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本发明涉及一种能产生抗猪链球菌细菌素的微生物，经鉴定为屎肠球菌LPL420P06，保藏编号为CGMCC 2856。本发明还公开了屎肠球菌LPL420P06所产细菌素的生产方法。本发明还公开了屎肠球菌LPL420P06所产细菌素的特性及应用方法。屎肠球菌LPL420P06可以在较廉价的培养基中产生活力较强的细菌素，生产方法较为简单易行，成本较低，该细菌素可以强烈抑制引起猪链球菌病的马链球菌兽疫亚种，对猪链球菌病的预防与治疗效果明显。

1.  一株产细菌素屎肠球菌菌株，其特征是：该屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏名称为屎肠球菌LPL420P06，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年1月8日，保藏号为：CGMCC2856。

2.  根据权利要求1所述的一种屎肠球菌菌株所产细菌素的生产方法，其特征是：步骤1，准备改良MRS培养基，30-35℃下培养14-16h后添加等量酵母膏与麸皮浸出液，继续培养8-10h；步骤2，细菌素的提取，采用pH值依赖的吸附解吸法进行提取，吸附pH值为4.0-7.0，解吸pH值为1.5-2.5，得到细菌素粗品，阳离子交换树脂层析后冷冻干燥得到细菌素纯品。

3.  根据权利2所述pH值依赖的吸附解吸法，其特征在于最佳的吸附pH值为6.0，最佳的解吸pH值为2.5。

4.  根据权利要求2所述细菌素的生产方法，其特征在于：所述的改良MRS培养基成分为：糖蜜3-4％，豆粉3-4％，酵母膏1.5-2％，麸皮浸出液10-15％，吐温0.1％，磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％，pH值6.5-7.0。

5.  根椐权利要求3的所述提取方法得到的细菌素，其特征为对温度、酸碱耐受性好，对蛋白酶敏感，抑菌谱广，尤其用于抑制引起我国养猪业流行的猪链球菌病的主要病原菌-马链球菌兽疫亚种。

