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本发明涉及自毛囊间充质细胞制备的真皮替代品。与成纤维细胞相比，分离自毛囊，尤其是来自人胡须毛囊的间充质细胞产生大量的生长因子和基质蛋白以刺激细胞再生，并产生少量的酶以分解基质蛋白。因此，由本发明制备的真皮替代品比传统的人造皮肤具有更出色的细胞再生效果。

1、  一种真皮替代品，包括：
a)活基质组织，包括培养于三维骨架中的毛囊间充质细胞和由该毛囊间充质细胞分泌的结缔组织蛋白；以及
b)连接于该基质组织的过渡覆层。

2、  根据权利要求1的真皮替代品，其中上述毛囊间充质细胞是真皮乳头细胞和结缔组织鞘细胞。

3、  根据权利要求1或2的真皮替代品，其中所述毛囊是头皮或胡须毛囊。

4.  根据权利要求1的真皮替代品，其中所述三维骨架由选自由聚半乳糖酸、几丁质、壳聚糖、棉花、聚葡萄糖醛酸、纤维素、明胶、胶原、血纤蛋白和葡聚糖所组成的组中的一种或多种生物可降解材料构成。

5、  根据权利要求1的真皮替代品，其中所述骨架由选自由聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙稀、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和硝化纤维所组成的组中的一种或多种非生物可降解材料构成。

