针对重组MUC1的适体.pdf

本发明描述了针对糖基化形式的MUC1的适体，以及它们在治疗和诊断与增高的MUC1生成量相关的病症中的应用。

1.  针对重组MUC1的适体配体。

2.  权利要求1的适体，其中所述适体包括寡核苷酸。

3.  权利要求2的适体，其中所述寡核苷酸是DNA。

4.  以上权利要求中任一项的适体，所述适体包括一种或多种修饰的核苷酸。

5.  权利要求2或3的适体，所述适体为至少25个核苷酸长。

6.  以上权利要求中任一项的适体，所述适体包含选自下列各项的一种序列：
GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA(SEQ ID NO：1)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC(SEQ ID NO：2)
CAAACAATCAAACAGCAGTGGGGTG(SEQ ID NO：3)
TACTGCATGCACACCACTTCAACTA(SEQ ID NO：4)
GGGTTATATTACTCGGCCGGTGTAA(SEQ ID NO：5)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC(SEQ ID NO：6)
GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG(SEQ ID NO：7)
GCTGGGTAAATAGATGATTCCCGGC(SEQ ID NO：8)
AGTGGTGGTTTTATAAGACTGATAC(SEQ ID NO：9)
TAGCCTTAATGCCTTTGTAAGGCGA(SEQ ID NO：10)
CGGTCTACGGAGCCGCGTTAAACTT(SEQ ID NO：11)。

7.  权利要求6的适体，所述适体由SEQ ID NO：1-11中的任一项组成。

8.  权利要求1-5中任一项的适体，所述适体包括与SEQ ID NO：1-11中的任一项具有至少70％同一性的序列。

9.  以上权利要求中任一项的适体，所述适体是针对糖基化的MUC1的配体。

10.  以上权利要求中任一项的适体，所述适体对糖基化的MUC1比对非糖基化MUC1具有更高的结合亲和性。

11.  以上权利要求中任一项的适体，所述适体对重组MUC1比对由3个拷贝的重复序列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS(SEQ ID NO：12)组成的60-mer，或对9个氨基酸的肽APDTRPAPG(SEQ ID NO：13)中的一项或这两项具有更高的结合亲和性。

12.  以上权利要求中任一项的适体，其中所述适体与MUC1相互作用的K_d小于1000nM。

13.  以上权利要求中任一项适体，所述适体与另一个活性部分缔合。

14.  权利要求13的适体，其中所述另一个部分是标记。

15.  权利要求13的适体，其中所述另一个部分是治疗剂。

16.  权利要求13的适体，其中所述另一个部分是放射源。

17.  权利要求13的适体，其中所述另一个部分是抗体或片段或部分。

18.  一种表达载体，所述表达载体编码权利要求1-12中任一项的适体。

19.  一种核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1-11中的任一项，或与与SEQ ID NO：1-11中任一项具有至少70％同一性的序列互补。

20.  一种RNA序列，所述RNA序列与SEQ ID NO：1-11中的任一项，或与与SEQ ID NO：1-11中任一项具有至少70％同一性的序列同源。

21.  治疗与MUC1相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1-17中任一项的适体。

22.  权利要求21的方法，其中所述病症与增高的MUC1生成量相关。

23.  权利要求21的方法，其中所述病症选自下列各项：癌症、胆囊纤维变性、哮喘、慢性阻塞性肺病、非-恶性炎性上皮疾病、腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺腺癌、非-小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、和结肠直肠癌。

24.  诊断与MUC1相关的病症的方法，所述方法包括检测权利要求1-17中任一项的适体与细胞、组织、或样品的结合。

25.  如权利要求1-17中任一项中所述的适体，其用在治疗或诊断中。

26.  如权利要求1-17中任一项中所述的适体在制造用于治疗与MUC1相关的病症的药物中的应用。

27.  权利要求26的应用，其中所述病症与增高的MUC1生成量相关。

28.  权利要求26的应用，其中所述病症选自下列各项：癌症、胆囊纤维变性、哮喘、慢性阻塞性肺病、非-恶性炎性上皮疾病、腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺腺癌、非-小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、和结肠直肠癌。

