水葫芦生防真菌凤眼莲链格孢.pdf

一种水葫芦生防真菌——凤眼莲链格孢(Alternaria crassipes)，从自然环境中分离获得，该菌在紫外光照射下易于产孢，菌落生长最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)，最适温度25～30℃，最适pH7.0～10；病菌侵染致病的最适条件是接种后暗光保湿24h和侵染期间保持28～30℃。其菌体制剂和毒素液对恶性杂草水葫芦具有很强的致病杀草作用，经发酵菌体或毒素仿生合成技术可生产环保型真菌除草剂，具有潜在的商业开发应用价值。用真菌培养液经乙酸乙酯萃取、减压蒸发得到致病粗毒素。该菌菌体悬浮液及其毒素液对水稻等20种重要作物都没有不良影响。

1、  一种水葫芦生防真菌——凤眼莲链格孢(Alternaria crassipes)，其特征在于：菌株为AFT001，该菌株的保藏号为CGMCC NO.2569。

水葫芦生防真菌——凤眼莲链格孢
技术领域
本发明涉及杂草的生物控制及微生物领域，特别是涉及一种水葫芦生防真菌——凤眼莲链格孢(Alternaria crassipes)。
背景技术
水葫芦(Eichhornia crassipes)，又名水浮莲，原产于南美，是世界十大害草之一，也是侵入我国的最重要有害物种之一，已在我国17个省、市、自治区泛滥成灾，其危害最严重为浙江、福建、广东、云南和台湾五省，主要是引起江河湖泽水库等水域的污染和阻塞，阻碍水路交通运输和干扰水电站的正常运行，每年造成巨大的经济损失。
目前，国内外对水葫芦主要采用人工打捞控制和化学除草剂防除，虽有一定成效，但两种措施的防除效果都非常有限，打捞仅能清除水葫芦植株，留在水体中的种子仍能萌发并很快形成新的杂草株群；而使用化学除草剂杀死杂草后，植株残体可使水体有机化而造成环境污染，化学制剂本身也存在着药物残留和非靶标生物安全等环境污染问题。因此，近年来人们开展了对杂草的生物控制的探索，20世纪60年代，在研究利用水葫芦象甲等草食性昆虫的同时，不少国家对水葫芦病原菌也作了大量的调查研究工作，并且已经取得一定的进展：全世界已经报道了60多种侵染水葫芦的病原真菌，在南非等国家已经筛选到的诺曼尼尾孢(Cercospora rodmanii)和水葫芦链格孢(Alternaria eichhorniae)对水葫芦具有较强的抑制作用，其中诺曼尼尾孢防除水葫芦的技术已获国际专利保护，但是这种病原菌对杂草的控制效果及应用范围都相当有限，还未见其在其他国家或地区被应用的报道。
我国也曾有人对水葫芦病害及病原真菌进行调查和研究，发现的水葫芦致病真菌主要有细极链格孢(Alternaria tenuissima)、尖孢尾孢(Cladosporium oxysporum)、阿氏拟盘多毛孢(Pestalotiopsis adusta)、水葫芦单孢(Monosporium eichhorniae)和瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)等，但这些真菌对水葫芦的致病作用都非常有限，没有实际应用价值，迄今也还没有关于这些病菌的进一步研究和应用的详细报道。
因此，寻求对水葫芦有强致病性和生防控制作用的病原微生物，由此进一步研制无残留、不污染环境的生物除草剂，将不仅具有重要的商业开发应用价值，而且能安全有效地控制水葫芦的危害，以避免由此造成的巨大经济损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种对水葫芦有很强致病作用和控制效果的杀草真菌——凤眼莲链格孢菌株。根据形态学特征将其定为一个链格孢新种，通过试验测定确定了它生长产孢和侵染致病的最适条件，研究发现其通过产生毒素使杂草植株发病死亡的致病机理，分析了病菌及其毒素的寄主专化性。
本发明目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的凤眼莲链格孢杀草菌株通过以下步骤分离纯化而来：
