鹅细小病毒VP1与VP3基因非重叠序列 原核表达蛋白及其制备方法 (一)技术领域
本发明涉及的是一种基因工程制品的制作方法，具体地说是一种鉴别鹅细小病毒抗体及鹅细小病毒VP3基因亚单位抗体的VP1与VP3基因非重叠序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。
(二)背景技术
鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)是鹅细小病毒感染(俗称小鹅瘟或Derzsy’s病)的病原。该病是养鹅业危害最大的传染病之一，感染鹅的死亡率在90-100％。自1956年发现本病以来，在全世界各养鹅国家和地区均有发生，造成巨大的经济损失。对于该病的防制，目前主要应用GPV全病毒疫苗进行预防，全病毒灭活苗及弱毒苗有较高的保护率，但是应用全毒疫苗后的确存在散毒、潜伏感染，尤其对自然感染抗体及全毒疫苗免疫抗体无法进行鉴别，导致小鹅瘟免疫的地区在发生疫情时无法进行有效的监测，无法采取有效的防制措施。而解决这一难题的唯一途径就是研究和开发VP3基因工程疫苗，而VP1-VP3抗原为基础的鉴别方法的建立是VP3基因工程疫苗能够实际应用的先决条件。因此研究和应用鹅细小病毒VP1-VP3基因片段原核表达产物具有重要地应用价值。
(三)发明内容
本发明提供一种鹅细小病毒VP1与VP3基因非重叠序列原核表达蛋白及其制备方法。其目的在于提供一种鉴别鹅细小病毒抗体与鹅细小病毒VP3基因亚单位抗体的无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的原核表达检测抗原及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
鹅细小病毒VP1与VP3基因非重叠序列原核表达蛋白它是一种鹅细小病毒衣壳蛋白核苷酸VP1与VP3基因非重叠序列原核表达产物，VP1-VP3基因片段含有594个碱基，编码198个氨基酸残基，在用原核表达载体pGEX-6p-1进行表达时，VP1-VP3基因片段与融合表达载体上的谷胱苷肽前导肽得到融合表达，融合蛋白的分子量大小约为47KU。
其非重叠序列的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列为：
ATGCGGAATCTGAAAGCTGGAGCCCCTCAGCCAAAACCAAACCAGCAGTCTCAGTCTGTG
1 M R N L K A G A P Q P K P N Q Q S Q S V
61 TCTCCAGACAGAGAACCCGAACGAAGAGATAATAATCGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTAT
21 S P D R E P E R R D N N R G F V L P G Y
121 AAGTATCTTGGGCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGCCCACCTGTCAATAACGCGGACACC
41 K Y L G P G N G L D K G P P V N N A D T
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61 V A L E H D K A Y D Q Q L K A G D N P Y
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161 S A V E D G G A T A E G T E P V R P
本发明的产品是这样制备的：
(1)、设计扩增GPV PV1-VP3基因的特异性引物；
(2)、通过PCR扩增获得VP1-VP3基因片段；
(3)、对VP1-VP3基因进行克隆、测序鉴定；
(4)、将VP1-VP3基因定向亚克隆至pGEX-6p-1原核表达载体；
(5)、VP1-VP3基因在大肠杆菌的诱导表达；
将重组表达质粒pGEX-6p-(VP1-VP3)转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，进行表达；
(6)、VP1-VP3基因表达蛋白的亲合层析纯化，主要包括：
①待纯化样的制备
离心收集表达细菌：离心取沉淀，用1mol/L、pH7.4的PBS洗涤3次，将沉淀用PBS溶液重悬起；
裂解菌体获取上清可溶性蛋白与包涵体沉淀：加入溶菌酶至重量体积比终浓度为1％，冰浴30min，然后进行超声处理，离心取上清并加入1％的TritionX-100及DTT至终浓度为1mmol/L后于-20℃保存，以备纯化，沉淀即为包涵体；
包涵体的裂解及可溶性蛋白的回收：包涵体用30％蔗糖、100mol/LNaCl、50mmol/L Tris、1％TritionX-100组成的pH8.0的包涵体洗涤液洗涤2次，加入由1.5％N-十二烷基肌氨酸钠、25mmol/L三乙醇胺、1mmol/LEDTA组成的pH8.0的包涵体裂解液重悬，4℃处理2h，再超声处理，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，可溶性上清按上述方法处理；
②表达蛋白的纯化前复性
上清中加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的由0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽GSSH、2mmol/L还原型谷胱苷肽GSH、2mmol/LEDTA、20mmol/L Tris组成的pH8.5的复性缓冲液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化；
VP1-VP3基因原核表达蛋白的亲合层析纯化包括：
①用20ml PBS冲洗柱子，以洗去保存液；
②用6ml PBS+1％ Trition X-100进行平衡凝胶层；
③往柱内加样，每次加2ml样，加样后于27℃温箱中感作30min，然后才弃掉流出液，释放的速率要求1滴/30秒；
④用10ml PBS缓冲液冲洗柱子4次，以充分洗去大肠杆菌菌体杂蛋白，保证产品的纯度；
⑤用10ml洗脱液冲洗结合物，按1-2ml量于洁净Eppendorf管内收集洗脱液；
⑥纯化柱的再生与保存：用5倍于胶层体积的由3mol/L PBS+3mol/LNaCl溶液组成的高盐溶液液洗2次，用5倍于胶层体积的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
