重组核酸序列和检测样品的基因毒 性与诱变性以及基因毒性的动力学的方法 本申请是1996年4月25日提交的中国发明专利申请96180308.8(题目为“重组核酸序列和检测样品的基因毒性与诱变性以及基因毒性的动力学的方法”)的分案申请。
目前有多种不同的使用微生物筛选基因毒性和/或毒性化合物的方法。Ames测试(Maron and Ames，1983)似乎是一种最广泛使用的测定毒性化合物的方法并因而在世界范围内被推荐使用。但完成该测试要花费大约三天的时间，同时该方法还伴有一些明显的缺点。
已引入了某些可短时间内完成的方法，这些方法包括，根据lacZ基因表达的β半乳糖苷酶的量来检测因DNA损伤引起的SOS反应，其中所说地lacZ基因位于SOS调节的umuD、C或sfiA应激诱导型启动子的下游。这些测试分别称为使用鼠伤寒沙门氏菌作为宿主微生物的umu测试(Oda等，1985)和使用大肠杆菌作为宿主微生物的SOS显色测试(Quillardat等，1982)。在umu测试和SOS显色测试中，在待检样品存在下培养宿主微生物，继之破坏该宿主微生物。然后加入β半乳糖苷酶的底物，约10分钟后加入抑制剂终止随后的反应，然后在两个波长处进行OD测量并计算β半乳糖苷酶活性。这些测试克服了Ames测试耗时长的问题，但它们也有自身的缺点，即灵敏度低而且检测时间仍需7-8小时，特别是硝基芳烃和多环芳烃的检测灵敏度低。另外，该检测方法还需要大量的操作和加入各种不同的试剂，从而使该方法很复杂并且花费高。由于为了检测任何诱导作用而必须破碎细胞，所以只可能对细胞进行一种检测。
EP-A-0649905述及，将SOS基因放在表达荧光素酶活性的基因上游，以使荧光素酶的表达与SOS基因的表达同时发生，从而可以克服上述测试的缺点。然后通过检测发光可在短时间里检测或测定诱变物质。据称任何SOS基因都是有用的，并且在实施例中以umuD、C基因(当用于umu测试中时)为例作了说明。另外，与SOS显色测试和umu测试等常规测试相比，由于该测试中检测所需的样品体积较小，所以认为其提高了检测的灵敏度。除了其必须是SOS可诱导型外，再没有与待用启动子相连的序列。又因为发光是即刻的，所以可以比使用Lac系统更早地进行检测，从而缩短了检测时间。
WO94/13831(DuPont)中还公开了与发光基因复合物结合使用应激诱导型启动子，以提供基因工程微生物。他们指出，“虽然已证明应激反应在检测各种环境危害中是有用的，但它须与易于检测的灵敏报道基因相连接”。DuPont公司提供了一个广泛的现有技术中已知的应激诱导型启动子清单，这些启动子可能是有用的，但本发明不只限于这些。所列清单包括下列调节系统的启动子：热休克、SOS、过氧化氢、超氧化物、脂肪酸饥饿、通用应激、静止状态、应急、分解代谢产物活化、P利用和N利用。在实施例中，他们使用了热休克调节的蛋白质启动子dnaK和grpE、SOS调节的启动子recA和uvrA、氧化损伤调节的启动子katG和micF、通用应激启动子uspA、静止期启动子xthA、来自氨基酸饥饿系统的his启动子、涉及碳饥饿系统的lac启动子、来自磷酸盐限制系统的phoA启动子和来自氮限制系统的glnA启动子。估计他们从很宽范围的不同调节方式的启动子中举出如此多的例子，是要说明他们的系统具有宽范围的适用性。其中未指出或可推断中优选使用某个特定组的启动子或任何个别启动子。只在其中的一个实施例(专利申请的实施例12)中明显地列举了一个特定的SOS调节的启动子，其中给出了SOS调节的启动子recA得到的结果。使微生物与加有诱变剂溴乙锭(浓度为0.25mg/ml)的样品接触，于加入诱变剂后180分钟测得诱导率为1.9。加入0.5μg/ml丝裂霉素C，100分钟后测定诱导率。依据所用测试菌株的不同，诱导率在4.7至20之间变动。根据DuPont的专利申请的实施例12可明显看到上述结果。
我们已不可预见地发现了一个应激诱导型启动子的亚组，即一个SOS调节的启动子的亚组，其与发光报道基因结合用于微生物系统估测致突变性得到了改善的结果。该亚组并不包括SOS调节的RecA启动子。该亚组具有许多优于DuPont RecA-荧光素酶系统及本领域已知的其它微生物毒性测试系统的特点。在以特定方式使启动子突变而进一步测试和开发这些新的系统中，我们能够更大程度地改善其性能。此外还完成了新的测试方法。这些新测试方法使我们能够获得迄今任何已有的微生物毒性测试中未曾述及的、更多更好的数据。
本发明涉及包含诱导率高于40的、SOS调节的启动子的重组核酸序列，所说的启动子被有效地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号。在根据本发明，重组核酸序列中优选含有更高诱导率的、特别是高于50的诱导率的启动子。可按照诸如M.Schnurr等人在Biochimie(1991)73，423-431中公开的方法检测诱导率。另外，也可选用Peterson K.R.和Mount D.W.(1987)，分子生物学杂志，193，27-40中所述的方法。这些公开内容均列为本文参考文献。现有技术中公开的与荧光素酶联合使用的recA启动子并不落入这一大类中，因为recA的诱导率要低得多。其在30°的诱导温度下为11X。诱导率是一个本领域公认的术语，并且可按本领域技术人员已知的方法确定。该文献的实施例中给出了如何确定诱导率的方法，并确定了大量启动子的许多数值及诱导率。recA的低诱导率可能是它为什么不特别适用于基于启动子诱导作用的灵敏检测系统的原因。在SOS调节的系统中，RecA启动子是最早被诱导的启动子。因代谢物缺乏而产生的信号被RecA蛋白质所识别。其也可能在诱变中具有第二种功能即能辅助DNA聚合酶绕过损伤。在DNA损伤后的前20分钟内，uvrA、B、C、D基因被激活，开始切割修复。然后在大约40分钟的时间内称为RecF重组途径的重组性修复途径很活跃。最后才得以诱导涉及umuD、C的SOS诱变途径。
上述专利申请中举例的DuPont系统所使用的丝裂霉素C的最低水平是500ng/ml。其中没有给出可检测更低诱变剂水平的指征和提示。而在本系统中则可以检测到7ng/ml的丝裂霉素。因此本系统要比DuPont系统中所指出的灵敏度要高大约80倍。我们发现，在我们的系统中从7.5ng/ml的浓度得到的诱导率高于2。
我们第一次举例说明了联机检测。因为用SOS或Ames系统需要破坏细胞，所以用这些系统进行联机检测是不可能的。所描述的其他测试也只是用于单一点检测。我们现已发现，有可能分辨样品中存在的多种诱变剂，并确定这些物质的诱导动力学。总体上不可预见的是，若定时检测发光，多种诱变剂的存在将提供不同的可检测信号。人们可能预计的是反面情况，即出现累积效应。但其清楚地说明，SOS调节的启动子构成了一组表现出这种调节特征的启动子，即对于各种不同的诱导性化学物质来说，诱导方式多有不同，因而存在着有差异的可检测信号。该新的方法应用上极为简单，而且可实现信号检测的自动化。该新方法只需培养包含SOS调节的启动子的微生物，所说的启动子被可效连接到编码报道分子的核酸序列上，所说的报道分子能产生可以发光形式测定的信号，并使微生物与待测样品接触，然后
—测定培养物中的发光，所说的测定是在不同时间点进行的，
—确定在所说时间点上的信号-噪音比，
—对数据作图，所说的数据代表所说样品的基因毒性的动力学，其中多个峰指示具有不同的诱导动力学的多种基因毒性化合物。发光检测最好是连续进行的。优选联机完成该方法。实施例和附图说明这样一个事实：在含有多种诱变剂的样品中可检测出多个峰。