29.  如权利要求1-17中任一项中所述的适体在制造用于检测或诊断与MUC1相关的病症的诊断剂中的应用。

30.  一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-17中任一项中所述的适体。

针对重组MUC1的适体
发明领域
本发明涉及适体的产生，所述适体识别MUC1肿瘤标记的糖基化和非糖基化形式，涉及该适体本身，并涉及包括所述适体的应用和方法。
发明背景
癌症是世界上最主要的致病原因。多年来已经对疾病特有分子的鉴定进行了研究。发现许多分子是肿瘤中独特的，或在癌症中过表达、改变或另外不同。在针对癌症诊断和治疗的许多免疫学方法中，使用这样的肿瘤标记作为靶标。
MUC1蛋白是一种这样的标记，已知其在恶性细胞中过表达。这种上皮黏蛋白由MUC1基因编码。它不是典型的细胞外复合黏蛋白，诸如发现作为覆盖胃-肠和呼吸道的粘膜层主要成分的那些，但是它是跨膜分子，其由大多数腺上皮细胞表达。该蛋白质由许多不同的区域组成，包括具有推定信号肽和简并的串联重复的N-末端、跨膜区和C-末端细胞质尾部。该蛋白质的主要部分是串联重复区。其由独特的肽序列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS的简并重复组成。重复的数量随等位基因而变化，由此使得该基因和蛋白质是高度多态的。MUC1还称为MUC-1、黏蛋白1、muc-1、上皮唾液蛋白、花生-反应性尿黏蛋白(PUM)、多态上皮黏蛋白(PEM)、CD227、上皮膜抗原(EMA)、DF3抗原和H23抗原。
MUC1黏蛋白通过与微丝网络的相互作用而被限制在顶端细胞的表面。尽管MUC1由正常的腺上皮细胞广泛表达，但是当细胞变为恶性时，该表达明显增加。已有文件充分记录了在乳腺癌和卵巢癌，以及一些肺癌、胰腺癌和前列腺癌中的这种情况。近期，还显示出MUC1是有价值的膀胱癌标记，并在许多研究中已用于膀胱癌的诊断。抗体研究还显示出不仅MUC1在癌中过表达，而且糖基化模式也被改变。因此，在乳腺癌黏蛋白中，糖基化的变化导致核心蛋白中的某些表位被暴露出来，所述表位被遮盖在由泌乳的乳腺产生的黏蛋白中。多年来，已经在许多免疫治疗方法中探究了MUC1的这些特征，所述方法主要包括针对乳腺癌和膀胱癌的放射性标记抗体。还在动物模型中进行了对基于MUC1的活性特异性免疫治疗的其他尝试，从而研究基于MUC1的免疫原的功效。
这些免疫治疗方法具有一些鼓舞人心的结果，且引起针对疫苗治疗和抗体治疗这两者的临床试验。然而，这些策略不是没有问题的。放射性标记抗体技术仅限于适度的(毫居里)放射剂量，因为放射性标记抗体的长循环时间使得骨髓毒性成为一个问题。另一个问题是产生特异性单克隆抗体所需的时间周期。另外，近期试图使用肽代替抗体造成了对MUC1黏蛋白具有非常低的亲和性的分子。
国际专利申请WO2004/081574描述了针对合成的MUC1肽的适体的产生。该公开物描述了产生这样的适体，即，所述适体靶向由3个拷贝的重复序列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS(SEQ ID NO：12)组成的60-mer肽或靶向该序列中包含的9个氨基酸的肽APDTRPAPG(SEQ ID NO：13)。虽然该方法可以产生有用的适体，但是备选方法可以用于产生针对MUC1肽的不同表位的适体是可能的。此外，已知癌中MUC1的体内糖基化模式改变，以致针对非糖基化合成肽的适体不能与针对肿瘤-糖基化MUC1蛋白所产生的备选适体一样有效地与所述肽结合。
本发明努力利用鉴定基于重组MUC1蛋白的适体而克服或减少至少这些问题中的一些。在优选的实施方案中，已通过与自然界中使用的方法类似的方法，对该重组蛋白进行了糖基化，从而为接近我们的适体工作(例如作为体内的治疗剂或诊断剂)的体内条件，提供更高水平的改进。
与基于识别MUC1的抗体的现有发明相比，本发明的优势在于所述适体提供针对MUC1靶蛋白的更高特异性和更强结合，由此在溶液中识别该蛋白质时变得更灵敏，由此在目前的诊断测定中提供显著降低肿瘤标记识别水平的潜力，导致更灵敏的测定，以此提供更好的预后/早期诊断价值。此外，当作为治疗剂与抗体相比较时，适体提供很小的或无免疫原性、更好的肿瘤渗透性、通过肾和尿的快速清除和一段时间后的天然降解。
本发明能够在商业上应用于癌症的诊断、成像和治疗。其由识别肿瘤标记的分子组成，所述肿瘤标记是肿瘤细胞特有的或在肿瘤细胞中处于与在正常细胞中不同形式的分子。该肿瘤标记在癌症细胞的表面上表达，但也在血流中流动。同样地，构成本发明的分子具有在诊断测定/血液检验中用于提供肿瘤或转移性疾病的预后和/或早期诊断的潜力。此外，该分子具有将能够实现细胞杀死的药征(modalities)运送到肿瘤细胞表面的能力。因此，该分子与化学治疗剂或放射性治疗剂的偶联能够将它们特异性的带到肿瘤细胞处，由此减少与一般治疗相关的副作用。最后，所述试剂与荧光、近红外、MRI或放射性核素配体的偶联能够产生强有力的成像试剂，该成像试剂将显著地增高成像灵敏度和图象清晰度。
发明概述
本发明是基于通过称为适体的新的生物学治疗剂种类来识别叫做MUC1的肿瘤标记。所述适体能够识别肿瘤细胞表面上的标记，并且如果适当标记的话，能够特异地递送放射性剂量，其他成像剂诸如MRI、NIR和荧光感觉模式，或用于成像和/或仅通过特异性杀死肿瘤细胞治疗癌症的化学治疗剂，从而避免由损伤身体其他部分所引起的不适副作用。此外，当适体在患者的血液中存在时，它能够识别肿瘤标记MUC1，在诊断测定中，这能够指示疾病的发作或复发。因此，本发明的潜在应用是多样的，其范围从改善当前的测定，诸如可商购的CA15-3MUC1诊断测定，到成像和治疗患有多种上皮肿瘤，包括乳腺、胃、肾、前列腺等的上皮肿瘤的癌症患者。
我们已经确定了生成针对MUC1糖基化形式的适体的方法；这种形式更接近地模拟体内表达的、特别是由癌组织表达的MUC1的形式。因此，认为该方法应该生成比现有技术方法更适合于临床或诊断应用的适体。
按照本发明的第一方面，提供了针对重组MUC1的适体配体。
优选地，所述适体包括寡核苷酸，且/或所述适体是寡核苷酸。寡核苷酸可以是DNA、RNA，和/或可以包括除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、和尿嘧啶以外的核苷酸；这些可以是基于这些天然-存在的核苷酸的被修饰核苷酸。备选地，适体可以包括肽、PNA、或其他化合物，例如如WO2004/081574中所述的，将其内容引入本文作为参考。优选地，所述适体是至少25个核苷酸长；优选地，适体是25个核苷酸长。
优选地，适体包括选自下列各项的一种序列：
GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA(SEQ ID NO：1)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC(SEQ ID NO：2)
CAAACAATCAAACAGCAGTGGGGTG(SEQ ID NO：3)
TACTGCATGCACACCACTTCAACTA(SEQ ID NO：4)
GGGTTATATTACTCGGCCGGTGTAA(SEQ ID NO：5)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC(SEQ ID NO：6)
GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG(SEQ ID NO：7)
GCTGGGTAAATAGATGATTCCCGGC(SEQ ID NO：8)
AGTGGTGGTTTTATAAGACTGATAC(SEQ ID NO：9)
TAGCCTTAATGCCTTTGTAAGGCGA(SEQ ID NO：10)
CGGTCTACGGAGCCGCGTTAAACTT(SEQ ID NO：11)。
所述适体可以由SEQ ID NO：1-11中的任一项组成；备选地，所述适体可以包括另外的序列。所述适体可以包括与SEQ ID NO：1-11中的任一项具有至少95％同一性，或至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％序列同一性的序列。
优选地，所述适体是针对糖基化的MUC1的配体。备选地，所述适体可以是针对非糖基化的MUC1的配体。应该理解特殊的适体可以具有对糖基化和非糖基化的MUC1二者的亲和性。优选地，所述适体对糖基化的MUC1具有比对非糖基化的MUC1更高的结合亲和性。
本发明中使用的重组MUC1是具有5个SEQ ID NO：12的串联重复的重组MUC1蛋白。优选地，所述适体对该重组MUC1比对由3个拷贝的重复序列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS(SEQ ID NO：12)组成的60-mer，或对9个氨基酸的肽APDTRPAPG(SEQ ID NO：13)之一或二者具有更高的结合亲和性。该重组MUC1可以是非糖基化的，但是优选是糖基化的。
优选地，适体与MUC1相互作用的K_d小于1000nM，小于500nM，小于250nM，优选地，小于200nM，小于100nM，小于90nM。
适体可以与另一个活性部分缔合。适体可以与所述另一个部分共价结合或缀合，或可以以别的方式与之缔合。所述另一个部分可以是标记，诸如放射性标记、荧光或发光标记。所述另一个部分可以是配体，诸如另外的适体或备选的配体。所述另一个部分可以是免疫球蛋白、或免疫球蛋白的片段或部分。所述另一个部分可以是治疗剂；例如，放射源；抗体或片段或部分；抗癌治疗剂；或其他药物或生物活性试剂。
本发明还提供编码如本文所述的适体的表达载体。本发明还提供与SEQ ID NO：1-11中任一项互补的核苷酸序列；和SEQ ID NO：1-11中任一项的RNA等价物。
按照本发明的一个方面，提供了治疗与MUC1相关病症的方法，所述方法包括对受试者施用如本文所述的适体。
所述病症优选地与增高的MUC1生成量有关。适宜地，所述病症可以选自癌症、胆囊纤维变性、哮喘、慢性阻塞性肺病、非-恶性炎性上皮疾病、腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺腺癌、非-小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、和结肠直肠癌。
本发明还提供诊断与MUC1相关的病症，且优选地，与增高的MUC1生成量相关的病症的方法，该方法包括检测如本文所述的适体与细胞、组织或样品的结合。该方法可以在体内或体外进行。可以以任何便利的方式来检测适体的结合；例如，通过检测与适体相关的标记；通过对适体成像；或通过确定结合的适体的量，来检测适体的结合。合适的方法记述在WO2004/081574中。
按照本发明的另一方面，提供了如本文所述的适体对治疗或诊断的应用。
本发明还提供了如本文所述的适体在制备用于治疗与MUC1相关病症的药物中的应用。
所述病症优选地与增高的MUC1生成量相关。适宜地，所述病症可以选自癌症、胆囊纤维变性、哮喘、慢性阻塞性肺病、非-恶性炎性上皮疾病、腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺腺癌、非-小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、和结肠直肠癌。
本发明还通过如本文所述的适体在制备用于检测或诊断与MUC1相关病症的诊断剂中的应用。
本发明还提供包括本文所述的适体的药物组合物。该组合物还可以包括药用载体。
如本领域中通常已知地，可以将本发明的适体及其制剂或组合物直接地或局部地(例如，局部化地)施用于患者或靶组织或器官。例如，为了施用于受试者，组合物能够包括递送赋形剂，其包括脂质体。药用制剂中可以存在载体和稀释剂以及它们的盐。通过多种本领域技术人员已知的许多方法，包括但不仅限于，包封在脂质体中，通过离子电渗疗法，或通过并入其他赋形剂，诸如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)和PLCA微球体、可生物降解的纳米胶囊(nanocapsule)、和生物粘性微球体中，或通过蛋白质样载体，可以对细胞施用核酸分子。
可以与本发明一起使用的递送系统包括，例如水性和非水性凝胶、霜剂、多种乳剂、微乳剂、脂质体、软膏剂、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、碳氢化合物主药和粉剂，并且能够含有赋形剂，诸如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和亲水聚合物(例如，聚亲碳性和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药用载体是脂质体或经皮增强剂。
本发明的药物制剂处于适于施用，例如，全身或局部施用到细胞或受试者中，包括例如，施用到人中的形式。合适的形式，部分地，取决于应用或进入的途径，例如口服、经皮、或通过注射。其他因素在本领域中是已知的，且包括这样的考虑，诸如防止所述组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。
本发明还包括为了保存或施用而制备的组合物，其包括处于药用载体或稀释剂中的药物有效量的需要的化合物。对治疗应用可接受的载体或稀释剂是制药领域中众所周知的。例如，能够提供防腐剂、稳定剂、染剂和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸、和对-羟基苯甲酸的酯。另外，能够使用抗氧化剂和混悬试剂。
药物有效剂量是防止、抑制疾病状态发生，或治疗(缓解症状到一定的程度，优选地缓解全部症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量取决于疾病的类型、所用组合物、施用途径、受治疗的哺乳动物类型、考虑中的特殊哺乳动物的身体特征、同时进行的药物治疗、和医药领域中的技术人员应该认识到的其他因素。
通常，施用0.1mg/kg-100mg/kg体重/天的量的活性成分。
能够以剂型制剂施用本发明的制剂，所述剂型制剂包含常规非-毒性药用载体、辅剂和/或赋形剂。制剂能够处于适合于口服使用的形式，例如，作为片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬液、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。按照本领域已知的任何制造药物组合物的方法，能够制备意欲口服使用的组合物，并且所述组合物能够含有一种或多种这样的甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，从而提供在制药学上精致味美的制剂。片剂包含活性成分，所述活性成分与适合于制造片剂的非-毒性药用赋形剂相混合。
