在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基 相关申请
根据35 U.S.C.119(e)，本申请基于2001-10-2由Brewer提交的题为“在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基”的美国临时专利申请No.60/326,658，并要求享受该申请的优先权，在此将其全文并入以供参考。
【发明领域】
本发明涉及一种维持经照射、受损或分离的神经细胞生存力的经过改进的含水培养基。本发明还涉及维持经照射、受损或分离的神经细胞生存力的改进方法。本发明还涉及将这种改进的培养基用于人类患者神经外科的方法。
【发明背景】
研究受损中枢神经系统组织的主要问题是维持细胞生存力。无法在各种环境条件下使维持中枢神经系统组织的生存力在培养物中维持较长时间，这曾经阻止了治疗中枢神经系统疾病的有效治疗方案的发展。
最近开发了一种在高二氧化碳气氛(5％CO2)下维持中枢神经系统组织生存力的营养平衡盐溶液(培养基)。NeurobasalTM(Gibco/Invitrogen股份有限公司，Rockville，MD)是能使胚胎大鼠海马神经元在pH 7.3、5％ CO2下生长最优的碳酸氢盐缓冲培养基。该培养基是Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)的衍生物并可优化胚胎大鼠海马细胞的存活率。与DMEM相比，NeurobasalTM含较少NaCl和NaHCO3，这使其渗量降低并含有较少量的半胱氨酸和谷氨酰胺，从而导致神经胶质生长降低。此外，NeurobasalTM含有丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和维生素B12，而这些DMEM都不含有。
尽管神经元可在5％CO2气氛下保持在高碳酸氢盐培养基中，当添加B27(一种获自Invitrogen公司的激素和抗氧化剂添加物)时，当转移到环境CO2条件(约0.2％)时神经元迅速死亡。死亡与培养基pH迅速升高至约8.1有关。
制造和研究神经组织和细胞通常需要在培养箱外使用环境CO2水平。现有控制培养箱外细胞pH的方法包括使用弱缓冲液(如Dulbecco改进的Eagle培养基或L 15培养基中使用地缓冲液)并用5-10％CO2连续吹气以维持生理pH。然而，一个简单的试验显示，环境CO2会使培养箱外DMEM的pH迅速升高至约8.1。通常用HEPES缓冲的做法会减慢，但不能阻止这种实质性的碱化。对组织连续吹气的做法可保持高CO2水平和生理pH，但设备笨重且成本昂贵。
美国专利6,180,404(2001.1.30)，该专利属于本申请相同受让人并被并入以供参考，提供了在环境CO2条件下维持神经细胞的培养基。所述培养基含有少于约2000μM碳酸氢盐(pKa为约6.9-约7.7的缓冲液)、0-约3000μM CaCl2、约0.05-约0.8μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约74000-约103000μM NaCl、约400-约2000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖和约20-约500μM丙酮酸钠，且其中所述培养基基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。这种培养基的一种形式可以商品名HibernateTM购得。优选地，这种培养基添加有B27(一种含有效量激素的促进生长的添加物)、必需脂肪酸和抗氧化剂以使神经细胞生长。
该领域还需要一种改进的培养基，这种培养基可维持生理pH，并可在受损的脑和脊髓组织中提供高神经细胞生存力，在受损的脑和脊髓组织中，受到损伤的血液供应会减少CO2和其它营养物、激素和/或促进再生和/或防止或显著降低退化的生长因子。本发明提供了这种改进的培养基。
脑肿瘤是15岁以下儿童和34岁以上青年中的第二大致死肿瘤。脑肿瘤是65岁以上成年中第二大发展最快的致死肿瘤。与许多其它肿瘤不同，行为改变似乎不会显著降低诸如脑肿瘤的风险。尽管约40％或50％的脑癌是良性的，但良性脑癌也会导致显著损伤和死亡。美国每年约有100,000人被诊断患有原发性或转移性脑肿瘤。只要肿瘤部位许可，通常可用外科手术技术来除去脑肿瘤。手术部位(即蛛网膜下隙、脑薄壁组织和切除腔)通常用生理盐水冲洗，有时还要用浸在生理盐水中的物质包扎。因此，就需要有可用于神经外科以提高神经细胞生存力和/或促进神经细胞再生和/或促进神经细胞分化的改进培养基和方法。这种改进的培养基和方法可用来冲洗或浸泡手术位置和/或用来浸渍或浸透填料(例如，明胶-泡沫海绵)，所述填料在除去肿瘤或其它神经组织后仍留在腔内。本发明提供了这种改进的培养基和方法。
发明概述
一方面，本发明提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，所述方法包括对脑或脊髓组织施用无菌含水液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μMFe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μMNaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及神经元生长有效量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。所述无菌液体培养基还可含有有效量的脱氢表雄酮-4-硫酸盐(DHEAS)以维持激素水平；通常，有效量的DHEAS是约2-约200μM，更优选约5-约100μM。所述无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)以协助支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选用于本发明的FGF2是获自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。更优选地，所述无菌液体培养基含有有效量的DHEAS和FGF2。这种优选的组合物通常含有约5-约50μM DHEAS和约1-约50ng/ml FGF2，更优选约10-约30μM DHEAS和约2-约20ng/ml FGF2。