6、  根据权利要求1的真皮替代品，其中所述过渡覆层由硅树脂或聚氨酯制成。

由毛囊间充质细胞制备的真皮替代品
[技术领域]
本发明一般地涉及活的真皮替代品，并且更具体地涉及由毛囊间充质细胞制备的真皮替代品。
[背景技术]
外科手术切除烧伤创面并应用取自该患者完整厚度(full-thickness)的未烧伤皮肤的自体移植物是治疗深度烧伤患者的理想方法。然而，由于皮肤给位首先要缝合，可用于创伤皮肤的自身未烧伤皮肤的量非常有限。因此，部分厚度(spilt-thickness)的真皮移植物被认为是最好的治疗方法，并且冷冻保藏的(cryopreserved)或者新鲜的皮肤也可作为当前的生物敷料，用以覆盖广泛切除的烧伤创面(Atnip和Burke，1983，Curr Prob.Surg.20：623-83)。冷冻保藏的同种移植物皮肤与新鲜皮肤相比对伤口的功效较次，很可能是由于在冷冻保藏、冻结和随后解冻后角质细胞和成纤维细胞丧失了存活力。此外，冷冻保藏对皮肤某些物理组分如基底膜的破坏，可能也促成了细胞存活力的下降。
因此，已进行了可用于上述情况的人造皮肤的研究。尽管首先分别研发出人造皮肤的表皮和真皮层并部分地用于临床试验，但已经出现了问题。当前，在人造真皮移植后利用的是用部分厚度的移植物或用培养的表皮细胞覆盖创伤皮肤的方法。人造真皮通过利用海绵或凝胶型胶原或通过利用吸收性聚合物制备。
当前人造皮肤的技术如下：
1)培养的自体同源(autologous)角质细胞(keratinocyte)移植物自从1950年代以来就认识到了培养的表皮细胞可用于完整厚度的皮肤部位缺失的事实。在1975年，Rheinwald和Green报道了当向底部覆盖有间充质细胞的培养基中添加生长刺激物质例如表皮生长因子(EGF)或霍乱毒素时，表皮细胞迅速增殖。根据他们的研究，当小量的表皮细胞培养3-4周后，细胞增殖5000倍，足以覆盖成人的整个体表面积(1.7m²)。
为了将表皮细胞用于移植，应当诱导正常分化的过程。然而，如果表皮细胞治标性地培养于培养基中，它们异常分化。结果，它们不能用于移植。换言之，由于角质层未形成，移植后的表皮细胞干燥并脱落。另外，由于细胞中发生不完全的生物化学分化，表皮层在维持其框架和防御功能方面出现问题。Prmieras等(1983，J Invest Dermatol 81：28s-33s.)宣称当在其培养步骤中将表皮层置于空气中时，形态分化正常发生。Maruguchi等(1994，PlastReconstr Surg 93：537-44)报道了当在移植的人造真皮上培养表皮细胞时，生物化学分化正常发生。因此，他们宣称如果表皮细胞在人造真皮上置于空气中培养，则正常表皮的功能和结构得以恢复。
O′connor(1981，Lancet 1:75)首先将培养的表皮细胞用于烧伤患者，并将细胞移植到溃疡、痣、大疱性表皮松解症部位。O′connor报道它们的粘附率在15到50％的范围内。然而，虽然它们在残留真皮的部位粘附得很好，但它们不粘附于脂肪、慢性创面或传染性创面。
即使在粘附后，培养的表皮细胞收缩至创面大小的30％，并且比部分厚度的移植物形成更多的过大疤痕。此外，移植部位容易剥离，或者在其上形成水泡。这些现象起因于不稳定的表皮层和后来形成的表皮-真皮结合部位。
2)无细胞人造真皮
Yannas和Burke(1980，J Biomed Mater Res 14：65-81)开发出无细胞人造真皮。该人造真皮通过将葡糖胺聚糖(glycosaminoglycan)混合在胶原中，将混合物快速冻干，然后在高温下真空干燥而制备。由于创面部位没有表皮层，应当利用两步的外科手术操作。首先，用硅橡胶层覆盖创面部位。然后，当人造真皮在移植后粘附于创面部位时，取走硅橡胶层并用部分厚度的移植物覆盖创面部位。
该人造真皮具有带孔的海绵型结构。移植后，血管、成纤维细胞和纤维组织生长进入这些孔中。结果形成新的表皮结构，并且人造真皮与正常组织结合。因此，孔径大小在人造真皮的粘附中起着重要作用。孔径大小取决于葡糖胺聚糖的种类或含量、交联方法、冷冻速率以及胶原的浓度。合适的孔径大小在50到150μm的范围内。该人造真皮移植后据报道具有在从50到70％范围内的相对低的粘附率。低粘附率因在移植部位产生血肿、38％的高感染率以及体内酶的早期降解所致。然而，该人造真皮不可用的主要原因在于移植后在新的真皮结构形成之前，该人造真皮的结构就被内在的胶原酶早早地降解了。虽然利用了与戊二醛交联后的人造真皮以解决这个问题，但存在另一个戊二醛的强毒性的问题。细胞在移植后迅速增殖从而新真皮得以快速形成的另一种方法是利用具有良好的亲细胞性的硫酸肝素替代葡糖胺聚糖中传统的软骨素-6-膦酸盐。可以利用无毒性的抗坏血酸铜离子替代戊二醛，但是难以诱导预期地交联。
3)细胞人造皮肤