在一个优选实施方案中，发光检测是连续进行的。从实现检测多种基因毒性剂存在的自动化和精确度的角度看，这一点是特别令人感兴趣的。信号噪音比越高测试系统就越灵敏。感兴趣的其他因素是诱导速度、表达程度和信号噪音比的波动程度。这些因素的变动不仅取决于所选择的启动子，而且取决于宿主菌株及基因毒性剂的性质。实际使用中，2种浓度毒性化合物的信号噪音比将等于或高于2。基于上述的一个或多个特征，本领域技术人员可选择最适于它们的状态的系统。下述实施例举例说明了新的生物传感器系统的广泛适用性。本发明新的生物传感器所显示的结果构成大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中本发明新的DNA序列的各种实施方案。测试的所有新的生物系统都比基于鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌菌株的标准Ames和SOS显色测试好。本发明的系统更快速、更准确而且更灵敏。我们针对那些在SOS显色测试和Ames测试中已知给出假阴性结果的毒性剂作清楚的举例说明，即已知测试确实给出假阴性结果的，本发明的系统提供阳性结果。特别是对新生霉素、叠氮化钠、丝裂霉素C、萘啶酮酸(naladixic acid)、过氧化氢、芘和菲(phenantrene)作了举例说明。本发明的测试系统特别适于检测PAH(多芳烃)的存在。
此外本发明的系统不需要为了提供检测而破坏细胞，因而可在继后用于进一步的测试，并且更重要的是可在一定时间内提供可检测的信号。因此可追踪并确定样品的诱导动力学。
本发明的一个重要实施方案是赖于这样的事实，即现在首次可以获得一种检测样品中多种基因毒性化合物存在的方法，所说的方法包括以下步骤：
—培养包含带有SOS调节启动子的核酸序列的宿主微生物，其中所说的启动子被有效地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号，
—测定培养物的发光，所说的测定是在各个时间点上进行的，优选是连续检测，并且在所说的时间点上检测信号噪音比，然后对这些数据作图，所说的数据代表所说样品的基因毒性动力学，其中多个峰表明存在多种具有不同的诱导动力学的基因毒性化合物。
由于选择了新的DNA序列并将其应用于可提供新的生物传感系统的宿主细胞中，我们还创造了很灵敏和快速的生物系统，可以在5分钟至2小时的时间内确定样品的基因毒性。
因此本发明的另一个实施方案包括确定样品中基因毒性化合物存在的方法，所说的方法包括以下步骤：
—培养宿主微生物，所说的宿主微生物包括一包含诱导率大于20的SOS调节的启动子的核酸序列，所说的启动子被有效地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号；
—在多个时间点上测定培养物的发光，
—确定培养物的发光是否发生了改变，增加发光是存在基因毒性化合物的指征。优选启动子的诱导率为40或更高，最适为50或更高。在前述检测样品中基因毒性化合物存在的方法中，优选的实施方案包括在多个时间点测定发光。连续检测则更好。另外，最好还有下列步骤：
—在所说的时间点检测发光的信号噪音比，
—将发光信号对噪音数据作图，所说的图代表样品的基因毒性动力学，可用于测定所说样品的基因毒性动力学。最好用本发明的生物传感器完成上述方法。这样的生物传感器包括宿主菌株，所说的菌株含有如本说明书中其它地方所限定的本发明的新核酸序列。宿主菌株较好是微生物，例如大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌菌株。具体地说，已应用标准的鼠伤寒沙门氏菌Ames测试菌株作为宿主菌株，并且为本发明的生物传感器提供了很适当的实施方案。本发明的菌株具有吸引力在于其适用于基因毒性和毒性测试中。Ames测试菌株的例子是TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535和TA1538，或新的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA7001至TA7006和TA7046(Gee等，1994)。另外Ames菌株还是世界医药工艺中普遍接受的菌株。对于包含作为宿主菌株的Ames菌株的本发明生物传感器来说，该菌株不仅能按照本发明用于基因毒性测试中，而且还可相继用于Ames测试中。其他可成为多功能菌株的适用宿主菌株是本领域技术人员显而易见的。
实施例中对适于应用于本发明的生物传感器的本发明核酸序列的各种实施方案作了举例说明。包含诱导率高于40的SOS调节的启动子的核酸序列是本发明一部分，所说的启动子被有效地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号。本发明的生物传感器包含本文所公开的各个实施方案中任一个的核酸序列。另外，这样的DNA序列可适用于完成本文所公开的本发明的所有方法。
重组性修复启动子中的适用启动子包括RecF、RecJ、RecN、RecO、RecQ、ruv和uvrD启动子。实施例中举例说明了RecN启动子。另一个适用的启动子是SfiA启动子，它也在实施例中作了举例说明。此外，可在重组修复期间诱导、诱导率高于40的上述SOS调节的启动子组的突变启动子也是本发明的适当实施方案。这样的突变体可能具有更强的启动子强度或调节作用，但极为重要的是SOS调节作用未被破坏。特别适用的突变的一个例子包括在至少一个LexA结合位点中发生的突变，而至少另有一个LexA结合位点保留活性。这种类型的优选突变将在所说的至少另一个LexA结合位点具有不改变野生型启动子序列的突变。这种类型的突变体的例子是具有序列ID No.7的RecN突变体(RecN1-3)。带有LexA突变这种类型的突变体特别适用于检测有多个基因毒性剂存在的方法中，并适用于按本说明书别处公开的本发明方法来检测这类样品的诱导动力学。这样的突变体也是极其灵敏和快速的。它们特别适用于检测基因毒性中间体降解或代谢产物的出现和/或聚积。这可以是在污染物和其降解物的田间例如生物改造土壤中，也可用于药物测试中。
已发现可提供有用特征的另一种类型的突变体是含有启动子增效突变的突变体。启动子增效突变是一个公认的技术术语，突变的结果是启动子序列更加相似于RNA聚合酶结合位点的一致序列。这种类型的突变可在启动子-35区域含有突变。实施例中以具有序列ID No.8的RecN2-4突变体形式提供了RecN启动子的这类突变实例。我们还提供了具有LexA和启动子增效突变的组合突变体的实例，其为具有序列ID No.9的RecN3-4突变体。原则上其他改进也是可能的，例如-10启动子区域的突变以及-35和-10区域之间更好的间距。后两种选择对于recN来说并不相关，因为这种启动子已表现出与σ35启动子序列具有良好一致性。鉴于该-35不是最佳的，所以我们举例说明能提供与σ35一致启动子序列有更密切相符性的突变可导致功能的改善。
除了启动子序列外，本发明的核酸序列还包括编码报道分子的核酸序列，该核酸序列编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号。这样的序列是本领域中已知的。由含有荧光素酶A和B基因的编码报道分子的核酸序列构成了适当的实施方案。在一优选的实施方案中，所说的序列还包括荧光素酶C、D和E基因，这些基因是产生可用于再循环的有限脂肪酸底物所必需的。有关这些序列的详细描述可见于PCT/EP专利申请WO92/15687中。
本发明的优选方法包括在如本文所述的本发明的任何一种方法中应用适于作为Ames测试菌株的微生物，所说的微生物进一步包含本发明的新的核酸序列，然后进行传统的Ames测试，从而提供一种使用同一菌株进行基因毒性诱变性和毒性测试的方法。
