抗结核CTL表位肽.pdf

本发明公开了一种抗结核CTL表位肽，由九个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为：AVADHVAAV(Ala-Val-Ala-Asp-His-Val-Ala-Ala-Val。选择结核杆菌分泌蛋白CFP21作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。将本肽中的第一位、第二位氨基酸分别被Y、L替换后，即可得到表位肽类似物，所述的表位肽类似物的氨基酸序列为：YLADHVAAV。将本肽中的第一位、第二位、第九位氨基酸分别被Y、L、L替换后，即可得到表位肽类似物，所述表位肽类似物的氨基酸序列为：YLADHVA

1、  一种抗结核CTL表位肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：AVADHVAAV。

2、  根据权利要求1所述的抗结核CTL表位肽的类似物，其特征在于：所述表位肽类似物的氨基酸序列为：YLADHVAAV。

3、  根据权利要求1所述的抗结核CTL表位肽的类似物，其特征在于：所述表位肽类似物的氨基酸序列为：YLADHVAAL。

抗结核CTL表位肽
技术领域
本发明涉及结核病治疗性多肽疫苗，尤其是涉及一种利用结核杆菌自身抗原筛选出的具有治疗活性的抗结核CTL表位肽及其类似物。
背景技术
结核病治疗性多肽疫苗发展的前提基础是结核杆菌抗原的发现及其细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的鉴定。结核抗原表位的鉴定，是设计基于CTL表位的结核多肽疫苗的重要途径。CFP21为结核杆菌分泌蛋白，含217个氨基酸，其编码基因位于RD2区。已有相关文献报道，CFP21能够诱导T细胞增殖、IFN-r、IL-12的产生、细胞毒活性及强烈的体液免疫反应，且该蛋白在抵抗试验性肺结核上起到一定水平的保护作用。
由于个体内仅存在少数几个型别的MHC-I类分子，而每个MHC-I类分子可与一系列同种类的抗原肽结合进而形成多种多样的MHC-肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。因此，筛选以高或中等亲和力与MHC-I类分子有效结合的表位肽，是诱导特异性细胞免疫应答的一个重要环节。另外，在细胞外游离肽浓度近乎为零的环境中，MHC-I类分子还必须使相应的抗原肽在细胞表面保留足够长的时间，要求它们要稳定性的结合，以避免因复合物存在的时间过短而导致的无效免疫监视，从而实现特异性CD8⁺T细胞对它的识别。有文献报道绝大多数CTL表位以高或中等亲和力与MHC-I类分子有效结合，稳定存在。
HLA-A2.1分子主要与九肽结合，其二位和九位为MHC主要锚着位，Jorg Ruppert在研究主要锚着位的优势氨基酸中发现：二位为L或M；九位为L、V或I，能将表位与MHC结合的能力提高10～100倍。Pasteur实验室在研究次要锚着位的优势氨基酸中表明：一位为Y，能增强表多肽与MHC分子的亲和力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与MHC分子结合能力高的CFP21来源的抗结核CTL表位肽及其类似物。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的抗结核CTL表位肽(P134)，由九个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为：AVADHVAAV(Ala-Val-Ala-Asp-His-Val-Ala-Ala-Val，即丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-组氨酸-缬氨酸-丙氨酸-丙氨酸-缬氨酸)。选择结核杆菌分泌蛋白CFP21作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
将母体肽(P134)中的第一位、第二位氨基酸分别被Y、L替换后，即可得到表位肽类似物P134-1Y2L，所述的表位肽类似物的氨基酸序列为：YLADHVAAV。
将母体肽(P134)中的第一位、第二位、第九位氨基酸分别被Y、L、L替换后，即可得到表位肽类似物P134-1Y2L9L，所述表位肽类似物的氨基酸序列为：YLADHVAAL。
本发明的优点在于利用结核杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核的治疗性活性肽，为研制基于CFP21抗原的结核疫苗提供了理论基础，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息。
附图说明
图1a是标准fmoc方法合成流程。
图1b是标准fmoc方法合成表位肽及其类似物流程。
图2是本肽(P134)的质谱分析图。
图3是本肽类似物(P134-1Y2L)的质谱分析图。
图4是本肽类似物(P134-1Y2L9L)的质谱分析图。
具体实施方式
运用Pubmed提供的结核杆菌的蛋白质组数据库，筛选结核杆菌分泌蛋白，选取免疫原性强的保护性抗原进行BLAST同源性分析，其中与人类的蛋白质同源性差异大于50％的蛋白质作为候选的抗原。最终确定结核杆菌分泌蛋白CFP21作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
本发明所述的抗结核CTL表位肽P134，其氨基酸序列为：AVADHVAAV(Ala-Val-Ala-Asp-His-Val-Ala-Ala-Val)，分子量为815.9。
将上述母体肽(P134)中的第一位、第二位氨基酸分别被Y、L替换后，即可得到表位肽类似物P134-1Y2L，其氨基酸序列为：YLADHVAAV(Tyr-Leu-Ala-Asp-His-Val-Ala-Ala-Val)，分子量为958.1。
将母体肽(P134)中的第一位、第二位、第九位氨基酸分别被Y、L、L替换后，即可得到表位肽类似物P134-1Y2L9L，其氨基酸序列为：YLADHVAAL(Tyr-Leu-Ala-Asp-His-Val-Ala-Ala-Leu)，分子量为972.1。
表位肽及其类似物采用标准Fmoc方案进行合成，经HPLC纯化后，其纯度大于90％，质谱分析并证实其分子量符合理论值，如图2、图3、图4所示。
肽/MHC结合力与稳定性分析：利用流式细胞术检测待测肽与T2A2细胞的结合力与稳定性。通过结合力实验初步筛选出中等结合力的表位肽P134，表位肽的第一位、二位氨基酸分别被Y、L替换、第一位、二位、九位氨基酸分别被Y、L、L替换后得到表位肽类似物P134-1Y2L、P134-1Y2L9。进一步在体外验证，实验结果提示：改造后的多肽都增强了与MHC分子的结合亲和力，且稳定性均较母体肽(P134)高。经候选肽134、134-1Y2L、134-1Y2L9L处理后，细胞平均荧光强度出现升高，与HLA-A*0201具有较高的结合力；候选肽与HLA-A*0201结合的稳定性分析结果显示，在Brefeldin A处理后，在4h时肽134-1Y2L、134-1Y2L9L与HLA复合物分别仍然保持了80％、79％。候选肽与HLA-A*0201结合活性见下表。
候选肽与HLA-A*0201结合力及稳定性试验结果

