液体矿物组合物在改善植物对环境条件中的变化的适应性 应答中的用途 【技术领域】
本发明涉及保持或改善植物的健康， 可用于农业、 园艺学、 树艺学或用于牲畜牧草 地的施肥物质的组合物领域。 它更尤其涉及增强植物针对外部生物性胁迫或非生物性胁迫 的防御系统的组合物领域。背景技术
植物在生长、 发育、 生物量累积和产量方面的性能尤其取决于它们适应其环境条 件中的变化 ( 其包括引起物理、 化学和生物胁迫的事件 ) 的能力。
作为说明， 在农业、 园艺学、 树艺学和牲畜牧草地领域中， 已观察到胁迫事件， 如水 分胁迫、 渗透压胁迫或热胁迫是对植物生长， 并因此是对生产力水平的限制因素。 暴露于热 或干旱条件的植物通常具有低产量的植物生物量、 种子、 果实和人或动物 ( 包括牲畜 ) 可食 的其他产物。 在一些发展中国家中， 胁迫事件在例如水稻、 玉米或小麦的栽培中引起的作物 损失 ( 包括可利用的植物材料的产量损失 ) 促成食物短缺。
胁迫事件在植物中产生动员资源 (mobilise resource) 来允许植物存活并保持其 健康的生理防御机制， 以致对用来维持希望的植物材料的最初产量的资源不利。
一般而言， 现有技术中已知设计用于保护植物至少部分免遭外部胁迫事件的结果 的多种生物学或化学技术溶液。
如 例 如 国 际 申 请 PCT 号 WO2007/125531、 WO2007/060514、 WO2008/050350 和 W2008/145675 中所公开， 尤其可以提到设计用于产生转基因植物的植物遗传修饰技术， 该 转基因植物具有改善对胁迫的抗性的可传递特征。但是， 这些是特异、 长期和昂贵的技术， 其必须针对每个待在遗传上修饰的植物品种进行重复。 此外， 在许多国家中， 目前存在对在 大田中栽培经遗传修饰的植物品种的一般或几乎一般的监管禁令。
根据解决植物对胁迫事件的抗性问题的其他方式， 目前销售有机或有机矿物施肥 组合物， 尤其是液体组合物， 其显示对克服营养成分的缺乏具有全面的或特异的特性。还 已知设计用于刺激植物的天然防御反应来克服来自致病生物的胁迫的组合物， 例如包含物 质， 如从植物提取的分子、 农业聚合物 (agro-polymer) 的水解物、 微生物提取物、 天然或修 饰的多糖、 植物激素、 肽或蛋白质、 或已知涉及植物防御机制的植物蛋白质的激动或拮抗物 质的组合物。
可以证明前述组合物尤其对弥补营养成分的缺乏或对刺激针对致病生物如某些 病毒、 微生物或昆虫的植物防御是令人满意的。
但是， 据申请人所知， 不存在能够针对非生物类型的胁迫事件， 如水分胁迫、 渗透 压胁迫或热胁迫的条件的保护或刺激植物， 同时促成植物针对富含壳多糖的攻击者， 如真 菌的反应的纯矿物组合物。
在所有情况下， 由于在农业、 园艺学、 树艺学和牲畜牧草地中具有健康植物， 尤其 是产生良好的产量的植物的经济重要性和对人或动物食物的重要性， 现有技术中存在对与已知组合物相比， 可以以负担得起的价格公开可得的备选的或改善的组合物的需要。
发明概述
本发明涉及本文的其他部分中详细说明的配方 (I) 的液体矿物组合物在改善植 物对环境条件中的变化的适应性应答中的用途。
配方 (I) 的液体矿物组合物以浓缩组合物存在， 其以稀释在水中或含水液体中的 形式 ( 以它用于叶片喷淋 (leaf spraying) 的形式 ) 使用。
更具体而言， 本发明涉及下文公开的配方 (I) 的液体矿物组合物在改善植物对生 物性或非生物性胁迫事件的适应性应答中的用途。
非生物性胁迫事件尤其包含水分胁迫、 渗透压胁迫、 热胁迫或营养缺乏。
生物性胁迫事件尤其包含与生物 ( 包含含有壳多糖的致病微生物 ) 和由这些多种 生物产生或源自这些多种生物的物质 ( 包含壳多糖 ) 接触或受其感染。
附图描述
图 1A 和 1B 显 示 通 过 用 量 渐 增 的 配 方 (I) 的 组 合 物 处 理 诱 导 的 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana) 十日龄小植株中的钙应答曲线。在 x 轴上 ： 以秒记的时间。在 y 2+ 轴上 ： 以微摩尔 (μM) 计的细胞溶胶中的 Ca 离子浓度。 图 2A 和 2B 显示在存在或缺乏配方 (I) 的组合物的情况下预处理植物 24 小时后， 通过冷休克诱导的拟南芥十日龄小植株中的钙应答曲线。图 2A 和 2B 显示两个相同的测试 系列的结果。在 x 轴上 ： 以秒记的时间。在 y 轴上 ： 以微摩尔 (μM) 计的细胞溶胶中的 Ca2+ 离子浓度。
图 3 显示在存在或缺乏配方 (I) 的组合物的情况下预处理植物 24 小时后， 通过渗 透压休克诱导的拟南芥十日龄小植株中的过氧化氢产生 (H2O2) 的曲线。在 x 轴上 ： 以秒计 的时间。在 y 轴上 ： 随意 ( 相对 ) 发光单位 (RLU)。