本发明的新的核酸序列另一个应用在于使用包含所说序列的微生物以检测毒性。优选的宿主细胞是能够产生高噪音信号的细胞。例如具有如上文所述启动子增效突变的本发明的核酸序列似乎很适合于这一应用。这种应用可以得出毒性产物的IC50计算值。换句话说，这种应用可构成一种检测样品中毒性化合物存在的方法，该方法包括以下步骤：
—培养宿主微生物，所说的宿主微生物是本文任一个实施例中公开的本发明的宿主微生物，
—测定培养物的发光，以及
—确定培养物的发光是否已发生了改变，发光降低即指示存在包含于本发明范围内的毒性化合物。
总之，本发明可能具有下列优点：
—有可能鉴别出样品中存在的呈现不同诱导动力学的至少两种基因毒性化合物。
—有可能在代谢期间利用诸如S9或在降解期间如生物除污中及时鉴定出中间体基因毒性产物的形成。
—可利用同一细胞联机检测基因毒性及一般毒性动力学。
—可在5分钟至4小时内，优选在3小时内，更优选在2小时内迅速完成测试，并给出明确的结果。
—在信号检测前不需对细胞培养物进行预先处理。
—在联机检测基因毒性化合物或液态溶液的一般毒性时不需要破坏细胞。
—可用根据本发明的菌株进一步检查在4小时内，优选在3小时内，更优选在2小时内发现有基因毒性的选用物质，以用同样的细胞按照Ames方法检查移码突变或碱基对取代。
—由于基础发光降低是一般毒性的指征，所以检测毒性时不需内部对照。
—由于实验的测试时间有限，所以不需要严格的无菌条件。
—由于实验的测试时间有限，所以不需要对测试样品进行化学稳定性测试。
【附图说明】
图1：启动子探针载体pMOL877(图1a)和在该载体中克隆了sfiA启动子的衍生物pMOL890(图1b)的限制性图谱。
图2：启动子探针载体pMOL877和在该载体中克隆了recN启动子(pMOL1066，recN1-2)、带有失活的LexA2位点的recN启动子(pMOL1067，recN1-3)、带有启动子增效突变的recN启动子(pMOL1068，rec2-4)、以及同时带有失活的Lex A2位点和启动子增效突变的启动子(pMOL1069，recN3-4)的衍生物pMOL1066(图2a)、pMOL1067(图2b)、pMOL1068(图2c)和pMOL1069(图2d)的限制性图谱。
图3：以经64ppm MMS处理的含pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大肠杆菌ED8739的信号/噪音比给出的光诱导动力学。发光是在2小时的期间内测定的。
图4：以经64ppm MMS处理的含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大肠杆菌ED8739的信号/噪音比给出的光诱导动力学。发光是在5小时的期间内测定的。
图5：对含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大肠杆菌，以最大信号/噪音比对浓度的形式给出了MMS(浓度为0.5-128ppm)的剂量-效应曲线。
图6：对含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大肠杆菌ED87391106，以最大信号/噪音比对照射时间的形式给出了紫外光(照射时间为2-10秒)的剂量-效应曲线。
图7：以经64ppm MMS处理的含有pMOL1067或pMOL1068的鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA104的信号/噪音比形式给出的光诱导动力学。发光是在5小时的期间内测定的。
图8：以经25.6ppb 4-NQO处理的含pMOL1067或pMOL1068的鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA104的信号/噪音比形式给出的光诱导动力学。发光是在5小时的时间内测定的。
图9：用TA98(pMOL1067)测试MMS和新生霉素的组合。在图示符号中，第一个数值代表MMS的量(ppm数)，其后是新生霉素值(ppm数)。
图10：用TA104(pMOL890)测试MMS和新生霉素的组合。图示符号中，第一个数值代表MMS的量(ppm数)，其后是新生霉素值(ppm数)。
图11：以使用菌株TA98(pMOL1067)得到的总信号/噪音比的函数形式排列的MMS和新生霉素组合的基因毒性。
图12：以使用菌株TA104(pMOL890)得到的总信号/噪音比的函数形式排列的MMS和新生霉素组合的基因毒性。
图13：当TA98(pMOL1067)与不同浓度的毒性产物R116一起保温时，该菌株的信号/噪音比随时间的降低情况。
图14：当TA98(pMOL1068)与不同浓度的毒性产物R116一起保温时，该菌株的信号/噪音比随时间的降低情况。
图15：在PAH污染的土壤的生物除污过程中取得的样品的基因毒性值。该实验的数据是使用TA104(pMOL890)得到的。经S9提取物代谢激活后检测基因毒性。使用TA104(pMOL1067)或TA104(pMOL1068)得到相似的数据。
图16：在用菌株LB208降解荧蒽期间基因毒性降解中间体的出现。该实验的数据是使用TA104(pMOL890)得到的，但使用TA104(pMOL1067)或TA104(pMOL1068)也获得了相似的结果。基因毒性增加表明有基因毒性中间体降解产物形成。以最大信号/噪音比表示基因毒性。于pH2.5下提取基因毒性中间体。在不用或用(#)S9代谢激活的情况下确定基因毒性。
实验数据
启动子-lux融合体的构建
大肠杆菌的sfiA启动子：sfiA-lux融合体的构建
细菌SOS反应处于许多调节蛋白质的控制之下，其中最重要的是RecA蛋白质(蛋白酶)和LexA阻抑蛋白。基因毒性产物的存在导致DNA损伤。其将激活DNA修复系统，并且部分激活作用是从无活性的RecA蛋白质改变成有活性的蛋白酶。这种RecA蛋白酶对LexA阻抑蛋白具有高度亲和性，由于RecA的蛋白酶解作用使之逐渐被失活。LexA失活后与其在LexA调节的启动子上的结合位点解离，从而导致启动子的活化和其相应基因的转录。处于LexA控制下的启动子之一是sfiA启动子。sfiA启动子具有一个LexA结合位点，该位点与-10区域和该启动子的转录起始点有所重叠，并且其转录激活需要LexA的解离。还知道sfiA启动子是处于细菌SOS反应控制下的最强的启动子，其诱导率为100。以PCR片段形式克隆sfiA启动子。基于已公开的sfiA序列，按RCR片段将侧翼接有HindIII和EcoRI限制性位点的方式设计引物(Beck和Bremer，1980)。
引物94C79(Seq.ID No.1)识别从位置59到87的sfiA序列：
TTTAAGCTTCCCGTCACCAACGACAAAATTTGCGAGGC
下划线部分是HindIII限制性位点，而sfiA序列则以斜体字母示出。
引物94C96(Seq.ID No.2)识别从位置400到376的互补sfiA：
AAGAATTCCCGACTCAGTTTTTGTTGCGG
下划线的是EcoRI限制性位点，而互补sfiA序列则以斜体字母表示。