本发明提供的VP1与VP3基因非重叠序列原核表达抗原，是利用基因工程技术，对鹅细小病毒(GPV)衣壳蛋白基因VP1与VP3非重叠序列进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pGEX-6p-1(是一种带有GST前导肽的融合表达载体)连接，转化大肠杆菌BL21表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是VP3/GST融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量为47KU，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。该基因编码蛋白是非糖基化蛋白，因此，经原核表达系统表达后的产品经Western blot、Dot-ELISA进行鉴定后均表明具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。
融合表达的优点一是便于亲合层析纯化，二是增加蛋白分子量后免疫原性得到提高。该融合蛋白在表达时，大部分以非可溶性的包涵体形式表达，在纯化之前对于包涵体我们采用了较为温和的包涵体裂解方式，因此包涵体蛋白裂解后又经复性处理后，根据Dot-ELISA及Western blot鉴定结果认为有一部分蛋白基本保持了天然蛋白的特性，其线性抗原及空间依赖性抗原结构依然保持。经裂解的包涵体蛋白经24个月仍保持良好的均质胶体状态，无析出和沉淀现象，表明状态稳定。
应用该原核表达检测抗原鉴别鹅细小病毒抗体与鹅细小病毒VP3亚单位抗体的优点一是因为该产品是病毒亚单位基因的表达产物，并非全病毒，因此在应用该抗原进行检测过程中绝无散毒危险；二是检测反应的灵敏度高，无交叉反应现象；三是因为VP3基因是鹅细小病毒的主要保护性基因，用VP3基因研制基因工程疫苗应用后，衣壳蛋白序列中只有避开VP3基因片段的VP1与VP3基因非重叠序列才能够鉴别GPV全病毒抗体及VP3基因亚单位抗体。该鉴别方法的建立是VP3基因工程疫苗能够实际应用的先决条件。
采用本发明的方法生产的产品可用于：
鉴别鹅细小病毒抗体与鹅细小病毒VP3基因亚单位抗体的间接-ELISA及Dot-ELISA方法的检测抗原。
本发明的产品优点体现在：
①由于该检测抗原是VP1-VP3基因片段原核表达蛋白，并非全病毒，因此应用该抗原进行检测时绝无散毒危险。
②作为ELISA抗原检测鹅细小病毒抗体，其检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应。
③生产工艺先进、性能稳定，生产成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。
(四)、具体实施方案
鹅细小病毒VP1与VP3基因非重叠序列原核表达抗原的制备生产工艺过程为：
1.设计扩增GPV VP1-VP3基因的特异性引物；
2.通过PCR扩增获得VP1-VP3基因片段；
3.对VP1-VP3基因进行克隆、测序鉴定；
4.将VP1-VP3基因定向亚克隆至pGEX-6p-1原核表达载体；
5.VP1-VP3基因在大肠杆菌的诱导表达：
将重组表达质粒pGEX-6p-(VP1-VP3)转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，然后进行诱导表达。
6.VP1-VP3基因表达蛋白的亲合层析纯化
(1)待纯化样的制备
离心收集表达细菌：离心取沉淀，用PBS(1mol/L，pH7.4)洗涤3次，细菌沉淀用PBS溶液重悬起。
裂解菌体获取上清可溶性蛋白与包涵体沉淀：加入溶菌酶至终浓度为1％(1mg/ml)，冰浴30min，然后进行超声处理，以悬液趋于透明、用移液枪吸吹时无明显凝块为度。离心取上清(即为可溶性蛋白)并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L后于-20℃保存，以备纯化。沉淀即为包涵体。
包涵体的裂解及可溶性蛋白的回收：包涵体部分用包涵体洗涤液(30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH8.0，1％TritionX-100)以12000r/m，4℃离心洗涤2次，重悬沉淀，加入16ml包涵体裂解液(1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/L EDTA，pH8.0)重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白。可溶性上清按上述方法处理。
(3)表达蛋白的纯化前复性
在包涵体溶解上清中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的复性缓冲液(0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽GSSH，2mmol/L还原型谷胱苷肽GSH，2mmol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH8.5)，用0.01mol/LPBS(pH7.4)透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化。
(4)表达蛋白的亲合层析纯化流程
①用20ml PBS冲洗柱子，以洗去保存液；
②用6ml PBS+1％Trition X-100进行平衡凝胶层；
③往柱内加样，加样时可用小滤器(0.22μm孔径)过滤上样，每次上样2ml，并在27℃条件下感作30min后缓慢弃掉流出液，释放流出液的速率为1滴/15秒。
④用10ml PBS缓冲液冲洗柱子2次；
⑤用10ml洗脱液冲洗结合物，按1-2ml量于洁净Eppendorf管内收集洗脱液；
⑥纯化柱的再生与保存：用高盐再生液(1mol/L PBS+3molo/L NaCl)洗涤凝胶2次可以再生利用。为了长期保存，用5倍于胶层体积的PBS液洗2次，用5倍于胶层体积的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
(5)表达蛋白含量的测定
采用紫外线吸收法定量蛋白质。将待检样品适当稀释后，同时测定该蛋白质溶液在λ260nm和λ280nm处的OD值，同时用稀释液作为空白对照，按下列公式计算蛋白含量：
(1.46×A280 0.74×A260)×稀释倍数＝(mg)/ml蛋白含量
VP1-VP3/GST纯化蛋白的质量浓度为≥1.5mg/ml。