FI^a＝(表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度，如果FI＞1.5：候选肽与HLA-A*0201/03具有强结合力；1.5＞FI＞1.0：中等结合力；FI＜0.5：弱结合力(阴性结果)；^bDC₅₀即为丢失50％的MHC/肽复合物所需的时间。
本发明抗结核CTL表位肽P134的合成方法为：
I.第一个C-氨基酸与Wang树脂的缩合
取Wang树脂(0.2-0.5g)置于多肽合成仪中，将Fmoc-氨基酸(2.5eq)、HOBt(2.5eq)和DIC(2.5eq)溶于少量DMF中，加入到合成仪中，缓慢搅拌10min后，加入DMAP(0.1eq)，缓慢搅拌反应2-4h。反应完成后，按下面表1的9步进行洗涤，抽干后真空干燥过夜，取出肽树脂，按称重法或紫外测取代值。称重法按如下公式进行取代值(Loading)的计算：
Loading＝1000(W2-W1)/[(MWa-MWb)*W1]
W2：Fmoc-氨基酸树脂的重量
W1：树脂的重量
MWa：Fmoc-氨基酸分子量
MWb：H20分子量(18)
紫外取代值按下面公式计算：
Fmoc-AA的取代值(mmol/g)＝(样品吸收值-参照池吸收值)/(1.65×树脂毫克数)
表1洗涤步骤