这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂；诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如，玉米淀粉、或褐藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包衣的，或者它们可以是通过已知技术包衣的。在一些情形中，所述包衣能够通过已知技术制备，从而延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并由此在较长时期内提供持续不变的作用。例如，能够使用时间延迟材料，诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
口服使用的制剂还可以以硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固相稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土相混合，或者以软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油相混合。
水性混悬液包含活性物质，其与适合于制造水性混悬液的赋形剂相混合。所述赋形剂是混悬试剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素(hydropropyl-methylcellulose)、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然-存在的磷脂，例如，磷脂酰胆碱，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性混悬液还能够包含一种或多种防腐剂，例如，乙基、或间-丙基对-羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。
油性混悬液能够通过将活性成分混悬在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或矿物油，诸如液体石蜡中而制备。油性混悬液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬蜡或鲸蜡醇。能够添加甜味剂和调味剂，从而提供味美的口服制剂。这些组合物能够通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
适合于通过加入水而制备水性混悬液的可分散粉剂和颗粒剂提供活性成分，所述活性成分与分散剂或润湿剂、混悬试剂和一种或多种防腐剂相混合。通过以上提及的那些，举例说明了合适的分散剂或润湿剂或混悬试剂。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还能够处于水包油的乳剂形式。油相可以是植物油或矿物油或其混合物。合适的乳化剂可以是天然-存在的树胶，例如，阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然-存在的磷脂，例如大豆、磷脂酰胆碱、和源自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯，酐，例如失水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯和环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还能够包含甜味剂和调味剂。
能够用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖配制糖浆和酏剂。所述制剂还能够包含缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。药物组合物能够处于无菌可注射的水性或油质混悬液形式。
该混悬液能够通过按照已知技术，利用上述提及的那些合适的分散剂或湿润剂和混悬试剂来配制。
无菌可注射制剂还能够是处于无毒肠胃外(parentally)可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。能够使用的可接受的赋形剂和溶剂是水、林格溶液、等渗氯化钠溶液、和含有氯化钠和氯化钾的等渗盐溶液。另外，无菌的不挥发性油常规用作溶剂或混悬介质。为了该目的，能够使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单酸甘油酯或二脂酰甘油酯。另外，脂肪酸，诸如油酸在注射剂制备中存在应用。
本发明的组合物还能够以栓剂的形式施用，例如，用于直肠施用药物。这些组合物能够通过将药物与合适的无刺激性赋形剂相混合而制备，所述赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，并且因此在直肠中融化，从而释放药物。该物质包括可可油和聚乙二醇。
本发明的组合物能够在无菌介质中肠胃外施用。根据使用的赋形剂和浓度，能够将药物混悬或溶解在该赋形剂中。有利地，能够将辅剂，诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解在所述赋形剂中。
应该理解，对任何具体受试者的特异性剂量水平取决于多种因素，包括所用的特异性化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施药时间、施药途径、和排泄率、药物联合和接受治疗的具体疾病的严重性。
为了对非-人动物施药，还能够将该组合物加入到动物饲料或饮用水中。能够方便地配制动物饲料和饮用水组合物，这样该动物随着其饮食，摄取治疗适当量的该组合物。还能够方便地使该组合物以预混合料存在，从而添加到饲料或饮用水中。
本发明的组合物还能够与其他治疗化合物联合施用于受试者，从而增高总治疗效果。使用多种化合物治疗适应证能够增高有益效果，同时降低副作用的存在。
本发明的方面使用鉴定与重组蛋白质靶标配位的适体的方法，该方法包括下列步骤：
a)使重组蛋白质靶标附着在固相支持体上；
b)混合适体文库和所述附着的靶标；
c)从所述固相支持体中洗脱未结合的适体；
d)从所述附着的靶标中释放结合的适体；
e)从所述固相支持体中洗脱释放的适体；
f)扩增洗脱出的释放的适体；和
g)鉴定扩增的适体。
所述重组蛋白质优选地是糖基化的。
所述重组蛋白质优选地是全长蛋白质。
本方法还可以包括在使所述重组蛋白质附着于固相支持体之前，表达所述重组蛋白质的步骤。该蛋白质可以在原核宿主中表达；适宜地，在大肠杆菌(E.coli)中表达，尽管熟练的技术人员应该知道其他合适的表达系统。
本方法可以包括在使所述重组蛋白质附着于固相支持体之前，糖基化所述重组蛋白质的步骤。
步骤b)-f)可以重复至少2、3、5、10次。