图 4 显示在存在或缺乏配方 (I) 的组合物的情况下预处理植物 24 小时后， 通过 化学物质壳多糖的引出物 (elicitor) 休克诱导的拟南芥十日龄小植株中的过氧化氢产生 (H2O2) 的曲线。在 x 轴上 ： 以秒计的时间。在 y 轴上 ： 随意 ( 相对 ) 发光单位 (RLU)。
图 5 显示配方 (I) 的组合物对之前经受了不同胁迫事件的拟南芥小植株的发育的 长期作用。在 y 轴上 ： 应用胁迫条件的两周期间以根生长的厘米数计的小植株生长测量结 果。x 轴上的块图 ： (a) 未处理且未经受胁迫的对照小植株 ； (b) 经受 NaCl 水分胁迫的未处 理的对照小植株 ； (c) 经受甘露糖醇渗透压胁迫的未处理的小植株 ； (d) 用配方 (I) 的组合 物处理且未经受胁迫的小植株 ； (e) 用配方 (I) 的组合物处理并经受 NaCl 水分胁迫的小植 株； (f) 用配方 (I) 的组合物处理并经受甘露糖醇渗透压胁迫的小植株。
发明详述
许多研究后， 申请人已开发了液体矿物组合物， 其已显示具有改善植物对环境条 件中的变化的适应性应答的特性。
尤其是， 已显示在按适当的稀释度使用时， 具有本文中下文定义的配方 (I) 的液 体矿物组合物具有改善植物在对包括水分休克、 渗透压休克的多种环境条件中的变化的反 应中和与来自生物如真菌的某些物质接触时的防御反应中的适应性应答的特性。
因此， 本发明涉及包含以下配方 (I) 的用于叶片喷淋的液体矿物组合物在改善植 物对环境条件中的变化的适应性应答中的用途 ：
百分比以与该组合物总重量相比的重量百分比存在。
配方 (I) 的矿物组合物以浓缩形式的矿物组合物存在。对于用于叶片喷淋， 将配 方 (I) 的液体矿物组合物适当地稀释在水中或含水液体中。
为了验证组合物具有配方 (I) 的组合物的矿物成分的定性和定量特征， 本领域技 术人员将有利地参考公知的用于此类组合物的测定技术。
作为说明， 本领域技术人员可以使用以下组合物分析技术 ：
(i) 对 于 氨 形 式 的 氮 含 量， 使 用 Conway 所 述 的 技 术 (European Directives no.73/47 和 no.81/681 修订的 European Community Directive no.71/393) ；
(ii) 对于钾含量， 使用法国标准 NF U 44-140 的 K2O 测定技术和火焰发射技术 ；
(iii) 对于镁含量， 使用法国标准 no.NF U 44-140 和 NF U 44-146 所述的测定技 术和原子吸收技术 ；
(iv) 对于钠 Na2O 含量， 使用法国标准 no.NF U 44-140 所述的测定技术和火焰光 谱学技术 ；
(v) 对于钙含量， 使用法国标准 no.NF U 44-140 中定义的原子吸收光谱法技术和 原子吸收技术 ；
(vi) 对于总硫酸盐含量， 使用欧洲标准 no.CEE 8.1 定义的方法和重量分析技术 ；
(vii) 对于表示为 P2O5 的百分比 ( 重量 / 重量 ) 的总磷的测定， 使用标准 NF U 42-241(CEE 3.1) 和 NF U 42-246( 分光光度法 ) 定义的技术 ；
(viii) 对于氯含量， 使用法国标准 no.NF U 42-371 定义的技术 ；
(ix) 对 于 碳 酸 氢 盐 含 量， 使 用 根 据 描 述 于 法 国 标 准 no.NF EN ISO9963-1(T 90-036) 中的技术的用于碳酸氢根离子的测定技术 ；
(x) 对于硼含量， 如果终浓度低于 10 ％ ( 重量 / 重量 )， 则使用欧洲标准 no.CEE 9-1 和 no.CEE 9-5 定义的测定技术， 或者如果终浓度超过 10％ ( 重量 / 重量 )， 则使用欧洲 标准 no.CEE 10-1 和 no.CEE 10-5 定义的测定技术 ；
(xi) 对于铜含量， 使用欧洲标准 no.CEE 9-1 和 no.CEE 9-7 定义的测定技术和原 子吸收技术 ；
(xii) 对于锰含量， 使用标准 no.ICP NF EN ISO 11885 定义的测定技术 ；
(xii) 对于碘含量， 使用以下技术 ： 按照 Grote-Krekeler 制备法 ( 将石英管标 准 DIN 53474 滑入小瓷坩埚中 ) 将样品还原为灰分。气态碘吸收在苛性钠中， 然后用 Sandell-Kolthoff 法 ( 在 436nm 下用氧化还原对 Ce(IV)/As(III) 的催化影响 ) 进行光度 测定。 (xiv) 对于锌含量， 使用标准 ICP NF EN ISO 11885 定义的测定技术 ； 和
(xv) 对于铁含量， 使用标准 ICP NF EN ISO 11885 定义的测定技术。
在优选实施方案中， 配方 (I) 的组合物以专一性包含矿物成分或化合物的组合物 存在。在这些实施方案中， 配方 (I) 的化合物以纯的或专一性的矿物组合物存在， 并因此不 包含非碳氢化合物的有机成分或化合物。作为说明， 配方 (I) 的组合物不包含维生素、 氨基 酸、 糖类、 有机酸或碱等。