在大肠杆菌HB101染色体DNA上进行PCR扩增，产生352bp的平头PCR片段。将此片段克隆到pMOL877的单一EcoRI位点中。质粒pMOL877衍生于IncQ质粒RSF1010，并除了四环素抗性标记外还含有无启动子的LuxCDABE操纵子。单一的EcoRI位点位于该操纵子的上游。用EcoRI消化后，使用Klenow DNA聚合酶将EcoRI位点的粘性末端填成平头。连接后用反应混合物转化大肠杆菌ED8739的电感受态细胞(Murray等，1977)。根据细胞在含四环素的培养基上的生长能力选择转化体，用牙签将转化体转接到两份含有四环素的丰富培养基中，然后用紫外光照射一个平板。使用放射自显影法可看到显示紫外光诱导型发光的阳性克隆。分析(限制性酶切分析和PCR)4个阳性克隆的质粒包含物，所有克隆均显示含有同样的重组质粒。将含有处于sfiA启动子转录控制下之LuxCDABE基因的基于pMOL877的衍生质粒定名为pMOL890。图1a和1b中分别给出了pMOL877和pMOL890的限制性酶切图谱。
作为sfiA启动子的适当的可代用物，可以将处于LexA控制下的并可在SOS反应期间被激活的其他启动子序列克隆到Lux报道基因系统的上游。如此可得到作为发光的函数显示基因毒性的新的构建体。特别有用的是具有高于40的诱导率的SOS-启动子。令人感兴趣的是不参与SOS诱变，但部分地参与RecF重组修复途径的SOS-启动子。这一组启动子包括recF、recJ、recN、recO、recQ、ruv和uvrD(以前称为recL)。鉴于SOS诱变启动子RecA和umu分别只有11和28的低诱导率，所以认为它们不是太有用的。在研究了文献之后，选择下列候选启动子序列作进一步的研究：
—大肠杆菌的recN启动子；
—大肠杆菌的ruv启动子；
—大肠杆菌质粒pHM101的muc启动子。
从这些候选启动子中选择recN进行进一步的实验工作，因为RecN是诱导SOS反应后细胞的主要构成成份，并且已知道LexA对它具有严格调节作用(Finch等，1985；Picksly等，1985)。
大肠杆菌的recN启动子：recN-lux融合体的构建
recN启动子具有三个LexA结合位点，一个与-35区域重叠，另一个与-10区域和该启动子的转录起始点重叠。推测第三个LexA结合位点位于编码区内。在这方面它不同于只有一个LexA结合位点的sfiA启动子。recN启动子具有下列序列(Seq ID No.3；Rostas等，1987)，其中指出了-35和-10区域(斜体字)的位置及两个LexA结合位点(下划线部分)的位置：
GCCTCTTTACTTGTATATAAAACCAGTTTATACTGTACACAATAACAGTAA
-35 LexA1 -10 LexA2
该启动子与一致的启动子序列(Seq.ID No.4)“TTGACA-16/17bp-TATAAT”具有相似性，但-35区的重要的G被T取代。因此，在诱导条件下recN的表达可能比-35区域的序列为TTGATC的sfiA启动子稍弱。
根据这一信息进行下列克隆实验：
—用PCR扩增法克隆野生型recN启动子。合成两个均引入EcoRI限制性位点的引物，即启动子区上游的引物1序列ID No.5和下游的引物2序列ID No.6。引物1位于recN序列的位置28-49。引物2位于recN序列的位置550-526(互补的)。引物中的GAATTC指示EcoRI位点。Rostas等人(1987)公开了recN序列。这些限制性位点是在pMOL877lux报道基因载体中克隆启动子片段所需要的。
—从启动子序列中除去LoxA2结合位点。为此目的，选择具有序列IDNo.7(AAAGAATTCTTATTGTGTACAGTATAAACTGG)的引物3，该引物在LexA2结合位点的最后三个碱基对处作了修饰。这三个碱基对构成一个一致序列，并且在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的所有Lex结合位点上都是保守的。引物3的5′末端以斜体字显示的碱基对并不符合野生型DNA序列，选择这种序列以引入一个EcoRI限制性位点。为了PCR扩增recN启动子，必须将此引物与引物1结合使用。引物3互补于recN序列的位置360-338(Rostas等，1987)。
使用具有序列ID No.8(相当于Rostas等1987所述的recN上的位置294-331)AAAAGAATTCTAATTTTACGCCAGCCTCTTGACTGTAT的引物4导入“启动子增效”突变。该引物在-35区的一致位置上引入一个G(黑体字)并且还在启动子区的5′末端引入一个EcoRI限制性位点。这样，引物4的5′端以斜体字表示的碱基对就不与野生型DNA序列相符合。recN启动子的PCR扩增中，必须联合使用该引物与引物2。
—从启动子序列中除去LexA2结合位点，并导入“启动子增效”突变。为此可使用引物3和4联合进行recN启动子的PCR扩增。
使用上述各对引物扩增recN基因的启动子区。也导入了额外的突变。由此得到下列PCR片段：
*recN1-2，野生型recN启动子(＝序列ID No.3)
*recN1-3，缺少LexA2位点的recN启动子(＝序列ID No.9)
*recN2-4，带有启动子增效突变的recN启动子(＝序列ID No.10)
*recN3-4，带有缺少LexA2位点之启动子增效突变的recN启动子(＝序列ID No.11)。
用EcoRI消化这些PCR片段并克隆到用EcoRI切成线性的luxCDABE表达载体pMOL877中。用连接混合物转化大肠杆菌ED8739(Met-，RecA+)。RecA+表型是获得启动子-lux融合体的SOS诱导表达所必需的。使用如前所述用于检测sfiA-lux融合体的紫外光照射诱导光发射，以鉴定含有所需的启动子-lux融合体的转化体。对于每种启动子构建体，均分别鉴定出显示有紫外光诱导之光发射的阳性克隆。如此得到下列质粒和大肠杆菌菌株：
*菌株CM2081中的pMOL1066，其含有recN1-2lux融合体(野生型recN启动子)。
*菌株CM2082中的pMOL1067，其含有recN1-3lux融合体(缺少LexA2位点的recN启动子)。
*菌株CM2083中的pMOL1068，其含有recN2-4lux融合体(带有启动子增效突变的recN启动子)。
*菌株CM2084中的pMOL1069，其含有recN3-4lux融合体(带有缺少LexA2位点之启动子增效突变的recN启动子)。
图2a-d中给出了recN-lux融合体质粒pMOL1066至pMOL1069的限制性酶切图谱。
使用启动子-lux构建体在大肠杆菌中进行发光测试
为了使用细菌SOS系统检查不同的启动子构建体的可诱导性，按照下文提供的方法，使用64ppm MMS进行诱导实验。取未经诱导的细胞作为对照。结果以信号/噪音比示于图3和4中。
根据这些结果可得出以下结论：
*含有野生型sfiA启动子的pMOL890(sfiA)在SOS诱导后得到很好的诱导和表达(图3和图4)。此外，诱导曲线与使用recN-lux融合体pMOL1066(recN1-2)和pMOL1067(recN1-3)观察到的曲线十分相似(见图4)。
*含有野生型recN启动子的pMOL1066(recN1-2)，在SOS诱导后比其衍生物的表达要差一些(也是关于总发光量)(图3和图4)。诱导曲线与使用sfiA-lux融合体pMOL890和pMOL1067(recN1-3)观察到的曲线十分相似(见图4)。
*含有缺少LexA2位点之recN启动子的recN1-3，在SOS诱导后得到很好的诱导和表达。此外，其诱导曲线与用sfiA-lux融合体观察到的曲线很相似(图3和图4)。
*含有带启动子增效突变之recN启动子的recN2-4，在SOS诱导后得以很好地诱导和表达。使用该构建体的总发光量以及起始诱导动力学甚至比使用pMOL890和pMOL1067更快(图3)。然而，由信号/噪音比表示的诱导曲线比使用pMOL890和pMOL1067时表现有更大的波动(见图4)。因此该构建体是检测基因毒性化合物存在的很好的候选构建体，但它似乎不太适合用于检测混合物中的单个基因毒性化合物的存在。