II.肽链的延长
第一个氨基酸与Wang树脂缩合之后，如果测定的取代值足够大，对利用20％乙酸酐/吡啶溶液(v/v)对树脂进行封头1h，并按照表1所述的方法进行洗涤。接下来，在合成仪中加入20％哌啶/DMF溶液(v/v)反应30min，进行脱保护，脱保护之后仍按照上述方法进行洗涤，洗涤完毕之后，利用Kaiser检测法检测脱保护反应是否完全。如果是阳性结果继续向下做，否则，重复脱保护步骤，至到结果是强阳性。脱保护之后，加入下一个氨基酸和缩合剂HOBT、DIC反应2h左右，洗涤，在此利用Kaiser[1]检测法检测，如果结果显阴性表明缩合完全，否则，重复缩合至到结果显强阴性。按照上面的方法缩合下一个氨基酸，至到所有的氨基酸都缩合完全(步骤见表2)。
表2肽链延长试验步骤

注：Kaiser检验法，所需试剂：①5％茚三酮的乙醇溶液(w/v)，②KCN的吡啶溶液(2mL 0.001M KCN溶于98mL吡啶)，③80％苯酚的乙醇溶液(w/v)。脱保护或缩合反应完成后，取一些树脂颗粒于小试管中，分别加试剂①2滴、②4滴、③2滴，混合后加热至100℃4-6min，如果树脂变为蓝色或红色，证明脱保护反应完全或缩合反应不完全；如果树脂颜色没有变化，证明脱保护反应不完全或缩合反应完全，依据不同情况进行后续处理。
III.合成后处理
在所有的氨基酸都缩合完全之后(完成上面步骤之后)，进一步利用二氯甲烷洗涤三次，再利用甲醇洗涤，使树脂收缩，树脂放置至少4h或干燥过夜。转移合成仪到通风橱中，加入新配置的切割试剂(TFA∶水∶苯酚∶苯甲硫醚∶1，2-乙二硫醇＝82.5∶5∶5∶5∶2.5)，连续搅拌反应2h。所有多肽产品都从树脂上切割下之后，收集滤液于预冷乙醚中，利用TFA试剂洗涤两次，也收集到乙醚中，-4℃冰箱过夜。
如果在冰乙醚中有沉淀生成，可以利用慢速滤纸进行过滤或离心收集多肽粗产品，其中，至少要用冰乙醚洗涤三次，彻底除去切割试剂和清除剂，使乙醚充分挥发干净，得到多肽粗产品，称重并计算产率。
如果在冷乙醚中没有沉淀生成，可以采用下面的方法处理以除去副产物：
(1)利用旋转蒸发仪蒸干多肽-TFA混合物；
(2)利用1-5mL 10-30％的乙酸溶液溶解蒸干的产品；
(3)把上一步得到的溶液转移到分液漏斗中，并加入2倍体积的氯仿；
(4)充分混匀溶液，然后静置使溶液分层；
(5)除去有机层(底层)，其中包含有侧链保护基和不易挥发的副产物；
(6)重复萃取两次；
(7)多肽的冻干。
IV.反相-高效液相色谱分析纯化多肽
i.洗脱剂配置
流动相A配制：取三氟乙酸1mL，溶于1000mL去离子三蒸水中。流动相B配制：取0.85ml TFA加入1000mL乙腈中。配制注意事项：(1)使用去离子化并经过超滤处理的水；(2)在洁净的玻璃器皿中制备流动相；(3)使用序列测定级TFA；(4)用0.45μm滤膜过滤缓冲液；(5)用超声波进行缓冲液的脱气；(6)每周制备新的水性缓冲液。
ii.梯度洗脱分离多肽
(1)开机预热30min；
(2)平衡层析柱5min；
(3)在未上样、室温检测波长228nm、流速5mL/min的条件下，缓冲液梯度由0％B到100％B线性洗脱30min；
(4)在运行结果显示稳定的基线时，将冷冻干燥产物应用A液配制成1mg/mL溶液上样；
(5)洗脱方式：反相C18柱，检测波长228nm，上样量1000μl(2000μg)，流速5mL/min；洗脱梯度0-5min：10％B液；5-40min：10-50％B液；40-45min：50％-10％B液；45-50min：10％B液；
(6)每min收集1mL洗脱液，冷冻干燥后备用，收集产物按照时间编号。
iii.质谱分析
采用激光解析质谱鉴定多肽，质谱仪为美国HEWLETT PACKARD的62025型LD-TOF System数据分析软件为G2025A Software A.02.01检测合成多肽的分子量。