根据其他特征， 配方 (I) 的组合物以一般在用于植物上之前进行稀释的浓缩形式 存在。
为了产生以上配方 (I) 的组合物， 本领域技术人员将有利地参考本文 ( 包含实施 例 ) 的技术内容。
本文中使用的术语 “植物” 理解为意指单子叶植物和双子叶植物。
在本发明的意义中， 植物包含用于农业、 用于园艺学、 用于树艺学和用于牲畜牧草 地的那些。
它们尤其包含主要的作物谷物、 果树和有花植物。 植物尤其包含小麦、 大麦、 油菜、 玉米和水稻， 以及树种， 如苹果树、 梨树、 李树、 桃树和杏树。
双 子 叶 植 物 包 含 以 下 属 和 科： 睡 莲 科 (Nymphaeaceae)、金 鱼 藻 科 (Ceratophyllaceae)、毛 茛 科 (Ranunculaceae)、罂 粟 科 (Papaveraceae)、蓝 堇 科 (Fumariaceae)、 榆 科 (Ulmaceae)、 大 麻 科 (Cannabinaceae)、 荨 麻 科 (Urticaceae)、 杨 梅 科 (Myricaceae)、 山 毛 榉 科 (Fagaceae)、 桦 木 科 (Betulaceae)、 番 杏 科 (Aizoaceae)、 藜 科 (Chenopodiaceae)、马 齿 苋 科 (Portulacaceae)、石 竹 科 (Caryophyllaceae)、 蓼 科 (Polygonaceae)、白 花 丹 科 (Plumbaginaceae)、沟 繁 缕 科 (Elatinaceae)、藤 黄 科 (Guttiferae)/ 金 丝 桃 科 (Hypericaceae)/ 山 竹 子 科 (Clusiaceae)、锦 葵 科 (Malvaceae)、 锦 葵 科 (Malvaceae)、 茅 膏 菜 科 (Droseraceae)、 堇 菜 科 (Violaceae)、 葫 芦 科 (Cucurbitaceae)、杨 柳 科 (Salicaceae)、十 字 花 科 (Cruciferae)/ 十 字
花 科 (Brassicaceae)、木 犀 草 科 (Resedaceae)、岩 高 兰 科 (Empetraceae)、杜 鹃 花 科 (Ericaceae)、鹿 蹄 草 科 (Pyrolaceae)、水 晶 兰 科 (Monotropaceae)、报 春 花 科 (Primulaceae)、茶 藨 子 科 (Grossulariaceae)、景 天 科 (Crassulaceae)、虎 耳 草 科 (Saxifragaceae)、 蔷 薇 科 (Rosaceae)、 豆 科 (Leguminosae)/ 豆 科 (Fabaceae)、 胡颓子 科 (Elaeagnaceae)、 Halogaraceae、 千 屈 菜 科 (Lythraceae)、 柳 叶 菜 科 (Onagraceae)、 槲 寄 生 科 (Viscaceae)、 卫 矛 科 (Celastraceae)、 冬 青 科 (Aquifoliaceae)、 大戟科 (Euphorbiaceae)、 鼠 李 科 (Rhamnaceae)、 亚 麻 科 (Linaceae)、 远 志 科 (Polygalaceae)、 槭 树 科 (Aceraceae)、 酢 浆 草 科 (Oxalidaceae)、 牻 牛 儿 苗 科 (Geraniaceae)、 凤仙 花 科 (Balsaminaceae)、五 加 科 (Araliaceae)、伞 形 科 (Umbelliferae)/ 伞 形 科 (Apiaceae)、 龙 胆 科 (Gentianaceae)、 夹 竹 桃 科 (Apocynaceae)、 茄 科 (Solanaceae)、 旋 花 科 (Convolvulaceae)、菟 丝 子 科 (Cuscutaceae)、睡 菜 科 (Menyanthaceae)、紫 草 科 (Boraginaceae)、唇 形 科 (Lamiaceae)、杉 叶 藻 科 (Hippuridaceae)、水 马 齿 科 (Callitrichaceae)、车 前 草 科 (Plantaginaceae)、醉 鱼 草 科 (Buddlejaceae)、 木 犀 科 (Oleaceae)、玄 参 科 (Scrophulariaceae)、列 当 科 (Orobanchaceae)、狸 藻 科 (Lentibulariaceae)、桔 梗 科 (Campanulaceae)、茜 草 科 (Rubiaceae)、忍 冬 科 (Caprifoliaceae)、 五 福 花 科 (Adoxaceae)、 败 酱 科 (Valerianaceae)、 川续断科 (Dipsacaceae) 和菊科 (Compositae)/ 菊科 (Asteraceae)。 本文中使用的术语植物的 “适应性应答” 理解为意指对该植物应用环境条件的快 速变化后植物的任意可检测的生理改变。可检测的生理改变包含一种或几种组织代谢物 ( 包含胞内代谢物 ) 的量或浓度的任意改变， 或该植物的酶活性的任意可检测的定性或定 量改变， 或该植物的形态学中任意可检测的改变。植物的适应性应答尤其导致植物细胞产 生称为 “第二信使” 的代谢物。第二信使包含钙离子和活性氧类别 (ROS)。