*含有缺少LexA2位点之启动子增效突变的recN启动子的recN3-4具有很强的发光，但信号噪音比例较差。因此，该构建体不适于用作基因毒性生物传感器(图3和图4)。
在另一个实验系列中，分别针对MMS(浓度为0.5-128ppm)和紫外光照射(照射时间为2-10秒)检测含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069之大肠杆菌1106的剂量-效应曲线。这些实验的结果示于图5和6中。
在两实验中，用pMOL1068(recN2-4)得到了最好的结果，而pMOL1069(recN3-4)则给出最低的信号/噪音比。使用pMOL890中的sfiA-lux融合体得到了相似的结果。基于这些结果，决定在鼠伤寒沙门氏菌Ames测试菌株TA98、TA100、TA104、TA1535和TA1538中导入这四个recN启动子-Lux融合构建体(pMOL1066-pMOL1069)，以及sfiA-lux融合体(pMOL890)，并测试它们的作为SOS反应(由于基因毒性产物的存在而诱发的)的函数的诱导作用。
在鼠伤寒沙门氏菌中导入启动子-lux融合构建体并进行测试
在Ames测试用鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98、TA100、TA104、TA1535和TA1538中导入所有五种质粒，pMOL890和pMOL1066至pMOL1069。由此说明Ames测试菌株的总体转化的普遍可行性。
在鼠伤寒沙门氏菌中进行诱变性测试
为了检查导入pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069是否对用于诱变测试的鼠伤寒沙门氏菌的特征有所影响(根据在存在或不存在诱变产物的情况下从His-到His+的回复频率所确定的)，用原始Ames测试菌株和它们的含有上述质粒的衍生菌株进行标准Ames测试。按照Maron和Ames(1983)所描述的步骤，对MMS、4-NQO、呋喃唑酮(furazolidone)、2-AF和苯并-α-芘进行测试。结果示于表1A至1G中。并未全部给出用原始Ames测试所得到的结果，但从表中给出的结果以及表1A与1B、1C与1D之间的比较可以得出这样的结论：导入质粒并没有改变重组菌株的His回复特征。因此，可以使用重组菌株进行传统的Ames测试。
在鼠伤寒沙门氏菌中进行发光测试
为了用鼠伤寒沙门氏菌的细菌SOS系统检查不同的大肠杆菌启动子构建体的可诱导性，按照下述公开的方法使用64ppm MMS或25.6ppb4-NQO进行诱导实验。取未经诱导的细胞作为对照。图7和8中给出了使用recN-lux融合体pMOL1067和pMOL1068得到的以信号/噪音比表示的结果。
从这些附图(图7和图8)中可以看出，用pMOL1068(RecN2-4)测得的诱导动力学稍快于就pMOL1067(RecN1-3)所观察到的诱导动力学，但用pMOL1067(RecN1-3)得到的最大信号/噪音比要高于pMOL1068(RecN2-4)。因此对于基因毒性测试，两构建体都是有用的并且是互为补充的。发现用pMOL890(sfiA)观察到的结果与用pMOL1067的结果相似。
测定13种产物的最小可检测浓度(MDC，nmol/测定)，其中使用含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的鼠伤寒沙门氏菌Ames测试菌株。表2中给出了用含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的鼠伤寒沙门氏菌TA104，以及含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的鼠伤寒沙门氏菌TA98得到的结果。此外还给出了文献中用SOS显色测试和Ames测试测得的MDC值。对于某些产物，无法计算出Ames测试的MDC值，而只指示出阳性(pos)或阴性(neg)反应。
表1A：用鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98，TA100，TA104，TA1535和TA1538对MMS进行Ames测试 His+回复体数目 TA98 TA100 TA104 TA1535 TA1538 MMS 1μl 41 38 1120 1282 988 836 27 38 11 12 MMS 0,2μl 23 32 604 560 582 404 23 24 15 15 MMS 0,1μl 22 35 344 392 432 512 27 18 23 20 平均空白 29 146 478 32 15 结论 - + + - -
表1B：用含有pMOL890的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98*，TA100*，TA104*，TA1535*和TA1538*对MMS进行Ames测试 His+回复体数目 TA98* TA100* TA104* TA1535* TA1538* MMS 1μl 22 27 536 528 672 724 29 26 29 27 MMS 0,2μl 26 28 242 314 428 325 24 24 27 28 MMS 0,1μl 25 27 160 152 224 218 32 32 28 36 平均空白 26 88 100 30 28 结论 - + + - -
表1C：用鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98，TA100，TA104，TA1535和TA1538对4-NQO进行Ames测试 His+回复体数目 TA98 TA100 TA104 TA1535 TA1538 4-NQO 1μl 310 348 2288 2160 1520 1760 52 38 370 360 4-NQO 0,1μl 69 60 400 440 544 520 46 48 50 51 4-NQO 0,01μl 47 50 182 174 272 448 40 38 16 15 平均空白 38 131 359 45 12 平均空白+DMSO 33 125 374 31 15 结论 + + + - +
表1D：用含有pMOL890的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98*，TA100*，TA104*，TA1535*和TA1538*对4-NQO进行Ames测试 His+回复体数目 TA98* TA100* TA104* TA1535* TA1538* 4-NQO 1μl 138 189 482 461 527 691 29 25 167 192 4-NQO 0,1μl 27 37 112 101 149 161 27 26 35 40 4-NQO 0,01μl 8 15 76 86 93 106 27 26 10 14 平均空白 32 69 95 30 33 平均空白+DMSO 35 73 102 28 36 结论 + + + - +