另一方面，本发明提供了一种将生存力增强的干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统的方法，所述方法包括(1)在将干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统之前或之时用含水的无菌液体培养基处理所述干细胞或神经系统细胞或组织，和(2)输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.01-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μMMgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM 亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM 乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM 腐胺、约20-约500μM 丙酮酸钠，和对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，其中所述无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。所述无菌液体培养基还可含有有效量的脱氢表雄酮-4-硫酸盐(DHEAS)以维持激素水平；通常，有效量的DHEAS是约2-约200μM，更优选约5-约100μM。所述无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)，以协助支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选的用于本发明的FGF2是获自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。更优选地，所述无菌液体培养基含有有效量的DHEAS和FGF2。这种优选的组合物通常含有约5-约50μM DHEAS和约1-约50ng/mlFGF2，更优选约10-约30μM DHEAS和约2-约20ng/ml FGF2。
再在另一方面，本发明提供了一种有效提高脑或脊髓损伤或手术后人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力，或有效提高欲输递至人的脑、脊髓或神经系统的神经系统细胞或组织的神经细胞生存力的含水组合物，所述含水组合物含有0-约3000μM CaCl2；约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3；约2500-约10,000μM KCl；0-约4000μMMgCl2；约30,000-约150,000μM NaCl；约100-约30,000μM NaHCO3；约250-约4000μM NaH2PO4；约0.01-约0.4μM 亚硒酸钠；约0.2-约2μM ZnSO4；约2500-约50,000μM D-葡萄糖；约1-约50μM L-肉碱；约3-约80μM乙醇胺；约15-约400μM D(+)-半乳糖；约5-约200μM人白蛋白；约40-约800μM腐胺；约20-约500μM丙酮酸钠；约0.01-约0.32μM运铁蛋白；0-约120μM L-丙氨酸；0-约2400μM L-精氨酸；0-约30μM L-天冬酰胺；0-约60μM L-半胱氨酸；0-约3000μM L-谷氨酰胺；0-约2400μM甘氨酸；0-约1200μM L-组氨酸；0-约5000μM L-异亮氨酸；0-约5000μM L-亮氨酸；0-约5000μM L赖氨酸；0-约1200μML-甲硫氨酸；0-约2400μM L-苯丙氨酸；0-约500μM L-脯氨酸；0-约2400μM L-丝氨酸；0-约5000μM L-苏氨酸；0-约500μM L-色氨酸；0-约2400μM L-酪氨酸；0-约5000μM L-缬氨酸；约0.5-约16μM谷胱甘肽(还原的)；约0.1-约10μMα-生育酚；约0.1-约10μMα-生育酚乙酸酯；约0.001-约0.1μM过氧化氢酶；约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶；约0.001-约0.1μM皮质醇；0-约200μM DHEAS；约0.001-约0.1μM孕酮；约0.02-约1μM醋酸视黄酯；约0.1-约5μM胰岛素；0-约0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；约0.05-约20μM亚油酸；约0.1-约10μM亚麻酸；0-约2.5μM生物素；0-约100μMD-泛酸钙；0-约200μM胆碱；0-约100μM叶酸；0-约240μMi-肌醇；0-约200μM烟酰胺；0-约120μM吡哆醛；0-约6μM核黄素；0-约100μM硫胺和0-约1.2μM钴胺素；其中，所述含水组合物的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
附图简述
图1显示了本发明的无菌液体培养基中DHEAS和FGF2使人神经元存活的协同作用。神经元在有(实心圆)或没有(空心圆)10μM DHEAS和0-约10ng/ml碱性人重组成纤维细胞生长因子(获自Introgen公司，Rockville，MD)的条件下培养6天。数值是来自67岁原发性脑淋巴瘤病例6块0.3mm2区域的平均值和S.E.(标准误差)。三个最低GFG2浓度的多因素ANOVA F(1，10)＝15.2。注意0浓度被人工置于对数x轴上。
图2基于实施例，显示明胶海绵中本发明无菌液体培养基在大鼠伞毛-穹隆(fimbria-fornix)损伤中可保持内隔膜(medial septum)中经过轴索显微外科术(axotomized)的神经元的神经元密度至少一个月。盐水(对照)和本发明无菌液体培养基组中未受损侧的细胞密度分别为每平方毫米61和62个细胞。同时进行第二种对照(伪受损即未受到损伤)。显示了每组6只大鼠的平均值+S.E.。概率是t-试验对比盐水的结果。
图3基于实施例3，显示明胶海绵中本发明的无菌液体培养基提高了吸引术损伤(aspiration lesion)周围大鼠皮层神经元1个月的存活。图A：用本发明的无菌液体培养基(实心圆)处理明显优于用盐水处理(实心三角)的动物，且几乎等于伪受损的脑(未受损的，空心圆)。图B：相对神经元密度，即占未受损侧密度的百分数。比较本发明的碱性无菌液体培养基(实心圆)和用碳酸氢盐缓冲的本发明的无菌液体培养基(方框)和盐水(空心圆)；通常碱性无菌液体培养基优于用碳酸氢盐缓冲的无菌液体培养基。图C：本发明的无菌液体培养基+FGF2(方框)优于DMEM+FGF2(菱形)和盐水(三角)。每个点都是6个动物测量值的平均值和S.E.，它是距损伤边缘的距离的函数。概率由比较本发明的无菌液体培养基和盐水或DMEM的两因素ANOVA确定。
图4同样基于实施例3，显示与盐水(方框)和伪受损(三角相比)，置于皮层吸引术损伤中的明胶海绵内的本发明的无菌液体培养基(圆圈)可消除神经胶质增生，该结果基于GFAP免疫染色。每个点都是20×400μm面积中象素强度的平均值和S.E.，每次处理有3只大鼠，距损伤边缘的距离每次增加20μm，损伤位于软脑膜下1200μm。
图5A基于实施例4，显示在Neurobasal A培养基中培养7天后脑膜瘤细胞的生长，该培养基中含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺。这些细胞在基质上铺展开并增殖，平均细胞面积达到3015+453μm2(平均值+/-S.E.，n＝12细胞)。
图5B基于实施例4，显示培养7天后生长在本发明的培养基上的脑膜瘤细胞未铺展开或增殖(平均面积＝936μm2)(t-试验，比较血清-生长细胞，p＝0.0001)。
本发明的培养基上几乎没有存活细胞。
图5C基于实施例4，显示在Neurobasal A培养基中培养7天后成胶质细胞瘤细胞的生长，该培养基中含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺。这些铺展在基质上并增殖。
图5D基于实施例4，显示培养7天后生长在本发明的培养基上的成胶质细胞瘤细胞未铺展开或增殖。