6.  根据权利要求2或3或4或5所述屎肠球菌细菌素，其特征在于：用于猪链球菌病的预防与治疗。

一种抗猪链球菌细菌素及其生产方法与专用菌株
本发明所属的技术领域
本发明提供一株有自主知识产权的屎肠球菌，及该屎肠球菌产生的细菌素、细菌素的制备方法与应用，属于生物技术领域。
发明的背景技术
随着对微生物活性代谢产物研究的进行，乳酸菌及其产生的细菌素成为研究的热点。某些乳酸菌细菌素能抑制常见的腐败菌和一些病原菌。细菌素是菌体通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性的多肽，具有较好的选择性杀菌效果，对热、酸等稳定性好，经蛋白酶作用而降解，不会在体内残留，具有较高的安全性，因而得到了较为广泛的研究应用。
其中，肠球菌是乳酸细菌的一个属，为动物体内正常定居的微生物，其产生的细菌素在复杂的微生态环境中扮演着非常重要的角色，对许多种属的微生物表现出强烈的抑菌活性，不同的肠球菌素抑菌谱各不相同。在肠球菌素的研究中，有关屎肠菌素的报道最多。防治动物疾病是屎肠球菌及其产生细菌素的重要应用方向。至今为止，纯化为均一物质并被深入研究的屎肠球菌素有enterocin A，P，B，L50A，L50B，I，Q，M，从不同生境筛选的屎肠球菌及其产生的细菌素目前主要用来防治动物的大肠杆菌、沙门氏菌等的感染。应用方法为：屎肠球菌作为益生菌制剂添加入饲料中，通过促进其生长的低聚糖等来使其定植于肠道中，发挥其抗菌效果，以预防感染；屎肠球菌产生的细菌素纯品稀释到一定浓度后，以生理盐水或灭菌注射用水稀释，肌肉注射，连用3-4d来治疗猪的各种细菌性感染疾病。
猪链球菌病为一种常见的猪病，在我国其病原菌主要以马链球菌兽疫亚种为主。该病在猪群中以呼吸道为主要传播途径，且可以通过伤口、消化道等途径传播，发病率和死亡率均较高。目前，全群预防在临床上常用弱毒疫苗免疫和饲喂抗生素两种方法。由于致病性猪链球菌的血清型较多，故免疫预防常常不能起到很好的效果；抗生素虽能够在一定程度上控制该病的流行，但容易引起猪胃肠道菌群失调，造成耐药菌增多及肉制品药物残留等问题，因此，用可以强烈抑制病原菌的细菌素来代替传统治疗方法成为促进养猪业健康发展的必然选择。
本发明所解决的问题
本发明的目的是针对我国目前没有可以安全有效防治猪链球菌病方法，猪链球菌病频频发生，为养猪业带来了巨大的经济损失的现实，提供一株有自主知识产权的屎肠球菌，及该菌所产细菌素的制备方法及应用。该细菌素对酸、热稳定，可以强烈抑制猪链球菌病的主要病原菌-马链球菌兽疫亚种，易被胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K降解，提取方法简单易行，应用效果良好，为预防和治疗猪链球菌病提供了新的途径。
发明内容
本发明筛选出一株产细菌素屎肠球菌LPL420P06，已于2009年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 2856，所产细菌素具有抑制马链球菌兽疫亚种(该菌是我国养猪业流行的猪链球菌病的主要病原菌)的活性。
本发明屎肠球菌LPL420P06的特征是：在MRS液体培养基中多呈对排列，细胞卵圆形，菌体大小为0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，不生芽孢，革兰氏阳性，兼性厌氧。在MRS固体培养基上呈现微小圆形，白色突起、较厚、边缘圆整的菌落。可发酵糖类产酸。其接触酶阴性，不运动，在10℃、45℃，6.5％NaCl，pH值9.6均能生长，V-P反应、精氨酸双水解酶和马尿酸水解为阳性，具有Lancefield D群抗原，不能耐受0.04％亚碲酸盐。
本发明还提供了抗猪链球菌细菌素产生菌的筛选方法及该菌产细菌素培养方法。
本发明之产抗猪链球菌细菌素菌株的定向筛选方法，从健康长白、大白未断奶仔猪的粪便中随机取样，将所得单菌落点种于含马链球菌兽疫亚种(引起猪链球菌病的主要病原菌)的固体平板上进行初筛，37℃培养24h观察周围有抑菌圈的菌落即怀疑为细菌素产生菌。将初筛得到的菌株进行培养，得到发酵上清液，排除干扰因素(有机酸如乳酸、过氧化氢及菌体细胞等)的干扰后仍有抑菌活性，而经蛋白酶的处理后无抑菌活性上清液对应的菌株为产细菌素菌株。
本发明之产细菌素屎肠球菌菌株产生细菌素的培养基为：糖蜜3-5％、豆粉3-4％、酵母膏1.5-2％、麸皮浸出液10-15％、吐温0.1％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％，pH值6.5-7.0，培养条件为：30-35℃下培养14h-16h后添加等量酵母膏与麸皮浸出液，继续培养8h-10h。
本发明还包括细菌素的制备方法，采用pH值依赖的吸附解吸法进行提取，吸附pH值为4.0-7.0(最佳为6.0)，解吸pH值为1.5-2.5(最佳为2.5)，阳离子交换树脂层析后冷冻干燥得到纯品。
本发明还提供了该细菌素的理化特性、抑菌谱及在防治猪链球菌病方面的应用。
本发明的优点
本发明筛选出的屎肠球菌LPL420P06可以产生屎肠球菌细菌素，该细菌素可以强烈抑制引起猪链球菌病的马链球菌兽疫亚种，从而使其具有很好的使用价值。
屎肠球菌LPL420P06可以在较廉价的培养基中产生活力较强的细菌素，生产方法较为简单易行，成本较低，对猪链球菌病的预防与治疗效果明显。
屎肠球菌LPL420P06产生的细菌素具有较稳定的理化特性，抑菌谱较广，可以用于微生态制剂的开发。
附图说明
图1为在不同pH值下细菌素对产生菌和指示菌的吸附率指示图。
图2为细菌素在pH5.5条件下的阳离子树脂层析洗脱曲线图。
图3为细菌素对温度的稳定性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不仅限于本发明。
实施实例1
菌种的筛选鉴定
从健康未断奶仔猪的粪便中分离出108株产生较大溶钙圈的可疑乳酸菌，经点种法初筛后，发现来自于长白仔猪的菌株LPL420P05，LPL420P06，LPL420P09，LPL420P027，LPL420P029，LPL420P033，LPL420P054和来自于大白仔猪的LPL420P11，LPL420P117，LPL420P126的发酵上清液对猪链球菌有不同程度的抑制作用。
将10株菌离心上清液用1MNaOH中和有机酸，加入过氧化氢酶，使其浓度为1mg/mL，37℃水浴1h，经细菌滤器过滤除去菌体细胞，硫酸铵沉淀、透析处理后，仅菌株LPL420P06的代谢产物有较好的抑制猪链球菌活性。向菌株LPL420P06透析液中加入蛋白酶K(20U/mL)，37℃作用1h后发现抑菌活性消失。用二倍稀释法测定其不同处理后的抑菌效价值，结果见表1
表1  不同处理对抑菌活性的影响