附图简述
图1显示a)从MUC15TR亲合柱中洗脱5TR-1适体；b)从MUC15TR亲合柱中洗脱5TR-2适体；c)从MUC15TR亲合柱中洗脱5TR-3适体；d)从MUC15TR亲合柱中洗脱5TR-4适体.
图2显示来自ELISA检验的％吸收vs适体浓度。
图3显示与重组人MUC1蛋白-适体MUC1 5TR-1相互作用相对应的SPR实验曲线拟合。
图4显示镍NTA适体：Tn抗原相互作用柱状图。
发明详述
现将通过参考下列试验程序和结果的实施例进一步描述本发明。
方法
1.表达和纯化MUC1 5TR
按照公开物：Brokx，R.D.等，关于黏蛋白MUC1串联重复的糖基转移酶特异性的基于核磁共振的分析(Nuclear Magnetic Resonance-BasedDissection of a Glycosyltransferase Specificity for the Mucin MUC1 TandemRepeat).生物化学(Biochemistry)42，13817-13825(2003)，通过一系列的简单步骤，生成并纯化蛋白质。
简言之，将BL21大肠杆菌细胞(Novagen，美国)细菌的甘油储液新鲜地划线接种在羧苄青霉素平板上，挑取单菌落，并用于接种40ml起子培养物。令该起子培养物生长过夜直到浑浊，并将接种体转移到LB-羧苄青霉素锥形瓶中，在37℃培养，并且继续直到为了产生MUC1，在25℃下，随着摇动，用0.4mM异丙基β-_D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导该培养物。通过离心回收细菌沉淀，并在变性条件下纯化MUC1.
通过镍NTA琼脂糖(Qiagen，米西索加(Mississauga)，On，加拿大)裂解和纯化该沉淀。对蛋白质进行广泛地透析，HPLC纯化和冷冻干燥。通过SDS-page进一步分析该样品，并利用通用染料简单蓝(simply blue)(Invitrogen，美国)对正确的条带尺寸进行染色。理论上计算了冻干的粉末是11.800kD MW，并通过MALDI质谱法得到证实。
2.表达和纯化重组ppGalNAc-T1
重组ppGalNAc-T1基因产物在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71H中表达。典型地，T1的表达是通过下列步骤实现的：将来自平板的单个毕赤酵母属(Pichia)菌落接种到BMGY培养基中，并在剧烈摇动下，在30℃生长直到浑浊(48小时)；通过在4krpm和RT下，短暂旋转10分钟而获得酵母，并将沉淀重新混悬在1/10体积(30-50mL)的BMMY培养基中；生长持续另外48小时，每24小时供给另外的甲醇(0.25mL100％)。
收获酵母，并将上清液移除到量筒中；为了日后再使用，可以将沉淀保存在冷室中。然后通过立即加入一半体积的3xT1缓冲剂缓冲该上清液，完全混合，利用Steriflip过滤器(Millipore，美国)过滤-灭菌，并在4℃冷冻。利用具有膜的Amicon部件，即10kDa截止点(Viva Science，美国)浓缩该溶液。通过SDS page监测酶的产生。发现酶在4℃很稳定，并且将其进一步用于构建Tn抗原。
3.用ppGalNAc-T1糖基化重组的MUC15TR:Tn抗原
反应混合物由蒸馏水、0.5M MES缓冲液，pH 6、1M MgCl₂，50mMUDP-GalNAc，10mg/mL MUC1-5TR，0.2M MnCl₂和天然T1酶组成。将反应混合物在静态培养箱中以37℃培养48小时，或直到完成糖基化反应。先前，利用作为对糖基化反应很关键的MnCl₂，广泛地最优化了该方案。认为该化合物是该反应的必要催化剂。通过在4-20％的SDS page凝胶(invitrogen)上，进行SDS page凝胶分析，而分析该反应的产物，并通过质谱法进行验证。
4.亲合层析法体外选择法
使用了两种基于亲合层析法的，用于体外选择针对5TR MUC 1重组蛋白的适体的方法学。
第一种方法学基于将MUC1蛋白固定在NHS-HiTrap琼脂糖凝胶活性柱(NHS-HiTrap Sepharose activated column)(1ml)(Uppsala，瑞典)上。按照供应商的指示，对该柱进行功能化。将3mg所述蛋白质固定在柱基体上，并用于适体选择。按照供应商的说明，通过UV光谱法确定在柱功能化后存在的蛋白质的量。NHS-HiTrap琼脂糖凝胶活性柱的使用容许将所述蛋白质通过该蛋白质的氨基末端固定于该柱。
备选地，利用5TR MUC1重组蛋白中存在的6-His标记(6-His Tag)发展了亲合层析方法。MUC1蛋白构建体中存在的6个组氨酸标记通过键与HisTrap^TM螯合HP柱(HisTrap^TM Chelating HP Column)(GE健康护理(GE Healthcare)，先前是安玛西亚法玛西亚(Amersham Pharmacia)，瑞典)相连。HiTrap螯合HP柱(1ml)充满了高性能螯合琼脂糖凝胶，其由高度交联的琼脂糖珠组成，所述琼脂糖珠与亚氨基二乙酸偶联，从而通过间隔臂稳定醚基团。螯合基体中装满了500μl 100mM镍溶液。通过SDS page凝胶电泳显现结合的靶标，并剥离用于检验肽负载。用1ml 10mg/ml糖基化的MUC15TR和/或10mg/ml非糖基化的MUC15TR再填装所述柱。用5倍柱体积的清洗缓冲液清洗所述柱，并用于选择循环。