图6基于实施例4、表3，比较了脑膜瘤细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基(空心圆)和本发明的培养基(实心圆)中的生长。使脑膜瘤细胞生长10天。培养10天后，生长在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基中的细胞产生融合生长。用胰蛋白酶处理收集这些细胞，并将其置于含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基或本发明的培养基。细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基中继续生长，但在本发明的培养基中生长受到抑制，并有细胞死亡。
图7基于实施例4、表4，比较了各种类型的肿瘤在含有胎牛血清(GIBCO)的Neurobasal A培养基(交叉线柱)和本发明的培养基(实心柱)中的生长。显示了第6或第7天细胞的增加，增加是用第6天或第7天的细胞数除以开始培养时的细胞数。对于这5种连续肿瘤状况，本发明的培养基导致生长停滞或抑制以及细胞死亡，而含有胎牛血清的Neurobasal A培养基使所有原发性肿瘤的细胞增殖而使转移肿瘤的细胞生长停滞。
优选实施方案的描述
本发明提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，所述方法包括对脑或脊髓组织施用无菌含水液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μML-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的必需脂肪酸、激素和抗氧化剂。用于本发明的培养基提供最少必需的含水培养基以维持神经细胞或组织在含有环境CO2水平环境下的生存力，且通常含有少于约2000μM碳酸氢盐，其渗量为约200-约270mOsm，含有pKa约6.9-约7.7的缓冲液，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。出于本发明的目的，″基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐″是指所述组合物含有少于约0.4μM硫酸亚铁、少于约1μM谷氨酸盐和少于约1μM天冬氨酸盐；优选地，所述组合物不含添加的硫酸亚铁、谷氨酸盐或天冬氨酸盐；更优选地，这些组分的水平接近或就是0。
通常，渗量优选约200-约240mOsm。优选地，以最终浓度表示，所述无菌液体培养基含有500-约2500μM CaCl2、约0.05-约0.6μM Fe(NO3)3、约3000-约8000μM KCl、约300-约2000μM MgCl2、约40000-约103000μM NaCl、约200-约1800μM NaHCO3、约400-约2000μM NaH2PO4、约0.03-约0.2μM亚硒酸钠、约0.4-约1.5μM ZnSO4、约10000-约40000μM D-葡萄糖、约3-约25μM L-肉碱、约6-约40μM乙醇胺、约30-约200μMD(+)-半乳糖、约80-约400μM腐胺，以及约100-约400μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的必需脂肪酸、激素和抗氧化剂。较佳地，优选的脂肪酸脂肪酸、激素和抗氧化剂包括约0.001-约0.1μM皮质醇、约0.5-约16μM还原的谷胱甘肽、约0.05-约20μM亚油酸、约0.1-约10μM亚麻酸、约0.001-约0.1μM孕酮、约0.02-约1μM醋酸视黄酯，0-约0.6μM3，3&APOS；，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、约0.1-约10μMDL-α生育酚、约0.1-约10μM DL-α生育酚乙酸酯、约5-约200μM人白蛋白、约0.001-约0.1μM过氧化氢酶、约0.1-约5μM胰岛素、约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶和约0.01-约0.32μM运铁蛋白。
所述无菌含水液体培养基含有pKa约6.9-约7.7的氢离子缓冲液，当与神经组织接触时，其量足以维持pH在约6.9-约7.7的所需范围。通常，所述氢离子缓冲液的量是约5000-约25000μM。适合用于本发明的缓冲液包括3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸(MOPS)、碳酸氢钠、N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、N，N-二-(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、1，3-二氮杂-2，4-环戊二烯、2-三(羟甲基)氨基乙烷磺酸(TES)等，以及它们的混合物。基础组合物中优选的缓冲液是3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸(MOPS)。碳酸氢钠在本发明中有双重作用。在低水平时(即通常少于约2000μM)，碳酸氢钠与氯离子的转运有关。此外，如上所述，碳酸氢钠可作为缓冲液；当用作缓冲液时，碳酸氢钠当然必需是高水平的(高达约30,000μM)。
本发明的培养基还含有有效量的至少10种必需氨基酸。优选地，用最终浓度表示，所述无菌液体培养基含有：(1)L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸各约250-约2500μM；(2)约150-约1500μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-酪氨酸各约120-约1200μM；(4)L-组氨酸和L-甲硫氨酸各约60-约600μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各约25-约250μM；(6)约6-约60μM L-丙氨酸；(7)约3-约30μM L-半胱氨酸；(8)约1.5-约15μML-天冬酰胺；(9)约12-约120μM i-肌醇，(10)约10-约100μM烟酰胺；(11)约9-约90μM胆碱；(12)约6-约60μM吡哆醛；(13)硫胺、叶酸和D-泛酸钙各约2-约40μM；(14)约0.3-约3μM核黄素；(15)约0.1-1.2μM生物素；和(16)约0.05-约1μM维生素B12。
优选地，所述促进生长的脂肪酸、激素和抗氧化剂包括约0.002-约0.03μM皮质醇、约1-约8μM还原的谷胱甘肽、约1-约10μM亚油酸、约0.2-约5μM亚麻酸、约0.005-约0.06μM孕酮、约0.05-约0.6μM醋酸视黄酯、约0.0005-约0.2μM3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、DL-α生育酚和DL-α生育酚乙酸酯各约0.5-约5μM、约15-约90μM人白蛋白、约0.002-约0.04μM过氧化氢酶、约0.2-约2μM胰岛素、约0.02-约0.25μM超氧化物歧化酶和约0.02-约0.16μM运铁蛋白。
本发明组合物的推荐组分如下表1所示：