表1E：用含有pMOL890的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98*，TA100*，TA104*，TA1535*和TA1538*对呋喃唑酮进行Ames测试 His+回复体数目 TA98* TA100* TA104* TA1535* TA1538*呋喃唑酮 10mmol 26 30 532 544 640 620 49 38 17 18呋喃唑酮 1mmol 20 14 124 132 320 308 30 15 15 7呋喃唑酮 0,1mmol 19 8 98 108 158 140 31 22 7 9平均空白 12 127 135 36 9平均空白+DMSO 11 118 157 38 11结论 + + + - +/-
表1F：用含有pMOL890的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98*，TA100*和TA104*对2-AF进行Ames测试 His+回复体数目 TA98* TA100* TA104* 2AF 670mmol +S9 5600 6250 2 3 548 464 2AF 670mmol -S9 62 68 0 3 120 118 2AF 67mmol +S9 3200 2560 134 108 350 368 2AF 67mmol -S9 34 31 11 5 115 110 2AF 67mmol +S9 576 555 73 52 178 162 2AF 6,7mmol +S9 9 9 1 3 144 142 2AF 6,7mmol +S9 52 53 33 42 188 162 平均空白+DMSO +S9 12 15 22 44 51 43 184 156 130 平均空白+DMSO -S9 2 3 5 33 36 27 126 90 140 平均空白 +S9 17 12 18 59 39 45 180 192 172 平均空白 -S9 7 9 7 4 7 10 166 160 150 结论 + + +
在有(+S9)或没有(-S9)进行代谢活化的情况下进行测试
表1G：用含有pMOL890的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98*，TA100*和TA104*对苯并-α-芘进行Ames测试 His+回复体数目 TA98* TA100* TA104* BαP 600mmol +S9 29 33 74 73 57 69 BαP 600mmol -S9 0 0 6 3 21 19 BαP 200mmol +S9 49 50 59 58 87 87 BαP 200mmol -S9 0 0 7 23 26 32 BαP 50mmol +S9 446 38 64 54 82 85 BαP 50mmol -S9 0 0 15 11 29 27 BαP 10mmol +S9 24 24 67 80 97 1062平均空白+DMSO +S9 2 0 2 21 36 27 50 50 57平均空白+DMSO -S9 0 0 0 0 0 3 22 26 25平均空白 +S9 0 5 4 29 25 28 49 78 41平均空白 -S9 0 0 0 0 0 0 28 36 31结论 + + +
在有(+S9)或没有(-S9)进行代谢活化的情况下进行测试
最小可检测浓度(MDC，nmol/测试) TA104 TA98 TA98 TA104 SOS AMES产物pMOL1066pMOL1067pMOL1068pMOL1069pMOL1067pMOL1068 pMOL890 pMOL890 显色测试2-氨基芴0.440.220.220.220.440.22 0.14 0.14 3.56 0.672，4，5，7-四硝基-9-芴酮0.0220.0110.0220.0110.0220.011 0.056 0.011 0.24 0.001K2Cr2O721.85.41.410.95.41.4 2.7 2.7 136 91H2O211.811.811.85.91.51.5 8.5 3.8 23 阴性新生霉素1.260.321.260.320.0790.63 0.57 1.26 阴性 阳性ICR1911.10.550.551.10.280.14 0.14 0.14 0.13 阳性1.0950.551.0950.555.55.5 2.2 2.2 11 阳性酪蛋白氨基酸阴性阴性阴性阴性阴性阴性 阴性 阴性 ？ -呋喃唑酮0.000440.000220.000220.000440.001760.00176 0.00176 0.00176 0.01 0.1苯并(α)芘0.160.0790.160.160.160.16 1.59 0.32 0.7 44-硝基喹啉-N-氧化物0.00340.00170.00080.00170.00170.0008 0.0008 0.0005 0.006 0.003甲基甲磺酸7.37.37.37.37.37.3 7.3 7.3 20 60CdCl2阴性阴性阴性阴性阴性阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
表2：用含有pMOL890，pMOL1066，pMOL1067，pMOL1068或pMOL1069的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA104，和含有pMOL890，pMOL1066，pMOL1067，pMOL1068或pMOL1069的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98确定13种产物的最小可检测浓度(MDC，以nmol/测试表示)。还给出了SOS显色测试和Ames测试的文献值。
表3试剂结果AmesSOS类别附注
药物ICR191阳阳阳吖啶环磷酰胺阴阳阴抗肿瘤药物丝裂霉素C阳阴阳抗肿瘤药物氨甲喋呤阳阳阳抗肿瘤药物
抗微生物剂呋喃唑酮阳阳阳抗微生物剂新生霉素阳阳阴抗微生物剂carbadox阳阳阳抗微生物剂Nifuroxazide阳阳阳抗微生物剂萘啶酮酸阳阴阳抗微生物剂
杀虫剂、除草剂亚乙基硫脲阴阳阴杀虫剂Carbaryl阳阳阳杀虫剂Lindane阴阴阴杀虫剂五氯苯酚阳阳阳除草剂
无机化合物SeO2阳阳未测金属氧化剂ZnCl2阴阴阴金属工业用CdCl2阴阴阴金属工业用K2Cr2O7阳阳阳金属氧化剂H2O2阳阴阳过氧化物氧化剂叠氮化钠阳阳阴叠氮化物工业用
多环芳烃(PAH)苯并(α)芘阳阳阳PAH(五环)环境污染物阳阳阳PAH(四环)环境污染物萘阴阴阴PAH(四环)环境污染物芘阳阴阳PAH(四环)环境污染物2，4，5，7-四硝基-9-芴酮阳阳阳PAH(三环)环境污染物4-硝基喹啉-N-氧化物阳阳阳PAH(三环)环境污染物荧蒽阳阳阳PAH(三环)环境污染物蒽阴阴阴PAH(三环)环境污染物菲阳阴阳PAH(三环)环境污染物
实验室化学物质N-亚硝基二乙胺阳阳阳亚硝胺2-氨基芴阳阳阳芳香胺酪蛋白氨基酸阴不可测*阴氨基酸十二烷基磺酸钠阴阴阴阴离子去污剂葡萄糖阴阴阴糖甲基甲磺酸阳阳阳磺酸酯乙基甲磺酸阳阳阳磺酸酯
不可测*：由于存在组氨酸
溶剂，燃料，…肼阳阳阳肼火箭燃料表氯醇阳阳阳环氧丙烷溶剂
电磁波UV射线阳阳未测电磁波治疗用射线、阳光，…RX射线阳阳阳电磁波治疗用射线
选择两种产物，即酪蛋白氨基酸和CdCl2作为阴性对照。因为酪蛋白氨基酸中含有组氨酸，所以不可能用Ames测试检测它。
从表2中可以看出，用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株可得到最好的结果。用所有构建体得到的结果均好于用SOS显色测试得到的结果，其中例外的是ICR191给出相似的结果。这些结果也大大好于用Ames测试得到的结果，其中例外的是2，4，5，7-四硝基-9-芴酮。因此可以认为，在鼠伤寒沙门氏菌Ames测试菌株中使用sfiA和recN-lux基因融合体(pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069)检测基因毒性时提供了一条比SOS显色测试和Ames测试更快速、更灵敏的途径。