“环境条件” 包含水分条件、 盐度条件、 渗透压条件、 氧化条件和热条件。本文中还 将植物的环境条件中的快速变化称为 “休克” 或 “胁迫” 。环境条件包含 (i)“生物” 条件， 其是植物的生物环境的结果 ； 和 (ii)“非生物” 条件， 其是植物的物理和化学环境的结果。
以非生物性胁迫或休克存在的环境条件中的变化包含盐、 渗透压、 氧化、 热和水分 胁迫或休克， 及由植物与毒性物质， 如某些金属或某些合成的有机毒性化学物质或某些天 然的或合成的矿物质接触引起的休克。 它们还包含暴露于电离或非电离辐射和养分的缺乏 或过量。
植物例如在沿海田地或草甸中在具有高氯化钠水平的土壤上生长时可以引起盐 胁迫或休克。盐胁迫尤其导致植物组织中稳态和离子分布的失调， 其导致种子萌发和植物 生长的改变。
可以通过在富含甘露糖醇的基底上生长来人为引起渗透压胁迫或休克。 渗透压胁 迫尤其导致植物组织中稳态和离子分布的失调， 其导致种子萌发和植物生长的改变。
可以通过在甲基紫精上生长来人为引起氧化胁迫或休克。 氧化胁迫尤其引起活性 氧类别 (ROS) 的形成、 蛋白质变性和叶绿素降解， 其导致植物的漂白， 并可以导致死亡。
热胁迫或休克包含由热引起的胁迫和由冷引起的胁迫。 在高温下生长引起的胁迫 尤其引起蛋白质的变性， 其导致植物生长的改变。在低温下生长引起的胁迫尤其引起活性 氧类别的形成和细胞膜的破裂， 其导致植物生长的改变。
可以通过在干燥条件中生长来引起水分胁迫。 水分胁迫尤其引起细胞生长和光合 作用的抑制， 其导致植物生长的改变。
以生物性胁迫或休克存在的环境条件中的变化包含由使植物与单细胞或多细胞 生物， 例如细菌、 病毒、 真菌、 以植物为食的生物、 昆虫或致病生物接触引起的胁迫或休克， 或由使植物与源自单细胞或多细胞生物的物质接触引起的胁迫或休克。 生物性胁迫可以由 细菌、 病毒或真菌或它们的部分、 或细菌、 病毒或真菌来源的物质引起。 2+
如通过实施例中所示的增加 Ca 离子浓度的作用所说明， 本发明的配方 (I) 的组 合物具有直接诱导涉及植物对环境条件中的变化的适应性应答的生理途径， 尤其是诱导钙 信号传导途径的特性。因此， 配方 (I) 的组合物诱导细胞的细胞溶胶中的钙变化， 其水平取 决于已使之与植物接触的配方 (I) 的组合物的量。
已显示配方 (I) 的组合物诱导植物对非生物性胁迫如冷休克的应答中的变化。
同样， 实施例中所示的结果显示， 本发明的配方 (I) 的组合物能够在对应用渗透 压胁迫的反应中刺激过氧化氢 (H2O2) 的产生的增加。
因此， 在它的某些方面， 通过配方 (I) 的组合物引起的植物的适应性应答的改善 在本发明的意义中包含 ： (i) 可检测地增加植物对非生物性胁迫或生物性胁迫的钙应答的特性， 通过测量 2+ 植物组织中， 且尤其是植物细胞的细胞溶胶中的 Ca 离子浓度来检测钙应答的增加 ； 和
(ii) 响应非生物性胁迫或生物性胁迫， 可检测地增加植物组织中过氧化氢的产生 的特性。
本发明的配方 (I) 的组合物具有在对生物性胁迫或非生物性胁迫的反应中增加 植物的钙应答的特性的事实是重要的， 因为现有技术中已知钙应答时产生的钙离子是级联 过程中在代谢上和时间先后顺序上定位非常高的信号传导途径中称为 “第二信使” 的类别， 该级联过程导致经受了生物性胁迫或非生物性胁迫的植物的适应性应答的诱导。已知钙 离子浓度的增加引起对这些离子具有亲和力的蛋白质， 如钙蛋白 (calciprotein) 的活化。 然后活化的钙蛋白转而活化其他酶活性蛋白质， 如激酶， 或活化其他非酶蛋白质， 如 “泵” 蛋 白质 (Sanders， D.， Brownlee， C. 和 Harper， J.F.(1999).Communicating with calcium. Plant Cell 11， 691-706 ； Shapiro， A.D.(2005).Nitric oxide signaling in plants. Plant Hormones 第 72 卷， 339-398 ； Brownlee， C.(2003).Plant signalling ： Calcium first and second.Current Biology 13， R923-R924 ； Hetherington， A.M. 和 Brownlee， C.(2004). 2+ The generation of Ca signals in plants.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 55， 401-427 ； Harper， J.F.