表1 组分 范围(μm) 优选范围(μM) 更优选的范围(μM) 无机盐 CaCl2 0-3000 500-2500 1200-2400 Fe(NO3)3·9H2O 0.1-1.2 0.05-0.6 0.1-0.3 KCl 2500-10000 3000-8000 4000-6000 MgCl2 0-4000 300-2000 600-1000 NaCl 30000-150000 40000-103000 66000-86000 NaHCO3 100-30000 200-1800 780-980 NaH2PO4·H2O 250-4000 400-2000 800-1000 亚硒酸钠 0.01-0.4 0.03-0.2 0.06-0.1 ZnSO4·7H2O 0.2-2 0.4-1.5 0.57-0.77
其它 D-葡萄糖 2500-50000 10000-40000 15000-35000 MOPS 5000-25000 8000-12000 9000-11000 L-肉碱 1-50 3-25 6-18 乙醇胺 3-80 6-40 12-20 D(+)-半乳糖 15-400 30-200 60-100 人白蛋白 5-200 15-90 30-45 腐胺 40-800 80-400 160-200 丙酮酸钠 20-500 100-400 130-330 运铁蛋白 0.01-0.32 0.02-0.16 0.04-0.08 氨基酸 L-丙氨酸 0-120 6-60 10-30 L-精氨酸·HCl 0-2400 120-1200 200-600 L-天冬酰胺·H2O 0-30 1.5-15 2.5-7.5 L-半胱氨酸 0-60 3-30 5-15 L-谷氨酰胺 0-3000 150-1500 300-700 甘氨酸 0-2400 120-1200 200-600 L-组氨酸·HCl·H2O 0-1200 60-600 100-300 L-异亮氨酸 0-5000 250-2500 600-1000 L-亮氨酸 0-5000 250-2500 600-1000 L-赖氨酸·HCl 0-5000 250-2500 600-1000 L-甲硫氨酸 0-1200 60-600 100-300 L-苯丙氨酸 0-2400 120-1200 200-600 L-脯氨酸 0-500 25-250 60-80 L-丝氨酸 0-2400 120-1200 200-600 L-苏氨酸 0-5000 250-2500 600-1000 L-色氨酸 0-500 25-250 40-160 L-酪氨酸 0-2400 120-1200 200-600 L-缬氨酸 0-5000 250-2500 600-1000 抗氧化剂
谷胱甘肽(还原的) 0.5-16 1-8 2-4 维生素E (α-生育酚) 0.1-10 0.5-5 1-3 维生素E乙酸酯 (α-生育酚乙酸酯) 0.1-10 0.5-5 1-3 过氧化氢酶 0.001-0.1 0.002-0.04 0.005-0.02 超氧化物歧化酶 0.01-0.5 0.02-0.25 0.04-0.12 激素 皮质醇 0.001-0.1 0.002-0.03 0.005-0.015 DHEAS 0-200 5-100 10-30 孕酮 0.001-0.1 0.005-0.06 0.01-0.03 醋酸视黄酯 0.02-1 0.05-0.6 0.1-0.3 胰岛素 0.1-5 0.2-2 0.4-0.8 3，3’，5-三碘-L- 甲腺原氨酸(T3) 0.0-0.6 0.0005-0.2 0.02-0.08 必需脂肪酸 亚油酸 0.05-20 1-10 2.5-4.5 亚麻酸 0.1-10 0.2-5 0.5-2.0 维生素 生物素 0-2.5 0.1-1.2 0.2-0.6 D-泛酸钙 0-100 2-40 6-24 胆碱 0-200 9-90 20-40 叶酸 0-100 2-40 4-14 i-肌醇 0-240 12-120 20-60 烟酰胺 0-200 10-100 15-50 吡哆醛·HCl 0-120 6-60 10-30 核黄素 0-6 0.3-3 0.5-1.5 硫胺·HCl 0-100 2-40 5-20 B12(钴胺素) 0-1.2 0.05-1 0.1-0.5
本发明的无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)，以参与支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选用于本发明的FGF2是获自Introgen公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。
特别优选所有的组分都是药物等级或更高等级的。此外，对于所有人衍生组分，只要可能，通常优选使用合成组分或经过处理的组分以减低患者接触有害试剂(例如朊病毒、HIV等等)的风险。
添加B27添加物(美国专利6,180,404)的HibernateTM可将活的脑组织在冷冻条件下保持至少一个月，这样就可在实验室之间运送活的脑组织。这种用NeurobasalTM代替HibernateTM的无菌液体培养基也支持任何年龄的成人海马神经元在培养基中再生(Brewer，J.Neurosci.Meth，1997；71：143-155)。从大约3岁大的成年大鼠(相当于人75岁)的脑中可分离约50％活细胞。在培养基中，这些细胞再生出轴突和树突，这清楚证明，在分离过程中经过轴索显微外科术后，成人的神经元可在无菌液体培养基中再生。本发明的这种进步扩使这种培养基可用于修复或损伤受损的脑或脊髓。因此，本发明的这种无菌液体培养基适合在体内临床保存受损的脑或其它神经系统组织中的神经元。
本发明的无菌液体培养基促进成人神经元的存活和再生(Brewer等，J.Neurosci.Methods，2001；107：15)。已证明神经丝、MAP2和τ细胞骨架免疫反应性的神经元特征。培养物可在本发明的无菌液体培养基中保持数周，足够长来证明突触原件的出现。观察到突触结、突触囊泡和突触后密度。由于案例数较少，不能鉴别边缘组织来源程度以外的因子，这些来源可提高神经元而不是神经胶质的频率。将小的组织切片和本发明的无菌液体培养基结合可获得更大成功。早期电灼组织的方法无法制造或的神经元。这里所述的方法，包括用压力部分止血，获得组织，然后进行必需的电灼以切割表面，不会对神经外科造成负担。
对于培养基中有神经元再生的40％的组织样品。在冷却在转运培养基(HibernateTM/B27，如美国专利No.6,180,404所述；www.siumed.edu/BrainBits)之前，脑组织经历了数分钟急性局部缺血。Viel等(J.Neurosci.Res.，2001；64：311)显示，甚至在室温下局部缺血2小时之后仍可获得活的大鼠脑神经元。然而，如果局部缺血的脑被冷却至4℃，可在长达24小时后获得活的皮层神经元。