细胞人造真皮是具有双层结构的人造皮肤，其中无细胞人造真皮覆以培养的表皮细胞以解决无细胞人造真皮两步外科手术的问题。由于人造真皮具有海绵型结构，其中细胞可穿透进入它的孔中，人造真皮表面用胶原凝胶或片层覆盖，然后表皮细胞在其上铺展。在这种情况下比仅移植无细胞人造真皮的情况较少发生创面收缩。据报道，从培养后11天起形成类似于正常层状体的结构。
将培养的成纤维细胞植入人造皮肤的真皮中，以便新的真皮可以在移植后快速形成。该方法表现出70％的粘附率(Hansbrough，1989 JAMA 262：2125-30)，并且在移植后9天形成固定的原纤维和基底膜。尽管该方法可用于完整厚度皮肤的缺陷部位，它具有的问题是真皮部位交联中所用的戊二醛的毒性。
4)培养的合成皮肤的移植
培养的合成皮肤是由Bell开发的人造皮肤，以活皮肤等同体或杂种皮肤闻名。表皮通过在胶原凝胶型真皮部位培养表皮细胞而制备，胶原凝胶型真皮部位通过在胶原溶液中种植并压缩成纤维细胞制备。真皮部位的成纤维细胞通过使胶原凝胶成熟增加人造皮肤的机械张力，使之易于操作，使得人造皮肤具有胶原酶降解的抗性，并刺激表皮细胞的增殖。此外，该成纤维细胞产生新的基质，并使得与血管和创面愈合相关的细胞在移植后快速生长。因此，成纤维细胞在人造皮肤的粘附中具有重要作用。不过，Bell的方法具有如下的一些问题：由Bell的方法制备的真皮部位的胞间基质为不规则排列。随着时间的推移，移植部位的细胞数目下降，因而外科手术期间的操作困难。移植后，真皮部位容易降解，而且它们具有表皮细胞的低粘附率。
5)由同种异体皮肤制备的人造真皮
当同种异体真皮被移植到完整厚度皮肤的缺陷部位且无排斥地粘附于皮肤时，该同种异体真皮补偿了真皮层的厚度，由此在移植完整厚度的皮肤时取得出色的结果。同种异体皮肤的免疫应答通过细胞发生，而真皮的胞间基质不导致排斥。因此，同种异体真皮在除去所有细胞并冻干以维持胞间基质结构时可用作移植物。由上述方法加工的同种异体真皮作为产品AlloDerm已经上市。然而，该产品昂贵，并且有赖于生产系统，该生成系统通过根据医生处方某患者需迅速供给在无菌室中大量培养的活细胞组织的医嘱进行。因此，国外开发的产品由于向患者提供它们需要长的周期而具有细胞坏死现象的问题。
6)由生物可降解聚合物制备的人造真皮
在Langer和Vacanti介绍了利用吸收性聚合物产生预期组织的组织工程技术之后，该技术被应用于人造皮肤。由生物可降解聚合物制备的人造真皮是通过将成纤维细胞种植到以聚合物而非胶原形成的骨架中制备的，以解决胶原制成的人造真皮的问题。移植后在胶原制成的人造皮肤上发生炎症，并且该人造皮肤在新的真皮结构形成之前就溶解了。American Advanced TissueScience利用polyglactin制备的人造真皮以Dermagraft的名称上市，并作为美国专利No.5,460,939被授予专利权。由于Dermagraft覆有硅橡胶层，Dermagraft在活体中移植2周后完成血管化。因此，如果取走硅橡胶层并用部分厚度的皮肤覆盖取走部位，它的粘附率为51％。虽然polyglactin在活体中通过水解作用在60天内降解，但当制备人造真皮时它在培养期间在培养基中就开始降解。因此，由于polyglactin在移植后快速溶解和消除，它不能很好地起人造皮肤的功用。
[发明内容]
本发明的目的在于提供一种真皮替代品，其包括培养于三维骨架中的活基质组织以及过渡覆层。
所述的基质组织包括毛囊间充质细胞、由该间充质细胞分泌的胞外基质蛋白和生长因子。
所述毛囊间充质细胞是真皮乳头细胞和结缔组织鞘细胞。
真皮乳头100长久以来被认为是毛发生长起始和维持所必需的。不过，环绕毛囊靠下节段并含血管丛的结缔组织鞘102的功能是未知的(见图1)。
尽管所有的毛囊间充质细胞可用作本文的毛囊间充质细胞，但头皮或胡须毛囊的间充质细胞是优选的。本发明实施例中使用的是胡须毛囊间充质细胞。
参照参考实施例1，在毛囊间充质细胞中而非成纤维细胞中检测到明显存在于肌成纤维细胞(myofibroblasts)中的α-平滑肌蛋白SM22和α-平滑肌肌动蛋白。因此，本文的毛囊间充质细胞较之于成纤维细胞具有与肌成纤维细胞更相近的特征。
真皮替代品最重要的事情是基质蛋白例如胶原、纤连蛋白、核心蛋白聚糖(decorin)和骨粘连蛋白(osteonectin)，以及生长因子例如结缔组织生长因子、色素表皮衍生因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子和葡糖胺聚糖。参照参考实施例2，毛囊间充质细胞中的基质蛋白和生长因子的产量比用作现有技术的基质细胞的成纤维细胞更高。不过，毛囊间充质细胞中降解基质蛋白的胶原酶活性小于成纤维细胞。因而，通过利用毛囊间充质细胞，本发明能够提供具有出色的再生皮肤细胞能力的真皮替代品。
本发明包括与过渡覆层相连的作为骨架的三维活基质组织。
所述过渡覆层由硅橡胶例如聚氨酯和硅橡胶层构成。