， Breton， G. 和 Harmon， A.(2004).Decoding Ca(2+)signals through plant protein kinase.Annu Rev Plant Biol 55， 263-288 ； Mori， I.C.， Murata， Y.， Yang， Y.Z.， Munemasa， S.， Wang， Y.F.， Andreoli， S.， Tiriac， H.， Alonso， J.M.， Harper， J.F.， Ecker， J.R.， Kwak， J.M. 和 Schroeder， J.I.(2006).CDPKs CPK6and CPK3 function in ABA regulation of guard cell S-type anion-and Ca2+ -permeable channels and stomatal closure-art.no.e327.Plos Biology 4， 1749-1762 ； George， L.， Romanowsky， 2+ S.M.， Harper， J.F. 和 Sharrock， R.A.(2007).The ACAl0 Ca ATPase Regulates Adult Vegetative Development and Inflorescence Architecture in Arabidopsis.Plant Physiol.)。 这些级联过程帮助在对最初的胁迫的反应中发展植物的特异性适应性应答。 作
为植物的适应性应答的实例， 可以提到水分胁迫期间限制水分丧失的气孔关闭， 对热胁迫 或渗透压胁迫的反应中的保护性渗压剂的产生， 及具有限制致病生物的进展的作用的内源 性毒性物质的产生。
本发明的配方 (I) 的组合物具有在对生物性胁迫或非生物性胁迫的反应中增加 植物的氧化应答， 尤其是活性氧类别的产生的特性是重要的。更具体而言， 本发明的配方 (I) 的组合物尤其引起过氧化氢产生的增加是尤其有利的， 过氧化氢是最稳定的活性氧类 别并因此作为 “第二信使” 化合物， 可以远距离诱导产生植物的活性应答所需的细胞反应。 应记住， 活性氧类别的产生引起植物对非生物性胁迫的大多数适应性应答的触发。还应指 出， 植物在对生物性胁迫或非生物性胁迫的反应中的适应性应答引起包含以下的活性氧类 别的产生 ： 过量能量的热逸散 ； 用氧作为电子传递链受体的光化学能量逸散 ； 用全系列的 抗氧化酶和分子来解毒所产生的 ROS ； 抗氧化酶 ( 超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶、 谷胱甘肽 过氧化物酶、 抗坏血酸过氧化物酶、 硫氧还蛋白 / 硫氧还蛋白还原酶对、 热休克蛋白 ) 的涉 及； 载铁蛋白和载铜蛋白 ( 运铁蛋白、 铁蛋白 ) 的涉及 ； 小的抗氧化分子 ： 谷胱甘肽、 类胡萝 卜素、 维生素 A、 维生素 C( 抗坏血酸 )、 维生素 E( 生育酚 )、 泛醌、 黄酮类化合物、 胆红素的涉 及； 作为辅因子对抗氧化酶活性至关重要的少量元素 ( 铜、 锌、 硒 ) 的涉及。
因此， 在这些方面之一中， 配方 (I) 的组合物的用途的特征在于改善植物对生物 性胁迫或非生物性胁迫的适应性应答。
在某些实施方案中， 配方 (I) 的组合物的用途的特征在于非生物性胁迫选自水分 胁迫、 渗透压胁迫、 热胁迫或营养缺乏。营养缺乏包含矿物缺乏， 其包含少量元素的缺乏。
根据其他实施方案， 配方 (I) 的组合物的用途的特征在于生物性胁迫尤其包含与 生物 ( 包含含有壳多糖的致病微生物 ) 和由这些多种生物产生或源自这些多种生物的物质 ( 包含壳多糖 ) 接触或受其感染。
此外， 申请人还已根据本发明显示， 尤其是通过应用于叶片， 配方 (I) 的组合物具 有刺激置于正常生长环境中的植物和已对其应用了至少一种非生物性或生物性胁迫条件 的植物二者的植物根生长的特性。
因此， 还在其他方面， 本发明的用途的特征在于配方 (I) 的组合物还导致植物根 发育的增加。可以通过测量平均长度， 通过根生长速度的增加来显示根发育的增加。
因此， 配方 (I) 组合了 (i) 增加植物对环境条件中的变化的适应性应答的作用和 (ii) 通过对增加的根发育的作用来显示的生理刺激作用。
因此， 本发明显示， 在优选通过分散在叶片上应用于植物时， 配方 (I) 的组合物引 起以下技术作用 ：
- 植物对水分胁迫、 渗透压胁迫和热胁迫的钙应答的增加 ；
- 壳多糖引出物对植物防御机制的引出反应的增加 ；
- 通过刺激包含过氧化氢 (H2O2) 的活性氧类别的产生改善植物细胞的氧化状态 ；
- 幼小植物根生长速度的增加 ； 和
- 幼小植物对干旱的抗性的增加。
尤其是， 实施例中显示了配方 (I) 的组合物的以下作用 ：