已经证明当包含在本发明的无菌液体培养基时，DHEAS和FGF2协同促进了人皮层神经元的存活。FGF是经典的皮层神经元营养因子(Walicke等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986；83：3012-3016；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986；83：7537-7541)。脑中的突触前神经元被认为依赖于适当刺激的突触后神经元释放的这些营养因子。在从数千脑突触提取神经元时，需要用外源营养支持代替这些神经元依赖的FGF是不奇怪的。FGF与神经元上的FGF受体结合(Walicke等，J.Biol.Chem.，1989；264：4120-4126)以活化酪氨酸激酶级联(Eckenstein，J.Neurobiol.，1994；25：1467-1480)。部分神经保护机制可抵御培养物内(Skaper等，Dev.Brain Res.，1993；71：1-8；Mattson等，J.Neurochem.，1995；65：1740-1751)和体内(Nakata等，Brain Res.，1993；605：354-356)的谷氨酸盐毒性，这种毒性与抗氧化剂保护的正调节有关(Mattson等，J.Neurochem.，1995；65：1740-1751)。因此，有许多FGF神经保护作用的先例。脑衍生神经营养因子(BDNF)可提供其它营养支持(Kirschenbaum等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1995；92：210-214；Goldman等，J.Neurobiol，1997；32：554-566)。
类固醇DHEAS在本发明的无菌液体培养基中的作用机制还不清楚。DHEAS提高分离的小鼠皮层神经元的存活率，并增强脑池内感染后的学习(learning)(Roberts等，Brain Res.，1987；406：357-362)。部分机制与通过提高神经保护转录因子NF-κB(Mao等，Neuro.Report，1998；9：759-763)，同时抑制糖皮质激素受体的核转录(Cardounel等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1999；222：145-149)，从而免遭谷氨酸盐毒性有关(Kimonides等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1998；95：1852-1857)。DHEAS抑制GABA介导的大鼠脑对氯的摄入(Imamura等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1998；243：771-775)，并迅速阻断分离的海马神经元中的电压门控钙流(Ffrench-Mullen等，Eur.J.PHARMACOL.，1991；202：269-272)。所有这些活性都有助于这里报道的DHEAS对人和大鼠神经元存活的有利作用，但他们认为DHEAS和FGF2通过活化单独的通路产生协同作用以促进神经保护。
根据发明者的知识，以前未报道高产量的成年人神经元。至少10年前就开始培养胚胎人神经元(Mattson等，Brain Res.，1990；522：204-214)，但由于缺乏这种组织和缺少组织供体同意的伦理问题，这种组织的应用并不常见。将成人脑组织作为外植块在含有血清的培养基中培养主要产生星形神经胶质(Gilden等，Comp.Neurol.，1975；161：295-306)，这可通过GFAP染色判断(Gilden等，J.Neurol.Sci.，1976；29：177-184)。Silant等(Appl.Neurophysiol.，1988；51：10-20)还报道了来自两名成人的含有血清的外植块培养物，但没有关于神经元的免疫细胞学证据。在其它含有血清的培养物中，MAP2阳性神经元的产量仅占平板细胞的约0.025％(Kirschenbaum等，Cereb.Cortex，1994；4：576-589)。通过对神经丝进行免疫染色证明，平铺在本发明的无菌液体培养基(含有FGF2和DHEAS)中的细胞产生约20％的神经元。这种占平板细胞20％的产量是不含FGF2和DHEAS的本发明的无菌液体培养基产量的约1000倍。平铺在本发明培养基上的大脑皮层细胞产生9,000个活细胞/mg，接近分离自大鼠前皮层的10,000细胞/mg(Viel等，J.Neurosci.Res.，2001；64：311-321)。
获自癫痫症状并经本发明的组合物处理的组织有助于解答一些与疾病有关的基础性问题：在培养物上培养组织连接是否可产生阵挛或紧张现象的自发爆发活性？兴奋突触/抑制突触的高重建比例或谷氨酸能细胞与分离的γ-氨基丁酸能细胞的比例是否会随癫痫原性病变变化？或者，新环境下轴突和树突的再生是否会导致更加正常的网络活性？成人神经元似乎与胚胎神经元有不同特性(Brewer，Neurobiol.Aging，1998；19：561-568；Evans等，J.Neurosci.Meth.，1998；79：37-46；Collings等，Brain Res.Bull.，1999；48：73-78)。这些成人神经元可用于研究高级人神经药理学、毒理学以及为脑抑制开发改进的方法。
如上所述，本发明提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法。该方法包括按上面的描述对有关脑或脊髓组织或需要治疗的脑或脊髓组织周围应用或施用所述无菌液体培养基。所谓需要治疗的脑或脊髓组织是与脑或脊髓损伤和/或外伤有关的组织。在适当的情况下，所述无菌液体培养基可以预防用药的方式(如在脑手术之前)应用于或施用于脑或脊髓组织。出于本发明的目的，″脑或脊髓组织″当然包括与脑和脊髓关联的组织，但同时包括全身的神经结缔组织。因此，本发明的无菌液体培养基可用来增强神经再生和/或神经生存力，例如在外科连接四肢或其它身体部分，或涉及神经损伤的受损四肢或其它身体部分的重建中。
各种输递系统是已知的并可用来应用或施用本发明的无菌液体培养基。所述无菌液体培养基可以任何常规途径应用或施用，例如包括灌输或快速输注，并可和其它生物活性剂(例如抗生素、生长因子、细胞因子、消炎剂、神经递质、受体激动剂、拮抗剂等)一起施用。通常，优选的施用方法取决于被治疗的组织和患者的特定状况。在特定的实施方案中，可在需要治疗的区域局部施用本发明的无菌液体组合物。例如，这可通过手术时局部灌输、局部敷贴(如创口贴)、注射、导管或植入(如由多孔性材料、非多孔性材料或胶状材料形成的植入物、外科包扎物或填充物，包括膜，比如硅酮基膜或纤维)等实现，但不限于此。在一个实施方案中，可在要治疗的组织部位(或成型部位)直接注射施用。
本发明的无菌液体培养基特别适合用于脑外科治疗，无论是由于如脑肿瘤、动脉瘤、增生、中风或脑损伤。所述无菌液体培养基一般可用来冲洗或浸泡手术部位和/或用来浸渍或浸透外科包扎物或填充物(如由多孔性材料、非多孔性材料或胶状材料形成的植入物，包括膜，比如硅酮基膜或纤维等)，这些包扎物或填充物在除去肿瘤或其它神经组织后将留在腔内。一种优选的手术包扎材料是Gel-FoamTM海绵。
如果有需要，所述无菌液体培养基可在一段时间内用控制释放系统输递。因此，例如可使用与含有所述无菌液体培养基的贮槽连接的泵。或者可使用浸透所述无菌液体培养基的聚合填充材料或其它填充材料，所述无菌液体培养基可从中以受控方式释放。当然，可根据需要将这种控制释放系统设计成可补充所述无菌液体培养基的样子；或者采用这种系统，所述无菌液体培养基可在一段时间内被修饰以满足患者症状和/或所达到的愈合速度的变化。