表3给出了用含有pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株进行的基因毒性测试的结果。因为用这些菌株得到的测试结果相似，所以只给出最后的测试结果(阳性或阴性)。SOS显色测试(SOS)和Ames测试也得到相似的结果。所测试的试剂是下面几类中的通常视为代表性的试剂：药物、抗微生物剂、杀虫剂、除草剂、无机化合物、多芳烃、实验室化学物质、溶剂、燃料及电磁射线。从该表中可以看出，可使用杂合的TA Ames测试菌株检测所有各类被试产物的基因毒性，并且与使用SOS显色测试和Ames测试得到的结果只有很小差异。
当将用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株得到的结果与用SOS显色测试得到的结果相比较时，可以得出如下结论：
当产物在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作测试中是阴性时，用SOS显色测试也是阴性。然而，可能有基因毒性的新生霉素和叠氮化钠在SOS显色测试中是阴性，但在使用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的测试中则是阳性。因此可以认为用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的测试，对于基因毒性测试来说，因为没有得到假阴性结果，所以比SOS显色测试更为准确。当产物在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作测试中是阴性时，其在Ames测试中也是阴性。所不同的是环磷酰胺和亚乙基硫脲在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作测试中是阴性的。这一现象是可以理解的，因为这些产物并不诱发细菌SOS反应。
发现在Ames测试中呈假阴性的基因毒性产物，例如丝裂霉素C、萘啶酮酸、过氧化氢、芘和菲，在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作测试中为阳性。因此可以认为，用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的测试不仅如Ames测试一样好，而且在PAH等环境污染物的测试中要更加准确。
组合的基因毒性产物的测试
检查测试样品中存在一种以上基因毒性产物时不同构建体的反应。这是一个很重要的方面，因为环境样品常常含有一种以上的基因毒性污染物。另外，有许多必须进行基因毒性测试的药物产品可能是不同的活性基因毒性物质(如抗肿瘤或抗爱滋病药物)的组合。使用含有pMOL1067或pMOL890的TA98和TA104进行实验。选择这两种构建体是因为它们在鼠伤寒沙门氏菌中显示有相似的诱导动力学和最好的信号/噪音比(见图7和图8)。作为测试产物，可采用MMS与新生霉素的几种组合。选择使用这些产物是因为我们发现它们有不同的诱导动力学(例如，用pMOL1067，MMS在2小时后给出最大值，而用新生霉素则在4小时后观察到最大信号噪音比)。图9和10中列出了这些实验的结果实例。
从这些结果可以看出，用含有pMOL890(sfiA-lux)或pMOL1067(recN 1，3-lux)的菌株，可在基因毒性化合物的混合物中检测出至少两种单个基因毒性化合物。这正好与所预期的情况相反，因为预期的是最大信号的增加而不是两个单个的最大值。
还检查了在以前实验中用MMS与新生霉素组合得到的数据是否会产生所用不同组合的基因毒性排序，并且这种排序是否与用不同的测试菌株[例如用TA98(pMOL1067)和TA104(pMOL890)]所得结果一样。为此，计算所测试的每种组合的总信号/噪音比，然后将它们从低至高进行排序。结果可见不同的测试菌株产生合理的、完全相同的排序。有关例子示于图11和12中。
毒性测试
不同的构建体在没有基因毒性产物的情况下也产生本底光信号，这称为噪音。这种噪音信号可用作检测毒性而不是基因毒性化合物的度量信号。特别是认为可显示相对较高噪音的、含pMOL890和pMOL1068的菌株很适合于这种毒性测试(在4小时实验过程中它们的噪音可从100升高到13000相对光单位)，而具有低噪音的含pMOL1066或pMOL1067的菌株则用处不大(在4小时实验过程中它们的噪音从20升高到750相对光单位)。如图13和14中所示，当用不同浓度的毒性产物R116处理时，观察到含有pMOL1067或pMOL1068的TA98菌株的发光量降低。
比较图13和14可见，用TA98(pMOL1068)观察到的信号/噪音比例远比用TA98(pMOL1067)所检测到的更为恒定。由于菌株TA98(pMOL1068)有高得多的基础发光量，所以发光量的测量中的误差重要性不太大，进而导致计算的信号/噪音数据的波动也较小。菌株TA98(pMOL1068)，还有其他含有pMOL890或pMOL1068的菌株对于毒性产物的IC50计算值是很有用的。优选的菌株将表现出至少与菌株TA98(pMOL1068)一样的基础发光量。
环境样品的测试
因为对纯的产物所作测试显示含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株在测试潜在的环境污染物(如PAH)时比传统的Ames测试更灵敏，所以使用这些菌株来测试环境样品。给出的实例是：
—估测对PAH污染的土壤的生物除污
—水溶性PAH降解产物的出现
用500ppm混合物(含有萘、菲、蒽、荧蒽、芘和苯并-α-芘的Borneff混合物)污染土壤样品。然后在生物反应器中处理该土壤以刺激细菌降解PAH。为了估计对土壤的生物除污并检查基因毒性的降低，在3周的期间内取10g土壤样品。用己烷(1ml/g土壤)提取这些样品，并将提取物浓缩100倍。将浓缩的提取物稀释1至8倍，并用于基因毒性测试中(有或没有代谢激活)。作为(最高阳性稀释度时高于2的信号/噪音比)×(稀释倍数)的乘积计算每种样品的基因毒性值。例如，如果稀释4倍时发现信号/噪音比为2.8，则该样品的基因毒性值为11.2。对基因毒性值作图，这可对此被污染土壤的基因毒性作出很好的评价。图15中给出了有关的实验数据。
从图15中可以看出，随着时间的推移，PAH污染的土壤的基因毒性出现降低。这证明含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株很适用于跟踪和估测污染了基因毒性产物的土壤的生物除污效果。一般含具有诱导率高于40之SOS调节的启动子的序列的菌株均可用于本发明的优选实施方案中，其中所说的启动子与编码报道分子的核酸序列有效相连，所编码的报道分子会产生可以发光形式测定的信号。权利要求的任何宿主微生物均适用于这样的测试中。
为了分析水溶性中间体PAH降解产物的生成，对菲、芴和荧蒽的降解进行了检测。为此，用0.1％PAH饱和未加额外碳源的基本M9培养基，并接种能够降解PAH的菌株。每3天取出样品(200ml)，并按照Grifoll等人(1994)的方法浓缩之。在pH2.5或pH7条件下进行提取并将样品浓缩至5ml。于37℃干燥每种样品各1ml，并重新悬浮于100μl DMSO中。取其中1μl用于基因毒性测试中。观察到菲的基因毒性先是增加，然后又降低；芴未显示出基因毒性的明显增加，但可见荧蒽的基因毒性增加。这表明有基因毒性中间体化合物的形成和聚积。图16中给出了估测菌株LB208降解荧蒽的结果。只给出pH2.5条件下进行提取的数据。