A. 在植物应答涉及信号传导途径的生物性 / 非生物性胁迫 (Ca2+ 和 H2O2) 的第二 信使水平 ：a) 植物将配方 (I) 的组合物感知为通过涉及拟南芥小植株的细胞中的细胞溶胶 钙变化的信号传导途径诱导的外源刺激物。用配方 (I) 的组合物处理诱导了植物应答胁迫 的能力的变化。
b) 用配方 (I) 的组合物预处理的小植株中活性氧类别如 H2O2 响应壳多糖引出物 的产生比在用水喷淋的小植株中测量的高。此结果显示了用配方 (I) 的组合物预处理的植 物的防御反应响应由致病剂产生的引出物的增加。
B. 在小植株的生长和发育的水平
a) 配方 (I) 的组合物在正常条件中或在 ( 渗透压或盐 ) 胁迫条件中显著增加拟南 芥小植株的根生长。
b) 通过配方 (I) 的组合物预处理改善了经受剧烈水分胁迫的小植株的恢复或发 育。
因此， 实施例中的结果显示， 配方 (I) 的组合物在正常生长条件下和在胁迫条件 下都对小植株的生长和发育具有有益作用。
在某些有利的实施方案中， 本发明的组合物具有为配方 (I) 所包含的以下配方 (II) ：
其中， 百分比以与该组合物总重量相比的重量百分比存在。还在其他有利的实施方案中， 本发明的组合物具有为配方 (I) 和 (II) 中的每一个 所包含的以下配方 (III) ：
其中， 百分比以与该组合物总重量相比的重量百分比存在。
本发明的另一目的还是本文 ( 包含实施例 ) 中公开的任意组合物， 尤其是配方 (I)、 (II) 和 (III) 的组合物。
在某些实施方案中， 可以按照下表中指出的方案获得配方 (I) 的组合物 ：以上百分比以各成分与该液体组合物总重量相比的重量百分比存在。
在室温下将以上多种成分加至自来水， 然后剧烈混合所获得的溶液， 直至获得稳 定的液体组合物。 然后过滤液体组合物来去除未溶解的固体， 以获得澄清、 随时可用的配方 (I) 的组合物。
有利地， 配方 (I) 的组合物 ( 包含配方 (II) 的其具体实例 ) 以浓缩形式的液体制 剂存在， 将其稀释在一定体积的水中来获得稀释的、 随时可用的组合物。
因此， 本发明还涉及以浓缩的配方 (I) 的组合物 ( 包括配方 (II) 的组合物 ) 存 在的用于叶片喷淋的液体矿物组合物 ( 已将其稀释在 50-10000 倍于其体积的水中， 优选 100-5000 倍于其体积的水中， 例如 100-1000 倍或 400-600 倍于其体积的水中的 ) 在改善植 物对环境条件中的变化的适应性应答中的用途。
本发明还涉及浓缩的配方 (I) 的矿物组合物的用途， 其特征在于在叶片喷淋前， 按组合物 (I) ： 水或含水液体为 0.1 ∶ 500(V/V) 至 10 ∶ 500(V/V)， 优选 0.5 ∶ 500(V/V) 至 2 ∶ 500(V/V) 的比例将配方 (I) 的组合物稀释在水中。
实际上， 优选通过叶片喷淋， 通过分散在植物的地上部分来将以上稀释的组合物 有利地应用于植物。
在某些实施方案中， 通过按每年每公顷待处理的植物表面 0.5l 至 20l， 优选每公 顷待处理的植物表面 1l 至 10l 的量一次性或分多次分散在植物的地上部分来应用以上稀 释的组合物。
此外， 通过以下图和实施例来说明本发明， 而不是以任意方式限制本发明。实施例 A. 用于实施例的材料和方法
A.1. 植物材料
十日龄的拟南芥生态型 Col 0( 野生型 ) 或生态型 No0( 表达水母发光蛋白钙探针 的转基因 ) 的小植株。
在营养琼脂 (Murashige 和 Skoog MS 培养基 ) 上在培养皿中体外培养， 或在盆中 或 Jiffy 盆中在盆栽土壤上培养小植株。
对于体外培养小植株， 按约 100 粒种子一排播种之前已消毒的拟南芥种子。
A.2. 测量拟南芥小植株的钙应答
测量前一天， 从体外培养物收集 50 株约十日龄的小植株， 并按三株放入培养皿中 的 500μl 含 2μM coelentarazine 的水中， 然后于室温下在暗处过夜孵育。第二天， 如下 通过发光计进行测量 ： 将一批 3 株小植株转入以所选择的浓度包含 1ml 配方 (III) 的组合 物的溶液的培养皿， 并在使小植株与产物接触 ( 通过浸渍 ) 后记录水母发光蛋白发出的信 号。记录信号 15 分钟后， 通过注入含有 100mM CaCl2 的裂解溶液来去除水母发光蛋白， 以 校准信号。
A.3. 测量拟南芥小植株的 H2O2 产生
通过氧化鲁米诺产生的发光来测量 10 日龄拟南芥小植株的 H202 产生。将一批 3 株小植株放入发光计中的培养皿中， 然后在注入补充了 350mM 甘露糖醇或 10μg/ml 壳多糖 ( 此处用作能够诱导 H2O2 产生的阳性对照 ) 的反应介质 (20μM 鲁米诺， 4 单位过氧化物酶， 5mM Tris-HCL pH7.8) 后测量发光 10 分钟。
A.4. 用配方 (I) 的组合物预处理的体外培养的小植株的根生长的测量
