一种棉毛鹿茸草的离体培养法.pdf

本发明公开了一种棉毛鹿茸草的离体培养法，依次包括以下步骤：1)绵毛鹿茸草嫩芽进行冲洗；2)经常规消毒后，切成小段嫩芽I接种到诱导不定芽培养基上进行培养；3)切取小段嫩芽I上长出的不定芽，将所得的小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；4)切取小段嫩芽II上长出的不定芽，将所得的小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养；5)切取小段嫩芽III上长出的不定芽，将所得的小苗III接种到生根培养基中；6)待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。采用本发明的方法能获得大量的绵毛鹿茸草的种苗。

1、  一种棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是依次包括以下步骤：
1)、取无病斑、生长健壮的绵毛鹿茸草嫩芽进行流水冲洗；
2)、将上述流水冲洗后的嫩芽经常规消毒，然后切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽I，将上述小段嫩芽I接种到诱导不定芽培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
3)、待小段嫩芽I上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗I时，割取小苗I；将此小苗I切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽II，将上述小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
4)、待小段嫩芽II上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗时II，割取小苗II；将此小苗II切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽III，将上述小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
5)、待小段嫩芽III上长出的不定芽长至3.0～5.0cm高的小苗III时，割取小苗III；将此小苗III接种到生根培养基中；
6)、待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。

2、  根据权利要求1所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是：步骤2)中的诱导不定芽培养基为：MS基本培养基+BA0.5～1.0mg/l+糖20～30g/l+琼脂5～9g/l，pH为5.5～6.0。

3、  根据权利要求2所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是：步骤3)和步骤4)中的增殖培养基均为：MS基本培养基+BA 0.3～0.5mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+糖20～30g/l+琼脂5～9g/l，pH为5.5～6.0。

4、  根据权利要求3所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是：步骤5)中的生根培养基为：1/2MS基本培养基+NAA 0.2～0.5mg/l+糖30g/l+琼脂5～9g/l+活性炭2g/l，pH为5.5～6.0。

5、  根据权利要求4所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是：所述步骤1)为：将绵毛鹿茸草嫩芽放入烧杯中，自来水冲洗1～2小时。

一种棉毛鹿茸草的离体培养法
技术领域
本发明涉及一种绵毛鹿茸草的离体培养方法。
背景技术
绵毛鹿茸草属玄参科鹿茸草属，具有清热解毒、祛风行气、凉血止血、祛痰等功效，用于治疗感冒、慢性气管炎、肺炎等，药用价值很高；其分布于江苏、浙江一带，目前国内还没有实现人工栽培，因此野生的绵毛鹿茸草的数量越来越少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种棉毛鹿茸草的离体培养方法，采用该方法能获得大量的绵毛鹿茸草的种苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种棉毛鹿茸草的离体培养法，依次包括以下步骤：
1)、取无病斑、生长健壮的绵毛鹿茸草嫩芽进行流水冲洗；
2)、将上述流水冲洗后的嫩芽经常规消毒，然后切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽I，将上述小段嫩芽I接种到诱导不定芽培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
3)、待小段嫩芽I上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗I时，割取小苗I；将此小苗I切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽II，将上述小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
4)、待小段嫩芽II上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗时II，割取小苗II；将此小苗II切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽III，将上述小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
5)、待小段嫩芽III上长出的不定芽长至3.0～5.0cm高的小苗III时，割取小苗III；将此小苗III接种到生根培养基中；
6)、待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的改进：步骤2)中的诱导不定芽培养基为：MS基本培养基+BA0.5～1.0mg/l+糖20～30g/l+琼脂5～9g/l，pH为5.5～6.0。
诱导不定芽培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基作为基础，分别加入6-苄基腺嘌呤(BA)、糖和琼脂，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基中加0.5～1.0mg BA、20～30g糖和5～9g琼脂。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的进一步改进：步骤3)和步骤4)中的增殖培养基均为：MS基本培养基+BA 0.3～0.5mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+糖20～30g/l+琼脂5～9g/l，pH为5.5～6.0。
增殖培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基作为基础，分别加入6-苄基腺嘌呤(BA)和萘乙酸(NAA)、糖和琼脂，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基加0.3～0.5mg BA、0.2～0.5mg NAA、20～30g糖和5～9g琼脂。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的进一步改进：步骤5)中的生根培养基为：1/2MS基本培养基+NAA0.2～0.5mg/l+糖30g/l+琼脂5～9g/l+活性炭2g/l，pH为5.5～6.0。
生根培养基的制作方法具体如下：以1/2MS基本培养基(即溶液中所有物质的含量为MS基本培养基的一半)作为基础，分别加入萘乙酸(NAA)、糖、琼脂和活性炭，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的1/2MS基本培养基加入0.2～0.5mg NAA、30g糖、5～9g琼脂和2g活性炭。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的进一步改进：步骤1)为：将绵毛鹿茸草嫩芽放入烧杯中，自来水冲洗1～2小时。
本发明的绵毛鹿茸草的离体培养法，属于一种诱导绵毛鹿茸草快速繁殖的组织培养方法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将健壮的绵毛鹿茸草嫩芽先进行消毒，再通过合适的诱导培养基诱导获得一定量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需60～80天即可得到可出瓶种植的种苗；因此绵毛鹿茸草试管苗一周年内的繁殖系数理论上为3¹⁰倍以上。本发明的绵毛鹿茸草离体培养法，是一种不受季节等因素影响，能高效、快速提供优质绵毛鹿茸草苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量。
本发明所得的种苗可采用以下方法进行种植：把具有至少3条长于2cm根的种苗移出培养瓶，洗净其根部培养基，移栽到基质(由体积比为3：1：1的泥炭、珍珠岩和蛭石组成)中，于人工气候箱室内培养，培养条件：12小时光照，光照强度15～25μmol m^-2.s^-1，温度为23～25℃；12小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；湿度85％～90％。3～5周后，改成：光照强度为30～40μmol m^-2.s^-1，其余条件同上。2个月后，存活率达到60％以上。
而自然所得的相同根数和根长的野生苗在上述相同的环境下培养，2个月后存活率仅为10％左右。
具体实施方式
实施例1、一种绵毛鹿茸草离体培养的方法，依次进行以下步骤：
1)、取无病斑、生长健壮的绵毛鹿茸草嫩芽放入烧杯中，自来水冲洗1～2小时；
2)、将上述嫩芽经常规消毒(即0.1％w/v HgCl₂处理6～10分钟后，无菌水冲洗5～8遍，然后用无菌滤纸吸干)后，切成1cm左右的小段嫩芽I，接种到诱导不定芽培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
诱导不定芽培养基为：MS基本培养基+BA0.5～1.0mg/l+糖20～30g/l+琼脂5～9g/l，pH为5.5～6.0。
3)、待小段嫩芽I上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗I时，割取小苗I；将此小苗I切成1cm左右的小段嫩芽II，将上述小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
增殖培养基为：MS基本培养基+BA 0.3～0.5mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+糖20～30g/l+琼脂5～9g/l，pH为5.5～6.0。
4)、待小段嫩芽II上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗时II，割取小苗II；将此小苗II切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽III，将上述小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
增殖培养基同步骤3)的增殖培养基。
5)、待小段嫩芽III上长出的不定芽长至3.0～5.0cm高的小苗III时，割取小苗III；将此小苗III接种到生根培养基中；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
生根培养基为：1/2MS基本培养基+NAA 0.2～0.5mg/l+糖30g/l+琼脂5～9g/l+活性炭2g/l，pH为5.5～6.0。
6)、待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。
依照上述方法，只需60～80天即可获得可出瓶种植的种苗(试管苗)；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。