我们选择对猪链球菌抑菌效果最好的菌株LPL420P06培养鉴定，其特征为：在液体培养基中呈对排列，细胞卵圆形，菌体大小为0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，不生芽孢，革兰氏阳性，兼性厌氧。在MRS固体培养基上呈现微小圆形，白色突起、较厚、边缘圆整的菌落。
用菌株LPL420P06发酵上清液做纸层析试验，与标准乳酸的Rf值对照基本一致，说明菌株LPL420P06发酵产物中有机酸含有乳酸，该菌属于乳酸细菌。菌株LPL420P06的生理生化试验表明，其接触酶阴性，不运动，在10℃、45℃，6.5％NaCl，pH值9.6均能生长，V-P反应、精氨酸双水解酶和马尿酸水解为阳性，具有Lancefield D群抗原，不能耐受0.04％亚碲酸盐，结合糖醇发酵试验结果(见表2)，参照伯杰氏鉴定细菌学手册(第八版)，初步确定该菌株属于屎肠球菌。进一步经16S rRNA序列鉴定知，菌株LPL420P06为屎肠球菌。
表2  菌株LPL420P06生理生化特征试验

实施实例2
屎肠球菌所产细菌素的培养基及培养条件确定
基础培养基(MRS培养基)：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、吐温800.1％，pH6.5。
不同培养温度细菌素产生的影响：分别在30℃、35℃、37℃、42℃三个温度下，以基础培养基培养24h，将发酵上清液做抑菌实验，比较温度对细菌素产生的影响。接种于MRS培养基在不同培养温度下培养时细胞的生长及细菌素产生情况见表3：在不同温度下培养时，生长与细菌素产生都有很大不同，在30-35℃培养时，细菌素活性较好。
表3  培养温度对细菌素产生的影响


培养pH值对细菌素产生的影响：pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的培养条件下培养至稳定期(24h)，接种于不同pH值的MRS培养基在30℃下培养时细胞的生长及细菌素产生情况见表4，培养pH值对细菌素的产生有明显的影响，在pH6.0-7.0时细菌素产量较高。
表4  培养pH对细菌素产生的影响

碳源不同添加量对细菌素产量的影响：糖蜜为3％、4％、5％的添加量，代替MRS中的葡萄糖成分，在以上实验确定的最佳培养条件(即30℃、初始pH6.5)下培养24h，结果见表5，可知添加3％-4％的糖蜜，可得到较大产量的细菌素。
表5  碳源对细菌素产量的影响

不同氮源不同添加量对细菌素产量的影响：氮源分别添加不同量的豆粉、酵母膏、麸皮浸出液代替MRS培养基中的氮源成分进行单因素试验，
表6  氮源对细菌素产量的影响

补料添加时间对细菌素产量的影响：在培养的不同时间添加的酵母膏与麸皮浸出液作为补料，得到的结果见表7，可知在14h-16h后添加补料，继续培养8h-10h，可得到较大产量的细菌素。
表7  补料添加时间对细菌素产量的影响