对于每个测试， 通过用 2％的配方 (III) 的组合物喷淋来处理一排 10 日龄的小植 株， 然后转移至正常培养基或诱导胁迫的培养基 (100mM NaCl 或 350mM 甘露糖醇 )。 然后每 天跟踪根生长。
A.5. 用配方 (I) 的组合物预处理后拟南芥小植株在胁迫条件下的发育的观察
将拟南芥种子播种在盆中的盆栽土壤上， 然后在人工气候室 (t°＝ 22/20℃， 光 周期 9/15， 70％湿度 ) 中培养 10 天 ( 拟南芥 )
然后通过用水 ( 对照 ) 或用 2 ％于水中的配方 (III) 的组合物喷淋叶片来处理 幼小植株， 然后置于胁迫条件中 ： 渗透压胁迫 ( 每天用 350mM 甘露糖醇浇灌 )、 盐胁迫 ( 用 100mM NaCl 浇灌 ) 或水分胁迫 ( 不浇灌 )。
然后通过拍照每天跟踪小植株的发育。
实施例 1 ： 制备配方 (I) 的组合物
用以下配方 (III) 制备配方 (I) 的组合物 ：
其中， 百分比以与该组合物总重量相比的重量百分比存在。 按照下表中总结的方案制备配方 (III) 的组合物。成分 自来水 KI NaCl H3BO3 NaHCO3 MgCl2 K2SO4 盐的量 (g) 2500.00 1.00 24.00 20.00 72.50 65.00 247.50 0.40 9.60 8.00 29.00 26.00 99.00 所加入的盐的终浓度 (g/l)14102348382 A CN 102348401 CuSO4.5H2O (NH4)2SO4 总计
2.50 62.50 495.00说明书1.00 25.00 198.0013/15 页在室温下将多种成分加至自来水， 然后剧烈混合溶液， 直至获得稳定的液体组合物。 然后过滤液体， 以获得澄清、 稳定、 随时可用、 可溶的配方 (III) 的组合物。对于过 滤， 可以使用孔径从 7 微米至 10 微米的无灰纤维素滤纸
在以下实施例中， 以在自来水中的 0.01％至 8.00％ ( 体积 / 体积 ) 的不同稀释液 使用配方 (III) 的组合物， 且产生的稀释组合物用于喷淋叶片。
实施例 2 ： 拟南芥小植株对将配方 (I) 的组合物应用于它的叶片的钙应答的测量
申请人已显示， 配方 (III) 的组合物的应用在细胞中引起钙变化， 其证明植物将 配方 (III) 的组合物感知为导致植物中的适应性应答的刺激物。
结果显示在图 1A 和 1B 中， 其显示不同浓度的配方 (III) 的组合物在 10 日龄拟南 芥小植株中引起的钙变化 ( 箭头＝小植株与产物接触的时间 )。
为了这样做， 使用了在细胞溶胶中表达水母发光蛋白基因的拟南芥小植株。测试 了在水中的 0.01-8％ (V/V) 的配方 (III) 的组合物的稀释液， 并进行了使用水的对照。在 使小植株与溶液接触时， 观察到了快速的信号变化， 其可以归因于操作本身 ( 机械休克 )， 且独立于产物浓度 ( 用水对照也观察到它 )。
结果显示， 配方 (III) 的组合物导致双峰剂量依赖性钙应答， 峰值在使小植株与 产物接触后的 30 秒和 1 分钟之间， 对于低于 2％ (V/V) 的稀释液， 随后是逐渐回到基础水平 的阶段， 对于高于 2％ (V/V) 的稀释液， 随后是延长的平台。 应注意， 配方 (III) 的组合物浓 度高于 2％ (V/V) 时， 钙应答快速、 剧烈且具有高背景噪音。
因此， 可以从这些测试得出结论 ：
1) 即使高度稀释至 0.01％ (V/V)， 配方 (III) 的组合物对植物的钙应答也具有刺 激作用。产物引起细胞溶胶中的钙变化， 其随应用于叶片的配方 (III) 的组合物的浓度而 变化， 并因此随应用于叶片的配方 (III) 的组合物的量而变化。
2) 对于超过 2％ (V/V) 的浓度， 此钙应答具有与针对低于 2％的浓度获得的特征不 同的特征。对于超过 2％ (V/V) 的浓度， 钙应答显著具有大的平台期 (δ[Ca2+] ＞ 0.5％ )， 其可暗示对这些 “第二信使” 钙信号的不同的最终生物应答。
实施例 3 ： 配方 (I) 的组合物的叶片应用对拟南芥小植株对冷休克的钙应答的长 期作用的研究
为了测定用配方 (III) 的组合物预处理拟南芥小植株对由冷休克引起的钙应答 的作用， 在测量前一天用配方 (III) 的组合物的 2％溶液或用水 ( 对照 ) 喷淋 10 日龄小植 株。处理后约 3 小时， 按材料和方法中所述收集这些小植株， 并使其与 coelentarazine 过 夜孵育。第二天， 记录通过冷休克在这些小植株中引起的钙应答。
已知通过将小植株浸渍在 4℃的水中获得的冷休克引起快速、 剧烈和短暂的钙应 答。
图 2A 和 2B 显示用配方 (III) 的组合物预处理 24 小时和 48 小时后， 在两个重复 三次的独立实验的系列中获得的平均结果。
取决于预处理 ( 配方 (III) 的组合物或水 )， 24 小时后观察到了由胁迫引起的应 答强度的显著差异。