三维骨架允许细胞粘附在它上面并生长不止一层。可利用非生物可降解材料例如尼龙(聚酰胺)、涤纶织物(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙稀、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯(PC)和硝化纤维形成该骨架。对于体内应用，优选利用生物可降解骨架例如聚半乳糖酸(polyglactic acid)、聚葡萄糖醛酸、胶原、血纤蛋白、明胶、棉花、纤维素、壳聚糖或葡聚糖。
在本发明的实施例中，真皮替代品通过在由胶原-壳聚糖-葡糖胺聚糖形成的三维骨架中培养分离自胡须的间充质细胞来制备。
[附图说明]
图1显示了毛囊的结构。
图2a是显示毛囊间充质细胞在培养状态下的模式的照片。
图2b是显示成纤维细胞在培养状态下的模式的照片。
图3是说明毛囊间充质细胞和成纤维细胞在培养10天时生长速率的曲线图。
图4a是显示利用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体对培养状态的毛囊间充质细胞免疫染色结果的照片。
图4a是显示利用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体对培养状态的成纤维细胞免疫染色结果的照片。
图5是显示在三维骨架上培养胡须间充质细胞结果的照片。
图6是显示对培养在三维骨架上的胡须间充质细胞染色结果的照片。
[具体实施方式]
参考实施例1：毛囊间充质细胞和成纤维细胞之间分类学差异的实验
1)毛囊间充质细胞和成纤维细胞的培养
从男性脱发症患者中通过生检(biopsy)获取胡须组织以分离胡须毛囊。将分离的毛囊靠上的2/3的部分除去，并将余下的靠下的1/3部分在5％的二氧化碳中培养。成纤维细胞在包皮环切术中获自皮肤。利用含青霉素(100U/ml)、链霉素(100ug/ml)、谷酰胺(0.584mg/ml)和20％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM；Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)作为液体培养基。该液体培养基每3天更换一次。培养后4周，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA溶液分离每一个细胞，然后亚培养。利用第三次亚培养的细胞来测量10天的细胞生长速率。
2)免疫组织化学
将第3代细胞培养物在甲醇中固定5分钟，并在室温下与α-平滑肌肌动蛋白的单克隆抗体温育1小时。在PBS(磷酸盐缓冲盐溶液)中充分洗涤后，将细胞暴露于生物素标记的抗鼠抗体(Dako，Glostrup，丹麦)1小时，再次洗涤，并与辣根过氧化物酶交联的链抗生素蛋白(steptavidin)温育等长的时间。用1％双氧水和5％二氨基联苯胺显色。免疫染色后，某些切片在脱水和固定前用苏木精轻微反染色。
上述实验的结果如下。
如图2a和2b所示，胡须间充质细胞呈现出扁平形态，具有众多的细胞突，而非毛囊皮肤成纤维细胞具有更加规则、纺锤状的形态。间充质细胞形成块或聚集物。该聚集物与规则的混杂模式的皮肤成纤维细胞形成对照。
如图3所示，胡须间充质细胞比皮肤成纤维细胞生长得更慢。
参照图4a和4b，当成纤维细胞和胡须间充质细胞用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体免疫染色时，成纤维细胞很少着色，但毛囊间充质细胞清晰着色。该结果表明胡须间充质细胞与肌成纤维细胞的亲缘关系比成纤维细胞更近。
参考实施例2：由毛囊间充质细胞和成纤维细胞构建cDNA文库，以及通过cDNA分析的基因表达频率差异的实验
在DMEM中培养毛囊间充质细胞和皮肤成纤维细胞，并从70％融合的细胞中制备poly(A)+RNA。利用poly(A)+RNA(5μg)和Uni-Zap XR试剂盒(Stratagene)在ZAP II载体(Stratagene，USA)中构建cDNA文库。通过ExAssist/SOLR系统(Stratagene)体内切除将该噬菌体文库转换为pBluescript噬菌粒cDNA文库。在具有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板上涂布该pBluescript cDNA文库，并挑选白色克隆进行测序。
利用所选克隆的过夜培养物(3ml在LB中)通过QIAwell-8质粒微抽提试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)制备质粒DNA。利用测序酶DNA测序试剂盒从插入物的5′端对cDNA进行测序。序列与GenBank数据库进行比较。
分析了来自每个cDNA文库的1400个克隆，以比较基质蛋白、生长因子和基质蛋白降解酶的基因。结果示于表1中。
[表1]分离自毛囊的间充质细胞以及分离自皮肤的成纤维细胞中生长因子、基质蛋白和基质蛋白降解酶的基因表达频率