如上所述，本发明还提供了一种将生存力增强的干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在将干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统之前或之时用含水的无菌液体培养基处理所述干细胞或神经系统细胞或组织，和(2)输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.01-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4suM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，其中所述含水的无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。在将细胞输递至人的脑、脊髓或神经系统之前或期间用本发明的含水的无菌液体培养基处理的细胞(包括干细胞、神经系统细胞或神经系统组织)通常有增强的生存力，并更易于在脑、脊髓或神经系统中存活和/或繁殖。更优选地，本发明的含水的无菌液体培养基可用作植入这种细胞的输递系统或载体。
以下实施例描述并例证了本发明的方法和组合物。这些实施例仅仅是为了例证本发明，而不是要限制其范围和精神。除非另有说明，所有的比例都以重量表示。那些精通此领域的技术人员将容易理解，也可采用这些实施例中所述材料、条件和过程的变化。其中引用的所有参考资料在此并入以供参考。
常规方法。按照人类对象研究Springfield委员会(Springfield Committeefor Research on Human Subjects)和UC Irvine IRB许可的方案，脑组织于手术前在伦理学上获自被告知的患者。未除去其它组织且样本与对病理学标本的需求不矛盾。与其采用吸引术来除去所有组织，不如从皮层入口(access port)或损伤边缘组织获得1-3mm厚的组织切片。电灼术的使用被限制到最小程度以减少氧化自由基和其它神经元损伤。将手术室内获得的组织(198±80mg，平均值±S.D.，n＝8)转移到20ml冰冷的无菌转移培养基，该培养基置于无菌的50ml聚苯乙烯试管(Corning)。转移培养基是Hibernate A(Brewer等，NeuroReport，1996；7：1509-1512)，其中加有2％B27培养基添加物(Introgen公司，Rockville，MD)(Brewer等，J.Neurosci.Res.，1993；35：567-576)和0.5mM谷氨酰胺。Hibernate A含有D-葡萄糖、丙酮酸盐、平衡盐、氨基酸和维生素。B27含有5种抗氧化剂和15种其它组分。尽管在8℃转移培养基可保持胚胎大鼠脑组织50％的生存力4周，但在4℃这里所用组织大多数不能存放超过4周。从冰上转移到培养物实验室内的层流无菌被覆物后，在35mm平皿中用解剖刀和镊子除去组织的脑膜和白质，平皿中含有2ml转移培养基。将组织切成0.5mm的切片，用木瓜蛋白酶消化，并分离成单细胞悬液(见Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71：143-155)。在Optiprep密度梯度(Invitrogen)上通过离心富集细胞悬液。Optiprep首先用0.8％NaCl 50.5：49.5(V/V，Optiprep：盐水)稀释以使22℃的密度为1.15。以后的试验显示，用10mM MOPS，pH7.4缓冲的盐水效果最好。稀释的Optiprep进一步用转移培养基(v/v)稀释以在15ml离心管中制成4个1ml的梯度：底部(0.35∶0.65)、0.25∶0.75、0.2∶0.8、顶部(0.15∶0.85)。将最多6ml细胞悬液置于Optiprep分级梯度上部。尽管神经元和神经胶质在所有梯度中都存在，收集小丸(pellet)和碎片(debris)致密带之间的组分，以最大富集神经元(Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71：143-155)。以320/mm2的密度将细胞铺到上述涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片上。细胞培养在Neurobasal A培养基(Invitrogen)中，培养基中含有2％B27、5ng/ml FGF2(碱性人重组成纤维细胞生长因子，Introgen)和0.5mM谷氨酰胺，并置于含有9％O2和5％CO2的湿润大气下(Forma，Marietta，OH)。在大多数试验中，还含有10μg/ml的DHEAS(脱氢表雄酮3-硫酸盐，Sigma)。DHEAS用10％的牛血清白蛋白稀释1mg/ml的贮液并无菌过滤得到。按照说明，用1％BSA/PBS将贮液稀释500倍，加入EGF(20ng/ml；鼠，Introgen)和NT3(100ng/ml；重组，Regeneron)。每3-4天用新鲜培养基更换一半培养基。
为进行免疫细胞学研究，培养物用热的PBS清洗两次并在PBS中4％的低聚甲醛中固定10分钟。用PBS清洗两次后，被GFAP染色的细胞再在乙酸/乙醇(1∶9，v/v)中固定20分钟，然后用PBS清洗两次。非特异性位点被封闭，并将细胞在5％正常羊血清和0.5％Triton X-100中渗透5分钟。在22℃，将细胞和第一抗体在5％羊血清和0.05％Triton中培养1小时，Triton中含有鼠抗-神经丝200(1∶40，Sigma)和兔抗-牛GFAP(1∶2000，Dako)，或鼠抗-MAP2(1∶250，Boeringer-Mannheim)和兔抗-τ(1∶2000)。用PBS清洗4次后，细胞在22℃和结合有若丹明的羊抗-兔IgG(重+轻链，1∶500，Tago)以及结合有cy2的羊抗-鼠IgG(重+轻链，1∶100，Jackson)一起培养1小时。用PBS清洗4次后，盖玻片用Aquamount固定并通过Nikon 60x/1.4目镜用Spot cooled CCD照相机(Diagnostic Instruments)照相。
为进行电子显微镜电子显微镜检测(Deitch等，J.Neurosci.，1993；13：4301-4315)，载玻片上的细胞在37℃用2.5％戊二醛固定1小时，直接稀释到培养基中形成25％的贮液。无需清洗，进一步固定细胞并在37℃用0.1％OsO4染色0.5小时。细胞用0.125M磷酸钠(pH7.4)清洗并用0.1％OsO4继续固定0.5小时。用3.6％NaCl和水清洗后，细胞用5％乙酸双氧铀水溶液染色1小时。用水清洗后，细胞用一系列乙醇脱水，继以环氧丙烷。将细胞倒入充满Spur树脂(Polysciences)的橡胶模具。在60℃聚合3小时以制成3mm厚的半透明盘，感兴趣的区域用20x物镜观察并用记号笔圈出。将圈出的区域移到划线树脂盘内侧。通过反复接触液氮和沸水除去玻璃盖玻片。用锯取下标记的区域并将其粘在金属轴(metal stub)上，以修剪和切片。将90nm金切片沉积在涂有聚醋酸甲基乙烯酯薄膜的狭缝载网上。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并用Hitachi H7显微镜在70kV观察。
实施例1.人皮层脑组织获自11例连续外科病例，包括7例肿瘤病例，3例癫痫病例和1例假性延髓麻痹(suprabulbar palsy)。患者年龄在41-70岁之间。表2总结了这11例病例的结果。