从该实验中可以看出，含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株适用于估测基因毒性污染物的降解，以及基因毒性中间体降解产物的出现和聚积。总之，可将含具有诱导率高于20、优选高于40、最优选高于50之SOS调节的启动子的序列的菌株用于优选实施方案中，其中所说的启动子与编码报道分子的核酸序列有效相连，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号。权利要求的任一种宿主微生物均可适用于这样的测试中。正如对gazoline污染之土壤的DMSO提取物的分析所证明的，也有可能对环境样品进行毒性测试。提取物的浓度越高使毒性越趋增加(数据未示出)。
用recN-lux细菌测试基因毒性的标准操作方法
1.引言
该测试是基于含有作为SOS系统一部分的费氏弧菌lux操纵子的细菌，其中所说的lux操纵子处于recN基因的转录控制下。将细胞与基因毒性产物一起保温后，recN启动子将解除阻抑，导致lux操纵子的表达。这种表达基因以毒性的函数形式产生发光。然而，使用sfiA-lux菌株完成的测试也按同样的方法进行。本领域技术人员也能够使用这一方法，对本发明的含有SOS调节的启动子的其它系统进行测试。
2.菌株
—TA104 recN1-3
—TA104 recN2-4
—TA98 recN1-3
—TA98 recN2-4
3.材料
3.1培养基
3.1.1 869培养基(pH＝7)
每升去离子水含有：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，葡萄糖D1g，CaCl2·2H2O0.345g，半胱氨酸30mg。
将培养基于120℃高压灭菌20分钟。加入四环素(20μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)。将培养基贮存于4℃备用。
3.1.2贫瘠869培养基(pH＝7)
每升去离子水含有：胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl5g，葡萄糖D1g，CaCl2·2H2O0.345g，半胱氨酸30mg。
3.2 S9成分
3.2.1 S9
使用标准方法从大鼠肝中得到芳氯物诱导的微粒体组分S9。可从药厂得到之。
3.2.2 KCl/MgCl2溶液
KCl6.15g，MgCl2·6H2O4.7g，加蒸馏水至100ml。高压灭菌并于室温下贮存。
3.2.3 0.1Mβ-NADP
β-NADP 500mg，加无菌蒸馏水6.53ml，以每份500μl于冷冻管中贮存于-20℃。
3.2.4 1M葡萄糖-6-磷酸(G6P)
G6P 282mg，加无菌蒸馏水1ml，在冷冻管中贮存于-20℃。
3.2.5磷酸盐缓冲液0.2M(pH＝7.4)
60ml 0.2M NaH2PO4·H2O，440ml 0.2M Na2HPO4，调pH至7.4并以100ml等份高压灭菌，贮存于室温下。
3.3化学物质
—DMSO：疏水产物的溶剂
—MMS：未经代谢情况下所作测试的阳性对照
—4NQO：未经代谢情况下测试疏水产物的阳性对照
—2AF：经S9代谢情况下所作测试的阳性对照
3.4设备
96孔微量滴定板光度计，其为计算机控制的，可将数据记录在工作行程纸上。
4.测试方法
4.1培养物的维持和起始
4.1.1维持
刮下很少量冷冻的永久培养物并接种于25ml 869培养基(见3.1.1)中。在旋转摇床(170rpm)上37℃培养过夜(ON)。次日早晨加入2.5mlDMSO。将细菌悬液分装到冷冻试管中并于-80℃保存。取一个试管用于测试作为推荐为Ames菌株(rfa、pKM101等)的细菌。
4.1.2起始测试培养物
用40μl细菌原液(见4.1.1)接种5ml 869培养基(见3.1.1)，并于37℃在旋转摇床(170rpm)上培养过夜。次日早晨，将20μl过夜培养物接种于2.5ml贫瘠869培养基(见3.1.2)中。37℃晃动(170rpm)下培养1小时。
4.2测试产物的稀释
4.2.1贮备溶液
作为溶解度和所需最高浓度的函数选择贮备液的浓度。在小瓶内称入几毫克产物(Amg)并加入所需体积(Vml)的溶剂，以得到所需的浓度(Smg/ml)，计算式为V＝A/S。
4.2.2测试产物的稀释
向8个小瓶(1-8号)内各加入50μl溶剂(H2O或DMSO)。向1个小瓶(9号)内加入100μl贮备液。从9号小瓶转移50μl至8号小瓶中，用取液器混合5次并取50μl转移到7号小瓶内依此类推，直到2号小瓶。混合后从2号(#2)中弃去50μl。
向各小瓶内加入450μl贫瘠869培养基。从各小瓶取10μl转入96孔板内：
—从1号小瓶移入栏1、2和3(＝溶剂对照)，
—从2号小瓶移入栏4，从3号小瓶移入栏5，如此直到栏11。
4.2.3阳性对照物的制备
阳性对照物的应用参见3.3节。
2AF(8ppm)：制备在DMSO中的6400ppm溶液；在50μl DMSO中两倍稀释直至800ppm；加入450μl贫瘠869培养基(＝80ppm)；向孔E12、F12、G12、H12中各转移10μl。
4NQO(4ppb)：制备在DMSO中的1000ppm溶液；向40μl该溶液内加入960μl DMSO(＝40ppm)；向10μl该溶液内加入990μl DMSO(＝0.4ppm)；向50μl该0.4ppm溶液内加入450μl贫瘠869培养基(＝40ppb)；转移10μl至孔A12、B12、C12、D12中。
MMS(16ppm)：将5μl MMS加到995μl H2O(＝6400ppm)；在50μl H2O中稀释2倍直至1600ppm；向50μl该1600ppm溶液内加入450μl贫瘠869培养基；转移10μl至孔A12、B12、C12、D12中。
4.3加或不加S9混合物进行实验
4.3.1加S9混合物
—一般在加入到细菌中之前新鲜制备S9混合物
在管中轻轻混合：100μl KCl：MgCl2(3.2.2)、100μl β-NADP(3.2.3)、50μl G6P(3.2.4)、2500μl磷酸盐缓冲液(3.2.5)、2500μl贫瘠869培养基(3.1.2)、132μl S9。
—加入细菌
轻轻混合：140μl细菌悬液(4.1.2)、860μl贫瘠869培养基、400μl S9混合物。
转移90μl至：
孔E1到E12：TA104 recN1-3
孔F1到F12：TA104 recN2-4
孔G1到G12：TA98 recN1-3
孔H1到H12：TA98 recN2-4
4.3.2不加S9混合物
向140μl细菌悬液(4.1.2)中加入1260μl贫瘠869培养基。
转移90μl至：
孔A1到A12：TA104 recN1-3
孔B1到B12：TA104 recN2-4
孔C1到C12：TA98 recN1-3
孔D1到D12：TA98 recN2-4
5.测定
将96孔平板放在光度计上并开始测定(1秒/孔；每循环一次300秒；60个循环；30℃)。
6.计算
完成测定后，将数据贮存在工作进程表上。将这组数据转移到自动计算信/噪比的大纸上，制作图表并作出最后报告。
7.评价
在下列情况下认为产物是有基因毒性的：
1)至少在2个浓度下，信号/噪音比等于或高于2；
2)有清楚的剂量-效果反应。
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