在重庆地区不同季节多次采集水葫芦自然发病植株，采用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，经室内组织培养和纯化得到不同类型的真菌，用柯赫氏证病方法确定其中的致病菌，最后经过致病性试验比较筛选获得对水葫芦有很强致病作用的杀草病原真菌(AFT001菌株)。
本发明的凤眼莲链格孢菌株已于2008年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，邮编：100101)，保藏号：CGMCC NO.2569。
以下是凤眼莲链格孢的详细描述
凤眼莲链格孢杀草菌株的形态特征与分类鉴定：在PSA培养基上菌落生长速度很快，在25℃下全光照与全黑暗培养5d菌落直径均可达到约70mm。菌丝部分埋生，部分表生，气生菌丝绒毛状，菌落初为青绿色后渐变为黑灰色，背面黑绿色。分生孢子链生，一般7～12个孢子，倒棒状，卵形，倒梨形或近椭圆形，淡褐色至中度褐色，孢身24.7(12.5～37.5)×10.1(7.5～12.5)μm，具短喙或无喙，0～30×2.5-4μm。成熟孢子表面具小疣突，具1～3个横隔，0～4个纵隔，除顶端次生产孢外，常见于侧面的任何部位产生短梗。分生孢子梗直立，直或略弯，分隔，不分枝或分枝，极淡的褐色至淡褐色，随着产孢作合轴式(sympodial)延伸，高倍镜下可见表面生细疣突，23.5～70.5×3.5～5μm。根据这些特征，参考有关真菌及链格孢属鉴定的文献资料(如：张天宇，2003中国真菌志——链格孢属，科学出版社；http://www.doctorfungus.org/)鉴定，该菌为链格孢属中细极链格孢组(Alternaia tenuissimagroup)的一新个成员(member)，将其命名为凤眼莲链格孢，拉丁学名为Alternaria crassipes。这是真菌分类学上的一个新种，其依据主要有：1)查阅现有镰刀菌属的相关分类文献和其他参考资料，这种链格孢的形态特征与其他种类有明显差异；这一点经国际链格孢属真菌分类权威专家、山东农业大学的张天宇教授验证；2)在水葫芦植物上迄今已经记载的病原链格孢菌有2种，即交链孢(Alternaria alternata)水葫芦链格孢(Alternaria eichhornia)，它们的分生孢子等结构的形态与该种链格孢区别很大，而且交链孢为一种弱寄生菌，其导致的病害症状非常轻微，水葫芦链格孢主要引起一种“黑斑病”，症状与本链格孢引起的“叶斑病”有根本性差别(Charudattan R，2001.Biological control of water hyacinth by using pathogens，ACIAR Proceedings 102，21-28；Shabana，YM et al，Biological control of water hyacinth by mycoherbicidein Egypt.ACIAR Proceedings 102，53-56)。
凤眼莲链格孢的最佳培养和侵染条件：该致病真菌在正常光照和黑暗条件下不容易产孢，而在紫外光照射下产孢较快；菌落生长最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)，最适温度25-30℃，最适酸碱度为pH7.0～10；病菌侵染致病的最佳条件是接种后保湿和暗光24小时，并在整个侵染期保持温度28～30℃。
凤眼莲链格孢的致病性和专化性：凤眼莲链格孢对水葫芦有良好的致病和生长抑制作用，主要侵染植株叶片，接种后7天即可发病，病叶率达100％，初期叶片上出现大小不等的圆形至不规则病斑，以后扩展至叶柄，病斑正反两面着生灰褐色霉层，导致大面积叶片甚至整个植株枯死。在适宜条件下用高浓度菌丝片段和分生孢子悬浮液接种试验结果表明，该真菌对水稻、小麦、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在内的6科16种水、旱作物都不致病，也不影响它们的种子萌发和植株生长，这说明凤眼莲链格孢是水葫芦的专性致病菌，若用于研制水葫芦除草剂，可以保证生境中其它植物的安全。