表2.培养在B27/Neurobasal A中的人皮层脑外科样本手术样品症状/诊断1年龄，性别 组织 重量 细胞产量 (百万)3 添加物4 ％，神经丝 ％GFAP (平均值±S.D.)51胶质瘤，r.太阳穴46，M n.d. 0.7 0 53±10，38±7 DHEAS 70±12，31±9 FGF2 67±7，30±72肿瘤，r.太阳穴69，M 150 1.5 FGF2 ＜10％，＞80％3神经胶质瘤，l.额41，M 205 5.7 FGF2 84±8 61±10 FGF2+DHEAS 73±114癫痫，l.上太阳穴脑回33，F 266 3.6 FGF2 16±5 15±2 17±45脑膜瘤，r.太阳穴70，M 150 1.7 FGF2 17±10 DHEAS 25±10 FGF2+DHEAS 65±486癫痫，l.颞叶切除术53，F 73 0.12 FGF2+DHEAS 84±6，16±6 +睾酮20nM 85±4，15±4 +雌二醇18nM 89±5，11±57r.颞皮质54，M 323 1.2 DHEAS，FGF2 所有神经胶质8癫痫15，F 253 0.9 DHEAS，FGF2 所有神经胶质9原发性脑淋巴瘤67，F 167 0.7 DHEAS，FGF2 26±310脑膜瘤，l.颞叶45，F 349 1.9 DHEAS，FGF2 所有神经胶质11假性延髓麻痹53，F 61 0.8 DHEAS，FGF2 所有神经胶质
1.皮层组织的来源和/或患者诊断的诊断，l.脑左侧；r.脑右侧。
2.切割和粉碎前组织的重量；n.d.表示未称重。
3.梯度分离后通过除去锥虫蓝判断细胞产量。
4.培养基的添加物：见常规方法。
5. 6天后，按常规方法的描述固定培养物并进行免疫染色。4-6个0.304平方毫米的区域为神经丝免疫反应阳性。当有两组值时，第二个值表示对GFAP的免疫反应性。
分离的细胞的神经特征。将细胞骨架组分作为特异性标记来区别神经元和神经胶质。微管结合蛋白MAP2和τ通常分别与神经元的树突和轴突区域结合。神经丝200是仅限于神经元的常见中间丝，而GFAP仅限于星形神经胶质。所有制品都至少被这些标记之一免疫染色。对于分离自67岁原发性淋巴瘤病例额叶并培养6天的样品，这些细胞显示神经元样的形态并对神经元细胞骨架元件MAP2和τ免疫染色。较好地，在相图中看到了分支过程。MAP2染色清楚显示了树突生长锥。用τ染色并对τ进行核定位看到了一个轴突样的粗细均匀的纤维。如表2所示，6例神经胶质瘤中的3例和3例癫痫中的2例得到的主要是神经元而不适神经胶质。具有神经元染色特征的培养物的比例为15-89％。平均有20％的存活平铺细胞是具有纤维的细胞。存活的分离细胞为每毫克组织9,000个细胞(±2,000S.E.，n＝10，表2)。
为提供出现神经元的细胞神经元特征的其它形态学证据，将来自70岁脑膜瘤病例的样品培养3周以建立突触，然后再固定并电子显微镜检测。电子显微照片显示了具有微管的均匀纤维，微管是轴突的特征，并显示了带有多种均匀直径清晰小泡的明显的突触结。突触后密度也是明显的。不是所有纤维间的接触都具有突触特征。基于相差光学显微镜对纤维接触区域的选择，随后的电子显微镜检测显示突触形成的频率约为纤维接触的10％，这与胚胎大鼠海马神经元不同(Brewer，未公布的结果)。
患者的年龄与神经丝阳性细胞的比例无关(R2＝0.03；数据未显示)。获自患者的组织和由神经外科医师提供的组织类型从恶性肿瘤变为癫痫。50％的恶性肿瘤病例(3/6)和1/3的癫痫病例产生了50％以上神经丝阳性细胞。病例数目不够大，因此无法得出进行细胞培养的最佳患者材料的确切结论。
营养和激素支持的需求。在初步试验中，评价了人神经元对FGF2的营养需求，这种需求在成年大鼠神经元中观察到(Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71：143-155)。对于对神经丝染色的细胞，FGF2使阳性细胞的比例从53±10％提高到67±7％(t试验，p＜0.02，n＝6个区域，每个区域约20个细胞，样品1，表2)。以后的试验都在有FGF2的情况下进行。在3例病例中，与FGF2相比，10μg/ml的DHEAS可促进存活。各个病例中，在促进神经丝阳性、神经元样细胞存活方面，DHEAS和FGF2一样有效。培养在无FGF2和DHEAS(A)、或有FGF2(B)、或DHEAS(C)条件下的成年人神经元的形态和神经丝染色没有显著差异。在两个病例中，DHEAS和FGF2对存活的综合效果并不比只有一种要好。然而，在较低浓度时，DHEAS和FGF2对存活有协同作用(图1)。无DHEAS时，存活的ED50接近1ng/ml FGF2。有DHEAS(10μg/ml)时，ED50降低了10倍，约为0.1ng/ml FGF2(图1)。将1μg/ml和3μg/ml DHEAS混合可产生0-10μg/ml之间的中间存活率(数据未显示)。在一个试验中(样品4，表2)，除FGF2外还加入了营养因子NT3或EGF。这些组合物对于神经丝阳性细胞的存活不比单独的FGF2更有效。在另一个试验中(样品6，表2)，在B27/Neurobasal内的FGF2和DHEAS中加入了性激素睾酮和雌二醇，但没有效果。
实施例2 在脑外科手术中，蛛网膜下隙、脑薄壁组织和切除腔通常用生理盐水冲洗。由于生理盐水在人开颅术时被用来清洗手术部位，且盐水可在大鼠皮层损伤中造成神经胶质增生(Gomez-Pinilla等，J.Neurosci.，1995；15：2021-2029)，测试了生理盐水在维持神经元在模型系统(即培养物中的大鼠胚胎海马神经元)中存活的能力。除去培养基并用盐水处理这些神经元24小时后，一半以上的细胞死亡，但所有细胞都丧失了产生树突的能力。48小时后，盐水使几乎所有细胞死亡。用Neurobasal/B27处理的平行培养物显示典型的最大存活率约为50-60％。
为评价本发明的无菌液体培养基对脑的作用，在大鼠伞毛-穹隆上建立了大鼠皮层的吸引术损伤，用培养基清洗损伤，然后将浸透培养基的明胶海绵移植到受损的腔中。以利用仪器不用肉眼的规程，在36只大鼠上进行操作：每组6只大鼠，接受浸透以下组合物之一的明胶海绵：(1)生理盐水，植入皮层损伤腔；(2)表1中更优选的组合物，用啮齿动物适用的皮质酮(0.01-0.05μM)代替皮质醇；(3)Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)，添加10ng/ml FGF2；(4)表1中更优选的组合物，用啮齿动物适用的皮质酮(0.01-0.05μM)代替皮质醇，并添加5ng/mlFGF2；和(5)对照(即无损伤或伪受损)。无需任何有关治疗的知识，神经科医师确定在这些大鼠中获得了靶伞毛-穹隆的损伤。通过计数中间隔膜中甲酚紫染色的神经元确定处理4周后的神经元密度。用本发明的无菌液体培养基处理使神经元密度增加了55％(图2)。用本发明的培养基处理得到的提高明显高于用盐水进行的处理(p＝0.01)，且用本发明的培养基处理的神经元的密度接近未受损病例的神经元密度。用26mM碳酸氢钠制备的类似制品的功效稍差(图2)。通常，添加了FGF2的基础组合物和单独的基础组合物对于保持中间隔膜的神经元密度一样有效。因此，上表1中“更加优选的范围”一栏所述的无菌液体培养基的基础组分通常是优选的。这些结果强调了本发明的组合物对于隔开神经元的作用，这些神经元的轴突已被切断或经历轴索显微外科术，这种情况通常发生在脑或脊髓外科手术或头或脊髓损伤中。