显示用配方 (III) 的组合物处理显著增加了对冷的应答。
在第二测试系列中， 与用水处理的植物相比， 用配方 (III) 的组合物处理引起对 冷的显著脱敏。
因此， 取决于所考虑的测试， 配方 (III) 的组合物对应答具有放大或抑制作用， 使 得不能对其作用下结论。48 小时后， 在两个实验系列上， PRP 处理明显不再有别于水处理 ( 对照 )。
最后， 实施例 3 的结果显示， 如果在 24 小时的最大延迟内应用冷休克， 则用 2 ％ (V/V) 的配方 (III) 的组合物预处理引起植物中对冷休克的钙应答的行为变化。
实施例 4 ： 配方 (I) 的组合物对拟南芥小植株中响应渗透压休克或响应由致病生 物产生的物质的引出物处理的 H2O2 产生的长期作用的研究
在实施例 4 中， 目的是测定用配方 (III) 的组合物预处理拟南芥小植株对由渗透 压休克或由真菌微生物产生的引出物物质壳多糖引起的 H2O2 应答的作用。 壳多糖在此用作 阳性对照， 已知其引起 H2O2 产生， 并模拟由能够引起防御反应的致病剂引起的胁迫， 用于该 防御反应的标志之一是 H2O2 产生。
为了这样做， 测量前一天， 用配方 (III) 的组合物的 2％溶液或水 ( 对照 ) 喷淋 10 日龄小植株。第二天， 按材料和方法中所述在这些小植株中测量由渗透压休克 ( 图 3) 或由 壳多糖 ( 图 4) 引起的 H2O2 产生。
结果在图 3 和 4 中给出。图 3 和 4 显示 24 小时前用水或 2％ (V/V) 的配方 (III) 的组合物预处理的拟南芥小植株中响应渗透压休克 ( 图 3) 或壳多糖 ( 图 4) 的 H2O2 产生。
响应甘露糖醇 ( 在此模拟水胁迫 )， 观察到的应答强度变化大。 在用配方 (III) 的 组合物预处理的小植株中测量的强度水平比在用水预处理的小植株中测量的强度水平低。 但是， 与通过用水取代甘露糖醇应用于之前用水 (H2O 对照 ) 喷淋或用配方 (III) 的组合物 (PRP) 喷淋的植物上获得的 H2O2 产生相比， 甘露糖醇并不引起显著不同的 H2O2 产生。
关于由壳多糖引起的 H2O2 产生， 应注意， 在用配方 (III) 的组合物预处理的小植 株中， 壳多糖引起 H2O2 产生， 其比用配方 (III) 的组合物预处理但在存在水的情况下孵育 (PRP) 的小植株的 H2O2 产生高 4 至 5 倍。
在用水预处理并通过壳多糖刺激的小植株的情况下， H2O2 产生并不与通过水刺激 相同的小植株 (H2O 对照 ) 显著不同。
总之， 来自实施例 4 的结果显示， 用配方 (III) 的组合物预处理小植株对响应壳多 糖的 H2O2 产生具有刺激作用。这表明， 用配方 (III) 的组合物预处理的小植株具有增加其 响应包含或产生壳多糖的致病剂如真菌的可能的感染的防御反应的能力。
实施例 5 ： 配方 (I) 的组合物对体外培养的拟南芥小植株根生长的长期作用
在实施例 5 中的研究中， 用 2％ (V/V) 的配方 (III) 的组合物或用水喷淋培养在琼 脂平皿中的拟南芥小植株。
第二天， 将小植株转入新平皿， 在正常培养基上， 或在含有 100mMNaCl 或 350mM 甘露糖醇的诱导胁迫的培养基上。
然后每天测量小植株的主根长度。
图 5 显示转移后 24 小时按每批 20 至 30 株小植株进行的测量的结果。尽管较大 的长度变异性， 但观察到了 PRP-EPV 产物对根生长的非常显著 (p ＜ 0.01) 的综合作用。不 论在对照条件 ( 未胁迫 ) 或胁迫条件 (NaCl 或甘露糖醇 ) 中， 用配方 (III) 的组合物预处 理的小植株中主根长度的增加都大于用 H2O 处理的小植株中的增加。通过读图， 预处理的 小植株比对照小植株更好地抵抗胁迫是显而易见的。
总之， 实施例 5 的结果显示， 配方 (III) 的组合物对主根的生长具有积极作用。包 含于胁迫条件中的此更好的生长产生对水分胁迫更好的耐受。
实施例 6 ： 配方 (I) 的组合物对盆内栽培的拟南芥小植株的发育的长期作用
为了测试配方 (III) 的组合物对拟南芥小植株对多种胁迫的抗性的作用， 通过用 2％ (V/V) 的配方 (III) 的组合物或水 ( 对照 ) 喷淋来处理 10 日龄盆栽植物， 然后在第二 天用含有 350mM 甘露糖醇 ( 刺激渗透压胁迫的水分胁迫 ) 或 100mM NaCl( 盐胁迫 ) 的水浇 灌， 或不浇灌 ( 水分胁迫 )。
胁迫处理 2 周后， 用纯水正常浇灌小植株。
观察到无论是否已用配方 (III) 的组合物处理了小植株， 处理对它们的发育都具 有相同的作用。
相反， 在停止浇灌引起水分胁迫后， 在已用配方 (III) 的组合物预处理的小植株 中， 再给水后发育的恢复改善。此改善的恢复在再给水 10 天后更明显。
结论 ： 实施例 5 的结果显示， 用配方 (III) 的组合物预处理改善了植物在高水分胁 迫 ( 地上部分的脱水 ) 后的恢复。