凤眼莲链格孢粗毒素：用真菌的培养液，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸馏得到致病毒素。用该毒素的水液分别浸渍水葫芦叶片和植株根系后24小时内即表现毒性症状，72小时内叶片黄化、植株萎蔫(但不退绿)。用此粗毒素溶液处理前述20种植物的种子和植株后未观察到毒性症状，说明这种毒素也是高度专化的。
附图说明
图1为凤眼莲链格孢的形态特征图：
1为PSA平板上的菌落初期，2为PSA平板上的菌落后期，3为分生孢子链，4为分生孢子，5为分生孢子类型图，6为分生孢子梗
图2为凤眼莲链格孢及其毒素对水葫芦的致病作用图：
7为用菌体处理第15天的水葫芦植株，8为用菌体处理第15天的水葫芦叶片，9、10为用毒素处理第3天的叶片和对照，11、12为用毒素处理第3天的植株和对照。
本发明的优点是：从自然环境中分离获得的凤眼莲链格孢(Alternaria crassipes)，是首次发现并鉴定的一个真菌新种，其菌丝片断和分生孢子接种体对世界十大恶性杂草水葫芦(Eichhornia crassipes)具有很强的致病控制作用，它分泌的毒素对这种杂草也具有很强的毒性致死功效。病菌的菌剂和毒素对重要作物及环境中其它植株都没有不良影响，表现出高度的专化杀草活性，可通过发酵菌体或仿生合成技术生产无残留的环保型真菌性除草剂，具有潜在的商业开发和应用价值，特别是在水葫芦的生物防治实践中具有重要的开发应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述
实施例1：
病原菌的分离纯化与筛选
(1)真菌分离培养用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，其配方是去皮的新鲜马铃薯200g，蔗糖和琼脂各20g，加自来水至1000ml。先加水将马铃薯煮烂，双层纱布过滤后加入蔗糖和琼脂，补充适量的水至1000ml，充分搅和均匀后装入三角瓶中，放入消毒器中灭菌后放置。使用前加热熔融，倒入灭菌培养皿或试管中制成平板或斜面培养基，供真菌分离培养或菌种保存用。
(2)分离培养和纯化：从自然条件下采集具有典型病害症状的水葫芦植株样品，漂洗干净后剪取叶片病斑与健康部分交界的组织小块儿(2mm)，放入5％次氯酸钠溶液中表面消毒以后用灭菌水漂洗3次，置于PSA平板中，在25℃温箱中培养并每天观察，待不同菌落长出后适时分别割取菌丝先端，转移到新的PSA平板上继续培养成纯的菌落，再转移到PSA试管斜面培养基上，并编号标明菌株，保存备用。
(3)确定病原菌：根据柯赫氏证病律步骤确定病原菌。用病叶组织分离纯化后获得各种真菌给健康水葫芦植株叶片涂抹或针刺点滴接种，保证避光保湿24小时，在28℃下生长，观察发病情况。引起接种叶片发病、表现相同症状的真菌即可确定为病原菌。
(4)强致病菌筛选：将上述试验确定所有病原菌相同的方法(涂抹雾或针刺点滴)给水葫芦植株接种，并在相同适宜条件下培养观察接种植株上病害的严重程度，比较筛选出引起水葫芦发病严重的菌株，由此筛选获得了凤眼莲链格孢。
实施例2：
病原菌的培养和接种条件试验
(2)温度试验：在培养5d的PDA平板上用打孔器取直径为0.5cm的AFT001菌株的菌丝块，接种于PDA培养基上，分别设5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40±0.5℃8个温度处理，每个处理重复3次。置于8个预先设定好所需温度的光照培养箱中培养，并用垂直十字法逐日测量菌落大小，每24h测量1次，连续测量5次，记录数据。PDA培养基的酸碱度约为pH7.0。由此确定链格孢菌的最适生长温度。