设计了严格的缓冲液系统，从而发展高度特异性ssDNA适体。结合缓冲液由100mM NaCl₂、和5mM MgCl₂组成，pH 7.4，并且在37℃下进行选择，从而获得在生理条件下使用的适体。清洗缓冲剂和洗脱缓冲剂由相同的物质组成，其中的氯化钠组成处于的不同浓度(分别为0.15M和1.5M)。使用5倍柱体积结合缓冲液的清洗步骤容许洗掉弱结合物，所述弱结合物是由于发生在1.5倍柱体积洗脱步骤前的高体积清洗所引起的对相互作用增高的应力而引起的。在室温下，针对固定的靶标-糖基化的5TR MUC1肽，对所述文库进行连续10轮的筛选。在每轮之间，用PD-10脱盐柱对所述文库进行脱盐作用，从而去除样品中过量的盐，对其进行冷冻干燥，从而减小样品体积，并对其进行进一步的扩增，从而通过结合的适体部分的数量加强竞争。在最后一轮选择中，将另外的步骤加入到该选择方案中。对筛选过的文库进行关于与HiTrap螯合柱结合的筛选，所述HiTrap螯合柱负荷了镍，并储备10mg非糖基化的5TR MUC1，从而将与核心MUC1肽结合的适体(与柱结合的适体)和与Tn抗原结合的适体(随着清洗流过的GalNac糖适体)分隔开。该最后的步骤容许选择MUC15TR核心适体结合物和MUC15TR Tn抗原结合适体。
在11轮选择后，将最终的集合体克隆到pCR21.TOPO载体中，并对克隆进行进一步的分析和测序，从而产生最终适体集合体的DNA碱基组成。将测序送到Macrogen(首尔，韩国)。通过BioEdit序列比对编辑器(BioEdit sequence alignment editor)(Tom Hall，Ibis治疗学(IbisTherapeutics)，Carlsbad，CA，美国)，对序列进行比对和家族分析。
5.在最后一轮选择后克隆和测序适体
通过PCR再一次扩增最后一轮的DNA集合体，并将其克隆到pCR21.TOPO质粒载体中。将每轮选择中的50个随机挑取的质粒克隆送去测序，并进一步利用BioEdit序列比对编辑器进行分析。90％的第10轮适体由以下表示的序列表示。
6.亲合层析法表征所选择的适体和5TR-MUC1蛋白之间的相互作用
首先通过选择柱，筛选合成的适体，从而筛选出由于在克隆和测序过程中的人为现象产生的任何非-结合序列。将选择的适体溶解在1x结合缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl₂，pH 7.2)中，以达到最终体积为1倍柱体积，并容许用准备好的选择树脂在室温下温育1小时。培养后，在具有1ml/分钟流速的FPLC系统中，利用具有初始缓冲液(1x清洗缓冲液，150mMNaCl，5mM MgCl₂，pH 7.2)和最终缓冲液(1x洗脱缓冲液，1.5M NaCl，5mM MgCl₂，pH 7.2)的盐梯度洗脱适体。
发现在1.35M NaCl(±0.05M；见图1)时，从亲合层析基体中洗脱出选择的适体。在类似的研究上，显示出在～0.8M NaSCN时，从层析基质中洗脱出充分表征且可商购的C595单克隆抗体。
7.利用竞争ELISA表征适体5TR-MUC1
为了评估结合和表位特征，进行了酶联免疫吸附测定。简言之，用处于100μL碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH 9.6)中的5μg MUC1肽包被ELISA微量滴定平板，并在4℃保持过夜。随后，在37℃，用100μL含有1％(w/v)BSA的PBS封闭孔1小时。然后，用200μL含有0.05％(v/v)吐温-20的PBS清洗孔3次。向每个孔中加入50μL处于固定浓度(30μM，在含有0.05％吐温-20和1％BSA的PBS中)的过量C595抗-MUC1单克隆抗体，以确保所有结合位点的饱和，并在37℃温育1小时。清洗该平板，并向每个孔中加入50μL浓度系列在100nM-700nM范围内，处于含有100mMNaCl，5mM MgCl₂，100mM KCl和5％甘油的缓冲剂中的适体，并容许在37℃温育1小时。再次清洗板，向该板中加入50μL过氧化物酶缀合的抗-小鼠二抗(西格玛(Sigma))，并在37℃再温育1小时。如上述进一步清洗孔3次，并通过添加2，2′-连氮基-二-(3-乙基-苯并-thiozolin磺酸)试剂(西格玛(Sigma))形成颜色。
