---- ND 31 X32989-65-2 4 7.12 ---- 0.095 ---- 1.9 0.59 X32989-65-3 8 7.11 ---- 0.110 ---- 1.9 0.37按比例放大5：300g 15.7％ Crepetrol A6115，1.46g的Alcalase， 100.0g-65，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH(30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.20 ---- ---- 6.26 2.0 35 X32989-67-1 0.083 7.17 C 0.050 ---- ND 35 X32989-67-2 15 7.17 C 0.107 ---- 1.7 0.19按比例放大6：300g 15.7％ Crepetrol A6115，1.46g的Alcalase， 100.0g-67，2.62g营养液 样品 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 0 7.16 ---- ---- 6.02 2.0 35 X32989-69-1 1 7.14 C 0.061 ---- 2.5 32 X32989-69-2 4 7.13 ---- 0.099 ---- 1.9 1.1 X32989-69-3 8 7.13 C 0.107 ---- 1.8 0.23
实施例38：高固体、同时酶-生物脱卤处理
一般步骤
通过将己二酸、二乙三胺和乙酸这些反应物以1∶0.9∶0.2的摩尔比于170℃下缩合3小时制备低分子量的三聚物。将反应产物稀释至50％固体。
将这些聚合物与环氧氯丙烷以环氧氯丙烷∶二乙三胺之比为0.82于40℃下反应3.5小时，并加入水以便反应物的总固体含量为40％。
在下一步中，将反应混合物稀释至总固体含量为31％并加热至68℃用于官能化和交联。在约2小时10分钟之后，在此温度下，通过加入30％硫酸使加入硫酸之后的pH是4.5，在Gardner-Holdt粘度“I/J”下使反应停止。将反应产物冷却至室温，加入1.75％磷酸(重量∶反应物体积)，并在加入磷酸之后，使用硫酸将其pH调整至pH2.7。向该pH中加入磷酸和硫酸的目的是获得粘度测量稳定的树脂。
对这些树脂分析其残余有机氯水平，并对含乙酸的物料发现1，3-DCP水平是816ppm。在纸试验中测定这些树脂，发现作为Kymene SLX2能有效地赋予纸湿强度。将这些树脂于32℃下贮藏6周，在这期间树脂没有发生胶凝。
生物脱卤作用(数据和细节参见表29)：用无封端树脂(KymeneE7129)制备接种物(参见表29的按比例放大1和按比例放大2)。将上面制备的封端树脂稀释至13.5％固体，用30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至pH 7.2，加入水解CPD形成物质的催化剂(Alcalase，Novozymes)、得自按比例放大2的接种物和营养液。不希望受理论约束，据信这种低固体中间步骤对提高微生物种群对新树脂的适应性是有用的。结束生物脱卤作用之后，开始接下来的批量(按比例放大4)。将上面制备的封端树脂稀释至20％固体，用30％氢氧化钠水溶液将其pH升高至pH 7.2，加入水解CPD形成物质的催化剂(Alcalase，Novozymes)、得自按比例放大3的接种物(20％接种率)和营养液。微生物快速生长，如光密度(OD600)所指示的(参见表29中的按比例放大4)。生物脱卤作用也快速，如DCP和CPD快速失去所指示的。
表29高固体湿强度树脂的Alcalase-生物脱卤作用按比例放大1：200g 8％ E7219(高压灭菌过的)，没有Alcalase， 400微升HK7，1.75g营养液 样品 时间 时间 (小时) pH(30℃)Gardner 粘度 OD600(绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 6:56 0 7.15 ---- ---- 2.54 ---- ---- X32966-3-1 7:58 1 7.14 ---- 0.171 ---- 213 143 X32966-3-2 10:57 4 7.13 ---- 0.162 ---- 144 181 X32966-3-3 13:58 7 7.08- 7.25 ---- 0.162 0.11 62 235 X32966-3-4 17:00 10 7.21 ---- 0.184 ---- ND 274 X32966-3-5 20:10 13 7.17 ---- 0.204 ---- ND 228 X32966-3-6 5:55 23 7.03 ---- 0.509 ---- ND 2.6 按比例放大2：350g 13.5％E7219(巴氏杀菌过的)， 5.03g Alcalase，87.5g的-3，3.06g营养液 样品 时间 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600(绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 6:40 0 7.23 ---- ---- 7.31 ---- ---- X32966-5-1 7:40 1 7.20 ---- 0.113 ---- 80 391 X32966-5-2 10:41 4 7.04- 7.21 ---- 0.149 0.33 ND 415 X32966-5-3 13:30 7 7.19 ---- 0.248 ---- ND 313 X32966-5-4 16:50 10 7.11- 7.27 ---- 0.383 0.31 ND 98 X32966-5-5 20:50 14 7.28 ---- 0.475 ---- ND 38 X32966-5-6 5:59 23 7.17 ---- 0.573 ---- ND 0.43
最终树脂具有38cps的Brookfield粘度。按比例放大3：200g 13.5％封端树脂，2.50g Alcalase， 22.22g的-5，1.75g营养液 样品 时间 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 7:00 0 7.22 ---- ---- 5.71 ---- ---- X32966-11-1 8:01 1 7.18 ---- 0.059 ---- 270 343 X32966-11-2 11:02 4 7.05- 7.23 ---- 0.092 0.28 40 621 X32966-11-3 14:01 7 7.17 ---- 0.165 ---- ND 660 X32966-11-4 17:00 10 7.15- 7.31 ---- 0.277 0.15 ND 627 X32966-11-5 5:50 23 7.11 ---- 0.772 ---- ND 0.4按比例放大4：160g 20％封端树脂，3.00g Alcalase， 40.0g的-11，1.40g营养液 样品 时间 时间 (小时) pH (30℃)Gardner 粘度 OD600 (绝对值) 30％ NaOH (g) DCP (ppm) CPD (ppm) ---- 6:56 0 7.25 ---- ---- 6.09 ---- ---- X32966-15-1 8:00 1 7.21 A-B 0.148 ---- 406 393 X32966-15-2 12:15 5.3 7.06- 7.23 A-A-1 0.346 0.27 283 586 X32966-15-3 17:45 10.6 7.03- 7.16 A-A-1 0.728 0.23 86 14 X32966-15-4 9:30 26.5 7.06 A-A-1 0.962 ---- ND 0.68 X32966-15-5 8:30 49.5 6.91 A-A-1 1.004 ---- ND 0.22