(2)酸碱度实验：实验采用PDA培养基，共设置11个酸碱度处理。分别用1.0mol/L的NaOH和HCl溶液将培养基的pH值分别调节到4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0(用电子pH计测定)，每个处理重复5次；病菌接种和生长测量方法同上，接菌处理后置于25℃下培养，每24h测量一次菌落直径，连续测量6次。由此确定链格孢生长的最佳pH值。
(3)培养基种类的筛选：实验共比较了8种培养基对AFT001菌落生长的影响，分别为WA、CAA、PSA、PDA、水葫芦叶片煎汁培养基(WLA)、燕麦片培养基(OSA)、WLA+PDA和WLA+PSA。病菌接种和生长测量方法同前述实例。各种培养基的酸碱度约为pH7.0，培养温度为25℃。由此确定病菌培养的最佳培养基。
(4)光照对产孢量的影响试验：将长势良好的AFT001菌株接种于PCA(马铃薯20g，胡萝卜20g，琼脂20g)培养基上，在近紫外灯(NUV)、日光灯(DL)和黑暗条件下培养20d，每个处理重复3次。收集孢子计数，方法如下：在培养基上加入1ml的无菌水，用盖玻片轻刮培养基表面。然后将孢子悬液用100目的网筛过滤，取滤得的孢子液镜检，用血球计数板计数。比较不同光照培养条件对产孢的影响，确定有利于病菌产孢的光源。
(5)病菌接种条件优化：一般影响植物病原真菌侵染的影子主要有温度、保湿时间和光照。本发明中根据前述凤眼莲链格孢的最佳生长条件设置了位于20～30℃间的5个温度，保湿(％)时间0、12、24、32和48h，光照设置为1200Lux，3000Lux下照射0、6、12、18和24h。每个温度处理3株水葫芦，每株5-6个叶片。由此分析确定病菌的适宜接种发病条件(温度、保湿时间和光照)。
实施例3：
病原菌粗毒素分离
(1)病菌培养滤液的准备：在500ml三角瓶中分别倒入250ml马铃薯蔗糖(PS)培养液，灭菌后待用。选取培养6～7d长势良好的菌落，用打孔器取Φ6mm大小的菌饼，接种到装有250ml PS培养液的三角瓶中，每瓶接种8片，在25℃培养箱中12h光照/天条件下静止培养20天。在超净工作台上，用定性滤纸(中速)过滤，即可得到培养滤液。由此准备足够的病菌培养滤液供毒素分离提取之用。
(2)毒素的萃取及活性试验：选择极性不同的有机溶剂石油醚、氯仿、苯酚和乙酸乙酯等分别对培养滤液进行萃取，方法是：将一定体积的培养滤液用等体积的有机溶剂萃取3次，然后合并有机相，用旋转蒸发仪蒸发浓缩，回收有机溶剂。将每种有机溶剂萃取的浓缩物用水溶解后用作对水葫芦叶片浸渍处理，测定其活性。结果用乙酸乙酯萃取后的浓缩产物溶液对水葫芦表现出很强的毒性。
实施例4：
病原菌及其毒素的安全(专化)性测定
(1)供测试的作物：选择了6个科的20种重要水旱作物，包括禾本科的水稻、小麦、玉米，茄科的番茄、辣椒和烟草，葫芦科的黄瓜和西瓜，十字花科的萝卜、甘蓝、油菜和白菜，豆科的花生、豌豆、蚕豆、大豆和绿豆，以及锦葵科的棉花。
(2)种子萌发试验：选择前述20种作物的健康种子，分别用菌丝和孢子悬浮液、病菌粗毒素溶液和清水(对照)浸泡12～36小时(小粒种子处理时间短，大粒种子处理时间长)，放置在湿滤纸上，在25℃生长箱中萌发后记载种子萌发率。结果表明所测试的作物种子萌发率与对照都没有显著差异。
(3)作物植株生长试验：用温水浸泡12～36h(根据种子大小而定)，放置在湿滤纸上，在25℃生长箱中催芽。待胚芽露出后播种到盆栽钵中。钵内加入经过水洗和高温烘干的沙土，然后加入一定量营养液(水中加入适量的尿素、硫酸铵和磷酸钾)。播种后在温室条件下生长，待植株长到适当大小时分别用菌丝和孢子悬浮液、病菌粗毒素溶液和清水(对照)喷雾处理，同时以处理水葫芦植株为发病对照。处理后每天观察记录各种植物的病变情况，到第20天时收获植株，测定不同处理的生长量。结果表明，用链格孢菌液和毒素液处理后水葫芦植株分别在处理后第7天和第2天即表现出明显的病害和毒素症状，而所有20种作物植株在处理20天后也没有任何病变，用菌液和毒素液处理后的植株生长量与清水对照植株的生长量之间没有显著差异。这说明病菌及其毒素对供试作物没有任何不良影响。