为了证实适体在结合MUC1肽中的功效和与确定的抗-MUC1抗体竞争表位结合，我们使用了先前描述的竞争ELISA[Missailidis S，ThomaidouD，Borbas KE，和Price MR：为了抗体靶向，选择具有针对C595，即抗-MUC1 IgG3单克隆抗体的高亲和性和高特异性的适体(Selection ofaptamers with high affinity and high specificity against C 595，an anti-MUC 1lgG3 monoclonal antibody，for antibody targeting).免疫学方法杂志(JImmunol Methods)2005；296：45-62]。为了确定适体结合MUC1肽表位和竞争出C595抗体的能力，将5TR MUC1重组蛋白直接吸附在ELISA平板上过夜。将可商购的C595抗体过量地加入到该ELISA上，从而容许所有可用的肽的饱和与结合。清洗过量的抗体，并将相关适体以0-600nM浓度范围，加入到孔中。利用第二抗-小鼠HRP缀合的抗体形成颜色。由于所述肽被固定在ELISA平板的孔上，所以，在添加适体后仍维持与所述肽结合的任何抗体会与辣根过氧化物酶-缀合的兔抗-小鼠免疫球蛋白相互作用，而引起颜色形成。在不同的清洗步骤中，除去在适体与肽结合时受到竞争而脱离所述肽的抗体。在该ELISA中选择并检验的适体拥有可变的碱基组成。先前在该ELISA系统中显示出，具有碱基组成7A，5G，7C，6T的合成的适体不干扰C595和MUC1肽之间的相互作用[43]。将该结果(见图2)以吸收％vs适体浓度绘图。
适体从C595抗体的天然抗原蛋白中取代C595抗体的能力在选择的适体种类之间似乎非常相似，并且大约200nM适体足以实现50％或更多的所述抗体的取代。
8.利用SPR表征5TR-MUC1蛋白与选择的适体间的相互作用
为了量化5TR-MUC1重组蛋白与不同的选择的适体之间的相互作用，并将其表达为缔合和解离常数的形式，我们在BIAcore仪器上使用SPR。通过对缔合(共振单位)的变化和时间(秒)进行绘图，获得了实验结合曲线，并计算了缔合和解离常数。
在我们的实验中，利用来自分子探针(molecular probes)(美国)的FluoReporter生物素-XX蛋白质标记试剂盒(FluoReporterBiotin-XXProtein Labelling Kit)，生成生物素化的5TR-MUC1蛋白。简言之，在即将缀合前，将5mg肽溶解在1mL碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠，pH 8.3)中。在即将使用前，在室温下，将2mg生物素-XX琥珀酰亚胺酯溶解在0.1mLDMSO中，涡旋直到溶解，按照供应商的说明加入到肽溶液中，并容许在室温下温育2小时。在PD-10柱(法玛西亚(Pharmacia)，瑞典)中对该溶液进行脱盐，并按照供应商的阳性指征试剂盒程序，利用染料HABA(4′-羟基偶氮苯-2-羧酸)的固有特性检验生物素水平。按照供应商的说明，利用在500nm处的UV吸收，测量其水平，并且计算了生物素化的肽样品与对照(PBS)相比的吸收区别。
将生物素化的5TR-MUC1蛋白固定在BIAcore SA传感器芯片(金-链霉抗生物素蛋白)上，并且最优化该系统，从而减少质量传递、立体位阻、拥挤现象、抗体亲抗原性和聚集。在不同的注射时间下，检验了1μM-1nM范围内的肽浓度范围，并且使用的最适条件是处于运行缓冲剂中的100μL1nM肽，所述运行缓冲剂通过每个单独的通道，以25μL/分钟的速率灌输60秒的脉冲。对肽水平的芯片重建之后，用10mM NaOH溶液进行30秒脉冲的后继应用。将适体以1μM配制在其选择缓冲剂(含有100mM NaCl，5mM MgCl₂的磷酸盐缓冲液，pH 7.4)中，并用选择缓冲剂，以30秒注射，5秒清洗步骤，对其进行应用，从而容许非特异性分析物的去除。通过应用10μL脉冲的1.5M NaCl，5mM MgCl₂，pH 7.4，重建(洗脱步骤)芯片表面。
利用非线性回归分析，将实验BIAcore数据拟合到两个数学等式中，从而确定缔合常数(k_a)和解离常数(k_d)。在图3中显示了SPR传感图，其显示了适体与它们各自的肽靶标的快速结合和解离，并且SPR传感图用Origin 6.0进行拟合(见图3)。
通过非线性回归分析由以下等式表示的单相指数缔合模型，分析了快速初始缔合相：
[响应]＝[平直部分]+[间距](1-exp(-K(t-t₀)))
也对解离相进行了由以下等式表示的单相指数缔合模型非线性回归分析：
[响应]＝[底部]+([平直部分]-[底部])exp(-k_d(t-t₀))
由于与MUC1的量相比较时，对系统应用了过量的自由适体，所以假设自由适体的浓度恒定。因此，K等同于k_aC+k_d，其中C是系统中总适体浓度，且k_a值获自下列关系：k_a＝(K-k_d)/C。由下列关系计算K_d∶K_d等于k_d/k_a。将数据的统计学拟合表示为χ²。
图3显示SPR实验的曲线拟合，SPR实验对应于重组人MUC1肽适体MUC1 5TR-1相互作用。由Origin 6.0绘图软件分析缔合(左侧)和解离(右侧)图。X轴C₀(计算的)对应于以秒为单位的时间。Y轴C₀(计算的)对应于如由BIAcore 2000软件给出的RU单位。
对剩余的适体获得了类似的图。在表1中对确定的缔合常数制表。