实施例3.用脑损伤模型在体外测试了用本发明的无菌液体培养基保持神经元的生存力。进行大鼠皮层吸引术(直径约1mm)以产生损伤腔，在腔中填满浸透(1)盐水、(2)表1中所列优选的本发明的无菌液体培养基(即第一种无菌液体培养基)，或(3)用26mM碳酸氢钠缓冲液而不是MOPS缓冲液进行缓冲的表1的无菌液体培养基(即第二种无菌液体培养基)的明胶海绵。恢复4周后，通过固定、石蜡包埋、切片和用甲酚紫染色来评价皮层神经元的存活。损伤周围神经元的存活是距损伤边缘和对测的距离的函数。距损伤边缘第一个100μm的图象显示，与盐水相比，无论用本发明的哪种无菌液体培养基，细胞损失都较小。手术一个月后，与盐水处理相比，用第一种无菌液体培养基处理的大鼠神经元密度的保存平均增加了27％(裂区中有一个块变量，F(1，10)＝7.1，p＝0.02)(图3A)。用以碳酸氢盐缓冲的本发明的培养基处理的损伤与上述盐水有相同的作用，但不显著(F(1，10)＝4.1，p＝0.07)。与伪损伤的动物(无损伤穿颅)，第一种和第二种方面无菌液体培养基都可几乎完全保存神经元密度。然而，第一种无菌液体培养基通常可提供较好的保存效果。
至于占皮层未受损对侧相同区域神经元密度的百分数，用第二种(碳酸氢盐缓冲的)无菌液体培养基处理的损伤与盐水处理的损伤无异(图3B)。然而，用第一种无菌液体培养基处理使神经元密度在中间距离(200-400μm)甚至高于未受损侧(图3B)。超过这一距离，第一种无菌液体培养基使神经元密度高于盐水处理约15％，但不显著(F(1，4)＝4，p＝0.09)。损伤导致的神经元的对侧损失或神经纤维网的变化可能是由于缺乏较大区别造成的。在感觉运动皮层损伤中，对侧神经纤维网扩大，这可能造成神经元密度降低。因此，重新测量了损伤对侧神经元密度的原始数据。用盐水处理观察到了令人吃惊的对侧神经元密度的大量减少，而第一种无菌液体培养基显示出对对侧神经元密度的较好保存。这些结果进一步证实了本发明的无菌液体培养基对于保存神经元密度的作用。
还用添加了5ng/ml FGF2的表1的无菌液体培养基处理了大鼠损伤，和以前公布的添加10ng/ml FGF2的DMEM(Otto等，J.Neurosci.Res.，1989；22：83-91)进行比较。图3C显示添加FGF2的本发明的无菌液体培养基使细胞密度较之盐水明显高出50％，且明显优于添加FGF2的DMEM(p＝0.03)和盐水(p＝0.002)。这些结果证明了如本发明所述的将无菌液体培养基和FGF2结合的额外好处。
上述处理后，切片还被脱蜡和对GFAP(角质细胞原纤维酸性蛋白)免疫染色，以观察随脑损伤发生的神经胶质增生。测量免疫染色的密度，它是距吸引损伤边缘的距离的函数。图4显示了用盐水处理产生的高密度的神经胶质增生(Gomez-Pinilla等，J.Neurosci.，1995；15：2021-2029)。通过伪受损处理显示GFAP染色的背景水平。用本发明的培养基处理的大鼠皮层中损伤GFAP染色明显降低(本发明的无菌液体培养基，p＝0.002)。
实施例4.测试了本发明的培养基对培养物中人肿瘤生长的作用。5个连续肿瘤样品获自接受包括损伤切除术的开颅术患者。将样品置于4℃的无菌转移培养基(HibernateTM/B27，如美国专利No.6,180,404所述；www.siumed.edu/BrainBits)，并通过冷敷连夜运输。在4℃保存1-3天后，在Mcllwain组织切片机上将组织切成0.5mm的切片。切片在30℃在Hibernate A(BrainBits)中用木瓜蛋白酶(2mg/ml，Worthington)消化30分钟，然后在Hibernate A/B27/0.5mM谷氨酰胺(GIBCO)中研磨。将样品分成两份并在200×g离心1分钟。将其中一个沉淀物再次悬浮在加有0.5mM谷氨酰胺的本发明培养基；另一个再次悬浮在加有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基。用锥虫蓝计数活细胞，并铺在2cm2经培养物处理的24孔板的聚苯乙烯孔中，它已经用50μg/ml聚-D-赖氨酸预涂布。在37℃、5％CO2和9％O2(Thermo-Forma)培养的第1天和第6或7天，用20x Nikon目镜通过Spot cooled CCD照相机(Diagnostic Instruments)获得相差图象。在0.373mm2的12块邻近区域通过肉眼或Image-Pro+软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)的帮助计数分离的相明亮区域。用标准误差表示每平方毫米培养物面积的平均细胞密度。用Plotit软件(Scientific Programming Enterprises)计算处理间的t-试验结果。
生长在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基内的脑膜瘤细胞在7天后显示令人吃惊的生长。这些细胞分散到基质中并增殖，平均细胞面积达到3015+453μm2(平均值+/-S.E.，n＝12细胞)(图5A)。以同样密度铺在本发明培养基上的相同细胞在培养7天后没有扩散或增殖(平均面积＝936μm2)(t-试验，p＝0.0001)(图5B)；在本发明的培养基中几乎没有活细胞。
类似地，生长在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基内的扩展到基质中并增殖(图5C)。相反，生长在本发明培养基中的成胶质细胞瘤细胞在培养7天后没有扩展或增殖(图5D)。
使脑膜瘤细胞生长10天。培养10天后，生长在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基内的细胞产生融合生长。用胰蛋白酶处理收集这些细胞，并将其置于含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基或本发明的培养基。下面的表3和图6显示细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基中继续生长，但在本发明的培养基中生长受到抑制，并有细胞死亡。
表3 培养天数 累积群体加倍 Neurobasal A/血清本发明的培养基 3 00 5 1.63-0.37 7 1.48-0.08 10 1.76-1.34 更换血清培养物 12 1.761.76 15 2.811.44 17 2.390.69 19 2.79-0.22
在表4中比较了各种类型肿瘤的细胞生长。表4中的数据显示了第6或第7天细胞的增加，增加是用第6天或第7天的细胞数除以开始培养时的细胞数。这些结果还显示在图7中。对于这5种连续肿瘤病例，本发明的培养基导致生长停滞或抑制以及细胞死亡，而含有胎牛血清的Neurobasal A培养基使所有原发性肿瘤的细胞增殖而使转移肿瘤的细胞生长停滞。
表4肿瘤类型比例 Neurobasal A/血清 (S.E.)本发明的培养基(S.E.)概率脑膜瘤1 2.80(0.26)0.94(0.15)3×10-62 3.19(0.19)0.45(0.09)6×10-12成胶质细胞瘤1 2.00(0.14)1.14(0.12)1×10-42 1.55(0.17)0.59(0.07)2×10-5转移1 0.99(0.15)0.31(0.09)2×10-3
有上述试验可见，本发明的培养基可抑制培养物中人肿瘤细胞的生长。