因此，该菌株作为细菌素产生菌，考虑到其大量应用，可采用如下改良MRS培养基，其成分为：糖蜜3-4％，豆粉3-4％，酵母膏1.5-2％，麸皮浸出液10-15％，吐温0.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，pH值6.5-7.0，培养条件为：30-35℃下培养14h-16h后添加等量的酵母膏和麸皮浸出液，继续培养8h-10h，以延长菌体的对数生长期，可得到细菌素的最大产量。
实施实例3
屎肠球菌所产细菌素的提取
最佳的吸附解吸pH值的确定：(1)离心收集细胞-包括产生菌和指示菌，用灭菌的PBS(5mM pH6.0)冲洗几次并重悬于1.0M NaCl中用5％的磷酸调pH 2.0，在4℃混匀1h，离心收集并重悬于20倍初始体积的无菌水中，以确保细胞表面已没有吸附的细菌素。(2)确定pH对细菌素吸附的影响(包括产生菌和指示菌)，0.1mL细胞(产生菌或指示菌)，0.1mL一定效价的细菌素加入1.8mL的PBS用磷酸或氢氧化钠调pH在1.5-14.0之间，混合物于30℃缓慢震荡30min，离心检测上清液中的效价。对照1：用0.1mL的水代替0.1mL的细菌素；对照2：用0.1mL的水代替加入的细胞；细菌素的吸附率＝100％*(上清液中的效价对照1)/对照2。(3)从吸附了细菌素的产生菌表面提纯细菌素，准备一定量的培养液，70℃，25min灭酶后调至最适吸附pH，4℃磁力搅拌2h，然后细胞用相同pH值的PBS洗净，重悬于一定体积的0.1M的NaCL中，用5％的磷酸调pH至2.5，4℃磁力搅拌至解吸充分，得到如图1的结果。
利用该细菌素可以吸附于产生菌细胞的特点，通过调节pH值实现了高效的纯化。将该菌以1％(V/V)的接种量(约10⁷CFU/mL)接种，培养温度为30℃，转速100rpm，发酵过程中控制pH值为6.5，发酵过程中补料，24h后结束发酵。结束发酵后调温度至70℃，25min灭酶。冷却至室温后将发酵液调至最适吸附pH 6.0，100rpm恒速搅拌2h，离心收集细胞，用与吸附pH值相同的磷酸缓冲液洗细胞1-2次，重悬于200mL的NaCl(0.1mol/L)溶液中，调至最佳解吸pH值2.5，4℃磁力搅拌12h以上，8000rpm，离心15min，上清液即为粗提物。
将得到的粗品用pH值5.5，0.02M醋酸缓冲液溶解至终浓度为1mg/mL，取样品1.0mL上样，进行阳离子交换层析(采用阳离子树脂填料SP Sepharose Fast Flow 25mL)，待样品全部进入柱中后，接入平衡缓冲液进行洗脱，同时开始收集流出液。调整洗脱流速约为1.0mL/min，每3min收集一管，洗脱过程中同时检测蛋白质浓度即紫外吸收值A280。待杂蛋白峰洗脱结束后，以0.5M NaCl的pH值5.5，0.02M醋酸缓冲液洗脱目的蛋白。检测洗脱液的紫外吸收值，得到如图1洗脱曲线，洗脱出的第一个峰(即34-38管)经检测有较好的抑菌活性，收集活性峰透析24h后冻干为细菌素纯品。
实施实例4
屎肠球菌所产细菌素的应用特性
细菌素对热的稳定性：将细菌素在60-100℃下分别水浴中处理15min和30min，121℃处理15min，所得结果如图2所示，细菌素在60-90℃下分别处理15min和30min，其残留效价经统计分析没有显著性差异(p＞0.05)；当处理温度达到100℃时，细菌素可保持约50％的活性；在121℃，15min处理后，其活性明显下降，但仍可以保持部分活性。试验结果表明，该细菌素具有很好的热稳定性，在巴氏杀菌(65-80℃15min)的条件下基本不会失活，因此具有很好的应用前景。
细菌素对蛋白酶的敏感性：细菌素对蛋白酶的敏感性试验结果如下表8所示，此粪肠球菌细菌素可以被胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶完全失活，胃蛋白酶部分失活、溶菌酶不能使细菌素失活。说明该细菌素是一种蛋白类物质，且由于可被蛋白酶降解而不会在体内残留，因此具有较高的安全性。
表8  细菌素对蛋白酶的敏感性

注：+表示有抑菌活性；-表示没有抑菌活性。
细菌素对表面活性剂的稳定性：对在饲料生产加工过程中，常会用到一些乳化剂如，吐温20、司本80等，因此有必要研究它们对细菌素活性的影响。结果(见表9)表明，四种表面活性剂对细菌素的活性影响较小，而SDS使得细菌素的活性有增强，有可能是细菌素这种聚合体在SDS的作用下其空间结构发生变化，更容易与敏感细胞接触，导致其杀菌能力增强。
表9  细菌素对表面活性剂的稳定性