表1.由SPR进行的5TR-MUC1重组蛋白：DNA适体结合分析。
SPR数据证实了在溶液中适体对5TR-MUC1蛋白的高亲和性，其具有处于纳摩尔范围中的K_d值。
6.镍NTA糖蛋白-DNA适体与糖基化的MUC1 5TR的相互作用
为了评估糖基化的MUC1适体：糖蛋白的相互作用，进行了测定，该测定利用了通过镍磁琼脂糖珠(如HiTrap螯合柱中使用的)引起的His-标记捕获原理。该测定容许以三步骤，即结合：清洗：分隔方案，快速地在管中检测/筛选与糖基化肽结合的适体。
为了该测定，使用了Qiagen试剂盒，其含有以溶液5％的比例存在的琼脂糖磁珠，为了His-标记纯化用镍包被所述珠。按照供应商的如下指示，制备了7个各容纳900μl初始缓冲剂(100mM NaCl₂，5mM MgCl₂，pH 7.4)的管，所述管用于重新混悬10μM糖基化MUC15TR肽的溶液：
将10μl 5％珠溶液加入到该溶液中，并在4℃，随着摇动温育半小时。30分钟后，去除上清液。通过添加初始缓冲剂清洗珠，容许1-5分钟的清洗时间。将1mM(500μl)各种处于初始缓冲剂中的糖基化MUC1适体溶液加入到预先制备的磁珠中，所述磁珠含有his-标记的糖基化MUC1。容许含有复合的珠的溶液和适体溶液在37℃，随着摇动温育1小时。
1小时后，去除上清液，并利用UV分光计(Eppendorf，美国)，在260nm处测量其吸收。用500μl清洗缓冲剂(150mM NaCl₂，5mM MgCl₂，pH 7.4)清洗剩余的磁珠3次。去除上清液，并加入50μl洗脱缓冲剂(1.5M NaCl₂，5mM MgCl₂，pH 7.4)。容许该洗脱缓冲剂与磁珠一起，随着摇动温育5分钟。在4000rpm，旋转该磁珠30秒，以获得沉淀。由磁条吸住磁珠，并去除上清液。去除洗脱的上清液，并利用UV分光计(Eppendorf，美国)，测量260nm吸收。
图4显示镍NTA适体：Tn抗体相互作用柱形图，其显示如通过260UV分光计测量的初始DNA浓度、清洗DNA浓度和最终结合浓度(上方)和结果表(下方)。
结论
从全部一系列上述测定，我们能够确定分析了所有的MUC1 5TR和糖基化的MUC1 5TR Tn抗原适体，并发现它们是对它们靶标的良好结合物，其具有选择性并以高亲和力结合于它们的蛋白质靶标的能力，并具有下列获得的适体序列。
MUC1 5TR，生理学上，来自细菌(大多数显性的)
非-Tn 5TR：
MUC1 5TR-1  GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA(SEQ ID NO：1)
MUC1 5TR-2  GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC(SEQ ID NO：2)
MUC1 5TR-3  CAAACAATCAAACAGCAGTGGGGTG(SEQ ID NO：3)
MUC1 5TR-4  TACTGCATGCACACCACTTCAACTA(SEQ ID NO：4)
MUC1 5TR糖基化的，生理学的，来自细菌，用T1糖基化的(糖选择)
TR-T1  GGGTTATATTACTCGGCCGGTGTAA(SEQ ID NO：5)
5TR-T2 GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC(SEQ ID NO：6)
5TR-T3 GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG(SEQ ID NO：7)
5TR-T4 GCTGGGTAAATAGATGATTCCCGGC(SEQ ID NO：8)
5TR-T5 AGTGGTGGTTTTATAAGACTGATAC(SEQ ID NO：9)
5TR-T6 TAGCCTTAATGCCTTTGTAAGGCGA(SEQ ID NO：10)
5TR-T7 CGGTCTACGGAGCCGCGTTAAACTT(SEQ ID NO：11)