注：+表示有抑菌活性；-表示没有抑菌活性。
细菌素的抑菌谱：屎肠球菌LPL420P06菌株所产细菌素的抑菌谱测定结果见表10：
表10  菌株LPL420P06所产细菌素的抑菌谱

抑菌谱的研究结果表明，该细菌素抑菌谱很广，不仅对受试的猪链球菌、热杀索丝菌、李斯特氏菌、部分金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有明显的抑菌作用，同时对大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌表现出抑制作用，而且对酵母菌-白色念珠菌也显示出一定的抑制作用。该细菌素对猪链球菌的抑制效果，显示出了该细菌素具有开发新型兽药制剂的潜在应用价值。而对其他病原菌的抑制作用提升了其作为微生态制剂应用的潜力。
实施实例5
细菌素在防治猪链球菌病方面的应用
菌液的制备：无菌条件下采用加入2％的小牛血清的THB液体培养基进行增菌培养，37℃，180rpm，24h，检测细菌浓度，并稀释到所需要的浓度。
THB培养基含量(g/L)：酵母浸出物3，胰蛋白胨20，牛肉膏5，葡萄糖2，氯化钠2，碳酸钠2.5，磷酸氢二钠0.4用盐酸调pH至7.5-7.8，115℃灭菌20min，温度降至70-80℃加入2％的小牛血清。
细菌素菌素的准备：将粗提后的细菌素用10mmol/L pH值7.0的磷酸缓冲液稀释至效价为20AU/ml；用无菌生理盐水稀释细菌素纯品至效价为2560AU/mL，按0.05mL/kg的量进行肌肉注射。
实验动物：一个月健康断奶长白系仔猪，每只体重为15kg左右，实验前用拭子采集鼻腔、扁桃体样本检测链球菌为阴性，观察10d后用于试验。
动物分组与接种：20头仔猪随机分为5组，每组4头，第一组为空白组，耳静脉注射1mL生理盐水，单独饲养；第二组为感染组，取马链球菌兽疫亚种的液体培养物(1-2)×10⁸cfu/mL经耳静脉注射猪，1mL/头；第三组为易感组，将该组猪与感染组猪相邻饲养，其间只隔栅栏，用细菌素粗品进行预防消毒，间隔1d对猪进行全身喷雾消毒一次，喷雾量以达到猪体潮湿为准，每次饲喂前，将饲槽等进食用具在细菌素稀释液中浸泡1h；第四组为易感组，将该组猪与感染组猪相邻饲养，其间只隔栅栏，常规消毒；第五组为治疗组，注射马链球菌兽疫亚种同第2组，接种1d后肌肉注射细菌素纯品0.75mL，每天一次，连用一周。
动物的临床表现(连续观测20d)：第一组：未发病，无肉眼可见症状。第二组：4只实验猪12h后体温均有所升高，仔猪食量略有减少，精神不振，1d后体温升高，有2头出现后腿红肿；2d后体温明显升高，仔猪出现四肢疼痛红肿，不敢受力，呈坐立姿势；3、4d精神不佳，食欲锐减，四肢红肿，不愿站立喜卧，其中有2头出现神经症状，呼吸急促、伸腿、抽动呈划水状，另有2头猪尿道口积尿；5d后2头出现神经症状的猪死亡，7d后，其余两只猪死亡。第三组：未发病，无肉眼可见症状。第四组：在5d时，有一只猪体温有升高，在一周后恢复正常。第五组：4只实验猪12h后体温均有所升高，仔猪食量略有减少，精神不振，1d后体温升高，有2头出现后腿红肿；2d后体温明显升高，仔猪出现四肢疼痛红肿，食欲不佳，精神不振；3、4d精神不佳，体温略有下降，四肢继续红肿，呈坐立姿势。5d后2头症状有所减缓，开始少量进食。7d后，病猪体温正常，红肿略有减轻。15d后恢复正常。
从上述试验结果我们可以看出，用该细菌素对猪体及进食用具消毒能够对猪链球菌病起到较好的预防作用，该细菌素纯品肌肉注射可以有效治疗由马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病。